Procédures sévères
Edition du genome de poisson zebre par CRISPR-Cas9 en vue de creation de lignees
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Le génome de ces poissons est modifié par CRISPR-Cas9 pour livrer des lignées stabilisées à des laboratoires privés ou publics, clients de la prestation, qui réaliseront ensuite leurs propres expériences. 6 500 poissons zèbres sont utilisés dans des procédures déclarées légères et sévères, ceux qui portent le génotype recherché étant gardés comme géniteurs, les autres tués. Chacun subit une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, et le porteur reconnaît que les modifications génétiques apportées peuvent être physiquement dommageables, occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Il décrit une espèce dont les femelles pondent jusqu'à 200 œufs par semaine et qui atteint l'âge adulte en trois mois, l'élevage d'un grand nombre d'individus étant "aisé".
Objectifs
Ce projet a pour but de créer des lignées génétiquement modifiées par la technique CRISPR-Cas9 sur le modèle poisson-zèbre pour des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Les lignées stabilisées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. En 3 mois il atteint l’âge adulte et est capable de se reproduire. Les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Son développement externe permet la micro-injection et donc facilite les procédures d’édition du génome.
Bénéfices attendus
Notre unité d’appui et de recherche a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant les modèles poissons zèbres. Les lignées ainsi produites permettront de mieux comprendre la fonction des gènes invalidés (knock-out) ou modifiés (mutations ponctuelles) ou insérés (knock-in).
Procédures
Biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie, de maximum 3 mm², 1 fois par animal. Temps de la biopsie (anesthésie incluse) : environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques apportées peuvent potentiellement être physiquement dommageables pour le poisson, lui occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Le génotypage, qui s’opère par une biopsie de la nageoire caudale, est réalisé rapidement sous anesthésie en balnéation (pas d’injection traumatisante). Le prélèvement n’impacte que temporairement voire pas du tout l’animal grâce à la régénération totale du membre en quelques jours. Parmi les effets indésirables potentiels nous pouvons donc lister : comportement d'aversion pour l'anesthésique, douleur suite à la biopsie si le geste est mal effectué, comportements de stress (tels que la désorientation) suite au réveil ou à la manipulation à l'épuisette.
Devenir
Les animaux présentant le génotype d’intérêt seront gardés en vie et utilisés comme géniteurs. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt seront euthanasiés.
Remplacement
Notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre pour étudier des phénotypes complexes par exemple des modifications du comportement ou des modifications à l’échelle d’organes entiers, l’espèce animale utilisée ne peut donc être remplacée par des expériences sur cellules ou organoïdes.
Réduction
Une attention particulière sera portée à la gestion du cheptel, notamment via un suivi informatisé, afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaires à la création de lignée. Un bon suivi des lignées permet par exemple d’éviter de produire davantage d’individus alors que des juvéniles sont déjà prêts à être utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Comme le poisson zèbre est une espèce grégaire, il est donc placé en groupe dans les aquariums d'élevage. Pendant le moment où les individus sont isolés (génotypage) les aquariums sont enrichis avec des structures ou objets (algues synthétiques, tuyaux de PVC) permettant aux individus de s’isoler temporairement si nécessaire ou de pallier un manque de compagnie (statut temporaire, généralement durant un séquençage pour identification génétique ou lors d’un isolement dû à une lésion observée sur un animal et qui requiert une convalescence). Deux ou trois congénères au phénotype différent visible (long fin ou nacre) seront également ajoutés à l’aquarium afin de limiter l’isolement pendant la période d’isolement qui n'excède pas deux semaines. Les paramètres de la qualité de l‘eau seront surveillés, ainsi que le bien-être et la santé des poissons. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, modification de la pigmentation. Si des signes de douleur sont observés suite à la biopsie, une administration par balnéation de lidocaïne (analgésique) à 2 mg/L sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Il permet l’obtention non invasive et indolore de plusieurs centaines d'œufs par ponte nécessaires à la mutagénèse. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à 3 mois. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle. Pour le génotypage, les biopsies des nageoires sont effectuées sur des individus entre un mois et trois mois.
Evaluation de la bio distribution de médicaments chez le rat porteur de tumeur cérébrale et évaluation de leur efficacité thérapeutique en combinaison avec la radiothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale leur est implantée, puis la barrière protégeant leur cerveau est ouverte par ultrasons pour y faire passer une chimiothérapie, associée ou non à une radiothérapie, avec deux à cinq interventions par animal pouvant durer jusqu'à deux heures. Le porteur indique que si les traitements ne suffisent pas, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l'étude étant alors interrompue. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthodes alternatives pour réaliser ce travail", alors qu'il décrit dans le même résumé des essais cliniques déjà en cours chez des patients avec les ultrasons, aux résultats qu'il qualifie de très encourageants.
Objectifs
Les gliomes sont des tumeurs cérébrales ayant une incidence de 4 à 5 nouveaux cas par an pour 100 000 personnes. Il s’agit également du deuxième type de cancer le plus fréquent chez l’enfant. Les patients atteints de glioblastome, le plus agressif des gliomes, survivent en moyenne 15 mois après le diagnostic de la tumeur et ce malgré le traitement combinant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. C’est pourquoi il est nécessaire de chercher de nouveaux traitements. La principale limite à l’efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison d'une barrière protégeant le cerveau qui limite le passage de la majorité des médicaments (chimiothérapie ou autres). Récemment, les ultrasons, guidés par l’imagerie de résonance magnétique et associés à des microbulles, ont attiré l’attention en tant que moyen non invasif pour permettre le passage des médicaments dans le cerveau. Dans la première phase du projet, nous étudierons l’efficacité du traitement administré à des rongeurs porteurs de tumeurs cérébrales après l’ouverture de la barrière protégeant le cerveau par ultrasons. Puis nous évaluerons l’efficacité de la combinaison de la chimiothérapie avec une radiothérapie dans le but de réaliser rapidement un transfert vers la clinique de cette nouvelle approche thérapeutique.
Bénéfices attendus
Dans le cas des tumeurs cérébrales, l’espérance de vie des patients est très petite. L’utilisation des ultrasons représentent un espoir majeur pour améliorer l’efficacité des traitements. Des essais cliniques utilisant les ultrasons sont déjà en cours pour améliorer la délivrance de la chimiothérapie dans les tumeurs cérébrales chez des patients. Des résultats très encourageants ont été obtenus. Nous pensons qu’il serait possible d’améliorer encore ces résultats en ajoutant la radiothérapie à la chimiothérapie (délivrée après traitement par ultrasons pour mieux pénétrer dans la tumeur cérébrale). C’est ce que nous souhaitons démontrer dans ce projet.
Procédures
Les animaux seront placés sous anesthésie générale pendant l’implantation des tumeurs et pendant les traitements. Ils recevront également des médicaments anti douleurs si nécessaire. Ils recevront un traitement de chimiothérapie et un traitement de radiothérapie ou la combinaison des deux traitements. Comme c’est le cas pour les humains, les animaux seront suivis par imagerie médicale. Le nombre d’interventions sera de 2 à 5 selon les groupes auxquels les animaux appartiennent. La durée des procédures varie de quelques minutes à 2h maximum.
Impact sur les animaux
L’inoculation de la tumeur peut induire des douleurs. L'utilisation des ultrasons peut provoquer une inflammation du cerveau qui se résorbe au bout de quelques jours. Cette inflammation, qui est un effet normal dû à cette procédure, ne provoque pas de dommages apparents pour l’animal. La chimiothérapie, comme chez l’homme pourra engendrer une perte de poids des animaux d’une durée limitée. La radiothérapie ne devrait pas engendrer d’effets indésirables. Si les traitements ne sont pas suffisamment efficaces, la tumeur continuera de grandir et pourra causer des douleurs, l‘étude sera alors interrompue.
Devenir
A l’issue des procédures, les animaux seront mis à mort pour obtenir un prélèvement cérébral. D’autres organes seront également prélevés dans certains groupes. Différentes analyses seront réalisées sur ces prélèvements. D’autre groupes de rats seront suivis dans le temps pour évaluer l’efficacité des traitements.
Remplacement
Pour améliorer le traitement des tumeurs cérébrales, Il n'existe pas d'autres méthodes qui permettent d’évaluer l’efficacité d’un traitement associant la chimiothérapie et la radiothérapie. En effet, pour mesurer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il est nécessaire d’étudier un organisme vivant. Celui-ci reflète la complexité des tissus sains, de la tumeur, des vaisseaux qui nourrissent la tumeur et du système immunitaire. Il est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le projet que nous proposons permettra de développer un nouveau traitement contre le cancer du cerveau qui pourra rapidement être transféré à l’homme. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour réaliser ce travail.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel qui permet d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum en choisissant par exemple de procéder par étapes pour définir les traitements les plus efficaces avant de les combiner entre eux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions répondant aux critères fixés par le ministère qui sont relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux. Toutes les mesures nécessaires seront prises pour réduire au maximum la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous analgésie et anesthésie adaptée. Dans le cas où certains signes seraient observés, un traitement de la douleur sera mis en place. Des points limite qui déterminent les conditions d’arrêt de l’expérience ont été définis.
Choix des espèces
Le rat est une espèce adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain. L’ensemble des animaux sera utilisé à partir de l'âge adulte (6 à 8 semaines pour le rat), car le cerveau du rat adulte est suffisamment gros pour permettre d’obtenir des images IRM assez résolues et de réaliser des irradiations dans de bonnes conditions de préservation des tissus sains.
Cibler les mégacaryocytes et les plaquettes hébergeant le virus du SARS-CoV-2 pour une restauration immunologique efficace
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par le SARS-CoV-2 par instillation nasale sous anesthésie, 1 704 souris subissent ensuite des prélèvements de sang derrière l'œil, jusqu'à un par semaine, et des prélèvements dans la bouche. Les procédures sont déclarées légères et sévères, aucun animal n'est gardé vivant et la durée de conservation après le début des expériences ne dépasse pas deux mois. L'infection fait perdre environ 12 % de leur poids aux souris Balb/c au quatrième jour et peut en tuer 10 %, l'objet du projet étant de chercher des réservoirs du virus dans les plaquettes et les mégacaryocytes. Le porteur écrit qu'au total 1 224 souris seront "nécessaires", pour un projet qui en déclare 1 704, et affirme qu'aucun système in vitro ne reproduit à ce jour les interactions hôte-virus aboutissant au Covid-19.
Objectifs
La pandémie Covid-19 est devenue une urgence sanitaire et médicale dans la plupart des pays dans le monde. Le SARS-CoV-2 cause des symptômes respiratoires qui peuvent être graves, ainsi que des symptômes à l’origine du COVID long par la persistance de réservoirs cellulaires du virus. Notre objectif est d’identifier et de caractériser ces réservoirs viraux dans le contexte de l’infection par le SARS-CoV-2 et les conséquences de ce phénomène sur la réplication virale et la pathologie Covid-19.
Bénéfices attendus
Les plaquettes et les mégacaryocytes sont des cachettes virales largement négligées. Nous étudierons leur participation dans des modèles murins de long COVID et COVID sévère. Nous proposons enfin de les cibler afin de restaurer le statut immunocompétent et la qualité de vie des individus présentant des déficits immunitaires persistants d'origine virale. A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire les interactions hôte-virus aboutissant au COVID-19. L'évaluation de la pathogénicité du SARS-CoV-2 pourra aider à développer de nouvelles stratégies de lutte qui nécessitent des modèles in vivo pertinents qu’il n’est pas possible à ce jour de remplacer par des tests in vitro ou in silico. Il est admis que le modèle murin et l’infection avec une souche du SARS-CoV-2 adaptée à la souris est pertinent pour le suivi de la réplication du virus et pour décrire la physiopathologie associée à l’infection par le SARS-CoV-2.
Procédures
(1) Infection de SARS-CoV-2 par voie nasale. L’instillation nasale du virus sera réalisée sous anesthésie générale obtenue par inhalation d’isoflurane. 1 infection par animal sera réalisée, celle ci dure environ 1 minute, après l'endormissement de l'animal par l'isoflurane. (2) Prélèvement sanguin par voie rétroorbitale. Une analgésie locale sera réalisée par le dépot d'une goutte de collyre à base de tétracaine. Une anesthésie générale sera obtenue par l'inhalation d’isoflurane. Les prélèvements intermédiaires (1 fois par semaine au maximum) durent moins d'une minute. Le prélèvement terminal en fin d'expérience durera plus longtemps afin d'obtenir un maximum de volume sanguin, les animaux seront euthanasiés à la suite de ce prélèvement. (3) Prélèvement de swabs buccaux. Ce prélèvement se fera à la suite du prélèvement sanguin intermédiaire pour éviter une autre anesthésie et contention des animaux. Un bref prélèvement à l'aide d'un swab (taille nourisson) sera effectué dans la bouche de chaque animal, ceux ci dureront moins d'une minute.
Impact sur les animaux
L’infection par le virus mouse-adapted SARS-CoV-2 conduit à une perte de poids d’environ 12% au 4ème jour de l’infection chez les souris Balb/c. A cette dose, 10% des souris Balb/c peuvent mourir, les C57Bl/6J ne meurent pas.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans cette procédure sera euthanasié à terme même ceux qui servent de contrôle. La durée maximale de conservation des animaux après le début des expériences est de deux mois.
Remplacement
Des modèles d'étude in vitro existent (organoides par exemple) cependant ils ne sont pas pertinents pour notre étude. En effet, nous nous intéressons à comprendre les effets physiopathologiques par l'infection au SARS-CoV-2 et seul l'étude sur l'organisme entier (animal) nous permettra de répondre à la problématique scientifique.
Réduction
Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe sera utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Dans cette étude, nous utiliserons un test de comparaison de moyennes t-test. Les expériences seront répétées 2 fois avec un nombre de 6 animaux par groupe expérimental. Au total, 1224 souris seront nécessaires. Cette utilisation maximise les données obtenues à partir de chaque animal, afin de limiter ou d'éviter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires, et ce, sans pour autant compromettre le bien-être animal.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, la réalisation de procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Chaque animal sera observé et scoré (évaluation des signes cliniques) toutes les 24h à partir du jour de l’infection. Les souris sont placées dans des cages contenant entre 2 et 4 animaux pour maintenir leur caractère grégaire. Si des conflits sont observés, les animaux agressifs seront écartés du groupe. Pour tout prélèvement et injection, les animaux seront placés sous anesthésie générale. Une analgésie locale sera réalisée pour les prélèvements sanguins.
Choix des espèces
La souris, exprimant naturellement le récepteur ACE2 du SARS-CoV-2, représente un modèle pertinent pour l’étude des réponses immunes et inflammatoires liées à l’infection par ce virus. Chez la souris, il existe de nombreux outils (anticorps, kit ELISA) permettant une analyse des mécanismes immunologiques impliqués dans un effet physiologique. Les souris mâles et femelles seront infectées à l’âge de 8 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.
Validation de l’efficacité des molécules candidates pour prévenir la fibrose myocardique dans un modèle murin d’insuffisance cardiaque.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
660 souris vont être utilisées, 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 20 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue pour peser leur cœur, leur foie et leurs poumons. Une partie subit un rétrécissement chirurgical de l'aorte destiné à provoquer une insuffisance cardiaque, les témoins ayant la cage thoracique ouverte sous anesthésie sans autre geste. Suivent deux échographies d'une demi-heure, trois prélèvements de sang à la queue et une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 21 jours. Le porteur écrit que le remodelage cardiaque et l'insuffisance cardiaque ne provoquent pas de douleur chez ces souris, alors que 640 d'entre elles sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
L'insuffisance cardiaque (IC) se développe suite à l’accumulation de multiples altérations dénommées remodelage, induites par un stress pathologique. Les avancées thérapeutiques permettent de ralentir cette progression vers l’IC et parfois de lever le stress cardiaque initial. Cependant de nombreux patients voient leur fonction cardiaque décliner inexorablement ou secondairement. Des études récentes conduites chez l'Homme et chez l’animal ont montré que suite à une pathologie cardiaque transitoire, certaines lésions accumulées initialement s’estompaient constituant un processus de remodelage inverse. L’analyse au niveau moléculaire de ce processus indique que cette inversion correspond à un nouvel état plutôt qu’à un retour à la normale. Ces données sont cohérentes avec la description clinique d’altérations tardives après une prise en charge efficace dans un premier temps. Ce retentissement à long terme sera probablement de plus en plus fréquent avec le vieillissement de la population. Le projet vise à identifier, in vivo dans un modèle murin, des acteurs moléculaires susceptibles de favoriser une récupération plus complète et durable lors de la prise en charge de la dysfonction cardiaque. A ce jour, les recherches précliniques se sont concentrées sur la caractérisation du remodelage inverse précoce ou sur des aspects restreints du remodelage inverse tardif, uniquement chez les mâles. Le projet permettra de compléter ces études, d'avoir des données en fonction du sexe et de proposer des stratégies thérapeutiques complémentaires et de tester les plus prometteuses. Sur la base d'un modèle murin bien caractérisé de pathologie cardiaque, plusieurs études seront conduites : 1) une caractérisation moléculaire approfondie de coeurs en phase de récupération comparés à des coeurs sains et malades. Cette approche sans à priori, par séquençage des gènes exprimés dans ces différentes conditions permettra de décrire les évènements moléculaires et de générer de nouvelles hypothèses d'intervention. 2) L'établissement d'un modèle cellulaire permettrait de réduire les animaux utilisés pour cibler des traitements potentiels. 3) la modification de la trajectoire du vieillissement, après une chirurgie de construction de l'aorte transverse (TAC), sera évaluée par un suivi régulier des groupes d’animaux. 4) essais précliniques d’interventions médicamenteuses favorisant la limitation voir la regression de la fibrose sur la base des résultats préliminaires au sein du laboratoire.
Bénéfices attendus
Le projet s'inscrit dans les recherches expérimentales pour l'amélioration future de la prise en charge et du traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de morbimortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. Il se penche sur un aspect nouveau de l'atteinte cardiaque, les altérations persistantes malgré les progrès de la prise en charge. A long terme chez l'Homme, la description de cette atteinte et la compréhension de ses mécanismes pourraient permettre de favoriser un vieillissement en meilleure santé et aussi de cibler des mécanismes pathologiques nouveaux lors dutraitement. Le projet déploit les dernières avancées technologiques pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques. A plus court terme, la faisabilité d'une mise en place d'un modèle in vitro de fibroblastes activés sera testée. Ce type cellulaire participe de manière importante à l'altération du muscle cardiaque en synthétisant en son sein une matrice rigide responsable de défauts mécaniques et électriques cardiaques. Cette altération de la matrice est en partie irréversible et peu soumise au remodelage inverse. Il est donc important de rechercher des moyens d'intervention sur cet aspect. Un résultat positif sur ce point permettra de diminuer le nombre d'animaux nécessaires.
Procédures
Les animaux subiront à 2 reprises une échographie de 0.5 heure par souris (état basal avant chirurgie, puis aprés 4 semaines de TAC - La chirurgie de TAC est réalisée à une seul moment soit à 3 mois pour le groupe jeune soit à 22 mois pour le groupe âgé. Les groupes contrôles ne subiront pas de chirurgie cardiaque mais une ouverture de la cage thoracique et une anesthésie également- les prélèvements sanguins de peptides natriurétiques de type B ou bien de son précurseur seront réalisés sur prélèvement sanguin de la queue tous les 15 jours aprés la chirurgie et ce jusqu'à l'euthanasie, soit 3 prélèvements (J0, J15 et J28). Les administrations intrapéritonéales des médicaments ou du véhicule (PBS stérile pour éviter la quantité de DMSO) seront réalisées tous les jours vers 10 h du matin +/- 1 h pendant 21 jours à partir du 5 eme jour aprés la chirurgie. 4 semaines aprés la chirurgie (1 semaine de récupération de chirugie puis 3 semaines d'administration en IP) les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Les échographies cardiaques sont réalisées sous anesthésie gazeuse (1,5% isoflurane) pour diminuer le stress (nuisance légèrer), un tapis chauffant, et un monitoring global de l'animal pour sa surveillance tout au long de l'examen seront mis en place. L'anesthésie lors de l'échographie et de la chirurgie peut comporter des risques de detresse respiratoire (nuisance sévères) et de trouble du rythme cardiaque (nuisance sévère) mais le monitoring permettra de diminuer ces risques et de réagir en diminuant les débits de gaz. Nuisance du modèle TAC: Les chirurgies comportent toujours un risque. Elles constituent les sources potentielles de douleur (nuisance modéré) et toutes les mesures d'anesthésie et d’analgésie décrites dans les procédures permettent de prévenir et d'éviter la douleur. Les lésions accidentelles associées à la chirurgie sont des lésions des gros vaisseaux induisant des pertes de sang importantes (nuisance sévères). Dans ce cas, la récupération étant compromise, le chirurgien procède à l’euthanasie de l’animal. Dans ce modèle, le remodelage cardiaque et l'insuffisance cardiaque ne provoquent pas de douleur mais un essoufflement des animaux et une diminution de leur capacité de se mouvoir (nuisances légères), une surveillance est cependant mise en oeuvre quotidienne pour vérifier qu'il n'y a pas de prostration des animaux. L'âge n'est pas connu pour être associé à une nuisance chez les souris en cage sans stress particulier. L'administration des candidats médicaments seuls ont déjà été administrés chez les animaux de laboratoire et ont montré une bonne tolérance, de la même manière que l'administration chez l’Homme . L'administration par voie intrapéritonéale sera réalisée quotidiennement à l'aide d'une aiguille de 29 gauges (nuisance modérée). Les nuisances de l'administration en IP peut être une inflammation au point d'injection, une rougeur, et une induration mais ces effets sont rares. Le DMSO est un véhicule irritant (douleur et nécrose cutanée) mais sera dilué avec du PBS stérile et sa concentration sera diminué conformément aux recommandations : pas plus de 50% de la dose administrée sera du DMSO. Les animaux seront injectés au côté droit conformément aux recommandations actuelles. Une administration de lidocaïne en IP à 1mg/kg sera réalisée si un animal présente des signes de prostration immédiate apres l'IP des candidats médicaments.
Devenir
A l'issu des temps prévu d'étude (4 mois et 22 mois), les animaux seront euthanasiés pour analyse histologique, le poids du coeur,le poid du foie, poid des poumons et le contrôle des autres organes.
Remplacement
Le mécanisme du remodelage cardiaque aboutissant à l'insuffisance cardiaque (IC) en réponse à un stress implique tous les types cellulaires constitutifs du tissu mais aussi le recrutement de cellules, en particulier inflammatoires et l’interaction avec d’autres organes (rein, système nerveux, …). L’IC est donc une pathologie touchant tout l’organisme rendant indispensable une approche in vivo. De manière analogue, le remodelage inverse nécessite la même approche. De plus, le meilleure critère d'évaluation de la fonction cardiaque est la capacité physique à l'image de ce qui est réalisé chez l'Homme (périmètre de marche, épreuve d'effort). Ce type d'exploration intégrée n'est possible que chez l'animal.
Réduction
Concernant la mise en place des modèles, les techniques utilisées correspondent au dernier développement publié pour permettre une diminution de la variabilité du remodelage ce qui entraîne une diminution du nombre d’animaux comparativement à la technique historique. Cette approche in vivo est complémentaire d’études in vitro qui seront conduites en parallèle et en complément. La culture de fibroblastes permettra d’établir un modèle ex vivo pour tester des cibles potentielles avec moins d’animaux que les tests in vivo. Enfin, les interventions thérapeutiques candidates pour améliorer la prise en charge seront testées chez les animaux. Le mode de calcul des animaux est basé sur la population la plus faible pour montrer un effet. Notre baisse attendue du niveau de fibrose est de 10%, le risque de première espèce alpha est fixé à 0.05, le risque beta de deuxième espèce est fixé à 0.1, la puissance du test (1-beta) est donc à 0.9 . La variabilité de notre mesure de fibrose est de 2%. Selon le logiciel R en ligne (BiostatTGV) le calcul du nombre d'animaux total à inclure est de 600. Le nombre de groupes se base sur l'effet des 2 molécules seules et de leur synergie possible et attendue (résultats préliminaires du laboratoire sur des cultures in vitro). De plus, le sexe des animaux semble jouer un rôle dans la physiopathologie de l'insuffisance cardiaque donc nous avons prévu de mener les expérimentations sur les 2 sexes, ceci augmente le nombre d'animaux mais nous semble nécessaire. Deux séries d'experimentation sont prévues. Les tests choisis seront des t test pour des variables continues à distribution normale et des test de Mann et Whitney pour des tests non paramétriques.
Raffinement
Les interventions susceptibles d’induire la douleur sont bien identifiées : l’approche chirurgicale d’induction de la sténose est réalisée sous anesthésie générale. Lors de ces interventions, l’analgésie locale en complément d’une analgésie générale (morphinique) permet de prévenir la douleur. De plus, les chirurgies seront réalisées par un chercheur rompu à la technique permettant des opérations rapides et des ouvertures minimales diminuant les risques opératoires et participant à une meilleure récupération. Les derniers développements de la technique chirurgicale qui rapportent un meilleur taux de succès seront mis en oeuvre. Le suivi est renforcé dans la période post-opératoire (48 h), l'analgésie est poursuivie et les animaux disposent d'aliments spécifiques, dédiés à la récupération. Il n’y a pas de source de douleur aprés la phase aigue post chirurgie. Le remodelage induit est silencieux mais malgrés cela, les animaux sont suivis quotidiennement. Les stress potentiels associés aux procédures sont de faible intensité, de courte durée (anesthésie/reveil) et espacés dans le temps. Cependant, si la surveillance quotidienne des animaux met en évidence, un arrêt du toilettage, une prostration et ou une perte de poids de plus de 10%, les animaux peuvent être euthanasiés plus tôt, car leur état sera jugé douloureux et non acceptable. Aprés la réalisation de l'administration intra péritonéale un massage est infectué au site d'injection pour diminuer la douleur. Si besoin, et devant des signes de douleurs visibles comme la prostration, un accident à type d'embol veineux ou arteriel sera supposé et une administration IP de lidocaïne sera réalisée pour diminuer la douleur à 1mg/kg. Ces animaux seront surveillés jusqu'à résolution du signe clinique. Les animaux sont par ailleurs hébergés dans un environnement enrichi (nidification) et les groupes sociaux sont conservés tout au long de l’étude. Un suivi quotidien est réalisé par le zootechnicien qui permettra d'intervenir le plus rapidement possible sur l'intervention de blessure ou autre problèmes post opératoire.
Choix des espèces
Le modèle souris est en grande majorité utilisé pour les études précliniques. Les connaissances acquises par la communauté scientifique sur cette espèce, toutes nécessaires à tirer le plus d'information à partir du présent projet, permettent l'analyse fine de l'expression génique et l'exploration de la physiologie cardiovasculaire. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle les modifications génétiques sont les plus aisées actuellement, permettant de tester plus aisément les hypothèses scientifiques. Elle combine donc les avantages d’être de la même classe que l’Homme. Les animaux seront utilisés majoritairement à l’âge de jeune adulte (à partir de 3 mois) car les pathologies étudiées sont, le plus souvent, des pathologies acquises. L’utilisation d’animaux jeunes est en revanche éloignée de la situation clinique mais permet une bonne récupération des procédures expérimentales chirurgicales et donc une bonne qualité de vie.
Traitement de l’encéphalopathie par administration de produits sous forme de dialyse péritonéale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Vocalises spontanées, difficultés respiratoires, incapacité à se retourner, absence de réflexe pupillaire, ptôse palpébrale avec larmoiement : ces signes déclenchent la mise à mort anticipée des rats en phase de décompensation. 3 374 rats vont être utilisés au total, 1 368 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 1 356 un niveau modéré et 650 un niveau léger, tous tués pour l'analyse histologique du foie, des reins et du cerveau. Chacun reçoit jusqu'à 32 administrations de tétrachlorure de carbone, deux par semaine pendant seize semaines, ou subit une laparotomie avec ligature des voies biliaires, avant que des injections de lipopolysaccharide bactérien ou douze administrations d'éthanol ne déclenchent la défaillance hépatique. Le porteur écrit que la décompensation peut inéluctablement conduire l'animal à la mort, et n'appuie l'effectif de 3 374 rats sur aucun calcul.
Objectifs
L'encéphalopathie hépatique (EH) est un syndrome d'altération des fonctions cérébrales dû à une maladie hépatique aiguë ou chronique. Les manifestations peuvent aller de troubles psychiatriques, neurologiques subcliniques jusqu’au coma. Ce syndrome est associé à une morbidité, à un taux de mortalité élevé et nécessite des soins importants. La principale cause de cette pathologie est la cirrhose hépatique qui est caractérisée par la présence de tissus cicatriciels au niveau du foie en réponse à une agression répétée de l’organe.
Bénéfices attendus
La prévalence de l’encéphalopathie hépatique (EH) clinique concerne 30 à 45 % des patients cirrhotiques avec une incidence de 20 % par an. La prévalence de l’EH minime est plus difficilement estimable mais elle pourrait toucher plus de 2/3 des malades. La prévalence de la cirrhose est d’environ 2000 à 3500 cas par million d’habitants, soit en France 700000 cas avec 10 à 15 000 décès par an. Le passage d’une cirrhose compensée vers une cirrhose décompensée est associé à une diminution de la survie à court terme (3-5 ans). La survenue d’une EH constitue un facteur majeur de mauvais pronostic. En effet, le développement d’un premier épisode d’EH au cours de la cirrhose est un facteur de risque indépendant de mortalité avec un taux de survie cumulée à 1 an et 3 ans de respectivement 42 % et 23 %. Ce projet vise donc à bloquer et reverser le processus qui conduit à la mise en place de l’encéphalopathie hépatique et de lui permettre d’avoir accès à une transplantation hépatique (seul recours actuel à la décompensation hépatique).
Procédures
Période d’induction : Décompensation spontanée selon les procédures : Jusqu’à 32 administrations de CCl4 (tétrachlorure de carbone, agent fortement hépatotoxique) à raison de 2 par semaines pendant 16 semaines (15 secondes) ou Chirurgie avec laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale et couverture analgésique (durée 15’) Pour les études pilotes : un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Pour les études avec produits : un prélèvement de sang intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Décompensation provoquée selon les procédures : Entre 18 et 20 administrations de CCl4 à raison de 2 par semaines pendant 9 ou 10 semaines (15 secondes) Ou Chirurgie avec laparotomie et ligature des voies biliaires sous anesthésie générale et couverture analgésique (durée 15’) un prélèvement de sang intermédiaire (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Déclenchement de la décompensation : Soi 4 administrations de LPS (Lipopolysaccharide: fragment de la paroi bactérienne entrainant une réaction inflammatoire à l'identique de celle rencontrée lors d'une infection) (15 secondes) à raison d’une administration journalière pendant 4 jours avec ou sans anesthésie selon la voie retenue soi 12 administrations d’éthanol à raison de 3 administrations par jour pendant 4 jours (15 secondes) un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes). Si procédure avec produit à étudier ajouter: 4 administrations des composés à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (durée 1 minute) sous anesthésie (3 minutes). 4 Drainages du dialysat à raison d’une fois par jour pendant 4 jours consécutifs (15 minutes) sous anesthésie générale. un prélèvement de sang final (1 minute) sous anesthésie (3 minutes).
Impact sur les animaux
Les modèles d’étude ne présentent pas de douleur ou d’inconfort pendant la phase d’induction de la fibrose ou de la cirrhose. Sur cette phase, le seul inconfort serait l’intervention chirurgical associée à la ligature des voies biliaires, celui-ci est géré par l’utilisation préventif d’un analgésique et en curatif pendant les deux jours qui suivent la période post-opératoire. L’encéphalopathie est une pathologie très lourde pouvant conduire au décès du patient. La décompensation qu’elle soit « spontanée » en prolongeant l’induction soit dans l’épisode aigu associé à l’administration de l’agent précipitant à un stade plus précoce de la cirrhose compensée peut inéluctablement le conduire à la mort, c'est par définition la caractéristique du modèle étudié dans ce projet. Nous reproduisons ces évènements qui surviennent chez les patients cirrhotiques qui décompensent qui dans le cadre d’une ACLF (décompensation ou aggravation d’une décompensation rapide et brutale par un agent précipitant - infection, absorption massive d’alcool, intoxication médicamenteuse, …- chez des patients souffrants d’une maladie chronique du foie) peuvent avoir une survie estimée à 28 jours dans 70% des cas. Des signes comme des vocalises spontanées, des difficultés respiratoires (dyspnée), une incapacité à se retourner (sauf dans le cadre du binge drinking où les pertes d’équilibres peuvent aller jusqu’à l’incapacité à se retourner), une absence de réflexe pupillaire, une ptose palpébrale avec larmoiement et une pâleur prononcée pourront être observés chez les animaux en phase de décompensation. Ils constitueront un point d’arrêt et une mise à mort des animaux par anticipation.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et cerveau) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Les modèles développés et décrits dans ce projet tentent de reproduire une cascade d’événements conduisant à la défaillance successive de plusieurs organes comme cela se produit chez le patient cirrhotique en phase de décompensation aigue ou chronique. Il n’existe pas de modèle in vitro permettant de reproduire la globalité ni la chronologie de la progression de la rupture multi organe. Les premières étapes du programme de recherche seront réalisées dans des tests in vitro pour évaluer les activités intéressantes sur des paramètres connus jouant un rôle dans l’évolution de la pathologie étudiée (par exemple l’inflammation, le stress oxydatif, ou la prolifération ou mort cellulaire etc.)
Réduction
Le nombre d’animaux estimé pour chaque procédure tient en compte de l’hétérogénéité associée aux modèles d’induction de la défaillance hépatiques. Le nombre initial de certaines procédures permettra l’élimination d’animaux sous ou sur-répondants, ce afin d’avoir une meilleure homogénéité après réponse à l’agent précipitant et donc in fine de réduire les groupes d’étude finaux. L’estimation du nombre d’animaux des groupes finaux a pour but de permettre une analyse robuste et fiable de l’effet des composés sur la pathologie. Les procédures de caractérisation des modèles permettront d’ajuster au mieux ce nombre d’animaux nécessaire à la mise en évidence d’un effet thérapeutique de composés.
Raffinement
L’encéphalopathie hépatique est une pathologie sévère, qui chez l’humain entraîne de nombreux décès dans un délai de 1 à 3 ans. Le modèle expérimental s’avère donc lui aussi sévère sur la phase finale de la procédure (prolongation de l’agent inducteur ou administration de l’agent précipitant). Nous avons établi une liste de signes cliniques de manière à ne pas conserver des animaux ayant atteint ces points limites. La liste de ces points limites pourra être réajustée après les procédures de caractérisation des modèles et afin d’éviter toute souffrance non nécessaire à l’établissement des résultats. Les procédures se feront avec un hébergement adapté au bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, tunnel ou igloo et éléments de nidification). Au cours des procédures, nous appliquerons pendant les périodes qui suivent les prélèvements sanguins, un apport d’aliment gélifié enrichi qui favorise la récupération des animaux suite à l’anesthésie. L’insuffisance hépatique qui conduit à l’encéphalopathie étant une pathologie multi-organe, l’étude de la maladie requiert l’utilisation d’animaux et ne peut être remplacée par des expérience in vitro.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce Rat a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Pour les études menées sur les rats avec une présensibilisation au phénobarbital, nous utiliserons des animaux de 4 semaines à l'arrivée (75-100 gr) âge préconisé dans: "Phenobarbitone induced enlargement of the liver : its relationship to carbon tetrachloride induced cirrhossis -Br. J.Exp.Pathol. 1981 Jun;62(3):283-8 », c’est en effet lorsque les rats ont atteint un poids de 100gfr environ que le ratio du poids du foie et le plus favorable, de même que l’expression du cytochrome P450 qui est plus stable.
Caractérisation du rôle du tronc cérébral dans le signal « glucose-portal »
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées à l'issue pour que leur cerveau, leur foie et leurs tissus gras soient prélevés, 56 souris vont être utilisées dans des procédures dont 40 impliquent un niveau de souffrance sévère, 8 un niveau modéré et 8 se déroulent sous anesthésie sans réveil. Quarante d'entre elles subissent une injection dans le cerveau sous anesthésie, puis quinze jours plus tard la pose d'un cathéter dans la veine porte, avant une perfusion de 24 heures. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent provoquer de la douleur, une hémorragie locale, des troubles neuro-musculaires et des difficultés respiratoires sous anesthésie gazeuse. Il précise que les souris utilisées pour la mise au point sont des animaux de réforme, de toute façon mis à mort en dehors du projet, et affirme que comprendre le dialogue entre l'intestin et le cerveau impose de travailler sur l'"organisme entier".
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de la glycémie, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de sucre (glucose) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. L’intestin est en effet capable de produire du glucose en dehors des repas dans une veine spécifique (veine porte), située entre l’intestin et le foie. La détection de glucose dans cette veine après un repas induit un signal nerveux qui cible le cerveau, et qui en retour, va diminuer la taille du repas suivant. Ainsi, lorsque nous imitons la production de sucre par l’intestin en perfusant du glucose directement dans la veine porte, nous observons une diminution de la prise alimentaire associée à une activation de 3 régions du cerveau, connues pour contrôler la faim. Cependant, les études réalisées jusqu’alors ne permettent pas de déterminer si l’activation de chacun de ces 3 noyaux est nécessaire ou si elle est redondante pour les effets coupe-faim de la production intestinale de glucose. Un des noyaux impliqué dans ces effets coupe faim, le noyau du tractus solitaire (ou NTS), est un centre important d’intégration des signaux provenant du système digestif et est connu pour moduler la prise alimentaire. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer si l’activation de ce noyau est nécessaire à la mise en place de l’effet coupe-faim induit par la production intestinale de glucose. Pour cela, nous étudierons, sur une durée d’un an, si l’inactivation de ce noyau cérébral spécifique (par l’injection d’un virus directement dans le cerveau) annule les effets coupe-faim de la détection de glucose dans la veine porte.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets anti-diabète et anti-obésité ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier précisément quelles régions du cerveau sont indispensables à ces effets bénéfiques. Ils s’intègrent dans une étude plus globale qui cherche à comprendre comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. A plus long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre l’obésité et ses complications.
Procédures
A l’âge de 12 semaines, certaines souris subiront : - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris et sans réveil (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris avec un suivi post-opératoire de deux semaines (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris, puis 15 jours après, une chirurgie sous anesthésie générale permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte d’une durée de 20 minutes/ souris (40 souris). Une semaine après, ces souris subiront une infusion (via le cathéter installé) d’une solution contrôle (20 souris) ou une solution de glucose (sucre) (20 souris) pendant 24h.
Impact sur les animaux
- Les interventions chirurgicales sont susceptibles de provoquer de la douleur. - L’injection du virus peut entrainer une faible réponse immunitaire localisée. - La chirurgie réalisée dans le cerveau peut entrainer des problèmes neuro-musculaires. - Au cours de la chirurgie, l’anesthésie gazeuse peut entrainer des difficultés respiratoires. - La chirurgie peut entrainer une hémorragie locale. - L’injection peut entrainer une légère douleur au niveau de l’abdomen ainsi qu’un stress. Une attention particulière sera portée lors de l’injection pour éviter au maximum toute inflammation du péritoine. Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de raffinements spécifiques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes et analyses des tissus. Le cerveau, le foie et les tissus gras seront étudiés pour déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques de la détection de glucose dans la veine porte préalablement observé sur ces tissus.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la détection du glucose dans la veine porte a des impacts sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-diabète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.
Réduction
La totalité des animaux utilisés dans la procédure de mise au point sont des animaux de réforme, systématiquement mis à mort en dehors de ce projet. Ainsi, l’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux spécifiquement pour cette expérience. Le nombre de souris utilisées pour l’expérience propre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept : Soit au maximum 10 souris par groupe. De plus, différents tissus (cerveau, foie, reins, tissus adipeux, pancréas, …) seront prélevés afin de déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques à court terme induit par le signal glucose portal dans ces tissus. Ces tissus pourront constituer une banque de tissus commune au laboratoire pouvant être utilisés par la suite pour d’autres problématiques relatives à la production intestinale de glucose, notamment en évaluant la stéatose hépatique et le brunissement du tissu adipeux.
Raffinement
Les souris seront accueillies à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Les souris seront hébergées en animalerie conventionnelle avec eau et nourriture ad libitum avec enrichissement. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisées et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Afin de limiter au maximum le risque d’hypothermie pendant la chirurgie, un module permettant de chauffer la boîte à induction de notre appareil à isoflurane va être ajouté. De plus, tout le suivi post-opératoire se fera dans une pièce dont la température sera réglée à 28°C afin de garder les souris à thermoneutralité. La mise en place de ces raffinements nous a permis d’observer une meilleure reprise de poids post-opératoire. Après les chirurgies, un suivi intensif est régulier sera réalisé tous les jours tout au long de l’expérience pour identifier et réduire d’éventuelles souffrances selon une grille de score spécifique. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points particuliers limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort.
Choix des espèces
Le rôle de l’intestin, organe capable de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kit biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, entre 12 et 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.
Maintenance et reparation de la myéline centrale: role d’ADAM10
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 402 souris vont être utilisées dans des procédures allant de la souffrance légère à sévère, toutes tuées au plus tard deux mois après la chirurgie pour prélever leurs tissus. Chacune subit un prélèvement à la queue entre le septième et le dixième jour de vie, un traitement pharmacologique, des tests de mémorisation et de locomotion de dix minutes, et pour une partie d'entre elles une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie destinée à provoquer une lésion de la myéline. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes. Le porteur chiffre le lot expérimental entre 1 152 et 2 304 souris, sans expliquer d'où viennent les 5 402 déclarées.
Objectifs
La myéline est une substance qui entoure le prolongement des neurones et qui est responsable de la conduction nerveuse et donc de la transmission des commandes initiées par le système nerveux. La myéline est produite par des cellules appelées oligodendrocytes, localisés dans le cerveau et la moelle épinière. La perte de myéline ou d’oligodendrocytes peut survenir dans le cas de pathologies appelées maladies démyélinisantes (telle que la sclérose en plaques) ou lors de traumatismes (par ex. accidents de la route), et peuvent mener à de lourds handicaps. La formation de la myéline (myélinisation) et sa réparation (remyélinisation) sont des processus complexes qui font intervenir de nombreux mécanismes dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est de comprendre l’implication d’une protéine particulière en recherchant (1) son rôle dans la maintenance des gaines autour des prolongements neuronaux et (2) son rôle dans la réparation de la myéline chez la souris en mimant une lésion par perte myélinique. Ce projet s’appuie sur des études précédentes montrant que l’activation de ce type de molécule est capable de protéger la myéline. Pour étudier l’implication de cette protéine uniquement dans les oligodendrocytes, nous caractériserons les individus d’un point de vue macroscopique (locomotion, cognition) mais aussi microscopique (état des tissus, organes, cellules). Le projet proposé nous permettra de mieux comprendre le rôle de notre protéine dans ces maladies démyélinisantes et son potentiel régénératif. Ce projet permettra d’ouvrir la voie à de nouvelles pistes thérapeutique pour les maladies démyélinisantes, pour lesquelles il n’existe actuellement pas de traitements efficaces chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Par ce projet, nous espérons faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes.
Procédures
- Un prélèvement à la queue sera réalisé à l’âge de P7-10 sur l’ensemble des souris afin de vérifier leur génotype (lien de leur parenté). - Les souris seront traitées par un composé pharmacologique afin de pouvoir étudier notre protéine d’intérêt dans le processus de réparation du système neveux. - Les souris réaliseront des expériences de comportement afin de vérifier leur capacités cognitives et motrices (mémorisation, locomotion). Ces expériences sont non-invasives et non douloureuses. Elles se feront sur animal vigile et dureront chacune maximum 10 min. - Une chirurgie sera réalisée sur des souris sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. L’ensemble des animaux sera mis à mort, 2 mois maximum après la chirurgie afin de récupérer les tissus d’intérêt pour les analyser.
Impact sur les animaux
- Stress de contention dû à la préhension de l’animal lors du traitement - Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie – Troubles moteurs suite à la chirurgie (de la nourriture humide sera placée dans la cage pour éviter les déplacements de l’animal).
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue des expérimentations de chaque procédure afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
Le modèle animal que nous utilisons permet de mimer certains aspects des pathologies que nous étudions (telle que la sclérose en plaques), et pour lesquelles il n’existe pas de traitement. Ce modèle est donc nécessaire pour mieux comprendre ces maladies. Les processus de myélinisation et de réparation de la myéline impliqués dans les maladies démyélinisantes que nous étudions induisent des processus biologiques et physiologiques complexes qui nécessitent l’intervention de multiples acteurs cellulaires. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet. Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer l’inflammation et la démyélinisation, ainsi que la récupération fonctionnelle de l’animal.
Réduction
Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique suffisante nécessaire à l’interprétation des résultats. Ce nombre a été évalué́ à partir d’études précédentes (les expériences histologiques et biochimiques nécessitent au moins 6 animaux et les expériences comportementales en nécessitent au moins 10). Ces précautions permettent de limiter les variations inter-individuelles et d’aboutir à des conclusions rigoureuses. Les animaux issus des études comportementales seront ensuite utilisés pour les études des tissus prélevés, nous évitant ainsi d’avoir recours à de nouveaux lots de souris dédiés à cette analyse. De plus, plusieurs tissus d’intérêt seront prélevés sur chaque souris, permettant encore de réduire le nombre d’animal utilisé. Dans le cas où nos premiers résultats ne montreraient pas d’effet d’OLA10 dans la réparation de la myéline, la procédure serait abandonnée. Nous envisageons donc de commencer par des expériences pilotes avec un nombre réduit de souris. Si les résultats sont concluants, les données seront complétées et approfondies en utilisant la totalité des groupes expérimentaux prévus. Ainsi, le lot expérimental serait constitué d’un minimum de 1152 souris, et d’un maximum de 2304. Les animaux contrôles utilisés dans nos procédures sont indispensables pour établir des comparaisons fiables et tirer des conclusions précises. Ces animaux nous permettront de contrôler les variables externes, d’éliminer les biais et de mesurer les effets de nos traitements en les comparant aux groupes expérimentaux. Ils renforcent ainsi la validité de nos conclusions.
Raffinement
Un suivi particulier du bien-être des animaux soumis à la chirurgie sera mis en place et une prise en charge de la douleur sera utilisée si nécessaire. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique post-chirurgical et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà̀ du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité́, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisément d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec l’Homme, en particulier au niveau génétique et neurologique. Elles constituent des modèles de choix pour (1) étudier les mécanismes des pathologies neurologiques humaines et (2) explorer des traitements potentiels de manière pertinente pour ces maladies. Les souris sont des organismes modèle bien établis en recherche biomédicale, et offrent une capacité élevée de reproduction et de cohérence dans les résultats expérimentaux, permettant des interprétations fiables et de tirer des conclusions robustes. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de notre molécule d’intérêt et l’état de la myéline (affectée dans la pathologie étudiée) sont très bien adaptées chez la souris. Les animaux sont utilisés à l’âge d’au moins 7 semaines car il est connu que le processus de myélinisation est terminé à cet âge, ce qui nous permet d’étudier la maintenance de la myéline une fois les gaines achevées autour des prolongements de neurones. De plus, la perte de myéline survient principalement chez le jeune adulte, que ce soit lors de maladies démyélinisantes telle que la sclérose en plaques, ou lors de traumatismes mécaniques type accident de la voie publique. L’âge choisi pour notre modèle permettra donc de mimer au mieux les lésions médullaires survenant chez l’Homme et d’en étudier le processus de réparation. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de ce modèle animal, et ce à l’âge choisi.
Etude de la mitophagie dans un modèle murin de SLA/DFT
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Baguées à l'oreille et biopsiées à la queue dès le plus jeune âge, 1 122 souris porteuses d'une mutation de sclérose latérale amyotrophique avec démence frontotemporale sont ensuite laissées vieillir sans autre intervention, dans des procédures allant de la souffrance légère à sévère. Leur prise de poids décroche dès trois mois. Entre dix et quatorze mois apparaissent la perte de poids, la baisse de mobilité et les tremblements, jusqu'au stade que le porteur retient comme final. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, le seuil déclenchant la mise à mort étant une perte de poids supérieure à 15 % ou l'incapacité à se retourner sur soi en moins de quinze secondes.
Objectifs
La maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique) et la démence frontotemporale sont des maladies neurodégénératives conduisant à la mort des motoneurones (= neurones situés dans la moelle épinière, innervant et commandant les fibres musculaires). Ces deux pathologies présentent un spectre clinique commun, 50% des patients atteints de sclérose latérale amyotrophique développent une démence frontotemporale, 15% des patients atteints de démence frontotemporale présentent des signes de sclérose latérale amyotrophique. Précédemment, une mutation sur le gène d'une protéine de la mitochondrie (= petit organite qui a un rôle essentiel dans les processus énergétiques cellulaires) a été identifiée chez des patients souffrant d'une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale. Parmi tous les facteurs impliqués dans le processus conduisant à la sclérose latérale amyotrophique, un dysfonctionnement des mitochondries a toujours été envisagé comme un acteur majeur de cette pathologie. Mais, l'identification d'une mutation dans un gène codant pour une protéine de la mitochondrie fut la 1ère preuve génétique démontrant le rôle primaire des mitochondries dans des atteintes du motoneurone. L'objectif général de notre projet de recherche est de comprendre comment la mutation de ce gène codant pour une protéine de la mitochondrie conduit à la mort des motoneurones. Pour cela, nous devons caractériser la séquence des évènements reliant l'atteinte des mitochondries à la mort des motoneurones. L'étude du modèle murin présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale suggérait une implication du processus de mitophagie (processus de mort permettant l'élimination des mitochondries anormales) dans différents organes. Ces souris ont été croisées avec des souris permettant de quantifier la mitophagie (la mitophagie est visualisée sous forme de points rouges en microscopie). Nous avons ainsi pu observer une augmentation de la mitophagie dans différents organes chez ces souris comparées à leurs souris contrôles. La poursuite de ce projet aura pour objectifs de 1/ caractériser le rôle de la mitophagie dans l'atteinte du motoneurone et 2/ établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans la séquence des évènements conduisant à la mort des motoneurones.
Bénéfices attendus
Actuellement, la maladie de Charcot et la démence frontotemporale ne présentent pas d'option thérapeutique, il est donc important de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail permettra de déterminer si le ciblage du processus de mitophagie peut être une piste thérapeutique intéressante dans le traitement des atteintes du motoneurone associées à un dysfonctionnement mitochondrial.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, l'identification des animaux nécessitera la pose d'une bague à l'oreille et d'une biopsie au niveau de la queue ou de l'oreille. Pour les procédures 1 et 2, les animaux seront élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement et ne seront soumis à aucune autre intervention avant la mise à mort des animaux. Pour la procédure 3 (240 animaux), les animaux seront également élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement. Au moment de la mise à mort des animaux, une injection intrapéritonéale d'une solution analgésique sera effectuée, suivie 15 minutes plus tard d'une deuxième injection intrapéritonéale d'une solution anesthésique. Deux injections en intrapéritonéales seront donc réalisées pendant la durée de vie de la souris.
Impact sur les animaux
Les souris présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale présenteront un phénotype dommageable conduisant à la mort des animaux. Les animaux présenteront : - une prise de poids diminée par rapport aux souris contrôles dès l'âge de 3 mois, - une diminution du poids et/ou une diminution de la mobilité des animaux et/ou la présence de tremblements à un stade plus avancé de la vie de l'animal (autour de 10 à 14 mois). L'identification des animaux (pose d'une bague et biopsie) entrainera une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Les animaux étudiés présentent un phénotype de maladie neurodégénérative (sclérose latérale amyotrophique et démence frontotemporale) nécessitant la mise à mort des animaux afin de prélever les organes pour les analyser.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des expériences in vitro ont été réalisées précédemment sur des cellules en culture à partir de fibroblastes primaires issus des patients porteurs de la mutation d'intérêt et à partir de motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites exprimant la mutation d'intérêt. Des expériences sur les motoneurones continueront à être menées. Néanmoins, bien que ces modèles cellulaires issus des patients présentent un potentiel important pour rempacer et réduire l'utilisation de l'animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l'ensemble de l'organisme. La sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant une pathologie touchant plusieurs organes, seul un modèle animal permettra d'étudier les conséquences multiples du processus de mitophagie dans les différents organes et surtout d'établir une cinétique (à des âges différents) permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones.
Réduction
Dans un but de réduction, nous utiliserons des modèles cellulaires (notamment des motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites) pour étudier le rôle de la mitophagie dans la mort des motoneurones. Ces expériences nous permettront de répondre à certaines questions scientifiques et ainsi de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d'utiliser le minimum d'animaux nécessaires à ce projet. Afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs, nous aurons besoin de 15 animaux par expérience et par génotype.
Raffinement
Dans un but de raffinement, un suivi hebdomadaire du poids sera réalisé et une fiche de score sera utilisée pour assurer un suivi optimal de chaque animal. Cette fiche de score a été établit en lien avec le phénotype attendu de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et a été précédemment utilisée pour le suivi de ces souris. Les animaux seront observés hebdomadairement, ce qui permettra d'identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Le phénotype de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant associé à une perte de poids, les animaux seront pesés une fois par semaine. Lorsqu'une perte de poids sera observée, une surveillance accrue de l'animal sera réalisée (2 fois par semaine ou tous les jours suivant le pourcentage de perte de poids), de l'eau et de la nourriture gélifiée seront également ajoutés dans la cage. Lors de cette surveillance hebdomadaire, une attention particulière sera portée sur la mobilité (affaiblissement des membres inférieurs ou tremblements) et sur le comportement des animaux. L'environnement de l'animal sera enrichi par ajout d'un igloo en papier mâché et de carrés de ouate ou de tissu compressé (pour permettre à l'animal de se faire un nid à l'abri de la lumière), ainsi que de batonnets en bois (pour permettre à l'animal de ronger) dans chaque cage.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) présente des similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, permettant dans la mesure du possible d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. De plus, elle présente un cycle de vie court et un cycle de reproduction avec une natalité importante. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour réaliser les analyses protéique, génomique et histologique nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, les modèles murins utilisés sont des modèles spécifiques déjà établis et caractérisés (modèle de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et modèle permettant de quantifier la mitophagie in vivo). Aucun autre modèle ne peut donc être utilisé. Les animaux seront utilisés à 4 stades de développement : - stade correspondant à l'atteinte finale de la maladie (= soit perte de poids supérieure à 15% par rapport à la pesée précédent la 1ère diminution de poids, soit un affaiblissement partiel de l'extension des pattes ou tremblements, associé à une incapacité pour la souris de se retourner sur elle-même lorsqu'elle est sur le flanc en moins de 15 secondes) - stade d'apparition des 1ers signes cliniques = 3 mois de vie - stade intermédiaire = 6 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones) - stade intermédiaire = 9 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones)
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes BRGS dans le but d’étudier le développement des lymphocytes B
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Dépourvues de lymphocytes T, de lymphocytes B et de cellules NK par construction génétique, donc incapables de combattre le moindre pathogène, une partie des 540 souris du projet vit en confinement sanitaire strict. Toutes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une irradiation qui détruit leurs cellules souches sanguines, une greffe de cellules par injection dans la queue préalablement chauffée, puis un prélèvement sanguin toutes les quatre semaines, l'irradiation à forte dose pouvant provoquer perte de poids, léthargie et dos courbé faute de reprise de l'hématopoïèse. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever la rate, les ganglions et les autres organes de l'immunité, exploration que le porteur juge "indispensable" pour conclure sur la reconstitution immunitaire.
Objectifs
Le but de ce projet est double. Tout d'abord un objectif fondamental qui sera d'évaluer le rôle de différentes mutations dans le développement et la maturation des lymphocytes B, qui sont les cellules productrices des anticorps. Pour cela, nous allons induire in vitro des mutations précises sur des cellules souches hématopoïétiques murines et injecter ces cellules mutées à des souris receveuses n'ayant plus de cellules souches hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques ayant la capacité de reconstituer tous les composants du système hématopoïétique et immunologique, nous pourrons alors suivre dans les souris l'effet des mutations sur le comportement des lymphocytes B. L'objectif étant de repérer les mutations impliquées dans l'hyperprolifération des lymphocytes B, afin de mieux comprendre les mécanismes ayant lieu dans les lymphomes. Ensuite un objectif plus translationnel avec la mise au point d’une stratégie permettant de faire produire aux lymphocytes B un anticorps choisi, ciblant spécifiquement une protéine exprimée par les cellules tumorales. Ce système permettra alors d’induire une réponse immunitaire spécifique contre les tumeurs. Nous allons donc modifier génétiquement les lymphocytes B ou les cellules souches hématopoïétiques humaines puis injecter ces cellules à des souris immunodéficientes, souris qui ne pourront pas rejeter les cellules humaines. Nous quantifierons alors la production des anticorps dans les souris et implanteront les tumeurs spécifiques des anticorps induits pour évaluer leur capacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Concernant le projet sur les cellules souches hématopoïétiques murines, de nombreux résultats seront attendus sur le rôle des différentes mutations induisant des syndromes lymphoprolifératifs (prolifération excessive des lymphocytes), ceci permettant une meilleure compréhension de la physiologie des lymphomes. Pour le projet sur la production d'anticorps humains, nous testons la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B des anticorps thérapeutiques. Ce projet pourra ensuite être valorisé et potentiellement ouvrir une autre voie dans les traitements d'immunothérapie.
Procédures
Les cellules souches hématopoïétiques murines mutées seront greffées dans des souris ayant reçues une forte dose d'irradiation, ceci afin d'éliminer toutes les cellules souches hématopoïétiques présentes et permettre uniquement à celles injectées de se développer. Dans le cas de la greffe des cellules humaines, l’irradiation sera plus légère car il faut garder des cellules souches hématopoïétiques murines mais juste faire de la place pour les cellules humaines. La greffe des cellules se fera ensuite par injection intraveineuse dans la veine de la queue. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 4 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution immunologique au cours du temps. Enfin des immunisations pourront être appliquées sur les animaux en post-greffe si la reconstitution a été jugé optimale.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection intraveineuse des cellules dans la veine de la queue. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention afin de chauffer leur queue avant l'injection. Un léger inconfort pourra être ressenti à cause de la chaleur et une douleur pourra être ressentie lors de la piqure dans la queue au moment de l'injection. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire afin de repérer tout signe indiquant un inconfort ou une douleur. Des nuisances plus importantes viendront de l'irradiation à forte dose. Le développement d'une immunodépression complète induite par l'irradiation à forte dose peut engendrer un affaiblissement notable de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter une potentielle absence de reprise de l'hématopoïèse (qui devrait être obtenues suite à la greffe des cellules souches hématopoïétiques murines) avec l'apparition de signes de l'immunodépression (perte de poids, léthargie, dos courbé...). L'irradiation à faible dose ne provoque en général aucune nuisance.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution hématopoïètique et immunologique ainsi que sur développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Ces dernières sont en effet capables de se différencier en de nombreux précurseurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse. Ces précurseurs vont ensuite continuer de se différencier soit dans la moelle osseuse soit dans d’autre organes du système immunitaire et ainsi reconstituer un système immunitaire entier et compétent. Il est actuellement possible de différencier des CSH in vitro mais uniquement vers une voie donnée, ce qui permet d’obtenir qu’un type de cellules immunitaires. Aucun modèle ne permet une différenciation complète des CSH. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes ou de souris immunocompétentes irradiées à forte dose reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes de cellules, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux (posture et comportement) par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon les mêmes critères généraux cités précédemment en plus de critères spécifiques: suivi du poids et mesure du score grimace permettant d’évaluer l’état de santé des animaux. Le « score de grimace » correspond a une échelle permettant d’évaluer la douleur chez l’animal, en particulier chez la souris. Si ce score excède 1.5 sur 2, les animaux seront alors euthanasiés. Également si la perte de poids excède 20% du poids de référence alors les animaux seront alors euthanasiés. Si des effets secondaires ou signes d'inconfort non soulagés par l’administration d'analgésiques ainsi que des changements perceptibles (aspect, comportement, poids, isolement dans la cage, déplacements limités) sont observés, les animaux seront alors euthanasiés.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes choisies pour le projet des cellules humaines sont complètement dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK, ce qui permet donc d'éviter le rejet de la xénogreffe de cellules humaines. Ces souris permettent la croissance de nombreuse lignées lymphoïdes humaines et l'utilisation d'effecteurs d'origine humaine. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé́ de prise de xénogreffes. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de l’expression d’un phénotype dommageable car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Le maintien de ces souris en hébergement protégé de type A2 permettra de prévenir tout risque d’infection. Les utilisateurs se muniront d'une combinaison recouvrant tout le corps ainsi que d'un masque chirurgical et d'une 2eme pair de gant. Enfin, les souris seront manipulées sous hotte à flux laminaire. L’expérimentation sera commencée chez des animaux de 5 semaines à 3 mois. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 6 mois.
Evaluation de prothèses vasculaires chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Les rats dont le pontage se bouche sont tués dès le premier ou le septième jour, les autres au quatorzième. 27 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélever la prothèse et l'analyser. Chacun subit une chirurgie abdominale de quarante à soixante minutes au cours de laquelle un segment de son aorte est remplacé par une prothèse synthétique, avec un risque de paralysie des pattes arrière si la circulation reste interrompue trop longtemps. Le porteur présente l'essai comme une preuve de concept pour la "chirurgie en situation de catastrophe", préalable à une étude de confirmation sur "gros animal".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires, notamment les pathologies touchant les vaisseaux sanguins, demeurent encore aujourd’hui un problème majeur de santé publique. Malgré le développement de nouvelles techniques chirurgicales et peu invasives, la réparation des artères pose encore problème. Il existe une importante demande clinique en nouvelles prothèses vasculaires synthétiques et durables. Les prothèses synthétiques sont performantes pour la réparation des artères de moyen et gros diamètres, mais donnent des résultats médiocres lorsqu'il s'agit de réparer des artères de petit diamètre (< 6 mm). L’objectif de cette étude est d'évaluer des biomatériaux comme prothèses vasculaires pour le remplacement de vaisseaux malades ou blessés de petit diamètre. La prothèse vasculaire doit supporter la chirurgie ainsi que la pression du sang qui s’exerce sur la paroi. Les propriétés mécaniques de la prothèse doivent être proches de celles du vaisseau receveur afin de limiter les perturbations dues à la circulation du sang. Nous souhaitons déterminer le devenir de ces prothèses dans un modèle de remplacement vasculaire chez le rat, au cours du temps : vérifier l’intégration, la dégradation et la colonisation par les cellules du receveur. L’intervention sur des rats sera réalisée sous anesthésie. Un segment de l'aorte sera alors remplacé par une prothèse vasculaire. Nous allons suivre la circulation du sang dans les prothèses (vérifier que les prothèses ne sont pas bouchées) à 1 jour, 7 jours et 14 jours après implantation, par imagerie.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de montrer que l’utilisation qu’une de nos formulations de substitut vasculaire est acceptable en termes de circulation du sang sur 14 jours, en regard des solutions actuelles insatisfaisantes, en particulier pour la chirurgie en situation de catastrophe. Cette preuve de concept sera un préalable à une étude de confirmation sur gros animal.
Procédures
Sur 6 rats de chaque groupe testé (soit 27 rats en tout pour 4 formulations testées), une chirurgie abdominale sera réalisée. Le temps de chirurgie est estimé à 40-60 min par animal. A cela, ajoutera le temps d’anesthésie et de réveil de l’animal (variable selon les individus). Les rats seront l’objet de 4 injections en tout de buprénorphine : pré/post op (J0 et J1) et euthanasie, par un geste de quelques secondes réalisé par un technicien compétent. Un suivi par imagerie de la circulation du sang sera réalisé à J1, J7 et J14: cet examen n'est pas douloureux en soi et dure 40 à 60 minutes.
Impact sur les animaux
L’expérimentation implique la réalisation d’une chirurgie abdominale et l’exposition de l’aorte. Les conséquences de la chirurgie peuvent être une paralysie des pattes arrière si l’arrêt de ma circulation sanguine est prolongé.
Devenir
Les rats seront euthanasiés après 14 jours d’implantation, ou plus tôt à J1 ou J7 si au moment du contrôle par imagerie, le pontage s’avère bouché. Les pontages seront prélevés pour analyse histologique
Remplacement
Devant la complexité de la formation des bouchons sanguins, l'évaluation de la circulation du sang dans les prothèses ne peut s’apprécier que sur modèle animal. Actuellement aucun autre modèle ne peut simuler cet évènement.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à utiliser a été déterminer d’après un test statistique prenant en compte la variabilité biologique entre individus et les risques dus à la chirurgie. Un nombre de 6 animaux par groupe est nécessaire pour assurer des résultats statistiquement pertinents. Ne seront implantées que les prothèses qui répondent aux bonnes propriétés mécaniques (supporter une pression, résister à la suture ...) après des tests en laboratoire. Au total, 27 prothèses seront implantées (soit 1 par animal).
Raffinement
Les rats seront hébergés dans une animalerie conventionnée, avec eau et alimentation ad libitum, dans des conditions de température et d’hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. Les animaux seront hébergés en cage collective, dans un milieu enrichi avec des maisonnettes, de la paille, du coton et des bois à ronger. Différents enrichissements seront proposés en alternance pour introduire de la nouveauté. L’acquisition des images n’étant pas douloureuse, l’animal est maintenu sous anesthésie gazeuse légère uniquement pour limiter ses mouvements et son stress. Après l'intervention chirurgicale, les animaux sont surveillés jusqu’à la phase de réveil puis tous les jours par du personnel bien formé. Une injection sous cutanée d'un analgésique sera réalisée pour réduire la douleur. Une grille d’évaluation de la douleur (points limites sont stricts, adaptés et précoces), tout au long de l'étude, a été mise en place et si l’animal atteint un certain score, il recevra une injection sous cutanée d'un analgésique, au-delà, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de tester de nouvelles prothèses vasculaire pour le remplacement vasculaire. Les prothèses sont de petit calibre inférieur à 6mm de diamètre, ce qui correspond à la taille de l'aorte abdominale chez le rat Wistar adulte (1.5-2mm de diamètre). Les animaux seront des rats Wistar adulte (au moins 400 gr) afin d’avoir des animaux de bonne taille et poids pour le remplacement vasculaire.
Sensibilité ghréline chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
652 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever tissus et sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Cent douze d'entre eux subissent une immobilisation forcée quatre heures par jour pendant six jours consécutifs pour reproduire un syndrome dépressif, cent douze autres reçoivent des injections répétées d'une substance psychoactive pour reproduire une addiction, quatre cent quarante-huit sont saignés à l'état vigile et quatre-vingts passent sur la table d'opération. Le porteur qualifie le modèle animal d'"incontournable" pour étudier l'exposome, au motif que le comportement et la physiologie intégrée ne s'observent pas in vitro. Le bénéfice avancé se limite à la possibilité de proposer un jour une stratégie thérapeutique agissant sur la ghréline.
Objectifs
La ghréline est une hormone produite par l’estomac capable d’influencer notre métabolisme ou le fonctionnement de notre cerveau. En particulier, cette hormone semble jouer un rôle prépondérant suite à l’expositions chronique à différents types de stress de notre environnement (stress, physiques, sociaux, chimiques ou nutritionnels), notre « exposome ». Or l’exposome est connu pour favoriser le développement de nombreuses maladies communes de cerveau ou du métabolisme. Ainsi, modifier génétiquement les effets de la ghréline chez l’animal pourrait être un moyen de tester la vulnérabilité des animaux à différents types de stress chroniques. Notre stratégie qui s’appuie sur des approches génétiques et pharmacologiques vise à raffiner les connaissances sur les moyens de moduler les effets de la ghréline sur le cerveau et à tester les liens entre effets ghréline et vulnérabilité de l’organisme à différents types d’exposomes.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de clarifier les mécanismes mis en jeu par une hormone, la ghréline, au cours de l’exposition d’un organisme à différents types de stress chroniques. Enfin, ce travail pourrait permettre de proposer une stratégie thérapeutique pour moduler les effets de la ghréline au bénéfice de la santé mentale.
Procédures
80 rats auront une procédure chirurgicale de 20-30 mins sous une anesthésie générale de 45 mins. 448 rats recevront des prélèvements de sang à l’état vigile. 112 rats seront soumis à un protocole de d’injections répétées par substance psychoactive (4 injections sur 8 jours). 112 rats seront soumis à un protocole de stress répété (4h par jour pendant 6 jours consécutifs). Enfin 320 rats recevront des injections répétées d’analogues de la ghréline sur deux semaines et 108 rats recevront des injections répétées pour évaluer leur homéostasie glucidique.
Impact sur les animaux
Tous les rats de l’étude subiront l’inconfort et des douleurs légères liés à des injections et des prélèvements de gouttes de sang. De plus, un groupe de rats sera soumis à une approche chirurgicale, les possibles douleurs post-opératoires seront pris en charge par un protocole adapté : injections d'anti-inflammatoire et une récupération post-chirurgicale sous surveillance pour détecter toute perte de poids ou d'autres problèmes de santé ou de bien-être. Un groupe de rats développera une souffrance psychique suite à l’injection répétée d’une substance psychoactive pour mimer une addiction. Enfin, un dernier groupe de rats subira un stress d’immobilisation forcée répété plusieurs jours pour mimer un syndrome dépressif.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l’issue des procédures pour des prélèvements de tissus et de sang pour mener des études moléculaires et hormonales.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, qui vise à modéliser l’émergence de pathologies humaines en lien avec l’Exposome, l’usage d’un modèle animal est incontournable. En effet, ce type de projet ne peut en aucun cas être remplacé par des expériences in vitro puisque nous avons besoin d’examiner des paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. A cet égard, l’allèle muté utilisé chez le rat remplit tout les critères requis pour le projet.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Lorsque cela a été possible, des protocoles croisés d’injections de composés/doses ou des injections séquentielles ont été prévus, ce qui a permis de réduire considérablement le nombre d’animaux requis. Enfin, nos résultats non publiés décrivent des réponses ghréline exagérées chez les rats mutants des deux sexes. En conséquence, les groupes expérimentaux de notre projet comportent des lots d’expérimentaux d’effectifs plus petits car composés de rats des deux sexes.
Raffinement
Notre projet d’étude porte sur la vulnérabilité aux stress environnementaux de tout type à travers le prisme de la signalisation ghréline. En conséquence le soin apporté aux animaux, requis éthiquement l’est également au plan scientifique. En conséquence, le bien être animal de l’élevage à la constitution des lots expérimentaux jusqu’à l’exécution des protocoles expérimentaux est déterminant. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par un tunnel et la vie en communauté. Le contrôle de l’approvisionnement en eau et nourriture et assuré par les zootechniciens agréés. Lorsque le protocole expérimental est lancé, l’équipe de recherche prend le relais et le suivi de chaque rat se fait plus intense selon le protocole (manipulation régulières, suivi du poids corporel) qui permettent d’individualiser le suivi de chaque animal tout au long du protocole jusqu’à la mise à mort. Ainsi, toute altération de l’état d’un animal attendue (post-chirurgical) ou inopinée est prise en charge selon les point limites établis pour discriminer un évènement transitoire d’un évènement plus rare qui s’aggrave et qui conduira à une sortie du protocole et à l’euthanasie. Au total, ce type de suivi permet de combiner bien-être animal avec résultats scientifiques valides.
Choix des espèces
L’ensemble des procédures seront basées sur ce modèle unique de gain de fonction dans le récepteur ghréline chez le rat. Le rat possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’Homme. Il est idéal pour les études physiologiques du fait de sa volémie plus élevée que celle de la souris (prélèvement sanguins répétés). Enfin, le rat est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés et ainsi modéliser des maladies du cerveau. Les animaux utilisés seront des rats adolescents ou de jeunes adultes (6-10 semaines).
Etude de l’intérêt des implants en graphène dans l’amélioration du diagnostic des pathologies rétiniennes et en thérapeutique (restauration visuelle) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Neuf examens de la rétine, sept séances d'enregistrement d'une heure et jusqu'à quatre heures de stimulation électrique sous anesthésie : 500 rats vont être utilisés dans des procédures allant de la souffrance modérée à sévère, une partie opérée sans réveil, tous tués à l'issue pour des prélèvements post-mortem. Une partie reçoit une injection qui détruit leur rétine, d'autres portent une mutation qui les rend progressivement aveugles. La pose d'électrodes sous la rétine dure jusqu'à une heure trente, et le porteur décrit comme risques une inflammation persistante dans 5 % des cas, le décollement de la fenêtre crânienne, une hémorragie sous celle-ci ou l'arrachement du connecteur par l'animal. Le rat a été retenu parce que son œil est assez grand pour recevoir les implants, la souris ayant été écartée pour cette seule raison.
Objectifs
Les pathologies rétiniennes touchent chaque année 10 millions de personnes dans le monde. Les plus connues sont la rétinite pigmentaire (RP) et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) qui se caractérisent par la dégradation progressive des photorécepteurs et mènent irrémédiablement à la cécité. Afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints, il est essentiel de disposer d’outils performants pour les diagnostiquer le plus tôt possible et de développer des stratégies de restauration visuelle qui pallient les traitements médicamenteux actuels inefficaces. Divers types d’interfaces cerveau-machine ont été développés ces dernières années pour le diagnostic (enregistrement des signaux électrophysiologiques via des électrorétinogrammes) et pour la restauration visuelle (stimulation électrique des neurones résiduels). Le matériau des électrodes joue un rôle majeur dans les performances et la longévité de ces interfaces. Par exemple, les prothèses actuelles en tests cliniques ne permettent pas une résolution spatiale suffisante pour l’autonomie complète du patient aveugle. De même, les électrodes actuelles en or utilisées en diagnostic clinique ne fournissent pas une précision optimale pour la caractérisation des fonctions rétiniennes. Les matériaux carbonés possèdent de prometteuses propriétés électrochimiques qui permettraient une stimulation électrique plus efficace et/ou une restitution plus fidèle des signaux neuronaux rétiniens. L’objectif de ce projet est de démontrer la performance de ces nouveaux types d’implants, aussi bien dans la détection de signaux rétiniens anormaux (diagnostic) ou bien dans la stimulation électrique sous-rétinienne à la manière de photorécepteurs artificiels (thérapeutique). Cette étude sera menée sur deux modèles murins. Pour les implants en mode diagnostic, la validation fonctionnelle sera effectuée par enregistrements de l’activité de l’œil in vivo (électrorétinogrammes). En mode thérapie (restauration visuelle) la validation fonctionnelle sera réalisée par stimulation électrique de la prothèse et enregistrement simultanée des signaux corticaux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de démontrer la supériorité des matériaux carbonés incorporé dans des interfaces cerveau-machine en permettant un enregistrement d’électrorétinogrammes (ERG) de qualité plus fine ainsi qu’en apportant une stimulation électrique plus stable et plus performante dans le temps. Ces implants, biocompatibles et plus performants que les prothèses classiques métalliques, permettront la mise en place d’une nouvelle génération d’interfaces dans l’espoir d’une translation clinique chez l’humain pour le diagnostic précoce de pathologies liées à la dégénérescence de l’épithélium rétinien pigmentaire (RPE) et pour la restauration visuelle.
Procédures
Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : Injection d’un composé chimique induisant une dégénération de la rétine (5 min) : 1 fois par rat sous anesthésie générale et analgésie. Enregistrements des signaux rétiniens sur rats (1h) : 7 séances par animal sous anesthésie générale pour les rats normaux, et 5 fois par rat atteint de dégénérescence progressive de la rétine sous anesthésie générale (fixe) Examens de la rétine : - les rats normaux seront imagés un jour avant chaque session d’enregistrements rétiniens 7 fois sous anesthésie générale fixe, pendant 10 min. - les rats rat atteint de dégénérescence progressive de la rétine seront imagés 5 fois afin d’observer la dégénérescence sous anesthésie générale fixe, pendant 10 min. - Tous les rats avec des implants sous la rétine feront 9 examens de la rétine, le tout sous anesthésie générale fixe pendant 10 min. Chirurgie pour implantation sous la rétine d’électrodes : - rats normaux et aveugles, 1 fois par animal avec ou sans réveil pendant au maximum 1h30 sous anesthésie générale et sous analgésie Imagerie du cerveau et stimulation électrique de l’implant sous-rétinien sous anesthésie fixe - les rats avec un implant rétinien seront imagés et stimulés pendant 4h avec euthanasie à la fin de l’expérience. - autres rats avec un implants rétinien seront imagés sur 8 séances pendant 1h30. Mesures des propriétés électrochimiques l’implant : - les rats implantés avec un implant sous la rétine feront l’objet de mesures électrochimiques sur 9 séances, pendant 1h30/séance, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Durant les chirurgies une mauvaise réaction à l’anesthésie peut survenir tel que : stress thermique, détresse cardio-respiratoire, arrêt cardiorespiratoire (rare). Les anesthésies par injection intrapéritonéales répétés peuvent engendrer à terme une résistance à l’anesthésie. Pour les animaux implantés en sous-rétinien, une éventuelle inflammation au niveau du site d’implantation peut apparaître, se résorbant naturellement généralement sous 7 jours (95 pour cent des cas). Dans les cas où l’inflammation ne se résorbe pas (5 pour cent), le rat sera surveillé, re-imagé à 14 jours et gardé s’il ne montre pas de signes de douleur, détresse ou de problèmes oculaires (paupière gonflée, paupière fermée, cataracte). La pose d’implants chronique avec fenêtre/aminci cranial peut engendrer dans les 3 premiers jours post-chirurgie un stress physique et une perte de poids, en plus du stress social lié à son isolement en cage. Il existe également un risque que la fenêtre chronique se décolle, que les fils de suture sautent (auxquels cas ils doivent être immédiatement recousus), qu’il y ait une hémorragie sous la fenêtre, ou encore que l’animal arrache le connecteur.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure. En effet, des prélèvements et analyses complémentaires sont nécessaires post-mortem.
Remplacement
Dans ce projet, l’enregistrement des électrorétinogrammes ainsi que la transmission de l’information visuelle au cerveau suite à un stimulus électrique ne peuvent pas être réalisés par des expérimentations ex vivo. Le suivi des caractéristiques électrochimiques dans des conditions proches de l’humain n’a de sens qu’évalué in vivo chez le rongeur en pré-clinique. De même, les activations neuronales et variations de flux sanguin mesurées par les techniques d’imagerie par ultrasons au niveau du cortex visuel ne peuvent être observées que sur un cerveau en fonctionnement. L’utilisation du modèle animal est donc indispensable.
Réduction
Basé sur l’expertise du laboratoire, sur des projets proches, le nombre d’animaux a été estimé pour obtenir un nombre minimum de résultats significatifs tenant compte des éventuelles pertes dues à une mauvaise implantation, une mauvaise réaction à l’anesthésie, ou par atteinte des points limites durant les procédures expérimentales. La rédaction d’un protocole précis ainsi que la bonne maîtrise des outils de chirurgie et d’imagerie par les expérimentateurs correspondants permet de minimiser les pertes inutiles. Une analyse de puissance statistique a été faite et le nombre d’animaux utilisé par protocole expérimental a été estimé en vue d’atteindre un compromis entre une puissance élevée et un nombre d’animaux raisonnable. Ceci implique l’utilisation de 500 animaux au total.
Raffinement
Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum, et sont hébergés en binôme avant le début des expériences. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce utilisée. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Lors des différentes procédures, les animaux bénéficieront d’une anesthésie gazeuse ou fixe intrapéritonéale prodiguée par une seringue et une aiguille. Un analgésique, un anesthésiant local et un anti-inflammatoire seront administrés afin que l’animal sous anesthésie ne ressente aucune douleur pendant l’expérimentation. La douleur post-opératoire est gérée par l'administration d'analgésique jusqu’à 3 jours post-opération. Une signalétique spécifique mise en place permettra une surveillance quotidienne adaptée des animaux en expérimentation tout particulièrement pour les chirurgies. Tout signe d’inconfort ou de détresse sera pris en compte tels que l'apparence et la position anormale, dos courbé, position couchée sur le côté ; comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, réduction de la mobilité. Des points limites adaptés au projet ont été définis.
Choix des espèces
Les rats présentent une architecture de l’œil très proche de celui humain, une organisation de la rétine similaire. Nous utilisons généralement dans le cadre de nos études des rats normaux, dont la taille de l’œil est adaptée à celle des implants fabriqués. Un modèle plus petit tel que les souris n’aurait pas convenu, du fait du trop petit diamètre de l’œil comparé aux implants de diagnostic et de stimulation électrique. Leur rétine devient mature à partir de 8 semaines d’âge, aussi nous les utiliserons à partir de 9 semaines. Des rats de lignée transgénique modélisant la rétinite pigmentaire montre une dégénérescence des photorécepteurs au bout d’environ 9 mois. Nous les utiliserons à partir de cet âge là. Ce modèle génétiquement modifié n’est pas à phénotype dommageable. En effet, La mutation induite entraîne la dégradation progressive des photorécepteurs et donc une cécité progressive, mais pas de douleur, détresse ou souffrance supérieure à celle causée par l’introduction d’une aiguille. Nous utilisons également un autre un modèle de dégénérescence héréditaire de la rétine qui débute à partir de 3 semaines post-naissance. Les enregistrements classiques des signaux rétiniens à partir de 3 mois d’âge montrent un signal plat du fait de la dégénérescence totale. Nous les utiliserons à partir de 2 semaines d’âge jusqu’à 2 mois d’âge, afin de visualiser l’évolution des signaux rétiniens avec l’avancée de la pathologie.