Procédures sévères
Etude des structures lymphoïdes tertiaires dans un modèle spontané d’inflammation du côlon
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Pour savoir si des agrégats de cellules immunitaires aggravent l'inflammation du côlon et préparent un cancer colorectal, 499 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, 354 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 145 dans des procédures déclarées légères. Toutes sont tuées pour des analyses post-mortem. Leurs mutations déclenchent une entérocolite dès trois semaines d'âge, avec perte de poids et saignements dans les selles et par le rectum, et le suivi se poursuit jusqu'à seize semaines. Le porteur souligne qu'aucun geste technique n'est pratiqué dans cette première phase, et prévoit, si les souris résistent à la colite, de leur administrer un produit inflammatoire dans l'eau de boisson à doses progressivement augmentées.
Objectifs
De nombreux organes, notamment le côlon, sont peuplés d’une accumulation de cellules immunitaires, prêtes à initier une réponse immunitaire rapide et ciblée en cas d’infection: ce sont les organes lymphoïdes secondaires. Ces structures apparaissent durant les premiers stades de développement embryonnaire et deviennent complètement matures après la naissance. Dans un contexte inflammatoire chronique, les cellules du système immunitaire se réorganisent pour former des agrégats dans le tissu inflammé : ce sont les structures lymphoïdes tertiaires (SLT). Ces nouveaux organes lymphoïdes reproduisent la structure et la fonction des organes lymphoïdes secondaires classiquement observés dans les tissus. Or dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) comme la maladie de Crohn, la présence et la densité de ces structures n’est pas systématiquement corrélée avec un pronostic favorable. En effet, il a récemment été démontré que les lymphocytes B, cellules immunitaires majoritaires des SLT, peuvent faire obstacle à la réparation de la muqueuse intestinale en contexte inflammatoire. Notre projet vise à caractériser les structures lymphoïdes tertiaires (SLT) dans l’inflammation du côlon et en particulier, de déterminer si ces SLT participent activement à la progression de l’inflammation colique dans les MICI et, par la suite, dans le cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre à court terme d’étudier la formation et le rôle des structures lymphoïdes tertiaires dans l’inflammation du côlon. Il va ainsi permettre d’améliorer les connaissances sur les interactions entre les cellules immunitaires et les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale en contexte inflammatoire chronique. A long terme, il pourrait permettre de mieux comprendre le rôle des SLT dans l’inflammation colique pré-cancéreuse et de mettre en évidence un nouveau mécanisme de cancérogenèse dans le côlon. Ceci pourrait participer à l’élaboration de nouveaux traitements des MICI ainsi que du cancer colorectal.
Procédures
Dans une première procédure, nous allons évaluer la cinétique d’apparition spontanée de l’inflammation du côlon dans des souris génétiquement modifiées en fonction de leur fonds génétique d’origine. Trois lots d’animaux seront comparés et suivis régulièrement de 4 à 16 semaines d’âge jusqu’à apparition d’une colite. Aucun geste technique ne sera réalisé sur les animaux. Néanmoins, les mutations étudiées entraineront l’inflammation du côlon à partir de l’âge de 3 semaines. Si les animaux utilisés dans cette première procédure ne présentent pas de signes de colite au bout de 16 semaines d’âge, nous réaliserons une deuxième procédure où les animaux seront traités avec un traitement inflammatoire dans l’eau de boisson, de 3 à 14 jours maximum. Les doses seront progressivement augmentées en cas de résistance avérée à l’apparition de la colite.
Impact sur les animaux
Les animaux d’intérêts peuvent présenter les premiers signes d’entérocolite spontanée dès 3 semaines d’âge (perte de poids, saignements dans les selles et rectaux). Le poids des animaux sera mesuré régulièrement tout au long de la procédure. Les selles seront vérifiées régulièrement. L’administration d’un traitement inflammatoire dans l’eau de boisson (DSS) peut engendrer une déshydratation et une inflammation de l’ensemble du tractus intestinal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Il est nécessaire de réaliser les expériences sur des animaux afin de modéliser (i) le développement des structures lymphoïdes tertiaires dans l’inflammation colique et (ii) les interactions entre les différentes populations immunitaires et les cellules épithéliales adjacentes. Les expériences in vitro ne sont pas adaptées pour étudier les comportements immunitaires dans l’inflammation du côlon (interactions cellulaires multiples et complexes).
Réduction
Nous réaliserons des expériences-pilote afin de déterminer avec un nombre minimal d’animaux, les conditions optimales d’apparition de la colite spontanée et des SLT dans notre modèle murin. La deuxième procédure (traitement DSS) sera réalisée uniquement en cas de résultats négatifs issus de la procédure 1, c’est-à-dire dans le cas où les souris d’intérêts sur différents fonds génétique présentent une résistance à l’apparition d’une colite spontanée en conditions d’hébergement conventionnel. Tous les tissus murins collectés lors des expériences-pilote seront utilisés pour analyse immunologique. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Comme recommandé dans la littérature, les animaux sont suivis attentivement afin de détecter tout signe de souffrance ou d’angoisse, et d’assurer leur bien-être. Une grille de score adaptée est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal sera mis à mort. En cas de perte de poids ou de déshydratation, du gel nutritif sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire qui peuvent être causés par la colite. En cas de déshydratation sévère, une réhydratation par injection de solutés en voie intra-péritonéale sera réalisée. De plus, l’inflammation du côlon peut être suivie par une méthode non invasive : la mesure du taux d’une protéine spécifique dans les selles.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en immunologie. La forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins en fait un modèle idéal. Par ailleurs, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés déjà développés et bien caractérisés qui sont les plus adaptés à ce projet. Les souris seront utilisées entre 3 et 16 semaines, selon le temps d’apparition de la colite.
Etude des mécanismes de sensibilisation nociceptive
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
À cinq jours de vie, des souriceaux reçoivent dans le cerveau une substance qui détruit leurs neurones dopaminergiques. À vingt et un jours vient une chirurgie d'implantation de deux heures, à quarante-neuf jours une restriction alimentaire de cinq jours, à cinquante-trois jours un enregistrement électrophysiologique de la moelle épinière de trois à cinq heures. 6 050 souris vont être utilisées ainsi, dont 3 540 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour étudier comment l'anxiété et le trouble de l'attention amplifient la douleur, certaines recevant en plus une injection articulaire qui provoque une arthrite. Le porteur annonce une évaluation comportementale sans préciser quels tests seront conduits, affirme que ses travaux "permettront de développer des traitements efficaces", et toutes les souris sont tuées pour vérifier au microscope les coordonnées des injections.
Objectifs
Nous nous intéressons à la régulation de la nociception dans le cerveau et à ses effets sur l’intégration sensorielle dans la moelle épinière. La nociception est une douleur déclenchée par une agression de l'organisme elle est ensuite intégré par le système nerveux central et périphérique dont la moelle épinière. Nous étudions en particulier les dysfonctionnements cérébraux qui caractérisent certaines pathologies émotionnelles et psychiatriques et qui sont aussi responsables de douleurs. A ce titre, nous nous intéressons aux anomalies sensorielles fréquemment décrites en clinique dans des conditions d’anxiété pathologique, ou dans les troubles de l’attention et de l’hyperactivité, avec ou sans impulsivité (TDAH). Plus précisément, nous cherchons à comprendre le rôle de différents systèmes moléculaires dans l'activité de certaines régions corticales et dans le développement de la douleur et des symptômes du TDAH. Dans ce but, nous combinons des approches méthodologiques variées pour étudier les comportements et pour analyser l’activité des populations neuronales impliquées
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude concernent le traitement de la douleur, et en particulier des douleurs associées à des pathologies anxieuses ou au TDAH. Au-delà d'un inconfort temporaire. la sensibilisation chronique à la douleur provoque une dégradation générale de la qualité de vie et entraîne un coût économique très important (arrêt de travail, consultations médicales, prise en charge complexe des patients). Cette sensibilisation amplifie à son tour les symptômes du TDAH et de l'anxiété et contribue à la mise en place d'un cercle vicieux qui aggrave les conditions médicales des patients. Nos études permettront de développer des traitements efficaces car ils empêcheront les interactions entre ces pathologies et les douleurs, et bloqueront l'aggravation mutuelle des symptômes. L’innovation consiste à étudier des circuits, ou des systèmes moléculaires, qui interviennent à la fois dans ces pathologies neuropsychiatriques et dans la douleur. Ce sont les mécanismes moléculaires partiellement communs aux douleurs et aux troubles neuropsychiatriques associés qui seront la cible des traitements à développer.
Procédures
Chirurgie et implantation à l’âge adulte à 21 jours (2heures), injection cérébrale et injection de substance qui induit la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques chez les souriceaux à 5 jours (30minutes), restriction calorique à 49 jours (pendant 5 jours), imagerie et enregistrement électrophysiologique sur la moelle épinière à la fin de la procédure à 53 jours (3-5heures)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ Un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ Arthrite si injection dans l’articulation, dans le cas du projet ça provoque de l’inflammation locale. 3/ Un risque stress comportemental et stress alimentaire 4/Un risque de perte de poids et d'hypothermie à cause de l'injection de la 6-OHDA
Devenir
Mise à mort à la fin de la procédure pour collecter les tissus pour les analyses histologiques et la vérification des coorodonées des injections et l'histologie des tissus
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Pour vérifier et valider le concept du projet dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Le recours au modèle animal est indispensable car ce projet demande une évaluation comportementale et aucun modèle in vitro (cellules ou tissus) ne peut reproduire les conditions des pathologies étudiées
Réduction
Dans cette étude, la réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique (hétérogénéité inter-individuelle), le nombre de souris utilisées dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe. Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés
Raffinement
Tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse comme indiqué lors des procédures et un anti-douleur sera administré avant et après chirurgie pour éviter les douleurs post-chirurgicales. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement et des traitements vétérinaires si besoin. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur bien-être sera contrôlé par la cellule de bien-être de l’animalerie. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Des points limites sont définis pour éviter la souffrance des animaux. Dans toutes les procédures où cela sera possible, un antalgique sera donné. Pour les autres procédures, les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne renforcée, et les points limites définis permettront de maîtriser cette douleur.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de P0 semaines à 3 semaines. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Evaluation in vivo de l’efficacité thérapeutique de bactériophages et protéines de bactériophage pour le traitement d’infections dans un modèle murin de pneumonie à Klebsiella pneumoniae
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Toutes tuées à l'issue, la plupart pour le prélèvement de leurs organes, 5 160 souris vont être utilisées dans ce projet, dont 5 010 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont anesthésiées puis infectées par voie intranasale avec des souches cliniques de Klebsiella pneumoniae, avant de recevoir des bactériophages, des enzymes de bactériophages ou un antibiotique par voie intranasale, intrapéritonéale ou par gavage, en injection unique ou trois jours de suite. L'infection peut provoquer maladie, soif, perte d'appétit et de mobilité, et conduire à leur mort, que le porteur tente de retarder par deux réhydratations quotidiennes sous la peau. Le bénéfice avancé, une réponse aux bactéries multirésistantes, est renvoyé à un développement chez l'humain à envisager à "plus long terme", quand la souffrance sévère concerne dès maintenant 5 010 individus.
Objectifs
La diffusion des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques représente un problème majeur de santé publique. Dans un contexte de faible développement d’antibiotiques réellement innovants et face à des infections qui deviennent non traitables, des alternatives sont nécessaires. Nous souhaitons évaluer l'efficacité thérapeutique d'enzymes issues de bactériophages ou de bactériophages entiers, seuls ou en combinaison avec des antibiotiques, pour lutter contre des infections à Klebsiella pneumoniae. Dans un premier temps, les doses infectieuses optimales de 10 souches cliniques différentes, représentatives de clones d’intérêt de Klebsiella pneumoniae, vont être déterminées dans un modèle murin de pneumonie. Ensuite l'absence de toxicité aigüe de ces enzymes thérapeutiques et des bactériophages sera évaluée. Enfin les animaux infectés seront traités par injection i) d'enzymes thérapeutiques, ii) de bactériophages, iii) d’antibiotique ciblant la membrane bactérienne et des combinaisons de ces 3 produits pour observer un effet thérapeutique et une potentielle synergie entre ces différents produits. Les infections sont réalisées chez la souris car elles reproduisent une pathologie pulmonaire similaire à celle observée chez l'homme.
Bénéfices attendus
Les avantages attendus de ce projet sont d'évaluer et démontrer l'activité et l'efficacité thérapeutique de nouveaux agents thérapeutiques issus de bactériophages actifs contre les bactéries Klebsiella pneumoniae. C'est une étape nécessaire avant de proposer une nouvelle approche thérapeutique active contre des bactéries multi-résistantes et envisager à plus long terme un développement chez l'homme.
Procédures
La grande majorité des animaux de ce projet seront anesthésiés puis infectés par des bactéries par voie intranasale (N=5010). Ils recevront ensuite différents traitements par les agents thérapeutiques par voie intranasale, injection intrapéritonéale ou gavage en injection unique ou pendant 3 jours consécutifs. Une partie des animaux (N=150) seront injectés par voie intranasale ou intrapéritonéale avec les candidats agents thérapeutique en seule injection. Les infections et injections par voie intranasale seront effectuées sur animaux anesthésiés (anesthésie gazeuse de 15 minutes maximum). Les injections intrapéritonéales et gavage seront effectués sur animaux vigile et réalisés en moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
La nuisance majeure résultera principalement de l'infection qui pourra engendrer maladie, soif, perte d'appétit, de mobilité et conduite à leur mort. Les injections intrapéritonéales, intranasales et par gavage pourront entraîner une douleur modérée de courte durée. Les anesthésies seront de courte durée. Cependant une hypothermie temporaire ainsi que des perturbations du rythme respiratoire pourront éventuellement être observés, mais ces effets devraient négligeables de par la courte durée de l'anesthésie. La toxicité éventuelle des enzymes de bactériophages et des bactériophages sera évaluée dans ce projet. Ces candidats thérapeutiques ne devraient pas induire par eux-mêmes de nuisances ou effets indésirables. Si ceux-ci surviennent, des pertes de poids, modifications du comportement (diminution de mobilité, prostration, diminution d'alimentation et de toilettage) des effets sur l'activité respiratoire pourront être observés.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. La plupart des animaux sont utilisés pour prélèvement d’organes. Les autres ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés ni adoptés.
Remplacement
Tous les bactériophages et enzymes de bactériophages auront au préalable été testés in vitro : - activité bactéricide des bactériophages . - activité des enzymes sur la capsule et sensibilisation des bactéries au système immunitaire avec des tests de résistance au sérum et de survie intracellulaire dans des cultures de cellules. La synergie des enzymes ou bactériophages avec l'antibiotique sera aussi préalablement démontré in vitro. Toutefois, comme nous voulons observer l'action de nos nouveaux agents thérapeutiques lors d'un processus infectieux complexe avec toutes les composantes de la réponse immunitaire (implication d'organes différents pour la mise en place de la réponse immunitaire, relations entre organes, multiples populations cellulaires impliquées), les expériences avec les composés ayant démontré l’activité maximum in vitro ne peuvent être réalisées que chez l'animal afin d'évaluer leur efficacité in vivo.
Réduction
Les groupes d’animaux ont été réduits au minimum tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, conduisant à un nombre total d’animaux de 5160 pour ce projet. La taille des groupes a été calculé pour obtenir des résultats statistiques et fiables en utilisant le moins d’animaux possible, et correspond aux données observées dans la littérature récente sur cette thématique. Les données obtenues seront analysées en utilisant les tests statistiques appropriés pour déterminer la robustesse des résultats.
Raffinement
Le projet a été construit en intégrant les mesures permettant de réduire le stress et la souffrance des animaux. Le raffinement sera assuré par l'enrichissement mis à disposition des animaux (litière en copeaux de cellulose, maison en carton et/ou boule de papier kraft type carfil nesting ou BedR’ Nest permettant de faire des nids). Les animaux sont hébergés par groupe de 6 souris maximum dans des cages respectant les normes en vigueur. Une période d’acclimatation d’une semaine est observée à l’arrivée des animaux avant le début des expériences. Les animaux seront évalués quotidiennement en utilisant la grille de scoring. Les animaux seront euthanasiés lorsqu'un point limite sera atteint . Pour réduire l'effet de l'infection sur les animaux, les animaux seront réhydratés 2 fois par jour par injection sous-cutanée de solution de Ringer pour permettre aux animaux pour qui le traitement serait actif de pouvoir récupérer. Une alimentation humide disposée dans des coupelles au fond de la cage sera fournie aux animaux infectés Les animaux sur lesquels des prélèvements ne sont pas prévus seront euthanasiés. La mort des animaux est confirmée par une vérification de l'arrêt respiratoire et de l'arrêt cardiaque. La vérification de ces paramètres est réalisée pendant une minute
Choix des espèces
La souris est un modèle robuste et fiable de pneumonies causées par K. pneumoniae. Il reproduit fidèlement l’inflammation aigüe caractéristique de la pneumonie à K. pneumoniae telle qu’observée chez l’homme. Le modèle d’infection par K. pneumoniae est largement utilisé par la communauté scientifique. Les infections sont robustes et reproductibles dans de nombreuses lignées murines telles que BALB/c. Les animaux utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines. Les animaux de cet âge reproduisent de façon fiable les pneumonies causées par Klebsiella pneumoniae telles qu’observées chez l’homme et sont donc un bon modèle de la pathologie humaine décrits dans de multiples publications.
Evaluation de candidats vaccins contre la fièvre hémorragique de Crimée-Congo dans le modèle de la souris déficiente en récepteurs de l’interféron de type I (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris non vaccinées devraient atteindre un point limite en quatre à cinq jours, avec perte de poids, dos voussé, fourrure ébouriffée et léthargie. 72 souris privées d'une partie de leur système immunitaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune est identifiée par des encoches dans les oreilles, anesthésiée quatre fois pour deux vaccinations et deux prises de sang, puis anesthésiée à nouveau pour l'implantation d'une puce thermique et l'inoculation du virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo. Trente-six d'entre elles sont tuées au quatrième jour, au pic de la maladie, ce qui ramène à six animaux par groupe la comparaison de survie entre vaccinées et non vaccinées.
Objectifs
L’aire de répartition du virus de fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHF) s’étend et atteint déjà l’Europe de l’Ouest. Cette progression est principalement liée à la circulation des tiques (genre Ixodidae) qui sont vecteurs de ce virus. Le virus CCHF infecte les humains et peut provoquer une fièvre hémorragique dont le taux de mortalité atteint 40%. Les humains se contaminent soit par morsure de tique soit par contact avec des fluides contaminés d’animaux infectés. Les éleveurs et les personnels d’abattoirs sont donc à risque accru de contracter la maladie. Ce virus représente donc un problème de santé publique contre lequel il faut se prémunir. A ce jour, aucun vaccin contre le virus CCHF n’est commercialisé. L’objectif de ce projet est de développer un vaccin contre la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHF). Il s’agit ici de déterminer quels seront les meilleurs candidats vaccins contre le virus CCHF parmi ceux que nous avons développé au laboratoire. Pour cela, des souris, étant un bon modèle d’infection par le virus CCHF, seront vaccinées environ 2 mois avant infection et recevront une dose de rappel un mois après la première injection. Les animaux seront ensuite infectés par le virus pour tester le niveau de protection conféré par les vaccins. Cinq candidats vaccins seront testés. Cette expérimentation, qui se déroulera dans deux animaleries, permettra non seulement de valider l’efficacité de nos candidats vaccins mais aussi de les comparer entre eux pour définir celui ou ceux qui peuvent être engagés plus avant dans leur développement.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, nous avons produit plusieurs candidats vaccins contre le virus CCHF et la phase suivante pour déterminer leur efficacité est de démontrer leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice contre l’infection par ce virus. Parmi les cinq candidats vaccins et grâce aux échantillons biologiques collectés auprès des animaux vaccinés (ou non) et infectés, nous pourrons évaluer l’efficacité du vaccin, vérifier l’absence de persistance virale et mesurer la synthèse d’anticorps spécifiques du virus. L’utilisation des animaux pour cette phase de validation est donc justifiée au vu de l’impact potentiel sur l’Homme de ce virus et pour la mise en place d’une vaccination. L’efficacité des vaccins utilisés dans cette étude sera mesurée selon le taux de survie des animaux vaccinés ainsi que l’analyse de la réponse immunitaire induite par chaque vaccin.
Procédures
Les animaux seront en expérimentation pour deux périodes successives dans deux animaleries distinctes et pour une durée totale d’environ 3 mois. Animalerie 1 : après répartition en 6 groupes de 12 animaux, les 72 animaux subiront les interventions suivantes : - Identification au sein d’un même groupe par encoches au niveau des oreilles - Quatre anesthésies, deux pour l’injection des vaccins (primo-vaccination + rappel) à un mois d’intervalle et deux pour des prélèvements sanguins pour analyse génétique. Chaque animal sera anesthésié pendant environ 10 à 15 minutes le temps d’être vaccinés ou prélevés. Chacun des gestes effectués sur les animaux dans l’animalerie 1 ne durera pas plus de 2 à 3 minutes. Animalerie 2 : La seconde période est celle de l’infection avec le virus pour évaluer l’efficacité de protection des vaccins testés. - Tous les animaux subiront une première anesthésie au cours de laquelle une puce leur sera implantée pour mesurer leur température corporelle et où ils seront infectés avec le virus. Cette anesthésie durera environ 15 à 20 minutes pour chaque animal - A J4 post infection, c’est-à-dire au pic des symptômes de la maladie provoquée par le virus, 36 animaux seront anesthésiés puis euthanasiés afin de prélever le maximum de sang ainsi que leurs organes - A J10 post infection, les animaux survivants seront anesthésiés pour leur prélever du sang. Cette anesthésie durera environ 10 à 15 minutes pour chaque animal - Enfin, tous les animaux survivants à la date fixée de fin de protocole seront anesthésiés avant euthanasie afin de prélever le maximum de sang ainsi que leurs organes pour réaliser des analyses. Au cours de chaque anesthésie, les animaux seront pesés. Chacun des gestes effectués sur les animaux dans l’animalerie 2 ne durera pas plus de 4 à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable des animaux est lié à leur immunodéficience et donc au risque de développer des infections en présence d’un agent pathogène mais ce risque est très limité en raison de l’utilisation de matériel irradié, filtré ou autoclavé. Dans l’animalerie 1/2, les animaux subiront quatre anesthésies, au cours d’un protocole d’environ deux mois et demi, au cours desquelles il sera procédé à deux injections de vaccins (faible douleur associée attendue). Les vaccins testés dans ce protocole sont connus pour ne causer qu’une fièvre modérée dans les heures suivant l’injection. Les prélèvements de sang peuvent causer des hématomes mais leur faible fréquence devrait limiter l’impact sur les animaux. Dans l’animalerie 2/2, tous les animaux subiront une anesthésie au cours de laquelle ils seront implantés d’une puce pouvant générer une légère douleur et un risque de léger saignement. Les animaux ensuite infectés étant non-vaccinés devraient manifester rapidement les signes cliniques de l’infection (perte de poids, dos voussé, fourrure ébouriffée, léthargie) jusqu’à atteindre un point limite en 4 à 5 jours environ. Les animaux infectés et ayant été vaccinés ne devraient pas présenter de signes cliniques durant cette même période. Après la mise à mort des animaux à J4, les animaux survivants seront anesthésiés et un prélèvement sanguin sera pratiqué, avec présence d’anesthésique local pour limiter la douleur.
Devenir
Certains animaux seront euthanasiés au cours de la procédure afin de comparer au pic de la maladie induite par le virus si les vaccins les ont bien protégés en comparant différents paramètres biologiques avec ceux du groupe contrôle. Tous les animaux survivants seront euthanasiés à la fin de l’étude dans les locaux de l’animalerie 2. Les animaux ayant survécus à l’infection grâce aux vaccins devront être étudiés en détail à travers l’étude de leurs organes et de leur sang qui seront prélevés en fin de protocole afin de vérifier si le virus inoculé persiste ou non dans l’organisme des animaux vaccinés.
Remplacement
Il est impossible à l’heure actuelle de déterminer par des expérimentations in vitro le degré de protection que peut conférer un vaccin et donc de conclure sur l’efficacité de celle-ci. Le recours à des organismes entiers reste indispensable pour éprouver les candidats vaccins. Les constructions vaccinales utilisées ont été sélectionnées sur la base de la meilleure expression des protéines virales, capable de conférer une immunité aux organismes qui y ont été exposés.
Réduction
Dans ce projet, 6 groupes de 12 animaux seront constitués : 5 groupes recevront chacun un vaccin différent, le sixième groupe constituant le groupe contrôle. La comparaison de la survie entre animaux vaccinés et non vaccinés sera donc établie sur un effectif de 6 animaux dans chaque groupe. Les sources de variabilité seront prises en compte lors des analyses, comme la variabilité liée au sexe (avec des mâles et des femelles dans chaque condition). Pour ce qui est de l’analyse de puissance, elle consistera en une comparaison multiple des moyennes des 6 groupes. Bien que le modèle soit connu puisque publié, l’objectif est dans un premier temps de confirmer le taux de létalité par observation de celui chez les animaux contrôles, puis d’observer une différence entre les différents groupes en matière de survie et de mise en place de la virémie, suite à l’infection réalisée avec une dose virale différente des études menées au préalable mais établie en fonction des publications les plus récentes. Les analyses statistiques sur les données qui seront collectées seront ensuite réalisées, par choix des tests en fonction de ces observations de survie et analyses virologiques.
Raffinement
Animalerie EU1/2 : Les animaux, du fait de leur immunodéficience, seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes avec des cages autoclavées avec nourriture et boisson stériles pour éviter tout risque de contamination microbienne indésirable. Chaque geste technique (injection, prélèvement) sera réalisé sous poste de sécurité microbiologique et une désinfection avant et après de la zone à injecter/prélever sera réalisée par application de vétédine. Ces anesthésies permettront de diminuer la douleur qui pourrait être provoquée par l’injection du vaccin ou le prélèvement sanguin. Après chaque anesthésie, les animaux peuvent présenter transitoirement une fatigue post-anesthésie et/ou une déshydratation transitoire. Un enrichissement de l’environnement, une réhydratation des animaux à l’aide de sérum physiologique par voie sous-cutanée, l’ajout de gel hydrique ainsi que de friandises peuvent être appliqués ainsi qu’un réchauffement si besoin. Etant donné l’immunodéficience des animaux utilisés dans ce protocole, ils seront hébergés dans des isolateurs placés dans une pièce en pression négative. Les conditions de vie (litière) et la nourriture seront issus de produits irradiés afin de minimiser le risque infectieux. Les matériels utilisés pour leur entretien seront préalablement autoclavés. Animalerie 2/2 : La réalisation des gestes techniques sous anesthésie (injections et prélèvements) permet de réduire grandement le stress des animaux et d’éviter des contentions longues. Le faible nombre de prélèvements effectués permet de réduire le nombre d’anesthésies et les effets associés (perte d’appétit, fatigue post-anesthésie). Des observations journalières seront réalisées afin d’évaluer l’état de chacun des animaux. À tout moment, en cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en zone sera programmée pour procéder à une observation des animaux et à une possible décision d’arrêter le protocole.
Choix des espèces
Il a été démontré que la souris déficiente pour une partie du système immunitaire était susceptible à l’infection par le virus de la fièvre hémorragique de Crimée Congo (CCHFV) et en reproduisait la physiopathogénèse observée chez l’Homme. Ce modèle de souris a également été utilisé dans le cadre de plusieurs essais vaccinaux contre le virus CCHF. Il s’agit donc d’un modèle adapté pour comparer les différents candidats vaccins et évaluer leur efficacité. Les animaux utilisés seront des adultes (à partir de 2 mois). Il est nécessaire que le développement de leur système immunitaire soit mature pour évaluer au mieux la réponse immune mise en place suite à la vaccination.
Impact du stress in utero sur les réponses immunes inflammatoires et autoimmunes des progénitures
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Toutes tuées pour le prélèvement des organes lymphoïdes, du tube digestif, du cerveau et de la moelle épinière, 2 676 souris vont être utilisées, dont 2 016 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les femelles gestantes sont enfermées dans un tube de contention sous une lumière vive trente minutes, trois fois par jour, du treizième au dix-huitième jour de gestation. Leurs descendants adultes reçoivent une inflammation provoquée du système nerveux central ou du côlon, avec syndrome fébrile et perte de poids, la mise à mort intervenant au bout de trente jours. Le porteur écrit pourtant que "le stress en soi ne cause aucun symptôme chez les génitrices" et que les injections et pesées "ne causent pas d'effets indésirables", dans un projet dont il déclare lui-même les trois quarts des effectifs en souffrance sévère.
Objectifs
La prévalence mondiale des pathologies auto-immunes et inflammatoires est en perpétuelle augmentation dans les pays développés et en voie de développement. Elles représentent un problème majeur de santé publique et les approches thérapeutiques utilisées aujourd’hui ne donnent pas entière satisfaction. Il est donc important de comprendre la physiopathologie de ces maladies au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ceci est basé sur l’utilisation des modèles animaux (lignées pures génétiquement homogènes, environnement "contrôlé") qui reproduisent en majeure partie les caractéristiques cliniques et histopathologiques des maladies humaines. De plus, il est tout à fait possible d’appliquer les résultats obtenus dans les modèles animaux à la pathologie humaine. De nombreux facteurs environnementaux ont été décrits comme participant au développement de ces maladies chroniques. Parmi ces facteurs environnementaux, de nombreuse étude épidémiologique placent le stress comme l'un des facteurs majeurs impliqués dans la régulation de l'immunité. L'objectif de cette demande est de comprendre l'association qui pourrait exister entre le stress en période néonatale et les maladies auto-immunes en utilisant un modèle animal de sclérose en plaques et les maladies inflammatoires intestinales en utilisant un modèle de colite
Bénéfices attendus
La période prénatale est une période délicate au cours de laquelle l’exposition intra-utérine à des facteurs environnementaux peut moduler le cours du développement du système immunitaire et conférer un effet durable sur la progéniture qui, plus tard dans la vie, influence le développement des réponses immunes normales et pathologiques. Cette étude sur l'impact du stress prénatal sur la réponse immunitaire de la progéniture chez la souris offre une approche expérimentale pour explorer les mécanismes sous-jacents à ces interactions complexes avec un focus sur le microbiote. Ceci pourrait identifier des souches bactériennes du microbiote ou des métabolites du microbiote qui pourraient être des cibles thérapeutiques des maladies inflammatoires. . Les résultats pourraient avoir des implications importantes pour la recherche sur la santé maternelle et infantile, ouvrant la voie à de nouvelles avenues de prévention et d'intervention.
Procédures
Les souris gestantes seront stressées du 13ème au 18ème jour de gestation à l'aide d'un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour. Nous allons induire chez les progénitures adultes ( 10 souris par groupe) une inflammatoin du système nerveux central ou une inflammation du colon. Au moment de la mise à mort (30 jours), les organes lympoides, le tractus digestif, le cerveau et la moelle epinière seront prélevés et analysés
Impact sur les animaux
Entre nos mains, le stress en soi ne cause aucun symptôme chez les génitrices et n'a aucun effet sur le nombre de petits par portée et sur les soins portés aux petits. Dans le cas du modèle de l'inflammation du système nerveux central ou de colite, les animaux présentent un syndrome fébrile entrainant une perte de poids. Puisque le stress prénatal réduit l’inflammation, on devrait s'attendre à une réduction de la sévérité de la maladie dans les deux modèles. Les expérimentations sur ces animaux (injections, pesées) ne causent pas d'effets indésirables.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire
Remplacement
Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les méthodes alternatives permettant une évaluation du statut immunitaire de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale car le stress, l'inflammation et l’auto-immunité sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité. Cependant, une veille bibliographique sera effectuée pour déterminer si des méthodes de remplacement ont été mises en place.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans chaque expérience a été calculé à minima à l'aide des outils statistiques en tenant compte de la variance biologique des résultats obtenus. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tous les échantillons prélevés sont stokés à -80°C et dans une banque de données. Ils peuvent être réutilisés ou servir de témoins dans des expériences ultérieures.
Raffinement
Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite (perte de poids superier à 20%, grattage ou léchage anormal, posture voûté ou prostrée, amaigrissement, déshydratation, poils hérissés, salissures, anomalies de la respiration, hypo ou hyperthermie et paralysie). Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement, cachettes et objets à ronger). Une surveillance journalière de l'état générale des animaux par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Comme précisé pour chacune des procédures,les animaux seront anesthésiés + anélgésiés (xylasine) en cas d'injection ou de prélévement.
Choix des espèces
L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés. Aucune autre espèce d'animaux n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Nous utuliserons des souris adultes mâles et femelles pour notre projet.
Etude de la virulence de la bactérie Leptospira interrogans chez la gerbille
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Inoculées d'un millilitre de leptospires dans l'abdomen, sept gerbilles de Mongolie développent une infection qui tue l'animal en cinq jours environ, et sept autres subiront la même chose si la première série échoue. Ces quatorze gerbilles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue, dès l'apparition des signes que le porteur décrit comme prédictifs de la mort, perte de plus de cinq grammes en deux jours, apathie, poil piqué, yeux mi-clos. Aucun groupe témoin n'est prévu. Le porteur indique devoir revalider le modèle gerbille après un déménagement d'animalerie pour que la fabrication du vaccin humain contre la leptospirose ne prenne pas de retard, ce projet revalidant un test de contrôle qualité dans de nouveaux locaux.
Objectifs
Dans le cadre d'un démenagement d'animalerie et de locaux en mars 2024, l'objectfif est de valider le modèle gerbille infecté par l'inoculum Leptospira interrogans serogroup icterohaemorrhagiae serovar copenhageni. En effet, dans le cadre du test d'un vaccin contre la Leptospirose, un test in vivo avec des animaux infectés par la leptospirose est nécessaire. Le vaccins étant le seul vaccin humain existant, il est soumis à une certaine contrainte d'approvisionnement et ne peut donc pas prendre de retard dans sa fabrication. Ainsi, il est nécessaire de mener une étude dans nos nouveaux locaux afin de valider le modèle gerbille et pouvoir continuer de réaliser les prochaines études de libération de lot dans les temps.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de valider le modèle gerbille inoculé par la souche Leptospira interrogans serogroup icterohaemorrhagiae serovar copenhageni dans notre nouvelle animalerie. Ce modèle sera ensuite utilisé pour réaliser des tests de lots ou de stabilité vaccinal.
Procédures
Les animaux ne seront soumis qu'à l'incoluation par la Leptospirose, par une injection intraperitonéale d'1mL. Les animaux seront vigiles, la contention ne dure pas plus d'une minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront maintenu environ une minute pour réaliser l'inoculation par injection intrapéritonéale par la leptorspirose. Les animaux seront inoculés par la souche Leptospira interrogans serogroup icterohaemorrhagiae serovar copenhageni qui provoque habituellement la mort de l’animal en environ 5 jours. Des euthanasies anticipées seront réalisées pour éviter toute souffrance de l’animal. Les signes cliniques et points limites attendus sont : une perte de poids de plus de 5g en 48h , un animal apathique et/ou recroquevillé sur lui-même avec un poil piqué et / ou des yeux mi-clos.
Devenir
Le but d'un test de virulence est d'observer la mortalité et la morbitié des animaux. Aussi, pour des raisons de biosécurité, les animaux infecté par la leptospire ne pourront pas être réutilisé ou replacer. Ils devront être euthanasiés en fin de procédure. Un premier groupe de 7 animaux sera utilisé afin de tester la virulence. Si cette première procédure fonctionne, les 7 autres animaux prévus à ce projet ne seront pas commandés à notre fournisseur et ne seront donc pas utilisés. Sinon, un nouveau test de virulence devra être reconduit après avoir pris toutes les dispositions possibles pour que celui-ci fonctionne, avec 7 nouveaux animaux.
Remplacement
Afin de valider les tests in vivo décrit dans l'Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) du vaccin contre la leptospirose, nous devons valider le modèle gerbille qui sera utilisé pour ces même tests. Nous ne pouvons donc pas encore remplacer l’animal sur ce projet.
Réduction
Un maximum de 14 animaux sera utilisé. Un premier projet comportera un lot de 7 animaux, correspondant au nombre d’animaux utilisés pour tester un lot vaccinal. Si ce premier projet n’est pas validé, de nouveaux tests seront réalisés après avoir analysé les causes de l’échec et mis en place les changements nécessaires pour que le test fonctionne. Nous n’utiliserons pas de groupe témoin lors de ce projet
Raffinement
Avant l’arrivée des animaux, une analyse 5M sera réalisée afin d’analyser tous les changements qui auront lieu avec le changement de locaux. Cela permettra d’identifier les points critiques et mettre en place les nouvelles procédures pour que tout se déroule au mieux. Ceci permettra de minimiser les risques de devoir réaliser une deuxième étude en cas d’échec. Aussi, des points limites bien défini permettrons de mettre à mort les animaux le plus rapidement possible dès les premiers signes cliniques. Les animaux seront hébergés en groupe dans une cage avec litière. Du matériel de nidification et du matériel à ronger sera mis à leur disposition quotidiennement. Des points limites prédictifs de la mort de l'animal sont mis en place : une perte de poids de plus de 5g en 48h , un animal apathique et/ou recroquevillé sur lui-même avec un poil piqué et / ou des yeux mi-clos. Les animaux seront euthanasié en cas d'atteinte d'un ou plusieurs points limites. Avant toute euthanasie, les animaux seront anesthesiés.
Choix des espèces
La gerbille est une des espèces rongeuses sensible à la bactérie Leptospirosa interrogans au point de reproduire les signes cliniques aboutissant à la mort comme cela est parfois observé chez l’homme. De plus, le vaccin contre cette bactérie est immunogène dans cette espèce. Les animaux seront agées entre 11 et 15 semaines, correspondant à l'âge ou les animaux sont inoculés lors des tests d'efficacités vaccinal. Ce seront donc des animaux adultes.
Mécanisme de toxicité rénale des maladies du sang associée à une production d’anticorps
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Comprendre pourquoi le dépôt d'un anticorps détruit le rein passe ici par des souris qui produisent un anticorps humain prélevé chez un patient et développent d'elles-mêmes une insuffisance rénale. 170 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement des reins. Elles sont isolées douze heures par mois dans une cage à urine, reçoivent chaque jour pendant une semaine, à quatre puis à six mois, un médicament administré par une paille enfoncée dans la bouche, et sont suivies jusqu'à neuf mois, l'âge médian de survie de la lignée. Le porteur ne retient comme nuisances que le stress de l'isolement et celui de la contention, et affirme que le médicament testé ne provoque aucun effet secondaire, quand la souffrance sévère déclarée tient à la maladie rénale que ces souris portent par construction.
Objectifs
Dans certaines maladies rénales appelées "light chain deposition disease" (LCDD ou maladie à dépôts de chaînes légères d'immunoglobulines monoclonales en français), un anticorps (molécule habituellement destinée à se défendre contre les microbes) fabriqué par une cellule cancéreuse ou pré-cancéreuse va se déposer au niveau du rein et provoquer des lésions rénales. Ces lésions rénales vont aboutir à une insuffisance rénale terminale en l’absence de traitement, et potentiellement au décès du patient. Aujourd’hui, les seuls traitements accessibles pour cette pathologie sont des chimiothérapies ciblant la cellule responsable de la fabrication de l’anticorps en cause. Néanmoins, ces traitements ne sont pas spécifiques et provoquent d’importants effets secondaires. Les mécanismes qui permettent le développement des lésions rénales à la suite du dépôt de l’anticorps ne sont pas connus. Les identifier permettrait donc de développer des médicaments plus ciblés, protégeant le rein des conséquences du dépôt de l’anticorps. Un modèle de souris reproduisant la pathologie humaine a déjà été créé, en permettant la fabrication d’un anticorps humain issu d’un patient atteint de LCDD chez la souris. Cela a permis de montrer que l’anticorps est directement toxique pour le rein. Néanmoins, il reste à comprendre les réponses du rein à la suite de ce dépôt. Nous allons donc utiliser ce modèle de souris afin de répondre à cette lacune des connaissances dans ce domaine. Cela permettra, nous l’espérons, d’identifier des cibles thérapeutiques que nous pourrons cibler pour protéger les reins après dépôts d’anticorps. En particulier, les cellules sénescentes paraissent impliquées dans ce processus. La sénescence, du latin senex ou « grand âge », est un état de la cellule dans lequel la cellule ne peut plus se diviser mais peut secréter un grand nombre de molécules. La sénescence a été impliquée dans plusieurs pathologies, comme le vieillissement ou le cancer par exemple.
Bénéfices attendus
Grace à ce projet nous espérons plusieurs bénéfices - Mieux comprendre les conséquences rénales des dépôts d’anticorps - Caractériser le rôle de la senescence dans le développement des lésions rénale après dépôt d’anticorps. - Identifier des cibles thérapeutiques spécifiques au rein permettant d’envisager une thérapie plus ciblée que les actuelles chimiothérapie - Estimer si la suppression des cellules sénescentes permet de protéger le rein de l’apparition de lésions après dépôt d’anticorps. - Etendre les découvertes de ce projet à d’autres pathologies rénales (en particulier le diabète qui présente beaucoup de similarités avec la LCDD) Cela permettra in fine d’envisager des alternatives thérapeutiques aux actuelles toxiques chimiothérapies recommandées dans cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions : - collecte d'urines pour mesurer la fuite de protéines dans les urines. Pour cela les animaux seront hébergés de manière individuelle dans des cages spécifiques pendant 12h afin de récupérer leur urine. Cette collecte se fera de manière mensuelle. - traitement par un médicament permettant d'éliminer les cellules senescentes. Ce traitement sera donné par voie orale, à l'aide d'une paille qui sera introduite dans la bouche de l'animal, de manière quotidienne pendant 7 jours, à 4 et 6 mois d'âge. - au moment du sacrifice, les animaux seront anesthésiés et du sang sera prélevé pour mesurer la fonction rénale
Impact sur les animaux
Plusieurs types d'effets indésirables peuvent etre observés. Stress lors de l'hebergement individuel pour collecte d'urine. Stress lors de la contention pour administration du médicament. Le médicament ne provoque pas d'effet secondaire. Le prélèvement de sang n'induit pas d'effet secondaire car les animaux seront anesthésiés et traités par un antalgique.
Devenir
Euthanasie pour collection et analyse d'organe (rein)
Remplacement
Les modèles de culture cellulaire ne permettent pas de reproduire la complexité de la maladie LCDD. D’autre part, il est probable que le développement des lésions rénales soit la conséquence de multiples types de cellules présentes dans le rein. Il est donc impossible de reproduire cette pathologie sur des modèles qui ne soient pas des animaux.
Réduction
Les procédures ici décrites utilisent des animaux qui risquent de developper des lésions rénales de manière spontanée. Afin de limiter le nombre d’animaux, nous utiliserons la totalité des animaux pour les procédures. Du fait de l’absence de différence entre les mâles et les femelles, nous utiliserons les 2 sexes pour nos procédures. Nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de calculer le nombre minimum d’animaux afin de voir une différence de 15% de la sévérité de l’atteinte rénale après traitement.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et du taux d'humidité de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement, change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluation et points limites) sera strictement respecté, et effectué quotidiennement en concertation avec l'équipe de zootechnie.
Choix des espèces
La souris est la seule espèce permettant à ce jour de reproduire la maladie observée chez l’homme. Dans les données de la littérature, les souris commencent à développer des lésions rénales microscopiques à l’âge de 6 mois, et la présence de dépôts sans insuffisance rénal est retrouvée dès l’âge de 2 mois. Nous étudierons donc les souris tous les mois dès l’âge de 3 mois, jusqu’à 9 mois, âge médian de survie.
Exploration d’une approche thérapeutique (probiotiques) sur l’impact de produits néoformés générés par le microbiote colique consécutif à la consommation de FODMAPs
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Gavées trois fois par semaine pendant neuf semaines, opérées trente minutes pour recevoir des électrodes, puis soumises à une distension du côlon par un ballonnet en cinq paliers de dix secondes, 540 souris vont être utilisées. 300 relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 240 d'un niveau modéré, et toutes sont tuées en fin de procédure pour des prélèvements de tissus. L'objet est de tester des souches probiotiques censées corriger l'hypersensibilité intestinale provoquée par un régime riche en sucres fermentescibles, avec pour horizon les patients atteints du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur ramène l'introduction du ballonnet et la mesure des contractions à un "inconfort", et rappelle que la même mesure se pratique chez les patients, quand 300 de ces souris sont déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
Le syndrome de l’intestin irritable (SII) est une pathologie intestinale chronique très répandue, qui altère la qualité de vie des patients de façon significative. Sur le plan thérapeutique, les traitements médicamenteux de la douleur restent à ce jour peu efficaces. L’alimentation est le domaine où ces patients sont le plus sensibles. Un groupe d’aliments promoteurs de douleurs abdominales chez ces patients a pu être mis en évidence: les sucres fermentescibles (FODMAPs). La fermentation de ces derniers par le microbiote intestinal des patients génère des composés chimiques provoquant la douleur. Aujourd'hui, pour réduire ces symptômes invalidants, un régime pauvre ou sans ces sucres fermentescibles est proposé aux patients SII. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de souches probiotiques (micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont ingérés en quantité suffisante, exercent des effets bénéfiques sur la santé), que nous avons sélectionné pour leurs propriétés bénéfiques sur la perméabilité intestinale et la sensibilité viscérale d’individus murins ayant consommé un régime en riche en FODMAPs. Cette étude préclinique, couplée aux analyses cliniques et in vitro menées dans notre équipe , permettrait à terme de proposer une solution thérapeutique pour les patients SII hypersensibles aux FODMAPs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra 1) de valider les hypothèses sur l’implication d’une consommation riche en FODMAPs sur le disfonctionnement de la barrière intestinale ; 2) d’élaborer des outils de lutte préventive et d’apporter des pistes de stratégie thérapeutique pour une meilleure santé intestinale liée à la consommation des FODMAPs. Il apportera des données objectives permettant à terme de réaliser des études cliniques qui viseront à améliorer la qualité de vie des patients SII.
Procédures
Les animaux seront soumis à des gavages (durée du geste : 30 secondes) trois fois par semaine sur une période de 9 semaines. Des prélèvements de fèces seront effectués au niveau de l’anus le premier jour, le 8ème jour et à la fin de la consommation du régime enrichis en FODMAPs. Des animaux subiront également un prélèvement sanguin unique non létal (20μl) effectué à la queue (durée du geste : 30 secondes). Des animaux seront équipés d’électrodes pour la mesure de sensibilité viscérale, nécessitant une chirurgie de courte durée (30 min). Après trois jours de récupération de l’acte chirurgical, les animaux seront soumis à une distension colorectale de cinq paliers d’une durée de 10 secondes chacune avec un temps de récupération de 10 minutes entre chaque palier.
Impact sur les animaux
Des nuisances ou effets indésirables attendus liés à ces procédures seront les suivants: -Une mobilité réduite liée à la contention manuelle (durée 1min) De plus l’ensemble des animaux pourraient subir une nuisance (peur) et une irritation du tube digestif lors des premiers jours d’administration orale des composés. -Un stress physique possible lié à un prélèvement de sang à la queue (durée 3min) -Des nuisances liées à la chirurgie peuvent être des douleurs post-opératoires, une perte de poids, une déshydratation ou une mauvaise cicatrisation. La nuisance liée à la contention dans le tunnel sera une mobilité réduite. L’introduction du ballonnet et la mesure des contractions peuvent être associés à un inconfort.
Devenir
Tous les animaux en fin de procédure, seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements de tissus post-mortem pour différentes analyses et dosages
Remplacement
Le SII est une pathologie dont les causes sont multifactorielles et méconnues, et qui présentent une physiopathologie complexe. Par conséquent, il n’est pas possible de reproduire cette pathologie uniquement sur un modèle cellulaire. Pour évaluer si un traitement est efficace il faut nécessairement coupler des analyses sur modèle intégré in vivo à des analyses in vitro sur modèles de cultures cellulaires. Cependant, des paramètres comme la sensibilité intestinale ou la perméabilité intestinale totale ne peuvent pas être mesurées in vitro. Ainsi, seule l’utilisation de modèles animaux permettra d’évaluer l’effet des cibles thérapeutiques sur une consommation riche en FODMAPs et ainsi permettre l’obtention de résultats transposables chez l’homme. Par ailleurs, la mesure de sensibilité viscérale en réponse à une distension colorectale est aussi une pratique qui est réalisée en clinique chez les patients souffrant de colopathie.
Réduction
Les études menées précédemment au sein de la communauté scientifique et en interne ont permis d’acquérir une meilleure performance pour le bien-être animal. L’amélioration de la prise en charge post-opératoire par l’acquisition d’armoires ventilées a permis d’améliorer le réveil des animaux, d’éviter des études en répétition et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires. En raison de la variabilité inter-individuelle à la sensibilité viscérale, le nombre calculé au plus juste d’animaux nécessaire est de 15 souris par groupe, et réduit à 12 souris par groupe pour les mesures de perméabilité intestinale.
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats et limiter le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être de l’animal. A leur arrivée les animaux sont hébergés collectivement au calme et surveillés pendant une période d’acclimatation. L’acclimatation permet de récupérer du stress lié au transport et de s’adapter à leurs nouvelles conditions de vie. Ce n’est qu’à l’issue de cette période que les animaux seront inclus dans l’étude. Dans le but d’améliorer le bien-être de ces animaux captifs, des bûchettes en peuplier seront disposées dans chaque cage afin de répondre à leur besoin naturel de ronger. Une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée pour détecter à temps toute anomalie et minimiser la durée de toute souffrance constatée. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place. Toutes les mesures seront prises pour réduire la douleur (anesthésie, prise en charge de la douleur pré-post opératoire, réhydratation, tapis chauffant, armoires ventilées).
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein de la communauté scientifique. Le modèle animal murin est un modèle largement utilisé et décrit pour la mesure de la sensibilité viscérale et reproduit les principales caractéristiques du syndrome de l’intestin irritable nécessaire pour une approche globale de cette pathologie. Les animaux utilisés sont tous à l’âge adulte (6 semaines) car il est indispensable d’avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.
Réparation de la moelle épinière lésée à l’aide de l’implantation d’un hydrogel contenant un facteur du système du complément chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats mâles vont être utilisés, tous tués pour prélèvement de leur système nerveux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moelle épinière cervicale de chacun est sectionnée sur la moitié de sa largeur au cours d'une chirurgie d'une heure, avec pose d'un hydrogel, puis suivent douze semaines de tests comportementaux hebdomadaires et une séance d'électrophysiologie sous anesthésie. Le porteur indique que la lésion entraîne des pertes de motricité et de sensibilité sous le niveau lésé, des troubles de la vessie et de la régulation cardiovasculaire, et rarement de l'automutilation, tout en soulignant que le côté intact permet à l'animal de compenser. Sur le remplacement, il conclut que l'utilisation de rongeurs est "absolument indispensable et nécessaire", et retient le rat plutôt qu'une autre espèce en partie parce que son animalerie n'est habilitée que pour les souris et les rats.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité d’une protéine faisant partie de l’immunité innée dans la réparation de la moelle épinière. Il s’agira d’étudier chez le rat mâle Sprague Dawley, une nouvelle stratégie thérapeutique consistant, après une demi-lésion de la moelle épinière haute, à réparer ou préserver la moelle épinière à l’aide d’un hydrogel contenant une protéine d’intérêt. L’objectif principal étant de réduire les déficits post-traumatiques et d’entraîner des récupérations sensitives et motrices les plus complètes possible. A terme, ces résultats pourraient être transférés aux bénéfices des patients ayant subi des dommages de la moelle épinière. L’évaluation qui portera sur les récupérations sensitives et motrices et l’activité électrique des réseaux de neurones sera complétée par des analyses histologiques et biochimiques.
Bénéfices attendus
Les protéines de l’immunité innée apparaissent comme une alternative prometteuse pour préserver et réparer la moelle épinière endommagée. En effet, ces protéines ont été décrits comme participant à la réaction inflammatoire et dans le recrutement de cellules souches. Notre étude pré-clinique vise à tester l’efficacité thérapeutique d’une de ces protéines sur la réaction inflammatoire post-traumatique et la régénérescence nerveuse centrale en vue de proposer une thérapie innovante transférable à l’Homme spino-lésé. Dans le domaine de la réparation de la moelle épinière, malgré une recherche intensive depuis les cinquante dernières années, à ce jour aucune stratégie thérapeutique n’a été proposer afin de limiter la progression des déficits fonctionnels post-lésionnels et d’entraîner des récupérations sensori-motrices suffisantes permettant une récupération de l’autonomie des patients. Notre étude représente donc une étape très importante avant un transfert vers la clinique humaine.
Procédures
Chirurgie Lésionnelle (sous anesthésie) : Durée 1h / Evaluation comportementale (animaux vigile) : 1 fois/semaine pendant 12 semaines, Durée : 15 min / Electrophysiologie (sous anesthésie) : Durée 1h
Impact sur les animaux
La lésion de la moelle épinière entraîne des déficits sensorimoteurs sous-lésionnels (perte de motricité, de sensibilité, troubles végétatifs : régulation cardio-vasculaire, fonction vésicale…). Les autres nuisances éventuelles pouvant être rencontrées chez les animaux sont les infections liées à la chirurgie, les effets secondaires post-anesthésie, les douleurs post-traumatiques ou liées aux injections intrapéritonéales, le stress liés à leur manipulation (pour anesthésie, mesure périodique du poids…) ou lors des tests comportementaux, et l’hébergement individuel. Il faut également noter que les lésions nerveuses centrales peuvent rarement conduire à de l’automutilation. Toutefois, l’expérience montre que l’hémisection (lésion de la moitié) cervicale de la moelle épinière n’entraîne que rarement une perte de poids, des problèmes de miction (élimination de l’urine par la vidange de la vessie), de déshydratation ou une dénutrition post-chirurgicale. En effet, le côté de la moelle épinière laissé intact permet à l’animal de compenser les déficits végétatifs et de conserver une autonomie suffisante pour lui permettre de subvenir à des besoins.
Devenir
Mise à mort afin de prélever le système nerveux pour analyse histologique.
Remplacement
Dans le cadre de l'étude des stratégies de réparation/récupération de la moelle épinière traumatisée, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d'animaux. Les études in vitro réalisées à partir de cellules issues de mammifères livrent une quantité́ infime d’informations au regard de ce qu’il pourrait se passer chez l’Homme. Notre projet vise donc à proposer une nouvelle stratégie de préservation et/ou réparation de la moelle épinière directement transférable vers la clinique humaine. Pour cette raison, l’utilisation de mammifères (rongeurs) est absolument indispensable et nécessaire. Il n’existe pas d’alternative au modèle animal in vivo.
Réduction
Afin de mener à bien notre projet, nous devons constituer 4 groupes expérimentaux. Ces groupes seront constitués de rats males Sprague Dawley d’environ 250 g (environ 2 mois d’âge) lors de la chirurgie initiale. Des males seront choisis en raison de l’absence d’importants cycles hormonaux mensuels pouvant introduire une grande variabilité dans les résultats attendus. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, chaque animal opéré sera engagé dans les 3 étapes expérimentales successives décrites dans la chronologie du protocole. Dans la mesure où la comparaison des résultats entre les groupes sera réalisée avec des tests statistiques paramétriques (analyse de la variance), nous prévoyons, au regard de nos expériences passées, d’inclure initialement dans chaque groupe au maximum 25 animaux, soit un total de 100 animaux. Toutefois, afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, nous enrôlerons, dans un premier temps, 5 animaux par groupe, soit un total de 20 animaux. A l’issue de cette première vague expérimentale, nous calculerons, au regard des résultats obtenus et de la variabilité intergroupe, d’une puissance de 80% et d’un seuil de significativité de 5%, avec un test statistique approprié (ANOVA Power, Test de puissance, calcul du risque alpha et béta), les effectifs nécessaires pour pouvoir montrer une différence entre le groupe traité et ceux non-traités. Si le calcul indique que les effectifs nécessaires sont supérieurs à ceux envisagés initialement ou qu’aucune différence intergroupe ne peut être dégagée pour un nombre d’animaux par groupe inférieur ou égal à celui initialement prévu, nous abandonnerons l’étude et conclurons à l’inefficacité du traitement thérapeutique.
Raffinement
Du gel ophtalmique sera utilisé au cours de la chirurgie afin d’éviter l’assèchement de la cornée. Une injection de sérum physiologique glucosée permettra de réhydrater les animaux en fin de chirurgie. Une couverture antibiotique, ainsi qu’un traitement antalgique seront administrés au cours de la semaine suivant la chirurgie afin de réduire les éventuelles infections et douleurs post-chirurgicales. L’observation détaillée quotidienne (7j/7) de l’état de santé des animaux et l’évaluation de l’expression faciale permettront de prendre l’ensemble des mesures destinées à réduire la douleur et le stress. Les animaux atteignant le point limite seront euthanasiés selon la procédure réservée aux animaux éveillés décrite dans la partie « Méthode de mise à mort ». Au cours des 7 jours suivant la chirurgie, les animaux seront placés seuls dans une cage le temps que les plaies cicatrisent afin d’éviter les blessures et réouverture des plaies que pourraient occasionner les congénères. Toutefois, même si les animaux sont placés seuls dans leur cage enrichie avec des objets (tubes en polycarbonate rouge…) et de l’eau et de la nourriture à proximité (gel), ils ne seront pas à l’isolement. Leurs cages seront placées sur des portoir de cages à côté des cages des autres animaux. De l’eau et de la nourriture seront données ad libitum. A l’issue de cette période critique, ils seront replacés avec leurs congénères dans des cages enrichies avec des objets (tubes en polycarbonate rouge…) et de l’eau et de la nourriture données ad libitum. L’hébergement des animaux sera réalisé dans l’animalerie du laboratoire dont la température des locaux est aux environs de 22°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h. Nous nous efforcerons à chaque instant d’affiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, et des soins et des gestes adaptés, avec notamment, pour ces derniers, une diminution de l’angoisse et du stress des animaux par manipulation avant, pendant et après tout prélèvement, intervention et test comportemental.
Choix des espèces
Les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre chez les mammifères après une lésion de la moelle épinière sont proches de ceux de l’humain. Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de mammifères pour réaliser notre étude pré-clinique. Par ailleurs, nous avons choisi d’utiliser des rats plutôt que des primates non humains, des bovidés, des porcidés, des canidés, des félidés… ou des murinés du genre Mus dont nous n’avons aucune expertise en termes de récupération après une lésion de la moelle épinière et dont la littérature scientifique est très pauvre en ce qui concerne l’utilisation de ces genres. De plus, notre animalerie est uniquement habilitée pour héberger des murinés des genres Mus et Rattus et nous disposons de plateformes d’analyse du mouvement et des dispositifs d’enregistrement électrophysiologiques uniquement destinés à ces familles. Les animaux seront des jeunes adultes de 250 g, c’est-à-dire de 2 mois d’âge environ. Afin d'étudier les processus régénératifs et la plasticité nerveuse, il est impératif d'utiliser des jeunes adultes. L'étude de ces procéssus ne pourraient pas être réalisée chez des animaux vieillissants ou des animaux imatures.
Rôle et régulation de la thrombopoïèse pulmonaire lors d’une infection virale pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une partie des souris est génétiquement modifiée pour porter le récepteur humain du SARS-CoV-2, ce qui les rend infectables par les variants humains du virus. 5 040 souris vont être utilisées, 4 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 240 opérées sous anesthésie sans réveil. Sept jours après inoculation, le porteur décrit chez ces souris une température corporelle tombée à 25 degrés et une perte de poids supérieure à 20 %, et prévoit par ailleurs des chirurgies pulmonaires de quatre à cinq heures, des interventions sur les os du crâne, jusqu'à cinq prélèvements de sang sous la mâchoire et des injections derrière l'œil. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, rate et moelle osseuse, ce cumul de prélèvements sur un même animal étant présenté comme une mesure de réduction.
Objectifs
Les mégacaryocytes sont des cellules qui se développent dans la moelle osseuse et qui permettent la formation de plaquettes dans le sang, nécessaire notamment à la coagulation sanguine. Récemment, nous avons démontré que cette formation de plaquettes n’est pas restreinte à la moelle osseuse mais qu’elle peut aussi avoir lieu dans les poumons. Des études récentes et nos données préliminaires suggèrent que cette formation de plaquettes dans les poumons pourrait jouer un rôle clef lors d'une infection virale pulmonaire. Chez l’homme au cours des infections à Sars-CoV-2 une augmentation très importante de ces mégacaryocytes pulmonaires a été reportée chez les patients atteints de COVID-19 en comparaison à d’autres patients atteints d’autres causes de détresse respiratoire. Nous pensons que la formation de plaquettes au niveau des poumons augmente au cours des infections pulmonaires, et cette augmentation semble liée à une aggravation de la détresse respiratoire et à une inflammation aigüe. Les mécanismes y conduisant ne sont pas connus et ce sont donc ces mécanismes que nous proposons d’identifier en utilisant des modèles d’infections pulmonaires chez la souris et des techniques de microscopie intravitale. L’identification de ces mécanismes devrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques non seulement pour les infections pulmonaires comme la COVID-19 mais aussi pour d’autres pathologies inflammatoires pulmonaires comme l’asthme ou les fibroses pulmonaires où l'activation des plaquettes contribue au développement de la pathologie
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) déterminer l’implication bénéfique ou délétère de la production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales ; (ii) étudier la cinétique de production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales pulmonaires et de l’inflammation pulmonaire ; (iii) caractériser et identifier de nouveaux mécanismes de la biologie plaquettaire (production, modifications, rôles) ; (iv) identifier potentiellement des nouvelles cibles thérapeutiques dans les pathologies pulmonaires dans lesquelles les plaquettes sont impliquées.
Procédures
Dans ce projet, - Les souris sous anesthésie générale subiront une injection de virus. L’injection ne dépasse pas 1 minute. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront entre un et cinq prélèvement sanguin. Les prélèvements ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques jours plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques heures ou minutes plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une injection de molécules puis une chirugie quelques heures ou quelques minutes plus tard. Les souris anesthésiées subiront une procédure de chirurgie sur les os du crane. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris anesthésiées subiront une injection de virus, puis quelques jours plus tard une injection de cellules, et quelques heures après ils seront mis à mort par anesthésie. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie generale subiront une injection de virus. Puis quelques jours plus tard une injection de cellules sous anesthésie generale et locale. Les injections ne dépassent pas 2 min.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous utiliserons un variant du SARS-CoV-2 adapté pour infecter les souris qui induit des pertes de poids inférieures à 10% sur toute la durée de l’infection ainsi qu’une faible baisse de la température corporelle
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront mises à mort pour des prélevements de tissus et de sang.
Remplacement
Notre projet a pour but de mieux comprendre la production de plaquettes sanguines au cours des infections virales pulmonaires. Afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire suffisamment proche de l’homme. Il est impossible de ne travailler sur des modèles in vitro strictement cellulaires car il n'est pas possible pour l'instant d'obtenir en dehors d'un organisme vivant la production de plaquettes pleinement fonctionnelles. En effet cette production est dépendante du flux sanguin et de nombreuses interactions cellulaires. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation d’un organisme entier, le plus adapté étant la souris.
Réduction
Des expériences préliminaires ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les analyses statistiques seront réalisées sur un logiciel d’analyse en combinant les résultats de n=4 expériences indépendantes avec 5 souris par lot (soit 20 animaux par groupe). En fonction des résultats obtenus lors de certaines étapes clés de notre projet, nous poursuivrons ou arrêterons certaines expériences. Après mise à mort de l’animal, des prélèvements seront réalisés, afin d’obtenir le plus d’informations possibles sans avoir à utiliser d’autres animaux. Nous prélèverons par exemple à la fois le sang, les poumons, la rate et la moelle osseuse, ce qui nous permettra de réaliser plusieurs tests à partir d'un seul animal.
Raffinement
Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux. Les injections sont réalisées sous anesthésie générale. Pour la chirurgie qui est une procédure sans réveil nous utilisons aussi une anesthésie générale, combinés à des anesthésiques locaux et un analgésiant. La température corporelle et l’hydratation des animaux sont maintenues tout au long de la procédure grâce à une caisse chauffante et des injections régulières de solution saline. Un gel est appliqué sur les yeux afin de prévenir leur assèchement. Les souris infectées seront surveillées quotidiennement jusqu’à l’arrêt des procédures. La température, le poids, l’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Pour notre projet visant à explorer la biologie des plaquettes sanguines dans les infections par des virus, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques ii) de l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà présentes dans l’équipe permettant de suivre les plaquettes et les mégacaryocytes, et iii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité et de la biologie plaquettaire chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, notre projet est basé sur l’étude de la dynamique de production de plaquettes par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez la souris. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes majoritairement âgées entre 8 et 12 semaines, mais également certaines de plus de 40 semaines afin d’étudier notre modèle à différents âges chez la souris. A ces stades de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
Rôle des gènes de Salmonella dans la colonisation, la virulence et la persistance de cette bactérie– Développement/Tests d’inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité de Salmonella
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Infectées par Salmonella par voie orale à deux reprises en vingt-quatre heures, puis suivies par imagerie trois fois dix minutes par jour pendant trois jours, des souris subissent aussi une chirurgie de deux heures sur les anses intestinales, menée sous anesthésie sans réveil. 6 600 souris vont être utilisées, 3 300 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 3 300 opérées sans réveil, toutes tuées pour prélèvement des organes. L'objet est d'identifier les gènes qui permettent à la bactérie de coloniser son hôte, et de tester des inhibiteurs. Pour 3 300 souris en souffrance sévère, le porteur résume les nuisances attendues à une perte de poids et une diarrhée, tout en décrivant par ailleurs des animaux tués dès que l'expérimentateur estime qu'ils mourraient dans la demi-journée.
Objectifs
Salmonella est une bactérie pathogène importante en santé publique. Elle est responsable, suivant le sérotype, d’infections systémiques létales, de gastroentérites ou encore d’un portage asymptomatique chez l’homme et les animaux. Chez l’homme, la fièvre typhoïde touche encore 22 millions de personnes chaque année et on estime à 1,3 milliard le nombre de cas de gastroentérites à Salmonella chaque année dans le monde. Comprendre les mécanismes d’interactions d’un pathogène avec son hôte est indispensable au développement de méthodes de prophylaxie ou de thérapeutiques. Notre projet vise à (1) identifier les gènes de Salmonella impliqués dans la colonisation, la réponse de l’hôte, la virulence et la persistance de cette bactérie chez son hôte et à caractériser leur rôle ; et/ou (2) à tester des inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité des salmonelles. Après caractérisation des gènes et/ou développement/analyse d’inhibiteurs in vitro, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider les résultats obtenus in vitro, c’est à dire l’implication du gène d’intérêt dans la virulence de Salmonella, l’efficacité de l’inhibiteur. Elle permet également de caractériser plus finement le rôle du gène d’intérêt in vivo.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes d’interactions d’un pathogène avec son hôte est indispensable au développement de méthodes de prophylaxie ou de thérapeutiques. Notre projet vise à (1) identifier les gènes de Salmonella impliqués dans la colonisation, la réponse de l’hôte, la virulence et la persistance de cette bactérie chez son hôte et à caractériser leur rôle ; et/ou (2) à tester des inhibiteurs des produits de ces gènes ou de la viabilité des salmonelles. Après caractérisation des gènes et/ou développement/analyse d’inhibiteurs in vitro, l’expérimentation animale est nécessaire pour valider les résultats obtenus in vitro, c’est à dire l’implication du gène d’intérêt dans la fitness et/ou la virulence de Salmonella, l’efficacité de l’inhibiteur. Elle permet également de caractériser plus finement le rôle du gène d’intérêt in vivo.
Procédures
Les animaux seront soumis à une infection à salmonella par voie orale (2 fois à 24h d'intervalle) . Ils pourront ensuite être soumis à des prélèvements sanguins afin d'étudier la perméabilité intestinale (1 fois), à un suivi par imagerie in vivo (3 x 10 min par jour pendant 3 jours). L'inoculation de salmonella sera également réalisé grâce à la méthode des anses intestinales ( 1 fois x 2heures; chirurgie sans réveil) .
Impact sur les animaux
Dans le cas de l'infection par voie orale les animaux pouront perdre du poids et développer une diarrhée
Devenir
Mise à mort afin de réaliser le prélèvement des organes
Remplacement
Une caractérisation préalable des gènes est réalisée in vitro pour permettre la sélection des gènes les plus pertinents et pour orienter le choix des voies d’inoculation à mettre en oeuvre. Le principe de remplacement n'est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduisent pas l'ecosystème complexe au cours de l'infection et par conséquent ne permettent pas l'obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.
Réduction
L'utilisation de l'IVIS (In Vivo Imaging System) permet de suivre les souris au cours du temps et permet donc l'étude de la cinétique de la colonisation sur une même souris là où il aurait fallu les sacrifier à différents temps sans cela. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux. De plus, nous avons déjà validé certaines de nos approches expérimentales in vitro permettant d'optimiser l'utilisation des animaux. Les rongeurs utilisés sont consanguins et de même âge réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Une étude statistique est réalisée sur les données brutes d’immunohistochimie ou de FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) obtenues à partir des organes prélevés. Les tests appliqués sont des tests non paramétriques (Kruskall-Wallis one-way analysis of variance suivi d’un Mann-Whitney en post-test). Pour les niveaux de colonisation des organes par les bactéries, les tests utilisés sont des tests paramétriques (ANOVA suivi d’un posttest Tukey-Kramer) car le cumul de l’ensemble des données que nous avons obtenues depuis plus de 10 ans concernant ce caractère montre que ces données suivent une loi normale. Ceci nous permet lorsque nous souhaitons uniquement comparer le niveau de colonisation de plusieurs souches de diminuer le nombre d’animaux pour obtenir la même puissance de test.
Raffinement
Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit grâce au suivi rapproché quotidien des animaux, l’enrichissement de leur environnement (coton ou sopalin afin qu'ils puissent faire un nid) et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). De plus une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant l'expérimentation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Dans le cas du modèle de portage, les souris ne présentent aucun symptôme. Un animal est euthanasié lorsqu’il présente des difficultés à se mouvoir après une stimulation et que l’expérimentateur juge que l’animal décèdera dans la ½ journée suivante c’est-à-dire avant la prochaine visite de l’expérimentateur afin d’éviter toute souffrance inutile. Ceci est rendu possible grâce à l’expérience acquise par l’équipe depuis plus de 15 ans. Les expérimentateurs « novices » travaillent en binôme tant qu’ils n’ont pas acquis l’expérience nécessaire De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Lorsque la procédure le nécessite les animaux seront anesthésiés à l’isofurane.
Choix des espèces
La souris est particulièrement pertinente pour étudier les infections à Salmonella en choisissant la bonne lignée de souris puisque nous reproduisons ainsi une infection naturelle. Le modèle gastroentérite a été montré dans la littérature comme reproduisant l’infection et la réponse immunitaire au cours d’une gastroentérite chez le veau, où Salmonella est responsable naturellement d’une gastroentérite. L’utilisation de ce modèle murin de « gastroentérite » est justifiée par rapport au modèle bovin par le moindre coût, la moindre lourdeur et la plus grande disponibilité des animaux. Les souris utilisées sont adultes, elles ont entre 8 et 12 semaines et ce, conformément aux modèles établis dans la littérature
Nouvelles formes de traitement ARN par voie orale dans les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Cinq jours de traitement destiné à enflammer l'intestin, quatre injections ou quatre gavages selon le groupe, puis une coloscopie sous anesthésie au dixième jour. 45 souris mâles de neuf à dix semaines traversent ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec pertes de poids et saignements possibles. Le porteur qualifie l'induction de l'inflammation de traitement sévère mais "nécessaire", et s'appuie sur une dose largement utilisée dans la littérature et sur un modèle qu'il décrit comme maîtrisé depuis longtemps. La coloscopie terminée, elles sont tuées sans reprendre conscience, et le foie, le cœur, la rate, l'intestin entier, les ganglions, le sang, les urines et les selles sont prélevés.
Objectifs
Nous développons une nouvelle méthode d’administration de traitement anti-inflammatoire dans les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI) comme la maladie de Crohn et la Rectocolite Hemorragique. Les études in vitro et in vivo ont d’ores et déjà montré des résultats prometteurs, permettant le dépôt d’un premier brevet. L'objectif général est de développer une stratégie alternative aux produits biologiques (anticorps administrés actuellement par voie injectable) dans le traitement des MICI modérées à sévères, par l'administration locale de petites molécules à base d'ARN, enveloppés dans des microcapsules qui peuvent être administrées par voie orale. Cette nouvelle technologie présente de nombreux avantages par rapport aux traitements conventionnels : (1) réduction des effets indésirables grâce à une action locale ; (2) diminution des effets secondaires par rapport aux anticorps injectés largement utilisés à l’heure actuelle (3) action simultanée possible sur plusieurs cibles en délivrant différentes petites molécules en une seule fois, à l'instar des stratégies biologiques doubles utilisées chez les patients atteints de MICI réfractaires (4) administration orale beaucoup moins contraignante par rapport aux voies injectables, permettant une meilleure observance thérapeutique. Pour optimiser et valider la stratégie d'administration orale de nos molécules à l'aide de microcapsules, les objectifs sont maintenant l'évaluation préclinique, sécurité et efficacité de nos microparticules par rapport aux produits biologiques conventionnels dans un modèle bien caractérisé d'inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
Les petites molécules à base d’ARN vont inhiber localement l’expression de protéines cibles impliquées dans la réponse inflammatoire. Ce projet permettra donc à long terme de développer une stratégie alternative aux produits biologiques afin de traiter les MICI modérées à sévères. Grâce à l’administration orale de petites molécules permettant d’améliorer l’observance thérapeutique des patients puisque la voie orale est beaucoup moins contraignante et risquée que les traitements injectables utilisés aujourd'hui chez les patients souffrants de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin.
Procédures
4 interventions seront réalisées durant ce projet : (1) Le traitement pro-inflammatoire pour "imiter" les symptômes d'une Maladie Inflammatoire Chronique Intestinale sera réalisé sur tous les animaux (45 souris) durant 5 jours. (2) Les injections du traitement de référence chez 9 animaux ou d’une solution tampon chez les autres animaux seront réalisées sur animal vigile 4 fois au cours du protocole (durée : quelques secondes). (3) L’administration par voie orale des microcapsules ou d’une solution tampon sera réalisée sur animal vigile 4 fois au cours du protocole (durée quelques secondes). (4) L'endoscopie rectale : examen de quelques minutes (10 min maximum) réalisé le dernier jour du protocole (10ème jour) sous anesthésie générale sur la totalité des animaux juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
L’induction d’une inflammation de l’intestin (intervention n°1) réalisée sur tous les animaux est un traitement sévère pour les animaux mais nécessaire pour étudier l’inflammation intestinale. Les souris pourront perdre du poids ou présenter des saignements pendant la durée du traitement. Cependant, la dose administrée est une dose très largement utilisée dans la littérature scientifique. C’est un modèle maîtrisé depuis longtemps. Il est à noter que la sévérité de la réponse au traitement est aussi très dépendante de l’environnement de l’animal et que de par nos protocoles antérieurs, les symptômes sont rapidement identifiés afin d'intervenir sans délai et ainsi limiter la souffrance des animaux. Aucun effet indésirable n'est attendu concernant l'administration des molécules anti-inflammatoires aussi bien par voie injectable (intervention n°2), en s’appuyant sur la littérature scientifique ; que par voie orale (intervention n°3) en s’appuyant sur le protocole initialement réalisé dans un modèle similaire d'inflammation chez la souris. L'administration par gavage ou par injection étant réalisé par un zootechnicien qualifié maîtrisant les gestes interventionnels, ceci limite le risque de nuisance pour les animaux. Enfin, concernant la coloscopie (intervention n°4), elle est réalisée sous anesthésie générale et suivie de la mise à mort des animaux donc sans nuisance ni effets indésirables.
Devenir
Les interventions successives sont réalisées sur animal vigile, seule la dernière (coloscopie) est réalisée sous anesthésie générale et à l’issue de celle-ci les animaux sont mis à mort sans réveil afin que tous les organes (foie, cœur, rate, intestin entier, ganglions mésentériques) ainsi que le sang, les urines et les selles soient prélevés.
Remplacement
A ce jour, les maladies intestinales ne peuvent pas être entièrement reproduites par des modèles cellulaires. En effet, la physiologie intestinale est complexe car elle implique plusieurs systèmes distincts notamment le système digestif, le système immunitaire et la flore intestinale. Aussi, les réponses inflammatoires sont des processus temporels et évolutifs impliquant des organes extérieurs au tube digestif, il n’existe donc pas de remplacement possible du modèle animal pour explorer l'effet thérapeutique de notre nouvelle technologique d'administration d'un traitement anti-inflammatoire.
Réduction
Afin de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, 45 souris (4 groupes expérimentaux de 9 animaux et un groupe témoin de 9 animaux également) seront nécessaires dans cette étude afin d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux. Le nombre de souris nécessaires a été calculé par une approche statistique sur la base d'études antérieures menées au sein du laboratoire, dans la même animalerie et sur le même modèle expériemntal pour permettre les analyses statistiques a postériori.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe de 4 à 5 animaux, dans des cages ventilées, avec à disposition du papier, des cabanes en carton pour se cacher et grimper, des buchettes de bois pour usure des dents et autres matériaux d’enrichissement tout au long du protocole. Toutes les interventions expérimentales seront réalisées par des personnes formées et expérimentées. Elles auront lieu dans l’animalerie du laboratoire, dans un environnement sécurisant pour l’animal et les coloscopies se feront sous anesthésie générale. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place. Le point limite est fixé selon un score défini au préalable et en tenant compte des signes éventuels de mal-être. En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biologiques. Le modèle d'inflammation est un modèle bien maîtrisé et les symptômes sévères sont repérés rapidement afin de limiter la souffrance des animaux et intervenir sans délai.
Choix des espèces
Il n’existe pas d’alternative pour étudier l’effet d’une nouvelle molécule dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin car : - La physiologie de l’intestin est complexe d’une part, et la réponse inflammatoire implique de nombreux acteurs présents dans l’ensemble de l’organisme. Les cultures cellulaires ont montré des résultats intéressants mais ne sont donc pas suffisantes pour valider l'effet anti-inflammatoire sur organisme entier. - La sévérité de l’inflammation étant évaluée notamment par endoscopie rectable, l’utilisation de l’animal comme modèle d’étude est donc indispensable. - Le choix du modèle murin permettra de comparer nos résultats avec d’autres études réalisées avec des modèles transgéniques (modèle de colite spontanée Il10-/- où l’inflammation est chronique et non aiguë). Les animaux utilisés sont des souris mâles car la réponse à la colite est plus variable chez les femelles. L'âge fixé des animaux est de de 9 à 10 semaines correspondant au passage à la maturité sexuelle chez la souris soit au stade « jeune adulte » car les MICI sont des maladies du jeune adulte donc cela correspond aux besoins du projet.