Procédures sévères

Des métastases hépatiques implantées par chirurgie, un jeûne de dix à douze heures suivi d'une nuit de régime carencé en un acide aminé indispensable, l'isolement en cage individuelle pour contrôler les prises alimentaires, deux séances d'imagerie par semaine avec un trajet de quatorze kilomètres à chaque fois: 1 845 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 686 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La rubrique consacrée aux atteintes ne dit rien des métastases elles-mêmes. Elle décrit des piqûres qui "génèrent des douleurs courtes et légères", une opération de trente minutes après laquelle "les souris récupèrent rapidement", et un isolement compensé par un tube rouge et une bille métallique. Toutes sont tuées, celles qui portent des métastases ou des tumeurs pour que le foie ou la tumeur soit analysé, les autres parce qu'elles ne peuvent pas être réutilisées.

Objectifs

Nos recherches ont pour but d’étudier les mécanismes d’adaptation à un stress nutritionnel chez les mammifères. Au cours de la dernière décade, nous avons démontré, dans des cellules en culture, le rôle clé joué par une voie de signalisation endogène dans la réponse à différents stress incluant la carence en acides aminés. En particulier, nous avons mis en évidence que cette réponse nécessite la fixation d'un facteur de transcription à un élément ADN de régulation. Ce mécanisme entraîne l’activation de la transcription de gènes cibles spécifiques. L’ensemble de ces résultats nous a permis de concevoir un système d’expression génique inductible (comprenant plusieurs copies d’éléments ADN de régulation) contrôlable par une manipulation nutritionnelle. Nous avons mis au point (i) un promoteur artificiel fortement inductible par une carence en un Acide Aminé Indispensable (AAI) encapsulé dans un vecteur de thérapie génique et (ii) une nourriture déséquilibrée en AAI qui entraîne une forte baisse de la concentration sanguine de l’AAI limitant et qui permet l’induction du transgène. En utilisant le gène rapporteur luciférase, nous avons apporté la preuve de concept de la fonctionnalité de ce système d’expression inductible. Notre technologie a permis de lever une limitation majeure à l'utilisation de la thérapie génique qui est la nécessité de moduler de manière non toxique l'expression d’un transgène en termes de durée et de niveau d'expression. ll est maintenant nécessaire de valider notre système de régulation génique dans un modèle de pathologie pour pouvoir envisager des tests cliniques chez l'homme. Pour son intérêt médical, sa faisabilité, et son transfert rapide en médecine humaine, nous avons choisi le modèle des Métastases Hépatiques du Cancer Colorectal (MHCC). En effet, (1) elles concernent 50% des patients, avec seulement 25% de survivants à 5 ans, (2) nous avons montré que notre voie de régulation est très réactive dans le foie et (3) l’utilisation de notre technologie apportée par un vecteur viral nous a déjà permis de valider l’efficacité de l’expression d’un gène pro-apoptotique ciblant les tumeurs sur des xénogreffes de souris. Notre objectif est donc de montrer que l’induction contrôlée du gène pro-apoptotique permet de traiter les MHCC et de montrer l’effet synergique avec les molécules de chimiothérapie déjà utilisées en clinique.

Bénéfices attendus

La validation de la fonctionnalité de notre technologie dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal est une étape importante dans le transfert de cette technologie à l’Homme. In fine, les bénéfices attendus sont le traitement des patients qui ont subi des chimiothérapies inefficaces et qui ne répondent malheureusement pas aux immunothérapies actuelles.

Procédures

Les souris seront soumises à des prises de sang (sur animal vigile, 2 à 3 fois au cours de l’expérimentation, et jusqu’à 10 fois par an et demi pour les souris qui seront suivies sur le long cours). Elles auront également une injection de vecteurs de thérapie génique sur animal vigile, et elles seront soumises à un protocole nutritionnel impliquant une phase de jeûne sur la journée (période de repos chez les souris), suivi d’une période de consommation d’un régime carencé en un acide aminé indispensable sur la nuit (période active), et enfin consommation d’un régime contrôle de récupération sur 24h, ceci de façon à pouvoir induire la production de la protéine médicament. Ce traitement sera complété par des injections sur animal vigile d’un anticorps (3 à 5 injections par souris) et/ou d’un traitement de chimiothérapie (1 à 3 injections par souris) afin d’en évaluer l’effet combiné. Selon le modèle d’expérimentation, une procédure chirurgicale sera réalisée pour implanter les métastases hépatiques (sous anesthésie et analgésie, l’opération dure environ 30 min) ou une injection de cellules cancéreuses sous la peau sera réalisée sur animal vigile. Si l’état général des souris le permet, 2 analyses bioluminescentes par semaine seront effectuées grâce à un bioimageur. Ces mesures permettront de suivre le développement des métastases bioluminescentes de manière non invasive. Elles nécessitent un transport depuis leur lieu d’hébergement vers le plateau d’imagerie situé à 14 km, une double injection d’une protéine nécessaire à l’émission de bioluminescence sur animal vigile 10 minutes avant la mesure (au total 300 µL injectés), et une anesthésie afin qu'elles restent immobiles pendant la mesure.

Impact sur les animaux

(1) Afin de faire un contrôle individuel de la consommation du régime carencé, il est nécessaire d’isoler les animaux (un animal par cage). Une période d’habituation et un enrichissement du milieu sont mis en place pour réduire le stress qui peut survenir en cas d’isolement des congénères. (2) L’induction de la protéine médicament nécessite une période de jeûne de 10h à 12h (qui a lieu sur la journée, période où les souris sont en phase de repos) suivi d’une période de consommation du régime carencé de 12 à 14h (sur la nuit, pendant leur période active). (3) La chirurgie nécessaire à l’implantation des métastases pouvant causer de la douleur, elle est réalisée sous anesthésie et analgésie. L’opération dure 30 min et les souris récupèrent rapidement (comportement normal dans les heures qui suivent). (4) Les piqûres (prises de sang, injections) génèrent des douleurs courtes et légères. Ces gestes techniques rapides sont réalisés par du personnel expérimenté afin de réduire stress ou douleur et sont réalisés dans le respect de la réglementation pour ce qui concerne les volumes et la fréquence de prélèvement ou d’injection.

Devenir

Chaque procédure impliquera une mise à mort des animaux, à plus ou moins long terme, selon les expérimentations. En effet, pour les procédures impliquant des métastases ou des tumeurs sous-cutanées, il est nécessaire de mettre à mort à l’animal afin d’étudier soit le foie soit les tumeurs sous-cutanées, et d’évaluer ainsi l’efficacité du traitement. Les procédures ne nécessitant pas de générer des métastases ou des tumeurs sous-cutanées nous permettent de garder les animaux en vie plus longtemps, afin d’étudier la stabilité de l’inductibilité du transgène. Néanmoins, nous ne pourrions pas les réutiliser pour d’autres projets, aussi, ils seront mis à mort à l’issue des expérimentations.

Remplacement

De nombreuses expériences préliminaires ont été réalisées in vitro sur plusieurs lignées de carcinome colique. Elles ont permis tout d'abord de tester l'efficacité de TRAIL pour induire la mort cellulaire des cellules d’intérêt, puis de tester l’effet de la combinaison de TRAIL avec l'anticorps MD5 (dirigé contre le récepteur de TRAIL), et enfin de sélectionner une série de molécules capables de faciliter l'action apoptotique de TRAIL couplé à MD5, dont celles utilisées en clinique (5-Fu + Oxaliplatine). Ces expériences ont permis dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire à ce projet, nous avons choisi de faire des études pilotes avec un petit nombre d’animaux, de manière à valider ou infirmer des paramètres clés qui seront décisifs pour les études à plus grande échelle. Les nombres d’animaux indiqués dans les procédures sont néanmoins évalués au maximum, si toutefois les premiers essais n’étaient pas concluants et que nous étions amenés à en faire de nouveaux avec d’autres doses notamment. Pour ce qui concerne les procédures impliquant des métastases, celles-ci ayant une grande diversité inter-individuelle, nous ne pouvons pas réduire le nombre d’animaux par groupe, en effet, un trop faible nombre d’animaux ne nous permettrait pas de conclure de manière fiable. En revanche, nous avons choisi de transformer les cellules afin qu’elles expriment la luciférase de manière constitutive. Une imagerie in vivo nous permet de suivre le développement des métastases sans sacrifier l’animal, grâce à une méthode non invasive, permettant ainsi d’obtenir plus d’information sans augmenter le nombre d’animaux. Pour ce qui concerne les études de clairance ou encore d’évaluation de la stabilité de l'inductibilité de du transgène, nous avons choisi de faire une étude longitudinale afin de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Afin de diminuer le stress dû à l’isolement des animaux, une période d’habituation et un enrichissement du milieu sont mis en place (tube rouge, bille métallique, et/ou coton pour nidification). La chirurgie pour la génération du modèle de MHCC est réalisée en prenant plusieurs dispositions pour diminuer l’inconfort et la douleur et augmenter le bien-être animal : elle est réalisée 1) sous anesthésie et analgésie afin de limiter la douleur, 2) sur une peau précédemment tondue et désinfectée afin de limiter toute infection, 3) sur un tapis chauffant de manière à pallier au manque de thermorégulation qui se produit sous anesthésie, 4) en appliquant un collyre pour éviter le dessèchement des yeux pour pallier à l’absence de clignement des yeux qui se produit également sous anesthésie. Si un animal présentait un état douloureux inacceptable ou des signes de mal-être important, il sera examiné par un responsable de la mise en œuvre du projet, et mis à mort si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est l'animal de référence dans ce type d'étude. Il existe en effet un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal décrit dans la littérature, qui mime relativement bien ce qui se passe chez l’Homme. Ce modèle permet d’obtenir rapidement des métastases, dont on peut suivre la croissance par mesure de bioluminescence. Stade adulte (3-4 mois) afin de s’affranchir des effets liés au développement de l’animal ou par la suite de ceux liés au vieillissement.

Une grille de score fixe le seuil de souffrance à partir duquel les souris sont tuées avant terme. Au total, 176 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la moitié et sévère pour l'autre, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Parmi elles, 88 subissent une hémisection de la moelle épinière sous anesthésie, avec paralysie d'une patte arrière, perte du contrôle urinaire et risque d'escarres, et 80 reçoivent des injections quotidiennes pendant les sept jours qui suivent. L'objectif est de voir si l'absence d'une protéine de la cicatrice médullaire améliore la récupération, et le porteur justifie l'emploi d'animaux adultes par le fait que les jeunes récupèrent trop spontanément pour permettre des statistiques fiables.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière (LME) touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs chroniques. Bien que les LME touchent des personnes relativement jeunes (moyenne d’âge à 40 ans), le nombre de patients plus âgés est en nette croissance dans les pays industrialisés. L’étude de cette pathologie représente un enjeu majeur. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une LME. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une LME. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle à la transmission des informations depuis le cerveau au reste du corps ainsi que du corps vers le cerveau. Nous voulons étudier si l’absence d’expression de l’un des facteurs associé a cette cicatrice favorise une meilleure récupération après une lésion de la moelle épinière.

Bénéfices attendus

Les lésions de la moelle épinière (LME) induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement permettant de soigner les patients. Développer des travaux visant à favoriser la récupération après lésion de la moelle épinière représente donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Les lésions de la moelle épinière étant d’origines variées chez l’homme (section par arme blanche, choc et écrasement…) nous utilisons des modèles similaires chez l’animal car ils représentent actuellement l’approche expérimentale la plus pertinente pour comparer à la pathologie humaine. Nous cherchons à caractériser les conséquences de l’absence d’expression d’une protéine du système nerveux au niveau de la moelle épinière dans un contexte physiologique et pathologique tant sur le plan cellulaire et tissulaire que comportemental. Nous obtiendrons des informations sur le rôle de cette protéine qui reste méconnu à ce jour et l’étude à différents temps après lésion permettra de déterminer précisément son importance à la fois juste après lésion moelle épinière mais également longtemps après chez les deux sexes et d’envisager des stratégies appropriés pour une approche visant à développer des thérapies adaptées.

Procédures

Tout ou partie des animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale et analgésie (30 min ; n=88) . Les animaux seront évalués au niveau comportemental (n=96) pour déterminer les fonctions motrices et évaluer l’anxiété avant et après lésion de la moelle épinière. L’évaluation comportementale analysera l’activité motrice spontanée durant 8 minutes, la marche et la coordination des animaux durant 10 minutes et la force d’agrippement des animaux (2 minutes par animal par session). Les manipulations peuvent engendrer un stress léger. Les tests seront faits 7 jours et 24 heures avant la lésion, puis à J3, J5, J7, J10 et J14 postopératoire puis 1 fois par semaine jusque 6 semaines post-opératoires. Les comportements de type anxieux seront évalués par des tests qui évalue la qualité du nid fait par un animal durant 24 heures, le temps de toilettage durant 5 minutes, et le temps que met l’animal à aller au contact de la nourriture durant 5 minutes. Ces tests seront effectués deux fois, au début et à la fin de la procédure. Une partie des animaux (n=80) recevra des injections quotidiennes (moins d’1 minute) en intra-péritonéal durant 7 jours juste après la lésion, ou à un âge équivalent pour les animaux non lésés. Tous les animaux recevront une injection en sous cutanée d'anesthésique local (moins de 1min) puis une injection en intra-péritonéal d’anesthésique (moins d'1 minute) afin de procéder aux prélèvements de tissus post-mortem.

Impact sur les animaux

Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée. Les injections quotidiennes en intra-péritonéal peuvent induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion de la moelle épinière (hémisection). Une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré après une hémisection, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection. Suite à la chirurgie les animaux sont observés quant au développement de signes légers relatifs à la détérioration de l’état de santé de l’animal. 24-48hrs suivant la lésion, les animaux peuvent présenter des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de dominance peuvent être observés. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.

Devenir

A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques et cellulaires.

Remplacement

Pour éviter l'expérimentation animale, on encourage l'utilisation de cultures de cellules nerveuses. Cependant, ces cultures ne peuvent pas reproduire entièrement la complexité des organismes vivants. Les modèles animaux de traumatisme de la moelle épinière sont actuellement considérés comme la méthode la plus adaptée pour étudier cette pathologie, car ils reproduisent de manière fidèle les différents aspects pertinents chez l'humain. Ces modèles permettront d'explorer les changements provoqués par l'absence d’expression d’une protéine du système nerveux et faciliteront l'évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. L'utilisation d'animaux est nécessaire à cette étape préclinique et demeure cruciale pour envisager des applications cliniques.

Réduction

Les animaux sont utilisés pour plusieurs analyses, les deux sexes sont utilisés. Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisées précédemment au laboratoire. Nous avons également calculé le nombre d'animaux avec un logiciel de biostatistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant des effectifs pertinents pour répondre à notre hypothèse biologique

Raffinement

Les croisements sont effectués de manière à éviter d’effectuer du génotypage qui est une source de stress pour les animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont croisés entre eux et les animaux sauvages également . Les deux souches sont sous le même fond génétique. Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants et d'analgésiques adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées. Afin de réduire la souffrance : soins quotidiens spécifiques. L'absence de signes anormaux sera vérifié 2 fois par jour après la lésion. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les LME, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Ces souris génétiquement modifiées n’expriment pas une protéine du système nerveux central. Cela en fait donc un modèle de choix pour déterminer les conséquences de l’absence de cette protéine dans un contexte physiologique et après une lésion médullaire. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 1, 2 ou 6 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée non seulement plus importants mais surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique.

Chacune des 2 718 souris de ce projet subit l'ouverture du crâne et la pose d'une fenêtre d'imagerie de trois millimètres sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Pour 420 d'entre elles s'ajoutent un traumatisme crânien ou l'implantation de cellules tumorales et jusqu'à deux injections dans l'arrière de l'œil, afin d'observer comment se déforme l'espace situé entre les cellules du cerveau. Les souris sont tuées pour prélever le cerveau entier, à l'exception de celles qui portent un dispositif d'injection implanté, que le texte annonce maintenues en vie. La réduction du nombre d'animaux repose, selon le porteur, sur l'emploi des mâles comme des femelles et sur "des années d'expérience", sans qu'aucun calcul ne vienne justifier ces 2 718 souris.

Objectifs

Environ 25% du volume cérébral est occupé par l'espace extracellulaire (ECS) qui correspond à l’espace se trouvant entre les cellules et qui sert d’environnement à l’échelle microscopique pour le cerveau et forme un chemin de communication chimique entre les cellules. Il a été montré que la structure et la diffusion de l'ECS sont composés d’éléments de nature différentes et qu'elles dépendent de conditions internes et externes, telles que le système de sommeil/éveil ou d’un œdème cellulaire provoqué par un traumatisme cérébral. De plus, l’ECS fournit un réservoir pour les ions impliqués dans l'activité électrique des neurones et joue un rôle clé dans la transmission de substances entre les cellules. Ainsi, l’ECS n'est pas seulement le siège de toutes sortes d'interactions cellule-cellule, mais peut également jouer un rôle important dans des fonctions neuronales cruciales, telles que la mémorisation ou la formation de circuits neuronaux. Afin de visualiser la structure de l'ECS à très petite échelle (nanomètre), nous utiliserons une nouvelle approche d'imagerie, à savoir la technique de Shadow imaging (SUSHI). C'est une méthode de marquage où un produit fluorescent est injecté localement dans le cerveau afin de visualiser l’ECS avec une très haute résolution. En outre, comme le produit fluorescenr ne pénètre pas les cellules saines, toutes les cellules apparaissent en noires, ce qui permet d'imager également la structure anatomique des cellules non marquées. Cette méthode présente de grands avantages puisqu’elle n’est pas sensible à la perte de fluorescence de la molécule (la diffusion du produit fluorescent permet de maintenir un signal constant) ni à la toxicité (puisque le produit fluorescent reste en dehors des cellules). Dans ce projet, nous comptons tester plusieurs produits fluorescents qui présentent tous une gamme de longueur d’onde proche de celui de la GFP (Protéine fluorescente verte) et ne pénètrent pas les membranes cellulaires.

Bénéfices attendus

Cette technique sera utilisée pour imager l’ECS au travers d’un dispositif d'imagerie posée soit sur le cortex soit sur l’hippocampe (petite partie du cerveau qui sert pour la mémoire, le comportement et certaines émotions). Partant de là, nous nous proposons d'effectuer des séances d'imagerie répétées d’un même animal pour cartographier, sur animal vivant et avec une résolution spatiale inédite, la morphologie de l’ECS et caractériser la dynamique (quelques minutes à quelques semaines) des structures fines de l’ECS afin de voir les interactions cellule/cellule à l'échelle des circuits intégrés.

Procédures

Toutes les souris auront la pose d'un dispositif d'imagerie (2718 souris). Pour avoir ce dispositif il faut procéder à une chirugie sur animal endormi qui dure environ 1h avec utilisation de produits anti douleur. Un dispositif d'imagerie de 3mm de diamètre sera fait dans le crâne de la souris et une lamelle sera posée dessus afin de protéger le cerveau de l'extérieur. 1770 souris auront une injection directe dans le cerveau pendant qu'elles seront endormies. L'injection prendra environ 15 minutes et sera faite qu'une seule fois sur ces souris. 948 souris auront une pose d'un dispositif implantatoire dans le cerveau permettant d'injecter plusieurs fois le produit fluorescent. Ce dispositif implantatoire sera posée pendant la chirugie pour le dispositif d'imagerie. Chaque souris de ce groupe aura un dispositif implantatoire et plusieurs injections dans le temps d'une durée de 15 minutes environ chacune. Une injection rétro-orbitales sera faite sur 420 souris. Une injection par oeil et 2 injections par animal au maximum. L’induction d’un traumatisme cranien (impact fait en une fraction de secondes) et l’induction de cellules tumorales (une dizaine de minutes) sera faite sur un total de 420 souris. Toutes les souris auront une préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires après une ou plusieurs injections injection (si la souris a un dispositif d'injection ou non). Cette préparation des tissus se fera sur animal endormi avec utilisation d'anti douleur. L'animal sera ensuite euthanasié et le cerveau sera récupéré.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et l'induction du traumatisme cranien et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies, injection retro-orbitale et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. Le risque de rejet des animaux non sevrés et le stress de la séparation peuvent également entrainer une nuisance ou un effet indésirable.

Devenir

Les souris subissant la préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires seront euthanasiées à la fin de l'expérimentation afin de prélever le cerveau entier. Les souris ayant subi une chirurgie pour l'implantation d'un dispositif d'imagerie seront utilisées pour la microscopie puis euthanasiées à la fin de l'expérimentation si elles ne sont pas utilisées pour la préparation des tissus. Les souris ayant un dispositif implantatoire seront maintenues en vie.

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. L’objectif de ce projet étant de caractériser l’ECS dans les conditions les plus naturelles possibles, cette étude ne peut être réalisée de manière pertinente avec des modèles sur ordinateurs (in silico) ou sur micro-organismes, organes ou cellules en dehors de leur contexte naturel (in vitro). Le microscope sera, dans un premier temps, validé en imageant de toutes petites particules (nanoparticules) fluorescentes. Toutefois, ces échantillons ne permettent pas réellement de reproduire l’ensemble des paramètres optiques observés dans les échantillons biologiques. C’est pourquoi une seconde étape de validation dans des tranches organotypiques (tranches de partie de cerveau sur une lamelle) apparait cruciale pour optimiser les conditions d’imagerie qui seront utilisées à terme pour l’imagerie sur animal vivant (in vivo).

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode de production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'Homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'Homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'Homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 1 et 21 jours. Puis sur ces mêmes animaux de 2 à 6 mois, période qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une meilleure reproductibilité des résultats.

Aspergées d'urine de mâle, séparées de leurs petits dix minutes par jour ou livrées six jours de suite à des mâles agressifs, des souris mères vont être utilisées pour provoquer un traumatisme précoce chez leurs souriceaux. Au total, 964 souris sont engagées dans ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 510 d'entre elles et sévère pour 454. Les souriceaux passent ensuite des tests d'anxiété, d'anhédonie et de résignation, à l'adolescence puis à l'âge adulte, avant que 454 souris soient tuées, les mères, les petits et trente mâles agressifs rejoignant l'élevage ou d'autres expériences. Le porteur écrit que l'analgésie et le renforcement positif ne peuvent être envisagés, puisque la douleur psychique visée forme la base même du modèle.

Objectifs

Les expériences de vie précoce pendant l’enfance, qu’elles soient positives ou négatives, peuvent laisser des traces indélibiles sur le cerveau et le développement psychologique. En effet l’exposition précoce à des traumatismes psychosociaux, incluant entre autres la maltraitance infantile, est indiscutablement l’un des plus importants facteurs prédicteurs de pathologies psychiatriques à l’adolescence et à l’âge adulte, notamment de la dépression et du suicide. Différents modèles animaux chez la souris ont été mis en place pour étudier les conséquences du stress précoce sur le développement cérébral et psychologique, mais ces modèles se concentrent principalement sur des périodes tardives du développement (après le sevrage), et nos connaissances des effets à long terme sur le cerveau du stress infantile sont extremement limitées. Nos connaissances des mécanismes cellulaires participant à la formation et à la persistance des mémoires traumatiques précoces sont aussi très lacunaires. Afin d’étudier ces mécanismes, nous nous proposons ici de mettre en place et de tester la validité d’une procédure de stress indirect (l'expositition indirecte de souriceaux à l'agression physique de leur mère) basée sur l’experience sensorielle et la contagion émotionnelle, pouvant mimer chez la souris un traumatisme psychologique infantile avant le sevrage des animaux. Nous testerons finalement comment cette expérience peut precipiter la survenue de comportements de type anxieux et dépressifs à l’adolescence et l’age adulte.

Bénéfices attendus

Il n’existe actuellement aucun modèle animal permettant d’étudier les conséquences du trauma infantile sur le cerveau. Pour autant, l’adversité précoce est sans conteste le premier facteur de vulnérabilité pour les maladies psychiatriques telles que la dépression, les troubles anxieux, le syndrome de stress-posttraumatique, et pour le suicide. Outre la souffrance morale induite par ces pathologies, elles constituent un enjeu majeur de sante publique compte tenu du fardeau socio-économique engendré. Ces pathologies sont difficiles à prendre en charge, avec des traitements qui sont actuellement peu satisfaisants en termes de cout et d’efficacité. La mise en place d’un modèle pertinent de trauma psychosocial infantile permettrait dans ce cadre de mieux comprendre, d’un point de vue fondamental, comment le stress précoce affecte le cerveau et son développement. Cela permettrait également de disposer d’un outil pertinent pour étudier les mécanismes cellulaires mis en jeu dans la formation et la persistance des mémoires traumatiques précoces, et comment elles influent notre comportement. Si l’objectif à court terme de cette recherche fondamentale n’est pas la mise au point d’un outil thérapeutique visant à améliorer la prise en charge de populations cliniques victimes de trauma psychosocial pendant l’enfance, il est certain qu’une étape indispensable vers cet objectif est la compréhension des mécanismes neurobiologiques mis en jeu.

Procédures

- 8 mères ne subiront aucune manipulation (groupe contrôle) - 16 mères subiront une aspersion d'urine de mâle. - 16 mères subiront une séparation de leurs petits de 10 min pendant 6 jours. - 16 mères seront exposées à des comportements antagonistes (défaite sociale) durant 10 min et répétés sur 6 jours - 16 mères seront aspergées d'urine de mâle et isolées 10 min de leur petit, et cela, à un rythme d'une fois par jour sur 6 jours. - 60 mâles seront utilisés pour sélectionner des individus agressifs. - 40 souris sentinelles seront utilisées pour sélectionner des individus agressifs. - 360 petits seront pesés soit entre 3 et 8 jours postnatal soit entre 14 et 21 jours apres la naissance. - 160 petits seront utilisés dans des tests comportementaux, deux fois par test (une fois pendant l'adolescence, l'autre fois à l'age adulte). Ces tests sont effectués au cours de sessions uniques, allant de 3 à 10 minutes, et visent à mesurer les comportements sociaux, les conflits motivationnels et l'anxieté, l'anhédonie et la résignation des animaux.

Impact sur les animaux

Le modèle de défaite sociale (DS), qui consiste à être exposé à des comportements antagonistes de facon répetée induira de la douleur physique chez les mères sujettes directement au modèle. Il induira également de la douleur psychique, un état de stress aigu pendant la procédure mais aussi durable, en induisant possiblement un phénotype anxiodépressif chez les souris exposées au modèle. Cette douleur psychique est la base du modèle, l’objectif étant d’étudier comment ces changements comportementaux sont transmis aux souriceaux des mères exposées ou modifient leur comportement. L’exposition indirecte à la défaite sociale des souriceaux n’aura aucune incidence d’un point de vue physique, puisqu’elle n’est effectuée que sur les mères. Il est possible cependant que dans l’éventualité où la DS perturberait le comportement maternel, cela induise une détresse physiologique et sensorielle des souriceaux en diminuant la qualité des soins fondamentaux promulgués par leur mère. C’est pour cette raison qu'une attention particulière sera donnée au monitoring des souriceaux et du comportement maternel tout au long du protocole. Par ailleurs si notre hypothèse est validée, il est possible que le modèle induise chez les souriceaux une détresse psychique liée au stress, ce qui est notre objectif, afin d’étudier les substrats neurobiologiques et conséquences comportementales de ce stress. Etant donné que les tests de comportement sont basés sur des mesures quantitatives ou qualitatives d’exploration dans des dispositifs nouveaux et donc possiblement anxiogènes, il est possible que les tests utilisés puissent induire un stress léger chez les animaux. Ces tests sont cependant de courtes durées (10 minutes maximum), et ne sont pas basés sur des situations hautement aversives. Ces tests ne sont d’ailleurs pas connus pour induire de changements physiologiques ou comportementaux durables chez les animaux.

Devenir

Pour la validation du modèle, tous les animaux experimentaux (400 souriceaux et 80 femelles) seront réaffectés à notre élevage de souris (à condition que nos résultats ne montrent aucune atteinte au comportement maternel), afin de permettre la génération de nouveaux souriceaux. Les souris agressives utilisees pour la defaite sociale (nous estimons à la moitié le nombre de souris qui rempliront les critères d'agressivité, soient 30 souris) seront par ailleurs maintenues en vie pour de futures experiences de défaite sociale. Les souris sentinelles servant à selectionner les souris agressives, les souris non agressives, et toutes les souris utilisées pour etudier les effets du modèle sur le comportement seront mises à mort à la fin des expériences.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des zones cérébrales impliquées dans la réponse au stress et les émotions.

Réduction

Nous souhaitons ici pouvoir évaluer une taille d’effet forte et être confiants dans les effets que nous observons, garantissant ainsi la fiabilité de nos conclusions et la reproductibilité future du modèle. Nos effectifs intègrent donc le fait de pouvoir comparer statistiquement les groupes expérimentaux pour les différentes variables comportementales (témoins, DS susceptibles : c’est-à-dire qui ont un comportement altéré à la suite du modèle de DS, DS résilients : qui ne présentent pas de modification comportementale à la suite du modèle). Basé sur la literature des effets comportementaux du stress et des changements neurobiologiques qui y sont associés, un dimorphisme sexuel est suspecté. C’est pourquoi nous utiliserons à la fois des males et des femelles en considerant ici le sexe comme une variable d’analyse. Seuls les mâles agressifs sélectionnés pourront être réutilisés pour la suite des expériences. Les effets du modèle sur le comportement des souriceaux sera testé à la fois à 22 jours et à l’âge adulte (63 jours) sur les mêmes souris, plutôt que d’utiliser des cohortes différentes pour ces différents temps de mesure, diminuant ainsi le nombre d’animaux utilisés. En l’absence d’effet délétère sur le comportement maternel et la survie des souriceaux, les animaux utilisés pour la validation du modèle pourront réintégrer l’élevage. Les tests statistiques seront adaptés à de petits effectifs expérimentaux.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimisées avec la mise à disposition de plusieurs supports pour la construction des nids (carton, coton, papier) et de bâtons de bois pour favoriser le comportement de ronger qui est important pour cette espèce (Raffinement hébergement). Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure seront réalisées avant les tests comportementaux. Les mères seront habituées à la manipulation au moins une semaine avant la naissance des petits. Les jeunes seront manipulés avec douceur et par des personnes habituées à manipuler des jeunes souriceaux. Nous incluons ici une procédure pilote en trois étapes pouvant chacune donner lieu à un arrêt total des expériences. La phase du projet étudiant l’impact de la DS indirecte sur les jeunes sera uniquement lancée si nous n’observons aucune surmortalité des petits par rapport aux mères contrôles au cours de cette procédure pilote (Raffinement des procédures). Des grilles d’évaluation de la douleur physique et de la qualité des soins maternels ont été créées pour définir précisément les points limites. Ce modèle visant à induire des atteintes psychiques, l’analgésie et le renforcement positif, ou tout traitement pouvant interférer avec l’étude ne peuvent être envisagés (réduction des douleurs physiques et psychiques associées aux procédures).

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris et la possibilité d’utiliser des animaux transgéniques permettant l’utilisation d’outils de neurosciences intégratives font de la souris le modèle animal le plus pertinent. Des souris OGM (phénotype non-dommageable) seront utilisées permettant d’induire l’expression permanente d’un rapporteur fluorescent dans les neurones activés pendant une fenêtre temporelle précise. Le choix de cette lignée est donc motivé par le fait que si notre modèle induit un phénotype robuste chez la descendance des souris exposées à la défaite sociale, elle nous permettra de visualiser les neurones activés pendant la défaite sociale, et d’étudier plus en avant la formation, la consolidation et le rappel de cette trace mnésique, ce qui est un objectif à long terme de ce projet. Par ailleurs des souris non-OGM classiquement etudiées seront utilisées afin de s'assurer que le modèle est viable sur une lignée bien caracterisée, avant la mise en place du modele sur les souris transgeniques. Les mâles agressifs seront d’anciens reproducteurs adultes, car c’est à cet âge que le comportement agressif est le plus marqué. Les souris femelles « sentinelles » seront âgées de 8 semaines (même âge que les mères qui seront utilisées pour la validation du modèle et la mesure de ses effets comportementaux). Mères expérimentales: jeunes adultes (8 semaines) ce qui est nécessaire pour la mise à la reproduction. Progéniture des mères expérimentales : de 3 jours après la naissance à l’âge adulte, car le modèle vise à induire un stress postnatal très précoce, pendant la période infantile. Les effets comportementaux du modèle seront testés après sevrage (à 21 jours) et à l’âge adulte (à 63 jours), puisque nous souhaitons connaitre les conséquences comportementales à long terme du modèle.

Une fenêtre d'imagerie de trois millimètres percée dans le crâne sous anesthésie, puis pour 1 770 d'entre elles une injection directe dans le cerveau : 2 718 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Pour 948 autres, un dispositif implanté permet des injections répétées, et 420 subissent des injections dans l'arrière de l'œil, un traumatisme crânien ou l'implantation de cellules tumorales. L'objectif est de cartographier l'espace entre les cellules du cerveau à l'échelle du nanomètre, sur des souris vivantes maintenues tête fixée. Le champ officiel du devenir ne mentionne aucun animal gardé vivant, alors que le texte annonce que les souris porteuses du dispositif implanté seront maintenues en vie, les autres étant tuées pour prélever le cerveau entier.

Objectifs

Environ 25% du volume cérébral est occupé par l'espace extracellulaire (ECS) qui correspond à l’espace se trouvant entre les cellules et qui sert d’environnement à l’échelle microscopique pour le cerveau et forme un chemin de communication chimique entre les cellules. Il a été montré que la structure et la diffusion de l'ECS sont composés d’éléments de nature différentes et qu'elles dépendent de conditions internes et externes, telles que le système de sommeil/éveil ou d’un œdème cellulaire provoqué par un traumatisme cérébral. De plus, l’ECS fournit un réservoir pour les ions impliqués dans l'activité électrique des neurones et joue un rôle clé dans la transmission de substances entre les cellules. Ainsi, l’ECS n'est pas seulement le siège de toutes sortes d'interactions cellule-cellule, mais peut également jouer un rôle important dans des fonctions neuronales cruciales, telles que la mémorisation ou la formation de circuits neuronaux. Afin de visualiser la structure de l'ECS à très petite échelle (nanomètre), nous utiliserons une nouvelle approche d'imagerie, à savoir la technique de Shadow imaging (SUSHI). C'est une méthode de marquage où un produit fluorescent est injecté localement dans le cerveau afin de visualiser l’ECS avec une très haute résolution. En outre, comme le produit fluorescenr ne pénètre pas les cellules saines, toutes les cellules apparaissent en noires, ce qui permet d'imager également la structure anatomique des cellules non marquées. Cette méthode présente de grands avantages puisqu’elle n’est pas sensible à la perte de fluorescence de la molécule (la diffusion du produit fluorescent permet de maintenir un signal constant) ni à la toxicité (puisque le produit fluorescent reste en dehors des cellules). Dans ce projet, nous comptons tester plusieurs produits fluorescents qui présentent tous une gamme de longueur d’onde proche de celui de la GFP (Protéine fluorescente verte) et ne pénètrent pas les membranes cellulaires.

Bénéfices attendus

Cette technique sera utilisée pour imager l’ECS au travers d’un dispositif d'imagerie posée soit sur le cortex soit sur l’hippocampe (petite partie du cerveau qui sert pour la mémoire, le comportement et certaines émotions). Partant de là, nous nous proposons d'effectuer des séances d'imagerie répétées d’un même animal pour cartographier, sur animal vivant et avec une résolution spatiale inédite, la morphologie de l’ECS et caractériser la dynamique (quelques minutes à quelques semaines) des structures fines de l’ECS afin de voir les interactions cellule/cellule à l'échelle des circuits intégrés.

Procédures

Toutes les souris auront la pose d'un dispositif d'imagerie (2718 souris). Pour avoir ce dispositif il faut procéder à une chirugie sur animal endormi qui dure environ 1h avec utilisation de produits anti douleur. Un dispositif d'imagerie de 3mm de diamètre sera fait dans le crâne de la souris et une lamelle sera posée dessus afin de protéger le cerveau de l'extérieur. 1770 souris auront une injection directe dans le cerveau pendant qu'elles seront endormies. L'injection prendra environ 15 minutes et sera faite qu'une seule fois sur ces souris. 948 souris auront une pose d'un dispositif implantatoire dans le cerveau permettant d'injecter plusieurs fois le produit fluorescent. Ce dispositif implantatoire sera posée pendant la chirugie pour le dispositif d'imagerie. Chaque souris de ce groupe aura un dispositif implantatoire et plusieurs injections dans le temps d'une durée de 15 minutes environ chacune. Une injection rétro-orbitales sera faite sur 420 souris. Une injection par oeil et 2 injections par animal au maximum. L’induction d’un traumatisme cranien (impact fait en une fraction de secondes) et l’induction de cellules tumorales (une dizaine de minutes) sera faite sur un total de 420 souris. Toutes les souris auront une préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires après une ou plusieurs injections injection (si la souris a un dispositif d'injection ou non). Cette préparation des tissus se fera sur animal endormi avec utilisation d'anti douleur. L'animal sera ensuite euthanasié et le cerveau sera récupéré.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et l'induction du traumatisme cranien et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies, injection retro-orbitale et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. Le risque de rejet des animaux non sevrés et le stress de la séparation peuvent également entrainer une nuisance ou un effet indésirable.

Devenir

Les souris subissant la préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires seront euthanasiées à la fin de l'expérimentation afin de prélever le cerveau entier. Les souris ayant subi une chirurgie pour l'implantation d'un dispositif d'imagerie seront utilisées pour la microscopie puis euthanasiées à la fin de l'expérimentation si elles ne sont pas utilisées pour la préparation des tissus. Les souris ayant un dispositif implantatoire seront maintenues en vie.

Remplacement

La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. L’objectif de ce projet étant de caractériser l’ECS dans les conditions les plus naturelles possibles, cette étude ne peut être réalisée de manière pertinente avec des modèles sur ordinateurs (in silico) ou sur micro-organismes, organes ou cellules en dehors de leur contexte naturel (in vitro). Le microscope sera, dans un premier temps, validé en imageant de toutes petites particules (nanoparticules) fluorescentes. Toutefois, ces échantillons ne permettent pas réellement de reproduire l’ensemble des paramètres optiques observés dans les échantillons biologiques. C’est pourquoi une seconde étape de validation dans des tranches organotypiques (tranches de partie de cerveau sur une lamelle) apparait cruciale pour optimiser les conditions d’imagerie qui seront utilisées à terme pour l’imagerie sur animal vivant (in vivo).

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode de production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'Homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'Homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'Homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 1 et 21 jours. Puis sur ces mêmes animaux de 2 à 6 mois, période qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une meilleure reproductibilité des résultats.

Infectées par le SARS-CoV-2 au moyen d'une administration intranasale sous anesthésie, 1 680 souris humanisées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées après mesure de leur pression pulmonaire. Certaines passent trois semaines en hypoxie chronique, d'autres subissent une chirurgie du cou avec injection intratrachéale. Le porteur reconnaît que l'infection peut conduire à la diarrhée, à l'affaiblissement, à la malnutrition puis à la mort, et revendique un protocole jamais mené ailleurs dans le monde. Il qualifie la mesure de pression artérielle à la queue de "procédure indolore", et liste par ailleurs l'hémorragie, la douleur post-opératoire et l'arrêt cardio-respiratoire parmi les suites possibles des chirurgies.

Objectifs

L’objectif de notre recherche est de mieux comprendre les altérations vasculaires et cardiaques liées à l'infection au SARS-Cov2. Nous allons utiliser des modèles murins (des souris transgéniques exprimant le récepteur humain du virus) afin de pouvoir suivre in vivo les effets de l'infection et de l'inflammation induite par cette infection. Notre but est d'augmenter les connaissances sur les conséquences au long cours du Covid19 pour améliorer la prise en charge des patients. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ces études nous permettront d’évaluer au long cours les altérations de la fonction cardiovasculaire à la suite d’une infection au SARS-Cov2. Nous utiliserons 2 lignées de souris afin de déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets. Les résultats serviront à mieux comprendre été prévenir les conséquences pulmonaires, vasculaires et cardiaques du Covid19

Procédures

Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à un prélèvement caudal pour génotypage (EU1). Cet acte ne dure que quelques secondes. Certaines souris seront soumises à une administration intra-nasale sous anesthésie pendant 15 minutes (EU1). Certaines souris recevront dans l’eau de boisson un anti-hypertenseur pendant 10 jours (EU1). Certaines souris seront étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie pendant 20 minutes (EU2). La pression artérielle sera aussi mesurée à la queue sur animaux vigiles (procédure indolore) après accoutumance à la contention pendant 5 jours (EU2). Certaines souris seront en plus soumises à une hypoxie chronique pendant 3 semaines avant l’étape finale (EU2). Pour les procédures chirurgicales sous anesthésie, la douleur sera évitée par l’administration d’anesthésiques et d’analgésiques (EU2). Certaines souris subiront une petite chirurgie au niveau du cou comprenant une anesthésie et une analgésie pendant 15 minutes et une injection intra-trachéale avant l’étape finale (EU2). Certaines souris recevront 1 à 5 injections intrapéritonéales (1 par jour) ou administrations intranasales sous anesthésie générale pendant 15 minutes avant l’étape finale (EU2). Pour toutes les souris, l’étape finale sera une procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie avec analgésie pendant 15 minutes avant l’euthanasie (EU2).

Impact sur les animaux

Le transport des animaux entre les 2 sites peut engendrer une anxiété temporaire. L’infection induit une maladie pulmonaire et chez certains animaux une maladie intestinale avec des conséquences qui peuvent être très sévères selon la lignée murine: les plus forts sont la perte de poids, la diarrhée, l’affaiblissement allant jusqu’à la malnutrition puis la mort. les souris seront soumises à un stress hypoxique. L'hypertension pulmonaire induite par l’hypoxie chronique est modérée chez la souris normale mais pourrait être sévère chez les souris post infection induisant un stress physique. Un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de l’acclimatation à la prise de pression systémique vigile. L’anesthésie peut induire des effets tels que l’hypothermie, des difficultés respiratoires ou dans les cas les plus critiques un arrêt cardio-respiratoire. La procédure chirurgicale peut également être source d’hémorragie ou de douleur post-opératoire. Les procédures d’injection peuvent potentiellement conduire à des infections.

Devenir

Les 1680 animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés en fin d’expérimentation à l’issue d’une mesure de la pression pulmonaire sous anesthésie. Les animaux sont utilisés à des fins expérimentales qui nécessitent leur euthanasie afin de pouvoir mesurer leurs paramètres hémodynamiques et étudier les tissus.

Remplacement

Pour comprendre les conséquences au niveau de la fonction et de la structure des vaisseaux pulmonaires de l’infection au SARS-Cov2, il est nécessaire d’infecter des animaux afin d’être dans les conditions les plus proches des patients et afin de conserver l’ensemble des phénomènes intervenants dans la régulation des vaisseaux pulmonaires : inflammatoires (interactions cellules immunes et cellules vasculaires), vasculaires (interactions des cellules vasculaires entre elles), respiratoires (hypoxie locale) et éventuellement nerveux. Les études in vitro ne permettent pas d’évaluer les conséquences de façon intégratives. De plus, la régulation de la pression artérielle pulmonaire ou systémique et de la fonction cardiaque ne peuvent être évaluées qu'in vivo. Cependant, une fois ces conséquences tissulaires et cellulaires identifiées in vivo, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (cellules vasculaires en culture) infectées ou non.

Réduction

1680 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.

Raffinement

Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Le poids des animaux est suivi tout au long des procédures. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum et une température et hygrométrie constantes. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée et le poids des animaux sera mesuré régulièrement. Les points limites seront évalués selon une grille de suivi. Après infection, les souris seront observées quotidiennement et pesées tous les jours pendant 1 semaine, puis toutes les semaines. La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémique au cours de la procédure finale. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20 pour cent de perte de poids. Une perte de sang importante, des signes de souffrance (prostration, poil hérissé, yeux fermés) qui se maintiennent, une prostration, une incapacité à se déplacer, des yeux larmoyants et exorbités constituent également des points limites. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique.

Choix des espèces

Nous effectuons des expériences avec des souris modifiées par transgénèse afin d’humaniser les souris pour en faire un modèle d’étude de l’infection au SARS-Cov2 dont la pertinence a été démontrée comme modèle pour étudier les effets liés au Covid19. Ces modèles de souris sont plus connus et plus facilement utilisables pour des études in vivo et pour les analyses d’organes que les autres modèles animaux existants (e.g. furet). Les études sur les effets de l’infection au SARS-Cov2 seront effectuées au stade adulte, lorsque le développement pulmonaire, vasculaire et cardiaque est fini, après l'âge de 8 semaines.

Les souris qui perdent 20 % de leur poids initial sont tuées. 1 280 souris vont être utilisées dans ce projet sur l'obésité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour mesurer leur masse graisseuse. Engraissées par un régime riche en lipides ou en sucres, elles reçoivent trois injections abdominales par semaine ou un gavage, sont pesées trois fois par semaine et saignées tous les trois mois. Le porteur indique que la molécule injectée peut provoquer une perte de poids importante, ce qui place les souris traitées entre l'obésité induite et le seuil de mise à mort, l'objectif final étant de porter une nouvelle thérapie amaigrissante vers la clinique.

Objectifs

En 2020, 8,5 millions de personnes souffrent d’obésité, dont 1 million de personnes en obésité massive soit 17% de la population nationale. De plus, l’obésité, chez les plus jeunes, montre des chiffres inquiétants, puisque l’on observe la plus forte progression des cas d’obésité chez les 18-24 ans. En effet, cette tranche d’âge est passée de 5,4% en 2012 à 9,2% en 2020. Chez les enfants, les observations sont elles aussi alarmantes puisque 34% des enfants de 2-7 ans et 21% des adolescents de 8-17 ans sont en situation de surpoids ou d’obésité. La situation actuelle est inquiétante pour l’avenir car cette augmentation de l’obésité chez les plus jeunes va conduire à une augmentation des pathologies liées à l’obésité telles que les maladies cardio-vasculaires, le diabète et les cancers. L’obésité reste aujourd’hui un problème de santé public important. La finalité du projet et son bien-fondé visent à comprendre le rôle et la fonction de notre protéine d’intérêt dans l’obésité et ses pathologies associées, afin de proposer une nouvelle thérapie pour leur prise en charge. Ce projet repose sur des observations que le laboratoire a obtenu sur cellules ainsi que sur des publications internationales. L’essence même de la question posée implique l’utilisation d’un organisme vivant tel que la souris, afin d’illustrer au plus proche de l’homme sa compléxité métabolique, sans solutions alternatives satisfaisantes.

Bénéfices attendus

Ce projet, à court terme, permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents au développement de l’obésité et des syndromes métaboliques associés. En étudiant, plus particulièrement le rôle et la fonction de notre protéine d’intérêt tout au long de la prise de poids. L’utilisation de souris non modifiées génétiquement mâles et femelles, permettra de modéliser au plus proche de l’humain le métabolisme lors d’un régime riche en lipides ou en sucres. Ces souris seront traitées avec un médicament permettant la disparition de cette protéine. Ceci nous permettra de voir si l’élimination de cette protéine induit une diminution de la prise de poids de nos souris et in fine de prévenir/traiter l’obésité et ses syndrômes métaboliques associés chez le rongeur. De plus, les souris prédisposées génétiquement à une prise de poids accélérée (obésité) ou à un développement de diabète de type 2 permettront de valider l’impact de la dégradation de notre protéine d’intérêt sur un syndrome métabolique établi génétiquement. A la fin du projet, l’objectif est de transférer une nouvelle thérapie vers la clinique afin de mieux répondre aux problématiques de santé publique que constituent que l’obésité et les pathologies associées comme le diabète de type 2.

Procédures

Nous serons ammenés à effectuer un prélévement sanguin tous les 3 mois afin de tester leur glycémie (80uL total de sang prélevé, 1min par souris contention comprise). Les animaux seront aussi soumis à des injections de médicaments dans le bas du ventre (5secondes par souris, contention comprise) ou gavage (10 secondes par souris, contention comprises). Pour pouvoir effectuer ces injections les animaux seront contentionnés de façon adéquat par le personnel.

Impact sur les animaux

Lors du traitement des animaux par un personnel qualifié, l’injection intra-péritonéale à répétition peut entrainer l’apparition occasionnelle d’hématomes sous-cutanés. Pour ces injections nous privilégierons le côté droit de l’animal. Lors de ces injections, il y aura une contention de l’animal (trois fois par semaine) ce qui peut conduire à un stress modéré pour les animaux. La drogue injectée peut également provoquer une perte de poids importante chez les animaux qu’il faudra surveiller attentivement grâce à des pesées tri-hebdomadaires. Lors du traitement par gavage, nous vérifierons l'abdomen des souris afin qu'il n'y ai aucune contraction de celui-ci pouvant être lié à une réaction du produit administré.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en respectant les règles de bien-être animal. Cela afin d’étudier au niveau moléculaire et anatomiques (diminution de la masse graisseuse, etc ) les effets de notre traitement.

Remplacement

Dans le laboratoire, nous avons déjà réalisé in vitro, sur des cellules pré-adipocytaire, les expériences permettant de montrer la nécessité de notre protéine d’intérêt dans la différenciation adipocytaire et son impact sur le métabolisme. Cependant les cellules pré-adipocytaires ne permettent pas d’appréhender la complexité métabolique d’un organisme entier, c’est pourquoi, il est important de réaliser ces procédures expérimentales sur l’animal. Notre objectif in fine, étant de présenter en clinique une nouvelle thérapie contre l’obésité et ses pathologies associées tel que le diabète, l’utilisation des animaux et notamment les souris est indispensable au déroulement de notre projet.

Réduction

Nos resultats expérimentaux obtenus sur des cellules nous permettent d’anticiper certains résultats et ainsi diminuer le nombre de conditions expérimentales sur animal vivant. Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini en prenant en compte les tests statistiques. Sur cette base, nous avons estimé à 1280 animaux, le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble de notre projet

Raffinement

L’hébergement se fera à raison de 5 animaux par cage, sur un fonds de litière et enrichissement en briques de peuplier ou carrés de cellulose pour favoriser la confection de nids. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les membres du personnel et à heures fixes afin de limiter le stress. Ils seront pesés trois fois par semaine. Tout animal présentant des difficultés à se nourrir ou à s’abreuver sera assisté par le dépôt dans la cage d’un gel lui évitant d’aller chercher en hauteur nourriture ou boisson. Une perte de masse corporelle constituera un indicateur de toxicité et sera considérée comme un point limite conduisant à l’euthanasie de l’animal lorsqu’elle sera égale ou supérieure à 20% du poids initial. Les injections IP seront réalisées par du personnel formé en préviliégiant le coté droit de l’animal . Une attention particulière sera portée aux points suivants afin de limiter la souffrance et la détresse des animaux : - Une absence d’hydratation ou de prise de nourriture afin d’anticiper une perte de poids excédant 20 % du poids initial - Une gêne dans la locomotion - D’autres signes de douleur tels que l’isolement des autres animaux, les yeux fermés ou creux, le dos voûté - Un saignement ou autre perte de liquide physiologique - Un changement du rythme respiratoire - Tout autre comportement anormal de l’animal tel que la prostration ou la vocalise lors de la préhension. - Lors du traitement par gavage, nous vérifierons l'abdomen des souris afin qu'il n'y ai aucune contraction de celui-ci pouvant être lié à une réaction du produit administré.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, disposant d’un système génétique et métabolique proche de l’homme. De plus, de nombreux modèles génétiquements modifiés pour les études de l’obésité ont été générés et utilisés dans la recherche scientifique. L’expérimentation sur ces modèles, déjà établis, nous permettra de voir l’efficacité du traitement et de comprendre au mieux l’impact de celui-ci sur un organisme entier. Nous choisirons des souris jeunes sevrées (c’est-à-dire environ 4 semaines de vie). Pour notre projet, il est important d’avoir de jeunes souris afin de suivre au plus tôt le développement de la pathologie (obésité/diabéte) mais aussi d’observer au mieux le temps de l’apparition des symdromes métaboliques associées à l’obésité.