Procédures sévères

528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 480 reçoivent une endotoxine bactérienne quatre jours de suite pour déclencher une neuroinflammation et détruire une partie de leurs neurones dopaminergiques, 288 se font implanter une électrode sur le nerf de la rate avec des connecteurs fixés au crâne, et 384 traversent une piste les pattes encrées pour mesurer leur longueur de foulée. Reliée trente-six jours par un fil à un stimulateur électrique, chaque souris opérée est séparée de ses congénères, et le bénéfice annoncé pour les personnes atteintes de Parkinson reste une piste thérapeutique à explorer. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'un tel travail ne peut être mené que sur des "organismes entiers" préservant les interactions entre système nerveux et système immunitaire.

Objectifs

L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer sur des modèles murins l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique de la maladie de Parkinson. Ce modèle de Parkinson est caractérisé par une réponse pathogénique neuroinflammatoire médiée par le système immunitaire. Il a pour finalité éventuelle d'appliquer ce traitement par électrostimulation en clinique. La maladie de Parkinson est une maladie du cerveau qui entraîne de la neuroinflammation, des problèmes moteurs, des troubles de la santé mentale et du sommeil, ainsi que des douleurs et d’autres problèmes de santé. L'efficacité des traitements actuels est malheureusement inconstante, et épuisable obligeant à changer souvent de molécule. Il n’y a pas de traitements curatifs. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante et pourrait apporter une nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels. Nous avons ainsi récemment démontré que la stimulation du nerf de la rate (splénique) réduisait significativement la neuroinflammation dans un modèle murin de la sclérose en plaque. On sait que la stimulation de certains nerfs périphériques agit également directement sur les cellules du système immunitaire en inhibant leur activité inflammatoire. Toutefois, l’impact d’une stimulation chronique du nerf splénique sur l’évolution de la maladie de Parkinson n’a jamais été évalué. Le projet consiste à : 1- implanter chez une souris une électrode de stimulation au niveau du nerf de la rate (nerf splénique); 2- puis induire la maladie de Parkinson (modèle par injection intra-péritonéale d’une endotoxine bactérienne ; 3- puis réaliser ou non des sessions d'électrostimulation du nerf de la rate. La comparaison des scores cliniques entre les animaux ayant subi une électrostimulation du nerf splénique et ceux n'ayant pas subit cette électrostimulation nous permettra de déterminer l'effet de l'électrostimulation sur le développement de la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer l'effet thérapeutique de l'électrostimulation du nerf splénique dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Une thérapie basée sur l’électrostimulation des nerfs périphériques est une approche thérapeutique innovante, présentant une toxicité potentielle moindre comparée aux molécules de type stéroïdien par exemple. Déterminer si l’électrostimulation inhibe les principales cellules immunitaires pathogéniques impliquées dans la sclérose en plaque pourrait conforter l’utilisation de cette nouvelle alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements actuels.

Procédures

Induction de la maladie de Parkinson : 480 animaux Les animaux subiront une anesthésie générale gazeuse et recevront une injection d'endotoxine bactérienne tous les jours pendant 4 jours consécutifs afin d’activer le système immunitaire (durée de l'intervention: 10 minutes). Implantation électrode : 288 animaux. Les animaux recevront un analgésique 20 minutes avant l’opération puis subiront une anesthésie générale pendant 20 minutes. Une électrode sera implantée au niveau du nerf splénique et les connecteurs seront fixés au niveau du crâne. La durée prévue de l’opération est de 20 minutes. Le lendemain de l'opération, les animaux opérés recevront un traitement anti-inflammatoire maintenu pendant les 3 jours suivants. Mesure de la longueur de foulé : 384 animaux. Les longueurs de foulée sont mesurées sur une piste plein champ contenant une bande de papier et disposée pour déboucher sur de la nourriture. Les pattes antérieures et postérieures de la souris sont humidifiées au préalable avec de l'encre avant d'être relâchées pour traverser la piste éclairée. Pas de prélèvement sur animaux vigiles, pas de prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

1- Nuisances associés à l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'endotoxine bactérienne : Dans ce modèle, la maladie de Parkinson est induite par injections d'une endotoxine bactérienne. Ces injections provoquent chez l’animal une réaction immunitaire induisant de la neuroinflammation et à terme la perte partielle de neurones dopaminergiques dès le 5ième jour. A partir du 19ème jour après la première injection , un déficit moteur modéré apparaît qui se traduit par une diminution maximale de la longueur de foulé de l’ordre de 8%. Le pic de la pathologie est atteint aux alentours du jour 19 post induction puis les symptômes associés à la maladie vont décroitre progressivement jusqu’à la fin de l’expérimentation (jours 36). 2- Nuisances associées à l’électrostimulation : Il n’y a pas de douleurs associées à l’électrostimulation du nerf splénique car ce nerf n’est pas constitué de fibres nerveuses sensitives. La procédure d'implantation d'une électrode sur le nerf de la rate et l'électrostimulation chronique de ce nerf est réalisée de manière récurrente au sein de notre équipe. Une douleur d’une durée estimée à 48 heures est par contre engendrée par la procédure chirurgicale permettant l’implantation de l’électrode de stimulation sur le nerf splenique du fait de l’incision de la peau et du péritoine. Lors de l'électrostimulation les animaux seront séparés les uns des autres car la stimulation électrique requiert une connexion à un stimulateur électrique externe par un fil incompatible avec une stabulation en groupe pendant 36 jours (risques de rognage de fils).

Devenir

Afin de limiter au maximum les souffrances potentielles associées à l'évolution de la pathologie, l'ensemble des animaux sera euthanasié à l'issue de chaque procédure

Remplacement

Ce type d’étude ne peut être envisagés que sur des organismes entiers préservant l’intégrité des interactions entre les systèmes immunitaires et nerveux dans un contexte pathologique et non pathologique.

Réduction

Les estimations du nombre d'animaux par condition expérimentale a été determiné par une approche statistique afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaire au bon déroulé de l’expérimentation et donc de limiter le nombre d’animaux

Raffinement

Des mesures de raffinements seront mises en place afin de limiter au maximum les contraintes imposées aux animaux dans le contexte de cette étude : les interventions chirurgicales seront menées suivant un protocole d’anesthésie et d’analgésie en prenant soin de maintenir la température corporelle des animaux en les plaçant sur une couverture chauffante. Le suivi postopératoire inclura un traitement antalgique et une grille d’observation préétablie prévoyant des mesures correctives et la mise en oeuvre le cas échéant de points limites précoces et adaptés.

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi car c’est l’espèce animale de référence en Immunologie chez laquelle l’induction de la maladie de Parkinson par injection d'une endotoxine bactérienne a été bien caractérisée. Le projet portera sur des souris mâles C57Bl/6 âgées de 12 semaines permettant une chirurgie aisée (poids entre 20 et 25 gr).

370 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant soit quatre membranes artificielles implantées sous la peau du dos, soit une perte de substance créée dans le fémur et fixée par une plaque vissée. Trente rats pour la première phase, cent dix pour la deuxième, deux cent trente pour la troisième. Après l'opération, ils sont placés seuls en cage jusqu'à sept jours, le temps que la douleur et la boiterie s'atténuent, et le porteur prévoit une hyperthermie possible par infection, une perte de poids et des anomalies de cicatrisation pendant une quinzaine de jours. Les bénéfices décrits concernent des patients humains, une seule chirurgie au lieu de deux et un retour plus rapide au travail, quand l'atteinte porte, elle, sur des fémurs de rats ouverts puis prélevés.

Objectifs

La gestion des pertes de substances osseuses critiques (supérieur à 5 cm) est une préoccupation quasi quotidienne en chirurgie orthopédique et traumatologique. Elle peut être prise en charge par la technique de la « membrane induite ». Cette technique consiste à placer une entretoise en ciment (PMMA ou polymethylmetacrylate) dans la zone de perte de substance osseuse. Une réaction autour du ciment permet la formation d’une membrane (en 2 à 3 mois environ) qui servira de réceptacle à une autogreffe osseuse prélevée sur le patient. Malgré les avancées permises par cette technique, il s’agit d’une procédure nécessitant le développement de cette membrane dans un délai assez long, requérant donc 2 interventions, retardant tout autant la récupération de l’autonomie du patient. De plus, la qualité de la membrane induite par l’organisme reste variable et dépendante du patient (âge, fumeur, comorbidités…), elle est hélas parfois quasi inexistante, friable et fragile, limitant les chances de succès et entraînant donc d’autres procédures chirurgicales plus agressives. L’immobilisation du patient et la mise en décharge plusieurs semaines présente des conséquences physiques lourdes à savoir : Amyotrophie, enraidissement articulaire mais aussi des conséquences socio-économiques avec une hospitalisation à deux reprises, souvent supérieures à 48-72h et un retard au retour aux activités personnelles et professionnelles (coût social de la perte d’activité). Ainsi, l’objectif de ce projet est d’être dans la mesure d’évaluer in vivo de membranes artificielles synthétiques, implantables, autorisant une consolidation osseuse en une chirurgie tout en ayant une maniabilité compatible avec le terrain chirurgical orthopédique et traumatologique. Ces membranes artificielles auront pour rôle d’être un soutien à la formation de la membrane induite naturellement par le corps mais également de servir de soutien à la greffe osseuse qui serait réalisée en un seul temps opératoire, optimisant donc la technique initiale sur les plans orthopédiques, rééducatifs mais aussi socio-économiques pour les patients.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont les suivants : - Limiter les échecs de la technique de la membrane induite dans sa forme actuelle en implantant un dispositif artificiel permettant de soutenir la formation de cette membrane induite, qui aurait donc des caractéristiques plus propices à la consolidation osseuse. - Limiter le nombre de chirurgies : en effet, il est impossible chez l’homme et chez l’animal de simplement greffer de l’os lorsque la perte osseuse est trop importante, cela résulte en une résorption du greffon et donc en un échec de la technique. Implanter une membrane artificielle aux propriétés supérieures permettrait de surseoir au temps de formation de la membrane induite, réduisant la chirurgie en 1 seul temps au lieu de 2. - Retirer le temps de formation de la membrane. Chez le rat, cette membrane se forme en 4 semaines mais chez l’homme celle-ci se forme en minimum 6 semaines (conditions idéales du jeune homme sans comorbidités) voire plusieurs mois (en moyenne 3 mois). Ce temps de formation chez l’homme, très long, limite grandement les capacités de mobilisation du membre concerné et donc la rééducation (avec pour conséquence une perte de musculature, un enraidissement articulaire), la reprise des activités professionnelles et personnelles. Les matériaux employés par les membranes artificielles ont pour objectif de maintenir l’autogreffe viable en 1 seul temps chirurgical, le temps d’obtenir une une consolidation osseuse indépendamment de la formation de la membrane induite et donc des comorbidités des patients et de la gravité de leur affection. - Au final : Limiter le temps d’immobilisation du patient, sa mise en décharge et ses conséquences : Perte musculaire, enraidissement articulaire, limitation des conséquences socio-économiques à savoir une double hospitalisation, souvent d’une durée supérieure à 48-72h, limiter le temps avant retour aux activités professionnelles et personnelles et donc limiter le coût socioéconomique de ces pathologies orthopédiques. - Accélération de la consolidation osseuse : les membranes artificielles, ayant des caractéristiques angiogéniques et ostéogénique ont pour objectif associé d’obtenir une consolidation du defect dans un délai plus rapide.

Procédures

Le nombre d'animaux se base sur une analyse de la littérature sur les mêmes modèles de defect femoral et d'implantation sous-cutanées du rat. La première phase du projet requiert 30 rats, la seconde 110 et la 3ème 230 (au maximum). Les résultats des matériaux étudiés permettront d'ajuster le nombre de rats nécessaires à l'étape 2 puis 3. La première phase consistera en l'implantation sous-cutanée de 4 membranes artificielles dans le dos des rats. Il s'agit de l'unique procédure chirurgicale réalisée par rat. L'objectif principal sera d'évaluer la capacité des matériaux à générer une membrane au propriétés histologiques supérieures à celle produite dans les groupes contrôles. Cette étape est la moins agressive et permettra de diminuer les nuisances animales. Le temps chirurgical est de 30 minutes pour les 4 implantations par rat. Pour la 2ème phase de l'étude, le groupe contrôle comportera 10 rats et 10 groupes de matériaux maximum seront analysés. L'objectif principal sera d'évaluer la capacité des matériaux à produire une membrane aux propriétés histologiques supérieures à celles produites dans le groupe contrôle. Une seule procédure sera réalisée par rat : la création d'un defect osseux fémoral et une stabilisation par plaque vissée (ostéosynthèse). Cela autorisera un appui sur le membre opéré juste après l'intervention. Cette procédure sera réalisée en 1h. Pour la 3ème phase de l'étude, une groupe contrôle de 15 rats sera requis et chaque groupe d'étude comportera 10 rats (10 groups maximum). L'objectif est d'étudier la consolidation en présence des membranes d'interêt comparé à la technique habituelle. L'analyse se fera à 2 points temporels différents. Le groupe contrôle comportera 15 rat car ce groupe requierts 2 chirurgies, augmentant le risque de complications. Cela correspond à ce qui est réalisé chez l'homme (temps de formation de la membrane induite autour du ciment). La greffe osseuse sera réalisée au cours de la 2nd chirurgie, 4 semaines plus tard. Les groupes d'étude ne comporteront qu'une seule chirurgie car il s'agit d'un des objectifs majeurs de ce projet (1 seul temps chirurgical). La greffe osseuse osseuse sera prelevée lors du même temps chirurgical et consistera au prélèvement de 2 à 3 vertèbres de la queue du rat, fragmentées et intégrées au defect osseux fémoral. La chirurgie est réalisée en 1h. Toutes ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (gazeuse) associée à une analgésie multimodale.

Impact sur les animaux

Le projet est pourvoyeur de plusieurs nuisances et effets indésirables qui seront recherchés, anticipés et traités en cas d’apparition. En premier lieu, plusieurs données générales seront analysées notamment : - Douleur de palier modéré à sévère étant donné qu’il s’agit d’une chirurgie avec incision cutanée pour la phase 1 et orthopédique avec réalisation d’un defect osseux pour les phases 2 et 3, la douleur est également prévisible et sera surveillée tout au long de l’étude, particulièrement la 1ère semaine post-opératoire. - Hyperthermie : pouvant être due à une infection post-opératoire, ce risque est présent au moins les 15 premiers jours, le temps de la cicatrisation cutanée. Elle sera recherchée par la mesure de la température de l’animal. - Perte de poids : par douleur et/ou difficulté de mobilisation due à la chirurgie sur le membre inférieur de l’animal (phases 2 et 3), entrainant une restriction alimentaire et hydrique, la durée prévisible est 7 jours d’après les modèles retrouvés dans la littérature, les rats retrouvant une mobilité habituelle après ce délai. Elle sera dépistée par la pesée régulière de l’animal. - Anomalie de la cicatrisation cutanée : désunion, saignement, hématome, écoulement suspect (infection), ce risque est présent au moins les 15 premiers jours, le temps de la cicatrisation cutanée. Il sera recherché par l’inspection de la cicatrice en période post-opératoire. - Limitation de la mobilité de l’animal dans les suites opératoires : bien que la chirurgie permette la déambulation, une diminution de la mobilité dans les modèles similaires est observée la première semaine post-opératoire (phases 2 et 3 notamment). - Altération de l’état physiologique par stress postopératoire de l’animal : trouble de la posture, du toilettage, dépilation, durée prévisible de 7 jours post-opératoire. Cela sera limité par la médication antalgique associée à ce protocole de recherche.

Devenir

A l’issue de chaque étape de ce protocole il sera réalisé une euthanasie car il est nécessaire de prélever les membrane formées et les fémurs opérés pour analyse comparative. Les méthodes d’euthanasie employées seront le surdosage d’anesthésique, réalisé sur animal préalablement sédaté (anesthésie gazeuse) ou l’inhalation de CO2 par incrémentation progressive.

Remplacement

Le principe de la membrane induite repose sur la réaction de l’organisme à la présence d’un matériau (le ciment en PMMA) sur le lieu de l’implantation, provoquant une réaction tissulaire à corps étranger, vascularisée et riche en facteurs de croissance. Dans notre travail, différents biomatériaux auront pour vocation à remplacer le PMMA pour optimiser cette réaction. Le but étant de former une membrane « induite » optimisée autour du matériau. Il s’agit d’une réaction complexe mêlant à la fois une réaction immunitaire « à corps étranger », une hypervascularisation locale et une stimulation de la formation d'os sur un organisme vivant. Dans la membrane induite, il est retrouvé des éléments cellulaires de ces 3 lignées (immunitaire, vasculaire et osseuse) avec une différenciation qui a lieu sur plusieurs semaines avant d’obtenir une membrane induite mature. Il n’est pas retrouvé dans la littérature de modèle in vitro, ex vivo ou in silico permettant de reproduire l’ensemble des éléments et des étapes menant à la formation de la membrane induite et cela empêche l’analyse in vitro. La seule analyse préalable, permettant de réduire l’agressivité chirurgicale est l’implantation sous-cutanée, suffisante pour analyse la réaction tissulaire immunitaire et la formation de vaisseaux et limitant drastiquement la sévérité du geste sur l’animal. Néanmoins, avant réalisation des études sur animal, des analyses in vitro de cytotoxicité et cytocompatibilité sur les des cellules osseuses, vasculaires et immunitaires seront menées sur les matériaux sélectionnés pour remplacer le PMMA actuel afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’analyse in vivo.

Réduction

La détermination du nombre d’animaux se base sur une analyse de la littérature étudiant le même modèle animal, sur le même sujet d’étude. 5 études d’implantation sous cutanée dans la littérature ont également été analysées. Le nombre moyen d’animaux par matériau analysé était de 10 pour l’implantation osseuse (10 échantillons par groupe). Pour l’analyse en implantation sous-cutanée, 5 échantillons de membrane induite étaient utilisés en moyenne par groupe. Une seule (defect osseux) étude publiée réalisait une analyse de puissance basée sur les résultats histologiques, avec un niveau de puissance de 80% et retrouvait un nombre requis minimal de 8 rats par groupe. En se basant sur ces différentes études et leurs résultats, un nombre de 10 rats par groupe a été sélectionné. La stratégie de réduction s’applique également dans le design de l’étude puisque pour limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaires, la première phase consistera à étudier la formation de la membrane induite après implantation sous-cutanée du matériau et la seconde phase après réalisation du defect osseux. L’implantation sous-cutanée permet également d’implanter plusieurs matériaux (jusque 4) sur un seul rat ce qui n’est pas possible en implantation osseuse. L’ensemble des membranes artificielles aura eu préalable une analyse de cytotoxicité et de cytocompatibilité in vitro. Ces analyses ne permettent pas de reproduire le procédé in vivo de formation de la membrane induite qui intègre simultanément des phénomènes immunitaires, vasculaires et osseux. Cependant elle permettra de vérifier sur chaque lignée l’absence de cytotoxicité limitant l’implantation chez l’animal. De même, ce projet est réparti en 3 phases car à l’issue de chaque phase, des résultats inférieurs aux groupes contrôles entraîneraient le retrait du matériau lors des étapes suivantes de l’étude. Cela permettra de sélectionner les matériaux ayant les meilleurs résultats à l’issue de chaque étape tout en limitant l’agressivité chirurgicale des procédures.

Raffinement

En premier lieu les conditions de vie des animaux respecteront un cycle de 12h jour/nuit en alternance. Le milieu de vie sera dans une salle à flux d’air contrôlé, avec une température contrôlée (21°C). Les animaux disposeront d’un accès à l’eau et à l’alimentation à volonté, selon des aliments standards (pas de modifications du régime alimentaire habituel). Le milieu de vie sera enrichi et consistera en un sol dur comportant une litière, disposant de moyens d’exploration et de cachettes (tunnels en cartons par exemple, ou petits dômes en papier maché etc.). Des éléments permettant la nidification seront présents également, (cylindre de coton, carré de cellulose, rondelles de peuplier compressé), enfin des éléments permettant aux rats de ronger seront présent (morceaux de bois). Avant l’intervention, les rats seront placés en cages, avec 3-4 rats par cages afin de respecter leur comportement social. Cependant, après la chirurgie et devant les conditions diminuées de déambulation et de douleur post-opératoire (notamment phases 2 et 3), ils seront placés en cage seuls, pour une durée minimale mais pouvant aller jusqu’à 7 jours. Il s’agit du temps requis avant reprise d’une déambulation habituelle et sans douleur à l’issue de la procédure. Plusieurs éléments seront analysés pour contrôler le bien-être des animaux à savoir : le poids avec mesure bihebdomadaire pendant 7 jours post-opératoire puis une fois par semaine, la température à la recherche d’une hyperthermie, mesurée tous les jours en post-opératoire (recherche d’une infection post-opératoire). Une analyse de la plaie post-opératoire (désunion, saignement, hématome) sera quotidienne les 7 premiers jours postopératoire. Une évaluation quotidienne de la capacité de déambulation de l’animal qui doit progressivement devenir normale en 7 jours pour les phases 2 et 3. Enfin une analyse comportementale sera réalisée notamment la posture, la position des oreilles, l’enfoncement des yeux mais aussi si un manque de toilettage est constaté (à l’aide de l’échelle d’évaluation des expressions faciales du rats, édité par la NC3Rs). Les sources d’eau et de nourriture seront placés à des lieux accessibles à proximité de la zone de repos et stabilisés pour qu’ils ne soient pas renversés facilement.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est le rat. Il s’agit dans la littérature de l’espèce animale la plus utilisée. Dans une revue systématique publié en 2022, 70% (28/40) des études animales évaluant la membrane induite étaient réalisées sur un modèle de rat. Sur ces études sélectionnées et utilisant un defect fémoral (24 études), 20 étaient réalisées sur le rat. Le choix de cette espèce permet donc d’obtenir des résultats comparables avec la littérature. En outre, l'élevage de ces animaux est plus rapide et plus facile, avec des coûts considérablement réduits. Les rats seront à un stade adulte de leur développement, correspondant à 10 semaines de vie avec un poids de 400-450 gr. Cela correspond à l’âge d’un humain adulte d’environ 18 ans. En effet, la technique de la membrane induite est le plus fréquemment utilisée chez le jeune adulte dans le cadre d’accidents à haute cinétique de la voie publique (moto, voiture etc.). De plus, l’utilisation des moyens d’ostéosynthèse chez des rats non matures et plus jeunes expose à des difficultés techniques matérielles (moyen d’ostéosynthèse non adapté à la taille des fémurs de rats plus jeunes).

48 veaux de boucherie de 100 ou 200 kilos vont être utilisés dans des procédures classées sévères, tous rendus ensuite à une structure d'élevage pour poursuivre leur croissance. Ils sont soumis pendant trente et un jours à une chaleur allant jusqu'à 30 °C et à une humidité allant jusqu'à 80 %, dont dix jours en chambre respiratoire, et restent enfermés seuls en cage individuelle dix-sept jours au total. Le porteur reconnaît que l'isolement d'une espèce grégaire est susceptible de créer de l'anxiété et du stress, et le compense par un dispositif audio qui diffuse le bruit des congénères. L'objet est de situer la zone de confort thermique des veaux pour régler la ventilation des bâtiments d'élevage, faute, écrit le porteur, de modèle mathématique capable de prédire leur adaptation à la chaleur.

Objectifs

Les veaux sont majoritairement élevés dans des batiments fermés équipés d'une ventilation dynamique, consistant en des ventilateurs électriques qui extraient en permanence de l'air des salles d'élevage. Cette extraction entraîne une dépression à l'intérieur de la salle, qui est compensée par une entrée d'air neuf venant de l'extérieur. Ce système de ventilation permet ainsi un renouvellement de l'air intérieur avec un système de régulation basé sur un objectif de température ambiante (plus la température monte par rapport à une température de consigne, plus les ventilateurs tournent pour augmenter le renouvellement de l'air et abaisser la température par une entrée accrue d'air frais). Ainsi, la chaleur générée par les animaux (environ 250 W par veau et par h) est compensée par une arrivée d'air neuf permettant de limiter l'élevation de la température dans la salle d'élevage. Ce système de ventilation devient ineffficace dès lors que la température extérieure est plus élevée que la température de consigne. Cette température de consigne doit correspondre à la température de thermoneutralité des veaux, qui est en moyenne de 18°C chez les veaux (donnée ancienne déterminée chez des animaux d'un poids de 200 kg). Pendant une grande partie de l'année, la température ambiante dans les salles d'élevage est donc plus élevée que la température de thermoneutralité, plaçant les animaux dans une situation de stress thermique, d'autant plus que la vapeur d'eau produite par les animaux entraîne conjointement une augmentation de l'humidité de l'air dans la salle, à même de compliquer encore plus les conditions d'élevage des veaux. Les objectifs du projet sont de déterminer les conditions de température et d'humidité correspondant à la thermoneutralité chez les veaux afin de développer des systèmes de régulation des conditions d'ambiance plus adaptés pour ces animaux. Le projet permettra également de déterminer les leviers d'adaptation des veaux aux conditions ambiantes afin d'adapter l'alimentation des animaux lors de périodes de vagues de chaleur.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre de disposer de connaissances concernant la capacité des veaux à faire face à des conditions d'ambiance de stress thermique. La caractérisation de l'adaptation des veaux (ajustement de la prise alimentaire, de la consommation d'eau, évapotranspiration) va aider à identifier des leviers permettant d'aider les animaux à supporter les vagues de chaleur. Celles-ci seront plus fréquentes du fait du contexte climatique et le projet permettra de proposer des solutions techniques (climatisation des salles, humidification de l'air) pour aider les animaux.

Procédures

Les animaux seront soumis à des conditions de stress thermique induites par une température ambiante et/ou une hygrométrie élevée pendant la durée du projet, soit 31 jours. De plus, les animaux seront placés dans des cages individuelles pendant 17 jours. Il est prévu deux prises de sang le 5ème et le 10ème jour de la période de mesure.

Impact sur les animaux

Les animaux sont placés en cages individuelles pendant la troisième semaine d'adaptation et pendant les 10 jours en chambre respiratoire, soit 17 jours au total. Pendant la troisième semaine d'adaptation, les cages sont contigues aux cases utilisées précédemment. Au cours des 10 derniers jours, les cages sont placées en chambre respiratoire induisant un isolement supplémentaire des animaux. Les veaux appartiennent à une espèce grégaire et l'isolement d'avec les congénères est susceptible de créer une anxiété et un stress pour les animaux. Les conditions d'ambiance (température jusqu'à 30°C et humidité jusqu'à 80% d'hygrométrie) vont induire un stress thermique pouvant générer une gêne pour les animaux. Les deux prises de sang induiront une douleur correspondant à la piqure de l'aiguillle lors de la ponction veineuse.

Devenir

Tous les animaux réintégreront une structure d'élevage pour poursuivre leur croissance.

Remplacement

L'adaptation des veaux à la chaleur est la résultante de modifications du comportement alimentaire, d'une répartition différente de la circulation sanguine et de modifications métaboliques et hormonales entraînant une utilisation différente de l'énergie. Il n'existe pas de modèles mathématiques prennent en compte ces différentes composantes afin de prédire l'adaptation des veaux. Pour cela, le projet est basé sur l'utilisation d'animaux en vue de mesurer leur réponse aux vagues de chaleur.

Réduction

Il n'existe pas de références sur l'adaptation des veaux au stress thermique et nous avons donc déterminé nos effectifs sur la base d'essais antérieurs réalisés chez le porc. Dans ces essais, nous avons observé qu'un effectif minimal de 6 animaux par lot était nécessaire pour déterminer avec une puissance statistique suffisante la différence de production de chaleur entre deux conditions d'ambiance. A chaque gamme de poids, nous avons 4 conditions expérimentales correspondant à 4 lots et nous allons donc utiliser 24 animaux d'un poids de 100 kg et 24 animaux d'un poids de 200 kg dans le projet.

Raffinement

Les mesures du projet nécessitent de placer les animaux individuellement en chambre respiratoire. Les chambres sont équipées d'un dispositif audio permettant aux animaux de maintenir un contact avec leurs congénères. La mise en place de la condition de stress thermique se fera sur 5 jours, afin de laisser suffisamment de temps aux animaux pour s'adater à ces nouvelles conditions. Toutes les cages sont équipées de dispositifs d'enrichissement qui sont renouvelés régulièrement et au gré des comportements individuels. Ils s'agit de matériels manipulables (chaînes métalliques, balles en plastique dur, jouets en plastique mou). Les animaux sont suivis a minima quotidiennement par du personnel expérimenté afin de détecter l'atteinte d'un point limite.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce-cible de l'étude. Les animaux seront en croissance et d'un poids de 100 kg ou de 200 kg. Ces deux gammes sont considérées car la sensibilité au stress thermique est susceptible de dépendre du poids des animaux, comme c'est le cas chez le porc par exemple. Nous souhaitons conduire des mesures à ces deux gammes de poids, car ils sont cohérents avec les poids des veaux présents dans les élevages (de 50 à 250 kg).

Nage sur le dos, apathie, lésions cutanées, exophtalmie bilatérale sévère : ces signes déclenchent le retrait de l'étude et la mise à mort par surdosage d'anesthésique. 108 truites arc-en-ciel de plus de 300 grammes vont être utilisées dans des procédures classées sévères, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des ponctions répétées du sinus veineux de la queue sous anesthésie générale, de une à trois le premier jour, une autre vingt-quatre heures plus tard, puis une tous les quinze jours pendant dix semaines. L'objet du projet est de déterminer combien de sang on peut prélever à une truite et en combien de temps elle le régénère, afin de produire un référentiel pour les prélèvements des futures expérimentations sur les poissons, le porteur relevant lui-même l'absence de tout consensus sur la question.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de déterminer les conditions à respecter pour mettre en place des suivis sanguins longitudinaux dans les protocoles d’expérimentation animale sur poissons (volume de sang à prélever, temps de régénération sanguine, qualité de la régénération sanguine). Ce travail permettra de proposer un référentiel quant à la réalisation de prélèvements sanguins pour la truite Arc-en-ciel, assurant un respect à la fois de la physiologie particulière de l’animal, de la qualité des résultats expérimentaux obtenus et du bien-être animal. Dans le cadre de la règle des 3R, ce nouveau référentiel garantira à la fois une réduction du nombre d’animaux utilisés (les suivis longitudinaux nécessitant moins d’animaux) et un meilleur raffinement expérimental (influence de prises de sang répétés sur les résultats).

Bénéfices attendus

L’absence de consensus quant au volume de sang que l’on peut prélever sur une truite, et quant à la vitesse de régénération sanguine dans cette espèce, est une contrainte majeure pour rédiger des protocoles expérimentaux plus en phase avec les exigences actuelles de réduction du nombre d’animaux utilisés, et de raffinement des protocoles expérimentaux. Ce projet a vocation à répondre aux questions suivantes : - Quel volume de sang peut-on prélever chez la truite Arc-en-ciel, en prélèvement unique ? en prélèvement multiple ? - Quelle est la durée de régénération sanguine chez la truite Arc-en-ciel à 14 °C, en fonction de la quantité de sang prélevée ? - Comment évolue la composition sanguine (maturité, taille et quantité des hématies) au cours du temps suite à un prélèvement sanguin ? Cette étude participera à l’établissement de nouvelles recommandations pour les poissons en expérimentation animale (le poisson est l’animal le plus utilisé en expérimentation animale après la souris).

Procédures

Les animaux seront soumis uniquement à des prélèvements sanguins répétés, tous effectués sous anesthésie générale, par un personnel qualifié et expérimenté. En fonction des groupes, il y aura de un à trois prélèvements sanguins le premier jour. Ensuite, tous les poissons seront prélevés une seule fois 24h plus tard, puis une fois tous les 15 jours pendant 10 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues sont les ponctions de sang répétées dans le sinus veineux caudal, sous anesthésie générale. La douleur correspond à la piqure d’une aiguille. Les cinq libertés individuelles de l’animal, telles que définies par l’OMSA, seront assurées tout au long de la procédure, grâce à un personnel formé et expérimenté et une station expérimentale adaptée aux besoins spécifiques de ces animaux. Dans la mesure où il n'existe aucun consensus quant à la possibilité de réaliser des prises de sang répétés chez la truite, ni de référentiel quant au volume de sang effectivement ponctionnable pour cette espèce, il a été décidé de classer cette procédure en catégorie sévère dans un premier temps, suite à des échanges avec le comité d'éthique. Une réévaluation sera réalisée postérieurement.

Devenir

Les animaux seront euthanisiés à la fin de la procédure.

Remplacement

L’objectif étant d’évaluer l’impact clinique, zootechnique et biologique de prélevements de sang plus ou moins importants ou de prélèvements répétés chez la truite Arc-en-ciel, cela ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n’existe pas actuellement de modèle qui permettrait de s’affranchir de ces manipulations.

Réduction

Pour ce projet, nous avons calculé le nombre minimum de poissons nécessaires pour répondre à la question de recherche autour de la quantité de sang qui peut être prélevée chez la truite Arc-en-ciel. Pour ce faire, nous avons utilisé une méthode statistique s’appuyant sur des données hématologiques préliminaires. Chaque poisson sera identifié par puce électronique, ce qui permet de réduire le nombre de poissons qui seront utilisés dans le cadre de cette expérimentation, par rapport à une approche qui ne s’appuierait que sur des moyennes de groupe. Par ailleurs, il n’y aura pas de lots pour lesquels serait réalisé un prélèvement de sang délibérément excessif (pas de groupe témoin positif) : chaque procédure évaluée devrait permettre de conclure sur la durée de récupération des animaux, et l’absence d’effets significatifs sur leur santé.

Raffinement

Les animaux sont observés deux fois par jour durant toute la durée du protocole. Les points limites sont : (1) les paramètres d’ambiance de l’élevage (oxygène, qualité de l’eau). Les paramètres de températures et d’oxygénation sont mesurés en permanence via des sondes. La qualité de l’eau (pH, teneurs en nitrites et en nitrates) est vérifiée chaque semaine ; (2) la santé des poissons. Les poissons seront qualifiés de moribonds si l’on observe l’un des signes suivants : nage sur le dos, apathie, lésions cutanées significatives, ou exophtalmie bilatérale sévère. Dans ce cas, les animaux seront retirés de l’expérimentation et euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Dans les bacs, la densité en poissons sera limité, environ 20 kg/m3. Par ailleurs, chaque bac est enrichi de tubes permettant aux poissons de se cacher. Enfin, le choix des volumes de sang que l’on pourrait prélever chez la truite, a été défini en s’appuyant sur des travaux antérieurs sur le poisson, et également sur des travaux plus récents menés chez les mammifères.

Choix des espèces

La truite Arc-en-ciel est l’espèce modèle de notre structure d’expérimentation animale. C’est un salmonidé d’eau douce. Les salmonidés sont les espèces piscicoles les plus fréquemment rencontrées en aquaculture en Europe. La truite est également un modèle habituel dans les laboratoires d’expérimentation animale. Les truites utilisées pèseront plus de 300g. Ce poids a été retenu pour deux raisons. D’une part, le volume minimal pour conduire les examens hématologiques est de 0,2 mL, ce qui représente 0,07% du poids vif d’une truite de 300g. De ce fait, un poids en début d’étude significativement inférieur à 300g pourrait trop influencer les résultats attendus. D’autre part, du fait de la contrainte de la station aquacole (taille des bassins), il ne nous est pas possible de loger des truites Arc-en-ciel de poids trop important en nombre suffisant. Or la croissance à cet âge est importante. Nous travaillons donc classiquement avec des truites de ce poids en début d’étude, pour prendre en compte leur croissance sur des suivis de longue durée (plusieurs mois). De ce fait, les résultats enregistrés correspondront aux animaux sur lesquels sont habituellement conduites les études expérimentales. A ce poids (300g), les animaux sont considérés comme physiologiquement proches des animaux d’un poids plus élevé (hors période de gamétogenèse).

800 souris reçoivent dans le muscle de la patte une injection de cardiotoxine, un venin de serpent qui lèse les fibres et provoque une douleur que le porteur reconnaît, après cinq jours de tamoxifène et, pour certains groupes, la pose chirurgicale d'un implant d'androgènes. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère, le plus élevé de l'échelle. Le porteur écrit pourtant n'avoir "pas prévu d'administrer d'analgésiques", hors chirurgie, et fixe la mise à mort à une perte de plus de 20 % du poids sur une semaine. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour que leurs muscles soient analysés, l'enjeu déclaré étant de savoir si les androgènes améliorent ou aggravent la réparation d'un muscle lésé.

Objectifs

La régénération musculaire est indispensable pour maintenir la fonctionnalité du muscle squelettique. Le muscle squelettique adulte est capable de se régénérer spontanément à la suite d'une lésion grâce à des cellules souches musculaires localisées à la périphérie des fibres musculaires. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la dégénération d’une part et la régénération musculaire d'un muscle adulte d’autre part. Pour ce faire, les muscles des souris de type sauvage (non sujettes à des mutations) seront traitées à la cardiotoxine (un venin de serpent) afin d'induire une blessure au niveau du muscle tibial antérieur. Ces souris seront en parallèle traitées avec une substance synthétique qui a le même rôle des androgènes sécrétés par l'organisme ou un placébo afin de mettre en évidence une amélioration ou au contraire une aggravation du processus de réparation du muscle lésé.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces procédures permettra de déterminer le potentiel thérapeutique des androgènes dans le processus de régénération musculaire.

Procédures

Tous les animaux seront traités au Tamoxifène par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris), anesthésiés à l'isoflurane (5-10 min/ souris), injectés à la cardiotoxine par voie intramusculaire (30 sec/souris). Un des groupes subira un implant d'androgènes en sous-cutané dans la région interscapulaire (5 min/souris). Un autre recevra les androgènes par voie musculaire en même temps que la cardiotoxine (30 sec/souris).

Impact sur les animaux

Les injections peuvent très rarement causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. L'injection de cardiotoxine engendrera une douleur au niveau du muscle lésé. La chirurgie nécessaire pour la pose de l'implant pourra générer un inconfort dans les premiers jours suivant l'intervention.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer le potentiel thérapeutique des molécules identifiées dans des systèmes cellulaires, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans la régénération fibrillaire. Ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, pour une même souris une patte sera utilisée pour des analyses moléculaires et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et de cardiotoxine. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage et son activité (un dos vouté, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation, sont tous des signes d'incofort de l'animal). Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de cardiotoxine, la substance synthétique et la chirurgie seront faites sous anesthésie. Nous n'avons pas prévu d'administrer d'analgésiques. Ils seront par contre donnés pour la chirurgie.

Choix des espèces

Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Les souris de 7 à 11 semaines seront utilisées. En effet, le projet s’intéresse à l’organisme adulte et les souris jeunes possèdent davantage de cellules satellites que les souris agées.

740 rats et 340 lapins vont être utilisés, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit une implantation chirurgicale d'un produit de santé sous la peau ou dans le muscle, de 30 minutes à une heure, suivie selon la durée de l'étude de plusieurs retraits et réimplantations espacés d'au moins deux semaines, avec tatouage des sites. Le porteur annonce des pertes de poids, des baisses d'appétit, des vocalises, des complications cutanées et, si l'étude l'exige, un hébergement individuel d'animaux sociaux. Ces essais servent à constituer le dossier réglementaire d'un donneur d'ordre avant mise sur le marché, obligation que le porteur présente comme excluant tout test in vitro validé et toute simulation informatique.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans les démarches réglementaires avant utilisation d’un produit de santé chez l’Homme. En effet, tout fabricant doit s’assurer que l’utilisation de son produit ne compromette ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. Cela signifit que les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit constituent des risques acceptables au regard du bienfait apporté au patient et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. L’efficacité de certains produits de santé nécessite de multiples implantations de la part leur indication clinique (exemples : système de délivrance comme les implants contraceptifs, …). Il est donc important d’évaluer ces produits de santé en mimant leur utilisation clinique et donc en prenant en compte les réimplantation (effet cumulatif). Si nécessaire aux objectifs de l’étude, l’évaluation de la cicatrisation après le retrait du produit de santé doit être évalué. Il est donc nécessaire pour cela de procéder à une explantation. Compte-tenu de la complexité des mécanismes de régulation d'un organisme vivant, le recours au modèle animal est nécessaire pour répondre aux objectifs du projet. Dans ce projet, il s’agit plus précisément d’évaluer la toxicité systémique (i.e. la toxicité non limitée aux effets défavorables au niveau du contact entre le corps et le dispositif) et éventuellement locale d’un produit fini ou de ses différents constituants, après réimplantation/explantation sous-cutanée ou intramusculaire chez le rat et le lapin sur une période allant de 14 jours à 24 mois. Le modèle lapin peut être privilégié du fait de la taille du dispositif à implanter car l’espace sous-cutané est plus important. De plus, dans le cas d’une implantation intramusculaire, cette espèce permet d’implanter une quantité de produit plus importante en taille et en nombre.

Bénéfices attendus

S’assurer avant sa mise sur le marché que l’utilisation du produit de santé ne compromet ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. Evaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et s’assurer le cas échéant qu’ils constituent des risques acceptables au regard des bienfaits/bénéfices apportés aux patients et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. Les résultats seront disponibles à l’issue des études et leur incorporation dans les dossiers de soumissions aux autorités de santé compétentes avant leur mise (ou leur maintien) sur le marché pourront en découler à court terme.

Procédures

Le nombre de réimplantation sous-cutanée ou intramusculaire et leur fréquence dépendent de l'utilisation clinique du produit à implanter, de sa taille de la durée d'étude, de la nature et de la durée de l'ensemble des procédures cumulées, et de l'avis vétérinaire en fonction de l'état général des animaux. Les animaux pour lesquels le but et d'évaluer la réversibilité de la réponse tissulaire locale (tolérance locale) après retrait du produit peuvent être soumis à une intervention chirurgicale d'explantation. Cette intervention aura dans les mêmes conditions que celles précédemment citées. Dans la mesure du possible, afin de limiter l'impact sur les animaux, les procédures seront mutualisées (réimplantation et explantation lors de la même anesthésie). Une première chirurgie aura lieu: Sous cutanée (30 minutes chez le rat, 1h chez le lapin) ou intramusculaire (45 minutes chez le rat, 1h chez le lapin). Il est possible d'ajouter à cela des tatouages des sites pendant la procédure (sous anesthésie, 10 minutes additionnelles). Selon la durée de l'étude, une ou plusieurs autres interventions chirugicales pourront avoir lieu pour (1) Explantation (retirer les dispositifs précédemment implantés) et/ou (2) Réimplantation (implanter de nouveau des dispositifs). La durée de ces interventions est similaire aux durées précédemment mentionnées. Un nombre maximum d'interventions est établi pour chaque durée d'étude (durée d'étude défini dans les textes réglementaires), afin de garantir qu'aucune chirurgie ne soit menée à moins de 2 semaines de la précédente pour les implantations sous-cutanées. Pour les interventions intramusculaires chez le rat, un maximum d'une explantation et d'une réimplantation pourra être menée quelle que soit la durée d'étude (minimum 2 semaines entre deux interventions). Pendant l'étude, selon une fréquence et un volume n'affectant pas l'animal, des prélèvements sanguins (environ 5 minutes) pourront être réalisés. La durée des interventions en fin d'étude est d'environ 10 minutes chez le rat et d'environ 40 minutes chez le lapin.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues suivant nos procédures expérimentales sont les suivantes : Stress liés aux chirurgies, perte de poids, baisse d’activité, baisse d’appétit, comportements atypiques pour l’espèce, vocalises, hébergement individuel pour les espèces sociales si nécessaire pour les besoins de l’étude, complication cutanée au niveau des sites d’implantations.

Devenir

Pour les besoins de l'étude, une analyse des paramètres sanguins ainsi qu'une évaluation des tissus au microscope (analyse histopathologique) est nécessaire. Ceci permet d'évaluer les effets potentiels de toxicité systémique et/ou la tolérance locale au niveau de la zone d'implantation du produit de santé à tester. Ces analyses expliquent l'impossibilité en fin d'étude de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets toxiques à moyen ou long terme des produits de santé en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant. Il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire post-chirurgicale et/ou des effets systémiques. L’utilisation d’animaux est alors obligatoire pour y parvenir. Des modèles animaux sont donc définis dans les règlementations et normes en vigueur. Ces modèles animaux sont largement utilisés, rendant disponibles de nombreuses données dans la littérature (données sur différents modèles - raffinement, données basales de pathologie…).

Réduction

Dans le cadre d'essai de toxicité systémique, le nombre d'animaux doit être suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente et cela est défini dans la norme. A la constitution de l’étude, le nombre minimal d'animaux/sites requis par les textes de références est considéré. Dans la mesure du possible, les témoins sont mutualisés entre les différents essais et l’évaluation de la toxicité systémique est couplée à une évaluation de la tolérance locale. Pour chaque étude, le donneur d'ordre s’engage à ne pas dupliquer les essais via la signature du protocole d’essai.

Raffinement

La stratégie de raffinement est établie afin de limiter le stress et la douleur des animaux et repose sur la présence d’enrichissements du milieu en systématique ; l’utilisation d’antalgiques et d’anesthésiques; un suivi sanitaire et clinique renforcé en phase post-opératoire avec une visite vétérinaire en cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, pour permettre une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Un suivi des points limites spécifiques au projet sera mis en place.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. Le modèle lapin peut être privilégié par rapport au modèle rat du fait de la taille du dispositif à implanter car l’espace sous-cutané est plus important. De plus, dans le cas d’une implantation intramusculaire, cette espèce permet d’implanter une quantité de produit plus importante en taille et en nombre. Le stade de développement est décrit dans le(s) texte(s) de référence qui recommande généralement l'utilisation d'animaux adultes. En l'absence d'exigence particulière, des animaux au stade jeune adulte sont utilisés (rats de 6 à 8 semaines, lapins de minimum 2,5 kg). Lorsque la procédure le nécessite ou dans le cas des propriétés intrinsèques du produit à tester (ex : quantité et/ou taille du matériel à tester importante), des animaux d’un poids plus important (donc plus « âgés ») peuvent être utilisés.

Quatre à sept injections intradermiques avec un adjuvant qui provoque une forte inflammation aux points de piqûre et des douleurs articulaires, quatre à six prélèvements sanguins sur animal vigile, puis une anesthésie générale de quinze minutes suivie d'une exsanguination de deux minutes: 2 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Leur sang fournira des anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine bactérienne, destinés à servir d'outil de laboratoire pour étudier la virulence de staphylocoques de la peau. La seconde lapine est immunisée quinze jours après la première, ce décalage permettant selon le porteur de renoncer à l'immuniser si la protéine était mal supportée. Le même document décrit deux plateformes, des blocs de luzerne, des friandises aromatisées deux fois par semaine et une heure quotidienne dans un parc intérieur.

Objectifs

Une neurohormone humaine sécrétée par les terminaisons nerveuses dans les parties superficielles de la peau, le CGRP (Calcitonin Gene Related Peptide), a été identifiée par le laboratoire comme facteur induisant une augmentation de la virulence de staphylocoques du microbiote cutané. Nous avons ainsi montré que le CGRP provoque une augmentation de la virulence de Staphylococcus epidermidis, par un mécanisme faisant intervenir la protéine chaperonne DnaK, alors retrouvée au niveau du sécrétome de la bactérie. Le gène dnaK de Staphylococcus epidermidis a été cloné et la protéine recombinante DnaK produite et purifiée à partir d’E. coli. Le projet vise à élucider ce nouveau mécanisme d’activation de la virulence par le CGRP. Pour ce faire, i) nous caractériserons l’interaction entre le CGRP et la protéine DnaK ; ii) nous étudierons le rôle de DnaK dans l’activation de la virulence, c'est-à-dire en tant que protéine effectrice et/ou en tant que protéine activatrice d’un messager secondaire : iii) DnaK étant capable de se lier à une multitude de ligands, en plus du CGRP, d’autres neurohormones de la peau seront testées pour leur capacité à activer la virulence en interagissant avec la protéine DnaK ; iv) enfin, la protéine DnaK étant l’une des protéines les plus conservées chez les procaryotes, nous testerons ce système de communication sur d’autres bactéries du microbiote cutané. L’intervention d’une protéine chaperonne procaryote dans la détection d’un signal eucaryote n’ayant jusqu’à présent jamais été mise en évidence, les résultats de ce projet pourraient ainsi mener à la découverte de nouvelles voies de signalisation hôte–bactéries. A long terme, la caractérisation des mécanismes moléculaires d’activation de la virulence des bactéries de la peau par le CGRP permettra par la suite de proposer de nouvelles molécules à visée thérapeutique pour le traitement de maladies inflammatoires de la peau telles que le psoriasis.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux anti Dnak seront d’abord des outils de lignage et de diagnostic. Ils nous permettront d’étudier le rôle de DnaK dans l’augmentation de la virulence chez les procaryotes, la découverte de nouvelles voies de signalisation hôte–bactéries et la caractérisation des mécanismes moléculaires d’activation de la virulence des bactéries de la peau par le CGRP.

Procédures

Prélèvement sur animaux vigiles et injection transdermiques. Prélévement vigile maximum 6 minimum 4. Injections intradermiques maximum 7 minimum 4. Les temps de prélèvement et d'injection seront de 1 à 2 minutes chacun. En fin de procédure une anesthésie générale de 15 minutes suivie d'une exsanguination de 2 minutes.

Impact sur les animaux

L’utilisation de l’adjuvent de Freund peut induire des douleurs articulaires et provoque une forte inflammation au niveau des points d’injection. La réaction immunitaire peut aussi induire une hausse de la température.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après l'immunisation afin de recueillir le maximum de sang et donc d'anticorps polyclonaux.

Remplacement

Des méthodes de production d'anticorps recombinant existent mais ils ne permettent en aucun cas d'obtenir une polyclonalité aussi élevé que chez l'animal. De plus la qualité des banques de phages est très variable et donc les résultats très aléatoires. La diversité des clones obtenus par sélection sur phage display est extrêmement faible et l’affinité des anticorps obtenus médiocre. Le lapin permet d’obtenir des anticorps de fortes affinités grâce à la longueur de leur partie variable. La finalité de notre projet est d’étudier les produits de dégradation de la protéine Dnak il est donc important de posséder des anticorps qui ciblent l’intégralité des épitopes immunodominants.

Réduction

Nous avons utilisé les données de la littérature pour calculer de façon théorique les capacités moyennes de production d'anticorps pour chaque lapin. Nous avons donc pu déterminer que 2 lapins seraient nécessaires pour obtenir la quantité d'anticorps indispensable à nos études. Les deux lapins seront immunisés avec 15 jours de décalage ceci permettra d’évaluer la toxicité intrinsèque de la protéine Dnak recombinante et de ne pas immuniser le second lapin si la protéine était mal supportée par le premier lapin.

Raffinement

Les injections intra-dermiques comme les ponctions sanguines seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane. Les règles d'asepsies seront respectées afin d'éviter tout risque d'infection aux sites d'injection et de ponction. Afin de diminuer au maximum toute douleur articulaire et toute douleur due à l’inflammation des sites d’injection, les animaux recevront un patch transcutané d'antalgique morphinique adapté à leur poids. Ce patch sera changé toutes les 72 heures. Le suivi sérologique de l’immunisation nous permettra de limiter au strict minimum les rappels d’immunisation et de mettre fin à la procédure au plus vite. L’observation des animaux au quotidien basée sur le score grimace scale permet d’établir un point limite précoce qui mettrait fin immédiatement à la procédure par la mise a mort. Les deux lapines seront hébergées ensemble dans des gages aux normes européennes elles disposeront de nourriture et d’eau ad libitum. Leur cage est équipée de deux plateformes et deux abris fixes. Le milieu est enrichi de briquettes de bois et de bloc de luzerne. 2 fois par semaine elles reçoivent des friandises sous forme de bonbons aromatisés spécialement développé pour les lapins. Elles seront sortie 1h par jour dans un « parc » intérieur agrémenté de jouets.

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. Sa taille moyenne permet d’obtenir une bonne quantité de sérum riche en anticorps tout en utilisant peu de protéine pour l’immunisation. La longueur des parties variables des IgG de lapin leur confère une excellente affinité, de plus ces IgG sont facilement purifiable. Les animaux seront des jeunes adultes de 1,5 à 2 kg (30 à 45 jours) car ils possèdent un taux maximum d’anticorps circulant et un système immunitaire mature.