Procédures sévères

1 038 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une incision chirurgicale sous anesthésie permet de greffer des cellules de cancer du pancréas directement dans l'organe, puis 732 d'entre elles reçoivent des injections intrapéritonéales deux à trois fois par semaine pendant six semaines, avec une anesthésie hebdomadaire pour imagerie pendant quatorze semaines au maximum. La tumeur pancréatique qui se développe peut provoquer une accumulation d'ascite dans l'abdomen, et les souris dont la douleur résiste aux analgésiques sont mises à mort. Le porteur affirme qu'aucun des objectifs du projet ne peut être modélisé "ni in vitro ni in silico" et désigne la souris comme l'espèce vertébrée non-primate la plus appropriée.

Objectifs

L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est un cancer de très mauvais pronostic. En raison de son diagnostic souvent trop tardif, de son agressivité, et de sa propension à métastaser rapidement, de nouvelles stratégies de diagnostic et thérapeutiques sont nécessaires pour améliorer ce pronostic. Des altérations de la glycosylation (qui est l’une des modifications essentielles des protéines et des lipides) sont associées et décrites pour le PDAC, cependant, leur rôle dans la maladie reste largement méconnu. Ce projet vise à déterminer le rôle de la O-glycosylation dans la genèse et la progression du PDAC afin d’identifier de potentiels marqueurs (protéines O- glycosylées) pour le développement du diagnostic et de thérapies ciblées.

Bénéfices attendus

Les traitements du cancer de pancréas sont à ce jour assez restreints, insuffisamment efficaces avec de nombreuses chimiorésistances aux traitements (FOLFIRINOX et Gemcitabine) d’où la nécessité d’explorer d’autres pistes thérapeutiques. L’importance de la glycosylation par la voie GALA a déjà été démontrée dans le développement de nombreux cancers, ce qui a permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, notamment la calnexine. Le développement des nouvelles thérapies basées sur les O- glycoprotéines de surface spécifiques des cellules cancéreuses avec une bonne spécificité et sensibilité, permettra à terme d'améliorer l’efficacité des thérapies existantes ; en effet, les anticorps cibles des protéines O-glycosylées sont spécifiques des cellules cancéreuses, et peuvent être utilisés comme conjugués anticorps-médicaments (ADC) afin de cibler spécifiquement les médicaments sur les cellules cancéreuses, réduisant aussi les effets secondaires. Notre projet permettra donc une meilleure compréhension du fonctionnement de GALA dans la carcinogenèse du pancréas et permettra de cribler de nouveaux candidats biomarqueurs potentiellement utiles dans le diagnostic et ouvrant de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris de ce projet (1038) seront soumises à des injections orthotopique de cellules, réalisées sous, à des injections intrapéritonéales 2-3 fois par semaine (total de 732 souris) d’anticorps/ADC (pendant 6 semaines au maximum). Toutes les souris dans les procédures seront surveillées par bioluminescence pour observer la croissance de la tumeur. Cela nécessite une anesthésie et l'injection du substrat de luminescence pour visualiser la tumeur. Cette opération sera effectuée chaque semaine pendant 14 semaines au maximum.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises à des procédures chirurgicales, à des injections d'analgésiques et, dans certains cas, à des injections d'anticorps, ce qui occasionnera une douleur et une gêne au niveau du site d'injection. La greffe orthotopique de cellules tumorales dans le pancréas nécessite de pratiquer une incision chirurgicale sous anesthésie. Le développement de la masse tumorale au niveau du pancréas sera la principale nuisance pour laquelle nous mettrons en place le suivi et les actions adaptées. Les souris seront également manipulées régulièrement, afin d'observer leur poids et leur bien-être, ce qui peut induire du stress. En outre, le développement des tumeurs pancréatiques peut provoquer des symptômes tels que l'accumulation d'ascite dans l'abdomen, ce qui est source d'inconfort.

Devenir

Les souris de chaque procédure seront sacrifiées en fin de l'expérience d'analyser la croissance tumorale et les métastases par des approches histologiques et biomoléculaires.

Remplacement

L'utilisation d'alternatives de substitution du modèle animal n'est pas adaptée à ce projet. Nous cherchons à déterminer le rôle de la O-glycosylation dans le développement des tumeurs pancréatiques et la composition du stroma. Aucun de ces objectifs ne peut être modélisé ni in vitro ni in silico. L'espèce vertébrée non-primate la plus appropriée est la souris.

Réduction

Nous utiliserons le moins d'animaux possible pour produire et vérifier nos résultats. En effet, des expériences préliminaires et pilotes ont été en partie réalisées à Singapour. Le nombre d'animaux requis par groupe a été déterminé par des analyses statistiques afin de s'assurer que la taille des échantillons ne dépasse pas le nombre requis d’animaux nécessaire pour obtenir une signification statistique et une reproductibilité. Un minimum de 6 animaux est nécessaire par groupe de traitement pour obtenir une signification statistique. Nous utiliserons le nombre minimum suggéré pour ce projet. Les tissus animaux seront utilisés pour tous les objectifs du projet afin de minimiser le nombre d'animaux. Suivre le développement des tumeurs par imagerie par bioluminescence permet de réduire le nombre d'animaux puisque les animaux sont ainsi utilisés au moment adéquat.

Raffinement

L'injection orthotopique (greffe de cellules cancéreuses dans le tissu) dans le pancréas sera réalisée sous anesthésie et nous mettrons en place l'utilisation de tapis chauffants/lampe pour la récupération et par l’injection de sérum physiologique pour la réhydratation après la chirurgie. Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique de ces modèles de pathologie, avec mise en place si nécessaire d’une analgésie spécifique. Le score de la grille sera utilisé pour observer les signes de malaise, tels que les changements physiques, les changements de comportement et la détérioration de l'état de santé. En fonction des scores obtenus, nous faciliterons l’accès à la nourriture en positionnant les croquettes dans le fond de la cage. Si plusieurs critères sont remplis, un analgésique sera administré et si les signes de douleur persistent, sans réduction de la douleur par les analgésiques, les souris seront sacrifiées. Tous les gestes techniques sont réalisés par du personnel compétent et expérimenté.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’homme pour sa physiologie. Les souris, âgées 6-8 semaines (qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe), ont le même fond génétique que les lignées cellulaires qui seront injectées orthotopiquement dans l’animal. Cela permettra de reproduire fidèlement la maladie, y compris la réaction immunitaire. Les souris (âgées 6-8 semaines) serviront à l'injection orthotopique des cellules obtenues à partir des biopsies cancéreuses pancréatiques humaines (PDX). L'utilisation de ces souris permettra d'éviter une réaction immunitaire lors de l'implantation des lignées cellulaires humaines dans les souris.

Injectées dans l'abdomen avec du LPS bactérien pour déclencher un choc endotoxique, 44 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. L'injection peut provoquer une perte de plus de 20 % du poids, des poils hérissés, une prostration et une chute de la température corporelle, une partie des souris recevant en plus un transpondeur sous-cutané et un prélèvement de sang. Le porteur indique avoir déjà montré sur cellules le rôle de la protéine étudiée dans la détection du LPS, et conclut que le modèle souris reste "indispensable". Il annonce des points limites "précoces et prédictifs" sans dire lesquels, et justifie l'effectif par des outils statistiques qu'il ne nomme pas.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier la réponse immune au choc endotoxique déclenché par la détection de produits bactériens, une réponse d’importance médicale chez l’humain. Le choc endotoxique correspond à la sur-activation du système immunitaire lors d'une infection bactérienne, qui peut entraîner une défaillance des organes et la mort. Lors de l’infection par une bactérie, des cellules du système immunitaire nommées macrophages détectent le pathogène et déclenchent une réponse immune en produisant de petites molécules « alarmes » nommées cytokines inflammatoires. Ce sont ces cytokines qui permettent la mise en place d’une réponse antibactérienne efficace. Ce projet apportera une réponse quant à l’importance de POBE1 dans la réponse antibactérienne. POBE1 est aussi exprimée par les cellules humaines, et nos données indiquent que i) POBE1 participe à l’immunité antibactérienne dans des cellules humaines en culture et ii) l’histoire évolutive de POBE1 dans la population humaine est compatible avec son rôle comme acteur de l’immunité. Ce projet est donc un premier pas dans l’étude de l’importance de POBE1 chez les patients. La démonstration éventuelle du rôle pivot de POBE1 dans le déclenchement du choc endotoxique ouvre la voie à la création de molécules thérapeutiques inhibitrices de POBE1 ayant pour but de limiter le choc endotoxique chez les patients.

Bénéfices attendus

La réponse immune antibactérienne n’est pas totalement comprise. Nous avons récemment découvert une protéine nécessaire à l’activation du système immunitaire au cours d’une infection bactérienne. Ce projet propose d’analyser son rôle in vivo. À long terme, ce projet pourrait apporter la preuve que notre protéine d’intérêt joue un rôle in vivo dans la protection antibactérienne, ouvrant la voie à l’étude de cette protéine chez les patients. Nous explorons notamment des stratégies thérapeutiques utilisant des molécules inhibitrices de POBE1 pour limiter le choc endotoxique.

Procédures

Les animaux vigiles recevront une injection de produit directement dans l’abdomen (durée du geste inf à 5 sec). Un transpondeur sous-cutané sera ensuite posé sur une partie de ces animaux (durée du geste inf à 5 sec) puis un prélèvement sanguin sera réalisé sur ces animaux (durée du geste inf à 1min)

Impact sur les animaux

L’injection de LPS en intra-péritonéal au moyen d’une aiguille entraîne une douleur transitoire due à la piqure. L'injection de LPS intra-péritonéale peut entraîner, en fonction de la dose : - Une cachexie (perte de poids >20% du poids initial) - Poils hérissés et prostration - Une altération de l’état général - Une baisse de température corporelle

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin de procédure pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Les premières étapes d’analyse et de validation in vitro ont démontré que POBE1 participe à la détection du LPS bactérien. Des cellules déficiente en POBE1 ne produisent plus de cytokines inflammatoires en présence de LPS, et contrôlent moins efficacement l’infection par Salmonella. Le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle dans la réponse inflammatoire antibactérienne de notre protéine d’intérêt chez la souris, organisme vivant intégré et autonome. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (culture cellulaire), l’utilisation du modèle Souris reste indispensable pour le présent projet.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima. Pour ce faire, nous allons effectuer une étude préliminaire avec un nombre de souris réduit. Le nombre d'animaux a utiliser dans les groupes dans les groupes a été déterminé à l'aide d'outils statistiques.

Raffinement

Les souris sont manipulées sans stress par des personnels compétents. Le bien être des souris sera suivi quotidiennement. Les points limites conduisant à la mise à mort des souris seront précoces et prédictifs. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche antibactérienne : souches murines parfaitement définies et modèles génétiquement modifiés, avec de grandes similarités entre les systèmes immunitaires humains et murins qui permet de transposer nos découvertes dans le modèle murin chez l’humain. De plus, nous avons documenté de manière robuste l’existence de notre protéine d’intérêt chez la souris. Souris adultes ( sup 6 semaines) dans lesquelles la réponse immune antibactérienne est active

550 souris génétiquement modifiées pour n'exprimer Mecp2 que dans les neurones catécholaminergiques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles peuvent développer des apnées, de l'hyperventilation, des crises d'épilepsie, une perte importante de poids et une mobilité réduite, et passent par un protocole d'induction de stress de deux fois trente minutes, le test de Barnes, le rotarod, l'open field, le labyrinthe surélevé et la boîte clair-obscur, un petit étant retiré du nid pour éprouver la réponse de la mère. L'ampleur réelle de ces atteintes reste inconnue, puisque caractériser le phénotype de la lignée est précisément l'objet du projet. Le porteur affirme que ce modèle, couplé à un modèle de surexpression ciblée, est "indispensable" pour développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Objectifs

Le syndrome de Rett (RTT) est une maladie neurodéveloppementale rare d’origine génétique. Dans la majorité des cas, la maladie est liée à une mutation du gène Mecp2 qui code pour un facteur de transcription possédant un rôle majeur dans le développement du système nerveux central. La pathologie touche majoritairement les filles et entraîne un polyhandicap sévère qui affecte considérablement la qualité de vie des patientes. Parmi les symptômes, on retrouve notamment une perte/non acquisition des fonctions motrices volontaire (marche/préhension) s’accompagnant de stéréotypies manuelles. On retrouve également des troubles des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation. Les patientes souffrent aussi d’une déficience intellectuelle, de crises d’épilepsie et de troubles variés affectant le sommeil et l’alimentation. De précédentes études réalisées chez des patientes et des modèles murins de la pathologie ont mis en évidence l’existence d’un déficit en certains neurotransmetteurs (dopamine, noradrénaline, sérotonie) largement impliqués dans les processus d’apprentissage et de réponse au stress. Afin d’identifier la part de des symptômes du RTT imputables aux déficits catécholaminergiques, nous souhaitons faire exprimer la protéine Mecp2 dans les neurones catécholaminergiques (exprimant la dopamine, l’adrénaline et la noradrénaline) des souris déficientes en Mecp2. Les animaux de cette étude seront analysés d’un point de vue phénotypique (survie, poids corporel, fonctions respiratoires/motrices/cognitives, anxiété, réponse au stress), histologique et moléculaire (prélèvements d’organes).

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’apporter une meilleure compréhension des relations entre Mecp2, le système catécholaminergique et l’état pathologique des animaux modèles du syndrome de Rett. Cela devrait nous permettre de déterminer la part des symptômes du RTT imputable à ces déficits catécholaminergique. Cette étude devrait par la suite permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant le système catécholaminergique et pouvant avoir un intérêt pour le traitement du RTT.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions: - phénotype neurologique dommageable (sur la durée de vie de l'animal), - retrait d'un petit du nid (stress pour la femelle et son petit): moins de 30s, - protocole d'induction de stress (deux fois 30 minutes), anesthésie gazeuse (deux fois 10 minutes), test de Barnes (2 minutes), Rotarod (5 minutes), open field, elevated plus maze, dark-light box (10 minutes), anesthésie profonde par injection (30 se pour l'injection) puis perfusion intracardiaque terminale

Impact sur les animaux

Nos souris Mecp2y/- pTh-Mecp2 présentent une absence d’expression de Mecp2 dans toutes les cellules à l’exception des neurones catécholaminergiques. Étant donné que la déficience totale de Mecp2 entraîne l’apparition d’un phénotype dommageable mimant le RTT, nous nous attendons à observer chez notre modèle d’intérêt un phénotype moins sévère mais restant pathologique en comparaison à des souris sauvages. Les potentiels effets indésirables attendus chez ces souris comprennent : - une altération des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation - une altération des fonctions motrices conduisant à une réduction de la mobilité - une sensibilité accrue au stress - une perturbation du comportement maternel chez les femelles - une perte importante de poids corporel - des crises d’épilepsies. La détermination précise du phénotype de notre modèle est un des objectifs de ce projet de recherche. En parallèle, les tests phénotypiques réalisés pour caractériser nos lignées sont susceptibles de générer une douleur ou un stress chez nos animaux. Certains animaux seront également anesthésiés pour la réalisation de prélèvements sanguins.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes

Remplacement

Nous ne pouvons pas expérimenter chez l'être humain malade atteint d'un syndrome de Rett. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle d'étude de la pathologie. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal, car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le seul modèle de mammifère disponible à l'heure actuelle pour nos travaux est le modèle souris transgénique dans lequel Mecp2 est manipulé. Ce modèle est utilisé pour mieux comprendre la pathologie et comme modèle pré-clinique afin de développer de nouveaux traitements.

Réduction

La variabilité interindividuelle est réduite par l'utilisation de souches de souris fixées génétiquement. Une analyse de puissance statistique est réalisée en amont de chaque procédure afin de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs. Une fois les expérimentations achevées, des test statistiques appropriés permettront de valider ou non les résultats obtenus. Les expérimentations seront initalement réalisées sur la moitié du n prévu. Les données obtenus feront l’objet d’analyse statistique préliminaire en fonction du résultats desquelles : - les expérimentations seront arrêtées si aucune différence ne ressort entre les groupes - le nombre d’animaux par groupe sera augmenté si une différence entre les groupes semble existée mais ne ressort pas suffisament pour atteindre la significativité

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage (afin de réduire la douleur et le stress des animaux). Les animaux sont hébergés, en groupes, dans des cages avec enrichissements (dôme et bandelettes de carton), eau et nourriture ad libitum. La température (21°C-23°C), la luminosité (cycle 12h jour / nuit), l'environnement sonore et l'hygrométrie sont contrôlés. Cet hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. Nos souris étant particulièrement sujettes au stress, la manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (cupping et tunnels) et à la fragilité de la lignée. Dans le but de limiter le stress des animaux lors des expérimentations, ceux-ci seront préalablement habitués à l’expérimentateur lors de session de « handling ». Une période d’habituation aux dispositifs de tests sera également prévue. Lors des expérimentations – qui seront réalisées par des personnels formés - le nombre de personnes présentes dans la pièce sera limité au maximum pour ne pas perturber les animaux. De plus, afin de limiter le stress des animaux, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie. En parallèle, l'état général de nos animaux sera surveillé quotidiennement de manière à pouvoir intervenir dans les plus brefs délais en cas d'atteinte des points limites définis.

Choix des espèces

Seule la souris permet actuellement de disposer facilement, rapidement et à moindre coût, d'un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L'intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle pré-clinique, repose essentiellement sur la proximité physiopathologique avec l'espèce humaine (transférabilité des résultats), un élément nécessaire à une recherche translationnelle valide. Le modèle déficient en Mecp2 est le modèle le plus largement utilisé par les laboratoires de recherche sur le syndrome de Rett, et est largement caractérisé dans la littérature. L'utilisation de ce modèle, couplé au modèle de surexpression ciblée de Mecp2 est indispensable pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nos animaux seront inclus dans la procédure de caractérisation phénotypique à partir de 30 jours de vie (P30), stade auquel les premiers symptômes de la pathologie apparaissent chez la souris Mecp2-déficiente.

Un score clinique décide du sort de chaque rat opéré, entre prise en charge de la douleur, exclusion de l'étude ou mise à mort. 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit deux chirurgies cérébrales d'une heure, une lésion du cortex moteur puis la pose d'un implant, trois séances d'IRM sous anesthésie et des tests répétés de force d'agrippement et de statut neurologique, jusqu'à trois fois par semaine pendant un mois. Le porteur indique avoir déjà obtenu cette preuve de concept chez le rat avec des biomatériaux non biodégradables et vouloir la répliquer avec des biomatériaux dégradables.

Objectifs

L’objectif scientifique du projet est de développer un traitement pour améliorer la reconnexion des fibres nerveuses après une atteinte du cortex moteur. Les effets du traitement sur l’architecture du tissu cérébral seront évalués par IRM in vivo, par une mesure des capacités motrice et enfin par histologie ex vivo. Le projet se déroulera sur trois mois dans deux établissements utilisateurs, un pour l'imagerie, l'autre prenant en charge toutes les autres techniques expérimentales et l'hébergement.

Bénéfices attendus

Amélioration de la récupération fonctionnelle du cerveau aprés un acccident vasculaire cérébral.

Procédures

Chaque animal sera soumis à 2 chriurgies sous anesthésie (réalisation de lésion (durée 1h) puis pose de l'implant (durée 1h)) au niveau cérébral (EU 1/2). Une IRM cérébrale sous anesthésie (durée 1h) sera réalisée 3 fois aprés la lésion puis 1mois et à 3 mois (EU 2/2). Des tests comportementaux et sensorimoteurs avant les chirurgies seront réalisés pour habituation et détermination des valeurs de références 3 à 4 jours par semaine durant 2 semaines avant les chirurgies puis après la pose de l'implant 3 fois par semaine pendant le premier mois et trois fois la première semaine des 2 mois suivant (EU 1/2). La mise à mort sera réalisée pour la récupération des tissus cérébraux (EU 1/2).

Impact sur les animaux

La chirurgie partiquée induit une lésion cérébrale de la région motrice antérieure (les conséquences de la chirurgie et la douleur est limitée par une prise en charge médicamenteuse). La génération de cette lésion cérébrale ciblée dans la zone contrôlant la motricité d'un membre antérieur provoque une diminution des capacités motrices de l'animal (EU 1/2). Les nuisances et effets indésirables sont dus aux chirurgies. Elles peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : douleur modérée, isolement, diminution du comportement exploratoire, perte de poids. Ces effets peuvent durer jusqu’à 48h (nuisances sévères). Le passage à l'IRM est réalisé sous anesthésie, la nuisance est modérée (EU 2/2). Les tests comportementaux pourraient engendrer un stress léger dû au fait que les animaux sont enlevés de leur environnement habituel, leur nuisance est légère (EU 1/2).

Devenir

La procédure se termine par une mise à mort des animaux pour effectuer l'analyse histologique.

Remplacement

L'accident vasculaire cérébral est une maladie grave entrainant un déficit neurologique lié à des lésions vasculaires. L'accident vasculaire cérébral est le résultat de l'obstruction d'un vaisseau sanguin (ischémique) ou de la rupture d'un vaisseau (hémorragique). Si les progrès actuels dans le domaine des organoides cérébraux ou de l'impression 3D de tissu cérébral in vitro sont remarquables, ils ne permettent toujours pas de recréer l'ensemble fonctionnel d'un cerveau. En particulier, les aspects vasculaires et les intéractions sytémiques ne sont pas encore accessibles avec ces méthodes alternatives à l'utilisation d'animaux. En effet, l'accident vascilaure cérébral conduit à des mécanismes comme l'inflammation, la migration cellulaire de cellules souches, la formation d'une cicatrice , la dégénérence des fibres nerveauses, et des processus de reconnexion dont la complexité et les interactions ne peuvent pas actuellement être simulées sur plusieurs mois par des approches in vitro ou ex vivo. Ainsi l'objectif de notre projet nécessite l'utilisation d'un modèle animal d'accident vasculaire cérébral. Le bénéfice de notre stratégie thérapeutique par greffe de biomatériaux (avec ou sans cellules) sur la récupération fonctionnelle de la motricité doit être évaluée sur des animaux vivants. La force d’agrippement, et le statut neurologique des animaux seront testés sur le long terme. Les effets des atteintes cérébrales et de la greffe sur l’architecture tissulaire du cerveau seront évaluée sur plusieurs mois par Imagerie par Résonance Magnétique. Nous avons déjà fait la preuve de concept de l'efficacité de notre stratégie thérapeutique sur le rat en utilisant des biomatériaux non biodégradables et projetons de la répliquer avec des biomatériaux biodégradables pour nous rapprocher de la situation physiologique.

Réduction

L'utilisation de méthodes non invasive comme l'IRM et l'évaluation motrice permettent le suivi longitudinal sur un même groupe d'animaux. Ainsi, les données peuvent être appariées, ce qui augmente la puissance statistique et limite le nombre d'animaux nécessaires dans l'étude. Des tests statistiques non paramétriques et de corrélation seront utilisés pour évaluer notre approche thérapeutique innovante de l'accident vasculaire cérébral. Nous réutiliserons les données d’animaux contrôles d’un protocole antérieur si possible.

Raffinement

Le principe fondamental des 5 libertés est respecté sur toute la durée de l’étude. Les rats sont hébergés dans des cages ventilées, en groupes de 2 (étant des animaux grégaires), dans une salle spécialement réservée aux rats. L'alimentation est disponible en permanence (ad libitum), y compris pendant les phases d'entraînement et d'évaluation motrice, sans jeûne ni restriction alimentaire. Le suivi de l'état de santé général des animaux est assuré par le personnel de zootechnie, qui les pèse chaque semaine et effectue des contrôles vétérinaires réguliers. Une attention particulière est portée aux animaux opérés, qui font l'objet d'une surveillance quotidienne par le personnel compétent. Cette surveillance inclut l'observation de l'appétit, du poids corporel, de la mobilité, de l'état du pelage et du comportement des animaux et fait l'objet d'un scoring clinique. La valeur du score détermine l'action à réaliser sur l'animal pour une prise en charge de la douleur, une notification de surveillance accrue, une exclusion de l'étude ou une mise à mort. La prise en charge de la douleur est mise en place avec des protocoles stricts validés, prenant en compte le principe de nociception et son impact sur les animaux et les résultats de l'étude. Un enrichissement environnemental est intégré au protocole, comprenant divers éléments pour stimuler cognitivement les rats (tunnels, boule de fouille, boule traversante, odeur naturelles variées, ..), ainsi qu'une composante sociale (arène de rencontre intercage). Les animaux sont conditionnés pour la réalisation de tâches motrices, renforcés positivement. Le procédé est très peu anxiogènes.

Choix des espèces

Les rats sont un modèle animal privilégié pour l'étude de la récupération fonctionnelle de la motricité du membre supérieur après lésion et greffe de bioimplants. Animaux adultes âgés de 3 mois, afin de se rapprocher de la démographie humaine pour l'apparition des accidents vasculaires ischémiques (à partir de 40 ans). La mobilité et la force du membre supérieur est un élément clé des fonctions motrices permettant aux patients cérébrolésés de récupérer une autonomie dans la vie de tous les jours. Nous disposons de tests adaptés pour évaluer ces paramètres sur le rat : l’amplitude de mouvement, la force et la sensibilité des membres supérieurs. Les examens d'imagerie, non-invasifs et indolores, se font sur le rat adulte anesthésié.

Ligament croisé antérieur sectionné et ménisque partiellement retiré au cours d'une opération de trente à quarante-cinq minutes, pour installer une arthrose du genou : 360 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Six semaines plus tard commencent les injections dans l'articulation opérée, jusqu'à trois par genou, complétées par des prélèvements sanguins à la jugulaire sur animal éveillé une fois par semaine. Le porteur attend des cris, de l'agitation, un oedème articulaire et une boiterie. Les hydrogels testés ont déjà été évalués in vitro, mais le porteur affirme que le passage par les rats reste "indispensable" pour observer les interactions avec l'ensemble des organes.

Objectifs

Alors que les affections ostéoarticulaires chroniques touchent tout particulièrement les adultes de plus de 50 ans, il n’existe encore aucun traitement permettant de guérir l’ensemble des signes cliniques associés aux rhumatismes, comme la dégradation du cartilage dont l’évolution conduit assurément à la pose de prothèse articulaire. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques (gel associé à des principes actifs) dans un modèle d’arthrose chez le rat, modèle d’arthrose très largement décrit dans la littérature et obtenu par chirurgie déstabilisatrice de l’articulation du genou. L’arthrose est causée par une altération des articulations suite à une usure progressive du cartilage associée à un remodelage des os situés à proximité, la formation d’excroissances osseuses, un affaiblissement des ligaments et des muscles et une inflammation articulaire. Si les traitements médicamenteux actuels soulagent en partie les douleurs intenses et l’inflammation de ces maladies aucun de ces traitements n’est capable de freiner la dégradation du cartilage ou guérir la maladie. Aujourd’hui, seuls les traitements chirurgicaux très invasifs, comme la pose de prothèse permettent de retrouver la mobilité perdue due à l’arthrose. Ainsi, la découverte et le développement de nouveaux traitements agissant de façon globale sur l’inflammation, les atteintes osseuses et cartilagineuses ainsi que la douleur, caractéristiques de l’arthrose, est un enjeu majeur de santé publique alors que le vieillissement de la population ne fait qu’augmenter. L’objectif du projet est d’évaluer la capacité d’hydrogels à limiter la dégradation du cartilage et/ou régénérer le cartilage dégradé dans un modèle d’arthrose chez le rat, dont les signes cliniques sont proches de ceux observés chez l’homme, obtenu par section du ligament croisé antérieur et ménisectomie partielle. Différents types d’hydrogels réalisés à base de glucose ou d’acide hyaluronique seront testés. Ces hydrogels sont des traitements de type « viscosupplémentation » et visent à rétablir une viscosité suffisante du liquide synovial afin de limiter les effets des contraintes mécaniques. Afin de potentialiser les effets de ces hydrogels, ils seront associés à différents principes actifs à des sous-produits de culture cellulaires (exosomes), ou à des cellules de classe 1 (cellules souches mésenchymateuses).

Bénéfices attendus

Chaque étude réalisée au sein de cette procédure permettra de générer des informations sur l’efficacité de nouveaux hydrogels testés, tant sur l’inflammation que sur la reconstitution du cartilage ou le ralentissement de l’apparition des lésions dans un modèle d’arthrose induit par chirurgie au niveau du genou. A plus long terme, ce projet permettra d’obtenir des données importantes dans le cadre du développement de nouvelles approches pour le traitement des lésions arthrosiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une opération chirurgicale unique réalisée sous anesthésie et avec analgésie afin de réaliser la section du ligament croisé ainsi que l’ablation d’une partie du ménisque. Cette opération dure 30 à 45 min par animal, et la prise en charge analgésique s’étale les jours suivant l’opération. Les traitements seront réalisés par injection intra articulaire, ou intra-musculaire réalisée au plus tôt 6 semaines après la chirurgie sur le membre opéré. Ces injections durent moins de 5 min par animal, et sont réalisées sous anesthésie et analgésie. Elles pourront être répétées au maximum 3 fois par articulation au cours du protocole (injection au maximum 1 fois par semaine par articulation) ou 5 fois au cours du protocole si administration intra-musculaire (injection au maximum 1 fois par jour). Des prélèvements sanguins au niveau de la veine jugulaire pourront également être réalisés. Ces prélèvements auront lieu sur animal vigile, et dureront moins de 5 min par animal. Ils pourront être répétés une fois par semaine tout au long du protocole.

Impact sur les animaux

La réalisation de la chirurgie peut s’accompagner d’une possible réaction inflammatoire transitoire au niveau de l’articulation opérée. De la même manière, l’apparition progressive des lésions arthrosiques est susceptible d’entrainer gène ou douleur. Les effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être un traumatisme exprimé par des cris/agitation pendant l’administration du traitement, ou le prélèvement de sang, une inflammation au niveau du site d’injection, un œdème articulaire ou une boiterie. Pour prévenir ces différents cas de figure, les animaux seront suivis avec précaution et des grilles d’évaluation clinique associée aux conduites à tenir en cas d’observation de ces signes ont été prévues.

Devenir

A l’issue de chaque protocole tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les articulations, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour évaluer les modifications de différents marqueurs induits par les traitements. Les organes et articulations prélevés seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques, histopathologiques et/ou d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les hydrogels que nous évaluons in vivo, ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir de produits testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, dans le cadre des pathologies arthrosiques, il est pour le moment impossible de reproduire in vitro les mécanismes de déstabilisation mécanique de l’articulation à l’origine de l’apparition des lésions arthrosiques. De la même façon, les interactions entre les différentes cellules et tissus composants l’articulation ne peuvent être mimées par un modèle simple de culture in vitro. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce procédure.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours d’un protocole. Etant donné la variabilité probable des réponses aux produits, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. L’effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu (par exemple : traitement de référence), et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente). Lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements, nous utiliserons un anesthésique, et des antalgiques dès l’apparition des premiers signes cliniques. Lors des traitements expérimentaux et lors des prises de mesures, nous maintiendrons les animaux dans une situation d’inconfort et de douleur pendant un minimum de temps. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine minimum. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus tôt possible au moment des suivis et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera pris en charge ou euthanasié.

Choix des espèces

Il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer les lésions ostéoarticulaires. L’animal demeure indispensable à l’évaluation de produits. De plus le modèle d’arthrose par chirurgie chez le rat, utilisé depuis de nombreuses années, est maintenant reconnu pour être un modèle très prédictif pour la recherche médicale humaine et vétérinaire. En effet, le rat est l’espèce mammifère dont les caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires sont proches de celles observées chez l'homme. Le rat, est fréquemment utilisé à des fins de recherche, car les résultats de produits thérapeutiques sont facilement transposables à l'homme, par simple approche/méthode statistique. La taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques analysables. Enfin, le rat est préféré à la souris pour l’étude de lésions cartilagineuses car le cartilage est plus épais et les effets d’une chirurgie chez le rat s’approchent de la pathologie humaine. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté au schéma thérapeutique des traitements étudiés. Bien que les pathologies rhumatiques puissent toucher des patients à n’importe quel âge, chez les rongeurs, la modélisation de ces maladies donne des résultats plus homogènes avec des rats adultes âgés de 8 à 10 semaines au début du protocole.

Le nerf sciatique de 136 souris est sectionné sous une anesthésie de trente minutes, puis un implant à électrodes en or est posé pour tester si un champ électrique accélère la repousse nerveuse. Toutes seront tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 72 d'entre elles subissant en plus une étude électrophysiologique à dix semaines. Le porteur reconnaît que la lésion peut causer des douleurs intenses, une restriction de la mobilité, une déshydratation et des comportements d'automutilation, avant que toutes les souris soient fixées pour prélever moelle épinière, nerf et muscle. Il annonce des tests comportementaux hebdomadaires qu'il qualifie de non invasifs et non douloureux, sans préciser lesquels.

Objectifs

Notre approche est novatrice et consiste à mettre au point un dispositif électrique implantable pour réparer des nerfs périphériques sectionnés ou écrasés. Un protocole expérimental a été validé in vitro pour optimiser l'effet d’un champ électrique local exogène sur les processus de régénération nerveuse in vivo. Le dispositif expérimental est constitué d’un tube sur lequel des électrodes en or sont imprimés. Il offre des possibilités polyvalentes pour des études physiques, biochimiques et biologiques approfondies. L'application potentielle de ce neuro-implant sur une lésion du nerf sciatique (modèle biologique) semble prometteuse pour améliorer la régénération nerveuse, en particulier dans le cas des lésions à gap important (au-delà de 3 cm chez l’homme) du nerf sectionné pour lequel la réparation est problématique.

Bénéfices attendus

La priorité de ce projet est de mettre au point un dispositif non invasif qui permette la repousse d’un nerf après traumatisme. Ce projet repose sur le développement d'une interface entre les neurosciences, la biophysique, la science des biomatériaux et les techniques d’imagerie appliquées aux systèmes biologiques. Les développements seront à la fois fondamentaux et techniques, y compris l’étude de nos hypothèses sur la capacité du champ électrique à modifier l’activité cellulaire, ce qui constituerait de grandes avancées en neurosciences, et la compréhension de l’interaction champ électrique-protéine, qui peut apporter de nouvelles perspectives en biophysique et en biomatériaux. Notre objectif à terme, est de proposer un traitement dans le cadre de la prise en charge de ce type de traumatisme chez l’Homme et d’étendre cette méthode thérapeutique à d’autres types de pathologies nerveuses.

Procédures

136 souris seront utilisées dans ce projet. La transsection du nerf sciatique et l’implantation du neuro-implant seront réalisées sous anesthésie générale d’une durée totale de 30 min. Toutes les souris réaliseront des tests comportementaux, ces expériences sont non-invasives et non douloureuses et se feront sur animal vigile. Ces expériences commencent à J7 post-lésionnelle et elles seront effectuées de manière hebdomadaire. L’étude électrophysiologique ne concernera que les souris de la deuxième procédure (n=72), elle sera réalisée sous anesthésié générale à J(10 semaines). L’ensemble des animaux (136 souris) seront fixés. Pour la première procédure, la fixation sera réalisée à deux stades post-lésionnels (J(5 semaines) et J(10 semaines)) afin de récupérer la moelle épinière. Pour la deuxième procédure, la fixation se réalisera à J(10 semaines) afin de prélever le nerf sciatique et le muscle gastrocnémien.

Impact sur les animaux

- Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie. - La lésion du nerf sciatique, peut causer des douleurs intenses avec restriction de la mobilité, diminution marquée de la prise de nourriture, déshydrations ou comportement d’automutilation. Les animaux seront surveillés et la prise en charge de la douleur sera adaptée en fonction des indices révélant la douleur ressentie par les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour les prélèvements de tissus.

Remplacement

Il est important de noter que nous avons étudié in-vitro l’effet de cette approche thérapeutique sur la repousse axonale sous forme d’étude préliminaire qui a abouti à la création d’un neuro-implant électroactif. Ce travail démontre la potentialité d’utiliser un champ électrique sans contact pour accélérer et orienter la pousse des axones. Cette étude nous permet aussi de comprendre l’impact du champ électrique sur les cellules et le substrat d’adhésion. Notre objectif est d’optimiser l’effet d’un champ électrique exogène et local sur les processus de neuritogenèse et de régénération, via la conception d’un dispositif expérimental original utilisant des électrodes en or. Des tests in-vivo utilisant des modèles de dénervation chez des souris adultes fourniront une preuve de concept de la capacité de réparation nerveuse de ces nouveaux implants électroactifs. Nous avons choisi de nous concentrer, pour cette étude, sur la réparation axonale après un trauma / axotomie. Nous avons donc besoin d'une approche intégrée allant du comportement au cellulaire pour à terme pouvoir juger de l'efficacité de cette approche chez l'Homme et développer des projets de recherche clinique.

Réduction

- Le groupe d’animaux contrôle sera utilisé dans le cadre des différents traitements. Pour chaque protocole, le nombre de souris par groupe est suffisant pour obtenir des données statistiquement valides, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 animaux selon des études antérieures. - 12 souris/groupe seront utilisées pour l’histologie de la moelle épinière (n=6 à J(5semaines) et n=6 à J(10semaines)). 12 souris/groupe seront utilisées à la fois pour l’histologie des nerfs sciatiques et des muscles gastrocnémiens. Il est à noter que 40 souris sont utilisées dans les tests préliminaires (pour rappel les tests préliminaires portent sur la taille du gap (1, 2 ou 3mm) et la sur durée de pré-stimulation (4, 8 ou 24h)). - Une veille bibliographique sera effectuée dans ce contexte scientifique afin d'éviter tout emploi injustifié des procédures expérimentales.

Raffinement

- Les interventions douloureuses ou angoissantes sont réalisées sous anesthésie et un monitoring de l’analgésie pré, per et postopératoire sera envisagé. Avant et pendant l’intervention chirurgicale, dès l’apparition d’un ou des premiers signes d’allègement de l’anesthésie (réflexes, accélération du pouls et de la respiration, mouvements des vibrisses, réaction à un stimulus douloureux), l’animal reçoit immédiatement une dose supplémentaire d’anesthésique équivalent au quart de la dose initiale. L’intervention ne reprend que lorsque l’animal est profondément anesthésié (immobilité, rythme cardio-respiratoire régulier, pas de réaction à un stimulus douloureux comme le pincement d’une patte). Une injection SC d’antalgique sera effectuée 20 minutes avant le début de la chirurgie et deux injections en post-chirurgie avec un intervalle de 4h durant les premiers 24h post-lésionnelles, de façon à réduire la gêne fonctionnelle et les douleurs. Un antalgique sera mis dans le biberon durant la première journée post-opératoire.- Des gouttes du gel oculaire seront appliquées sur les yeux des souris durant la procédure chirurgicale pour éviter toute lésion cornéenne. - Un score de douleur sera établi en observant le comportement des animaux toutes les semaines et selon le résultat une analgésie sera mise en place ou l’animal sera exclu ou sacrifié. Pour réduire le stress éventuel engendré par les procédures, un enrichissement de l'environnement est essentiel, les cages seront pourvues d’un rouleau en carton ainsi que du coton et des bâtonnets de bois et isolées des vibrations grâce à un tapis en mousse. Les souris seront placées dans une pièce au calme et manipulées de façon journalière.

Choix des espèces

L'objectif de ce projet est d'étudier les effets d'un champ électrique sur le processus de régénération nerveuse après lésion. Nous travaillons sur la souris pour deux raisons : (i) facilités des observations : évaluation comportementale des sorties motrices et sensitives et accessibilité aux motoneurones. (ii) possibilité d'avoir des souris mutantes dans certaines pathologies inflammatoires et démyélinisantes. Ce travail sera réalisé sur des souris adultes de 8 semaines parce qu’elles présentent un degré de myélinisation optimal. De plus, l’objectif à terme est de réparer des nerfs chez des patients essentiellement adultes.