Procédures sévères

Pour étudier la nécrolyse épidermique toxique, réaction allergique rare à un médicament où la couche supérieure de la peau se nécrose et se décolle, 190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 70 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau sévère. Les procédures comprennent une biopsie de queue pour le génotypage, un rasage du dos et du ventre, un test de chaleur dans un bain à 52 °C que le porteur dit "sensiblement douloureux", de 2 à 7 injections sans anesthésie, l'élimination chimique des neurones sensoriels ou l'application d'un produit allergisant et irritant. Dans la première partie, un test de Nikolsky, pression du doigt sur la peau pour voir si l'épiderme se détache, est pratiqué chaque jour sous anesthésie, les oreilles étant mesurées sous anesthésie cinq jours sur sept pendant 21 jours au plus, et le porteur prévoit œdème, perte de poids, atteintes des muqueuses et conjonctivites possibles. Les souris qui présentent un décollement de l'épiderme, qu'il compte parmi les "premiers symptômes cliniques" de la maladie, sont mises à mort aussitôt, et la peau de toutes est ensuite analysée.

Objectifs

Les réactions d’allergie médicamenteuse sont des effets secondaires fréquents chez les patients hospitalisés (1‐3%), dont la prise de médicament est l’élément déclencheur. Ces réactions allergiques peuvent être de sévérité très variée mais la plus sévère est la nécrolyse épidermique toxique. Il s’agit d’une réaction rare (2-4 patients/million d’habitants/an) mais extrêmement sévère, avec décollement et nécrose de la partie supérieure de la peau. Ces réactions sont potentiellement mortelles (~30%) ou entraînent fréquemment de graves séquelles (>50% des patients). L’un des premiers symptômes de la nécrolyse épidermique toxique est une douleur cutanée perçue par des neurones sensoriels spécialisés dans la peau. Des recherches récentes ont mis en évidence que les interactions entre les neurones sensoriels et le système immunitaire participent activement au développement des maladies de la peau. Pour mieux comprendre la sévérité de cette maladie, un modèle très récemment mis au point par l'équipe et mimant les symptômes chez la souris sera utilisé. L’objectif de ce projet sera dans un premier temps de mieux caractériser la réponse immunitaire dans la peau et dans un deuxième temps, d'évaluer le rôle potentiel des neurones sensoriels dans le développement de la nécrolyse épidermique toxique dans ce modèle de souris.

Bénéfices attendus

1/ Caractérisation de la dynamique de la réponse immunitaire d’un modèle de souris de nécrolyse épidermique au cours du temps 2/ Existence d'interactions entre les neurones sensoriels et les cellules immunitaires qui participent au développement de la nécrolyse épidermique toxique.

Procédures

Les souris sont génotypés avec une biopsie de queue de 1mm entre 10 et 15 jours. Les souris seront rasées sur le dos et le ventre, cette procédure est réalisée sous anesthésie à l'isoflurane et dure 30s. Le test à la chaleur réalisé avec un bain marie chauffé à 52°C pendant 15s est perçu comme sensiblement douloureux par la souris mais n'induit aucune brûlure ou douleur persistante chez l'animal. 1ère partie des animaux : Les animaux seront injectés en vigiles par injections à plusieurs reprises (selon les animaux = entre 2 et 7 injections au total, durée 30sec). La déplétion chimique des neurones sensoriels sera faite par injection sous cutanée (3 injections, 30sec). La déplétion des CD4 sera faite par injection intra-péritonéale (1, 2 ou 3 injections, 30sec). Le transfert des cellules sera fait par injection sur des animaux anesthesiés (1 injection, 40sec). Des tests de Nikolsky (legère pression de la peau avec le doigt) seront réalisés sur les animaux quotidiennement sous anesthésie (30 sec). Les animaux seront pesés quotidiennement et la température rectale sera prise de manière bi-hebdomadaire (45sec). Les oreilles des animaux seront également mesurées quotidiennement 5jours/7 sous anesthésie (durant 21 jours maximum, durée 30 sec). 2ème partie des animaux : Les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre au début des procédures. 5 jours après, les animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles et le dos, afin d'induire une réaction allergique (inflammation). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 1h.

Impact sur les animaux

La biopsie de queue réalisé pour le génotypage peut entrainer une douleur légère de courte durée. Les souris seront rasées sur le dos et le ventre pour observer les atteintes cutanées, ce qui n'entraine pas de douleur mais un léger inconfort durant la procédure. Les anesthésies peuvent entrainer du stress chez les animaux. Les injections génèrent un stress et une légère douleur. La déplétion des neurones sensoriels entraine une baisse de la température et de faibles démangeaisons lors de la première injection dans les 60min suivant l'injection. Sur le long terme, elle entraine une perte de sensibilité mais pas de changement de comportement des animaux, possible dépigementation du poil (taches blanches). Pour les animaux qui vont développer une réaction mimant les symptômes de la nécrose épidermique toxique avec des atteintes cutanées : on s'attend à ce que les premiers symptômes arrivent 9 jours après le début de la procédure, et a ce que les animaux développent dans un premier temps un léger œdème cutanée (qui sera suivi par l'augmentation de l'épaisseur de l'oreille) ce qui pourra engendrer de l'inconfort, peux être des grattages chez ces animaux. On pourra aussi observer une perte de poids. Puis dans un deuxième temps on devrait observer un détachement de l’épiderme par endroit. Celui-ci sera suivi quotidiennement par la réalisation d’un test de Nikolsky sur des animaux anesthesiés (en exerçant avec un doigt une très légère pression / frottement sur la peau afin de voir si l’épiderme se détache). A noter que des atteintes des muqueuses, et des conjonctivites sont possibles ainsi qu’une modification significative de l’activité. Le modèle d'eczéma induit chez la souris est parfaitemenent maitrisé dans l'équipe ; l'induction d'un eczéma chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. L'eczéma peut conduire les souris à se gratter, mais dans notre expérience, nous n'avons jamais observé de signe excessif de grattage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de réaliser des analyses sur la peau. Ces analyses permettront d'analyser les populations de cellules qui infiltrent le tissu au cours du temps afin de caractériser la réponse immunitaire de notre modèle et également d’évaluer l’implication des nocicepteurs dans le développement de la nécrolyse épidermique toxique.

Remplacement

La finalité du projet est de mieux comprendre la réponse immunitaire qui se met en place et qui aboutit au développement des symptômes cliniques de la nécrolyse épidermique toxique. Cette compréhension au niveau du modèle murin pourra permettre de mieux comprendre l’origine de cette sévérité et ouvrir la voie au développement de nouvelles thérapies. Le signe clinique clé de la pathologie est le détachement de la membrane basale suite à l’activité cytotoxique de cellules spécifiques qui vont infiltrer le tissu. Il n’est pas possible de mimer cette réponse physiopathologique dans un modèle in vitro et aucune autre alternative ne peux mimer ce qui se passe dans un organisme entier, de ce fait l’utilisation d’un model in vivo est obligatoire pour caractériser cette pathologie.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience. Il a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Le contrôle d'une pathologie moins sévère où les acteurs cellulaires sont les mêmes (eczéma de contact), ne sera réalisé qu'une seule fois.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début des procédures expérimentales. Les animaux seront maintenus à 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, pour prévenir tout stress et limiter la survenue de symptômes douloureux ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 7jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dès l’apparition des premiers symptômes cliniques de la nécrolyse épidermique toxique (décollement de l'épiderme), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour explorer les maladies immunologiques, telles que l’allergie ou l’inflammation cutanée, en raison des nombreux outils qui ont été développés pour caractériser les réponses immunitaires. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. Les souris entrent dans les procédures à l’âge de 5-22 semaines, période correspondant à l’âge de maturité du système immunitaire.

4 775 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 500 et sévère pour 2 275, la plupart tués et 625 réutilisés. Une hypersensibilité viscérale est provoquée par chirurgie ou injection, puis les animaux subissent des distensions colorectales par ballonnet, des contentions en tunnel et l'administration de composés par de multiples voies. Le porteur indique que les rats en procédure sévère sont tués en raison d'une douleur persistante liée à leur pathologie. Il teste des candidats-médicaments contre la douleur viscérale et affirme que seule l'étude chez l'animal vigile permet de distinguer la douleur de la simple nociception.

Objectifs

La douleur, très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires,nécessite une recherche constante de nouvelles pharmacologies de références. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur viscérale. Ces modèles et tests sont couramment décrit dans la littérature et sont réalisés au sein de la communauté scientifique depuis plusieurs années. La douleur viscérale, est un problème socio-économique non résolu qui affecte jusqu’à 20% de la population adulte. Les pathologies associées à la douleur viscérale sont les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin telles que la maladie de Crohn ou la colite ulcéreuse ou encore les troubles gastro-intestinaux fonctionnels. Le syndrome de l’intestin irritable est caractérisé par des douleurs abdominales, de l’inconfort et des habitudes intestinales altérées. Il n’existe pas de marqueurs biologiques, seuls les symptômes permettent le diagnostic de cette pathologie. Par exemple, lors d’une distension colorectale, les patients présentent des seuils de sensibilité viscérale inférieurs à ceux observés chez des sujets sains. Ceci démontre une hypersensibilité viscérale. Un des modèles d’hypersensibilité viscérale couramment utilisé est l’induction d’une inflammation du côlon chez le rat. Cette inflammation est induite par administration chirurgicale d'un produit chimique dans le côlon proximal. Dans ce modèle, le critère d’évaluation de cette hypersensibilité viscérale est la diminution du seuil nociceptif mesuré durant une distension colo-rectale. Le stress pourrait également jouer un rôle dans l'apparition des symptômes. Environ un malade sur deux rapporte une relation chronologique entre la survenue d’un stress et l’apparition des premiers symptômes du syndrome de l'intestin irritable. Il a été démontré que des stimuli stressants pouvaient engendrer une diminution des seuils de distension colo-rectale chez les rats. D’autre part, un modèle de crampe abdominale est développé chez le rat. Le comportement est alors observé (apparition de crampes, torsion du corps) et quantifié. L'objectif du projet, est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l'évaluation de l'efficacité de nouvelles molécules qui pourront être utilisée en clinique. Le but à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs viscérales

Bénéfices attendus

Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication de certains résultats encourageants sera envisagée.

Procédures

Les animaux sont soumis à une chirurgie ou une injection en intrapéritonéale afin d’induire les modèles d’hypersensibilité viscérale. Lors des tests les animaux sont osumis à une contention dans un tunnel (2 heures maximum), un isolement dans des compartiments (30minutes à 4 heures maximum). Lors de la distension, le test est stoppé dès réaction de l’animal dans l’objectif de déterminer les seuils de sensibilité viscérale et de mettre en évidence une amélioration suite au traitement pharmacologique (maximum 8 minutes par cycle). Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.

Impact sur les animaux

Les modèles décrits dans ce projet sont des modèles de douleur viscérale chronique (sévère) ou aigue (modérée) Les nuisances liées au développement de ces modèles sont : chirurgie, une contention dans un tunnel (nuisance modérée, 2heures maximum) ou injection intrapéritonéale afin d’induire le modèle, une perte de poids, une déshydratation ou une mauvaise cicatrisation (nuisances modérées). Les nuisances liées aux tests (notamment la distension colorectale) peuvent être : sensibilisation des tissus à la suite de l’introduction du ballonnet par la voie rectale (nuisance modérée) Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (nuisance légère 1min) ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité possible mais réduite (nuisance légère, durée maximale 4heures). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de cinétiques par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle, nuisance légère). Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance légère, 3min). Enfin, pour l’ensemble des procédures une mise à jeun est nécessaire (nuisance modérée, temps maximal 24h).

Devenir

Les animaux des procédures sévères sont mis à morts, ils ne peuvent être ni replacés ni réutilisés à cause de la douleur persistante liée à leur pathologie. Enfin bien que les animaux ne présentent plus d’effets post-test, nous ne connaissons pas les impacts potentiels que les administrations de composés en systémique ou non ont pu réaliser. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. C’est pourquoi, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité. Dans le cas de la procédure 3 les animaux ne présentant pas de signe de souffrance pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple).

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition , la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Ces modèles sont couramment mis en place au sein de la communauté scientifique. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place.

Raffinement

Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers. Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée solution saline ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du monde scientifique. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour la procédure n°1 sont des animaux juvéniles/ péri-adolescents (4-6semaines ; 100-250g le jour d’induction du modèle). Ce stade a été choisi car il est adapté au screening de molècules, il permet d’éviter d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Pour les procédures n°2 et 3 les animaux sont âgés d’environ de 7-8 semaines, stade adulte. Ce stade de développement a été choisi car le syndrome de l'intestin irritable touche des personnes adultes. De plus, les modèles ont été développés chez des sujets âgés.

Une souris qui convulse plus de trois minutes pendant une manipulation est mise à mort, durée au-delà de laquelle les convulsions peuvent abîmer le cerveau. 142 souris, mutantes ou témoins, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, et la déclaration en compte 118 en souffrance modérée et 24 en souffrance sévère. Les mutantes portent deux variants relevés chez une adolescente morte à 16 ans au cours d'une crise d'épilepsie. Les souris reçoivent sous anesthésie une puce sous la peau pour suivre leurs interactions sociales, boivent une eau acidifiée les jours d'un test cognitif de quatre semaines, subissent des sons de 110 dB et une injection d'un agent convulsivant, et passent un labyrinthe à bras ouverts, une arène, un test d'alternance et un test de mémoire. Le projet doit vérifier si ces souris reproduisent les troubles de la patiente, et le porteur juge "impossible de mettre en place un suivi permanent" de leurs crises spontanées.

Objectifs

Notre recherche porte sur la caractérisation in vivo de deux variants identifiés chez une jeune fille atteinte d’épilepsie frontale nocturne décédée brutalement au décours d’une crise d’épilepsie fatale. Les investigations génétiques ont permis d’identifier deux variants de deux gènes, chacun à l’état hétérozygote (où un seul chromosome porte la mutation). Les mutations liées à l'un des gènes sont rapportées dans l’épilepsie frontale nocturne et dans d’autres pathologies tel que le trouble du spectre autistique, mais pas aux crises d’épilepsie fatale. Plusieurs variants du deuxième gène ont été associés à des épilepsies focales héréditaires (dont l’épilepsie frontale nocturne) avec résistance aux médicaments et un risque accru de crise d’épilepsie fatale, mais le variant identifié dans notre cas n’a encore jamais été rapporté dans un cas de crise fatale. Notre objectif est ainsi de caractériser les souris portant les deux mutations afin de déterminer si elles reproduisent les phénotypes observés chez la patiente.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de valider les souris portant deux mutations pour deux gènes impliqués dans des crises d'épilepsie, mais également de mort subite et inattendue en épilepsie. En effet, le projet a pour but de déterminer les phénotypes comportementaux chez la souris et de les comparer à ceux observés chez la patiente afin de déterminer si les souris portant les deux mutations sont un bon modèle pour ces maladies humaines. Une fois le modèle murin validé, il permettra de caractériser les mécanismes physiopathologiques impliqués, ce qui facilitera l’identification des cibles thérapeutiques qui pourront ensuite être testées sur ce même modèle murin.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Une implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes). - Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. - Lors du test d'altérations des capacités de filtrage de l'information, des sons à fréquence croissante seront présentés à l'animal sur plusieurs sessions (durée totale du test: environ 45 min). - test de susceptibilité aux crises épileptiques (injection d'un agent convulvisant): 5 sec; durée du test:20 minutes);

Impact sur les animaux

Le modèle murin étudié modélise la situation observée chez une patiente porteuse des deux mutations sur deux gènes différents présentant des crises hypermotrices frontales nocturnes, une forme d’épilepsie modérée pour laquelle elle était traitée depuis l’âge de 11 ans. Il est donc attendu que les souris porteuses de ces deux mutations présentent les mêmes symptômes d’épilepsie frontale survenant pendant le sommeil. Il faudra donc faire une surveillance renforcée des souris en journée pour voir si les souris (qui sont des animaux nocturnes) présentent des épilepsies. Les souris pouvant présenter des crises convulsives spontanées à n’importe quel moment de la journée, il est impossible de mettre en place un suivi permanent. Cependant, les crises ayant tendance à apparaitre après stimulation, elles peuvent se produire lors de la manipulation de l’animal. Si lors d'une manipulation, nous observons une souris qui convulse plus de 3 min (temps au-delà duquel les convulsions peuvent entraîner des dommages sur le cerveau), celle-ci sera euthanasiée. Par ailleurs, ce projet comprend une implantation d'une puce RFID en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'implantation. Le test acoustique présente quant à lui un inconfort léger notamment en raison des stimuli auditifs qui sont de 110dB et durent quelques ms.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue des croisements ou de la réalisation de l'ensemble des expériences, pour prélever des organes en vue des analyses post-mortem.

Remplacement

L’utilisation de l’expérimentation animale pour nos travaux est rendue nécessaire par la complexité de l’environnement cérébral qui ne peut pas être recréé par des approches in vitro. L’épilepsie étant causée par un déséquilibre de la balance excitation et inhibition dans le cerveau, il n’est pas possible d’étudier dans un modèle cellulaire l’impact de nos mutations sur le risque de survenue de crises épileptiques.

Réduction

Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Les mêmes animaux seront utilisés dans les différents tests comportementaux. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 12 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative. Nous appliquerons des analyses statistiques adéquates pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (mutants vs contrôles) : nombre et durée des entrées dans les bras ouverts d'un labyrinthe; distance parcourue et temps passé dans le centre d'une arène; nombre d'alternance; nombre et type d'interactions ; performance lors du test du mémoire; caractérisation des crises épileptiques après administration d'un agent pro-convulsivant.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort des animaux et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupération entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Afin de prévenir la survenue de crises épileptiques, nous éviterons les bruits au maximum et nous manipulerons les souris avec douceur, en utilisant un tunnel lors de chaque manipulation et change de cage. La manipulation par tunnel sera mise en œuvre dès le sevrage afin que l’animal s’y habitue. Si lors d'une manipulation, nous observons une souris qui convulse plus de 3 min (temps au-delà duquel les convulsions peuvent entraîner des dommages sur le cerveau), celle-ci sera euthanasiée. Par ailleurs, chacune des lignées sera maintenue à l'état hétérozygote pour chacune des mutations individuelles, pour ne pas induire de phénotype dommageable

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'Homme. En particulier, deux gènes sont fortement conservés entre la souris et l’humain. Par ailleurs, grâce aux progrès des technologies de manipulation génétique, il est aujourd’hui possible d’introduire des mutations ponctuelles dans le génome de la souris et modéliser ainsi une maladie génétique humaine chez la souris. Les manipulations génétiques nous permettent de simuler in vivo des altérations de l’expression de gènes ou de la physiologie cellulaire, caractéristiques de pathologies humaines. La génération et l’analyse de ces modèles pourront nous être utiles dans la compréhension des mécanismes à la base de la maladie génétique et au développement de nouvelles thérapies pharmacologiques et cellulaires. Enfin, des résultats sont disponibles sur des modèles de souris ne portant qu'une seule des deux mutations, pouvant permettre de comparer ces résultats à ceux qui seront issus du modèle souris mutées pour les deux gènes. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes et âgés de 5 à 18 semaines. Cet âge a été choisi selon la symptomatologie clinique, la patiente portant ces deux mutations ayant présenté un tableau clinique à l'adolescence (âge du décès de la patiente à 16 ans).

40 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Une colite sévère est provoquée pour augmenter la perméabilité intestinale, le porteur reconnaissant des saignements rectaux, une diarrhée, une anémie et une perte de mobilité, tandis qu'un édulcorant, le sucralose, est administré par gavage pendant quatorze jours. Les tissus sont prélevés après la mise à mort pour doser le sucralose. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit la digestion et la bioaccumulation.

Objectifs

Ce projet vise d’une part à étudier l’impact d’une consommation d’édulcorant artificiel (sucralose) de 14 jours sur sa bioaccumulation dans différents compartiments tissulaires tels que le sang, les vaisseaux sanguins, le tissu adipeux et le cœur dans un modèle de souris dont la perméabilité intestinale est augmentée ou non par traitement entrainant le développement d’une colitis sévère. D’autre part, l’état inflammatoire du tissu adipeux sera étudié, en réponse à la prise de sucralose en condition de perméabilité intestinale induite ou non.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer la bioaccumulation de sucralose dans les différents compartiments tissulaires (en particulier dans le plasma sanguin et le tissu adipeux) suite à une consommation de 14 jours car très peu d’informations à ce jour sont disponibles dans la littérature. Ce projet permettra également d’étudier le profil inflammatoire du tissu adipeux pour mieux comprendre les effets de ce régime.

Procédures

Les animaux seront pesés quotidiennement et soumis à une administration orale subchronique (1 traitement par jour pendant 2 semaines) en eau ou en sucralose (185mg/kg). Ces tests nécessitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage.

Impact sur les animaux

Les pesées quotidiennes peuvent être source d’un stress léger pour les animaux. Le traitement pendant une semaine induit une source de stress et de douleurs sévères chez l’animal. Ce traitement peut provoquer plusieurs effets indésirables, à savoir : saignements rectaux, perte de poids, diarrhée, anémie et perte de mobilité. L’administration de sucralose par voie orale (gavage, sonde métallique rigide) peut également être source de stress ou de douleurs modérées pour l’animal.

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'intérêt qui seront ensuite étudiés (quantification sucralose).

Remplacement

Les mécanismes de digestion, d’absorption et de bioaccumulation de molécules sont complexes. Aucune méthode in vitro ne permet de remplacer de manière exhaustive les mécanismes de digestion in vivo. Il convient donc d’étudier in vivo sur une faible population la bioaccumulation du sucralose dans différents tissus d’intérêt.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire afin de réaliser les mesures de biodisponibilité et bioaccumulation tout en s’assurant de la répétabilité du résultat. Pour cela, un nombre minimum de 10 animaux par condition apparaît comme nécessaire. (G Power, Differences between two groups, A priori: Compute required sample size; Effect size d. 2 30%; puissance statistique= 0,80, risque alpha=0,05)

Raffinement

Les animaux sont acclimatés à leurs conditions d’hébergement pendant les 11 jours suivant leur arrivée, avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les animaux sont hébergés en cages de 5 individus avec un enrichissement du milieu (igloos, tubes, et coton). Pour permettre aux souris de ronger, de petits bâtonnets en bois sont également proposés. La température et l’hygrométrie sont contrôlées dans des conditions constantes de température (21°C±1°C) et d’humidité (55±5%) avec des cycles jour/nuit de 12 heures et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une table de score intégrant les différents points limites et mesures médicamenteuses ou non à mettre en place (annexe en pièce jointe). Au-delà d'un score de 5 sur cette fiche l'utilisation un analgésique sera utilisé (buprénorphine 0,5 mg/kg/j et 3mL/kg en sous-cutané) afin de garantir le bien-être de l'animal. Les animaux seront manipulés régulièrement afin de réduire leur stress. Une phase d'habituation au gavage sera réalisée pendant 3 jours avant le début de l'étude. Enfin, avant de réaliser tout type de prélèvements, une dislocation cervicale sera réalisée.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent afin d’étudier les mécanismes de digestion car son système digestif est proche de celui retrouvé chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 8 semaines à l’achat et de 9 semaines au début du protocole. Cet âge a été défini conformément à la littérature et aux guidelines de référence liés au traitement comme moyen d’induire une colitis sévère et in fine une perméabilité intestinale augmentée. De plus, ces animaux correspondent à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.