Procédures sévères
Mise en place d’un modèle murin avec un microbiote intestinal contrôlé et un système immunitaire humain permettant d’évaluer des thérapies anti-tumorales
- Recherche appliquée
- Cancers
1362 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de modéré à sévère. Elles reçoivent des antibiotiques puis une transplantation de flore intestinale par gavage répété, une suppression de leur système immunitaire, une greffe de cellules immunitaires humaines et de cellules tumorales, avant l'administration de traitements anticancéreux. Le porteur indique que ces manipulations peuvent provoquer diarrhées et effets délétères mal connus, et que des souris sont tuées lorsque la tumeur ou le traitement entraîne des atteintes, ou pour des prélèvements incompatibles avec la survie. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permet d'évaluer une thérapie en tenant compte à la fois du microbiote et d'un système immunitaire humain.
Objectifs
Le projet a pour objectif de mettre en place un modèle de cancer chez la souris avec un microbiote intestinal contrôlé (= « flore intestinale ») et un système immunitaire de type "humain" permettant d'évaluer de nouveaux traitements anticancéreux à visées humaines.
Bénéfices attendus
A court terme, les bénéfices attendus sont d’évaluer le lien entre la composition du microbiote intestinal et l'efficacité des thérapies, en particulier des immunothérapies dans la lutte contre le cancer. A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments et stratégies thérapeutiques pour traiter les cancers.
Procédures
Modification du microbiote des animaux (traitement de 1 semaine par antibiotiques), change des cages durant la durée du traitement par antibiotique (1 fois par jour pendant 2 à 8 jours), transplantation d’un nouvelle flore intestinale par gavage oral (durée du gavage inférieure à 1 min, à raison 3 fois par semaines pendant 3 à 8 semaines), suppression du système immunitaire d’origine (durée du protocole : 1 semaine maximum avec des injections régulières de durée inférieures à 1 min), greffe de cellules immunitaire humaine (durée de l'injection inférieure à 1 min) et greffe de cellules tumorales (durée de l'injection inférieure à 1 min). Application / Administrations des traitements (moins de 2min pour les injections). En cas de prélèvement de sang (durée de moins de 2min).
Impact sur les animaux
Stress lié à la contention pour suivi des signes cliniques, administration des anesthésiques, analgésiques et des différents traitements par différentes voies (douleur équivalente à la piqure d’une aiguille). Stress lié au change des cages. A noter que l’implantation d’un nouveau microbiote et suppression du système immunitaire d'origine pourra conduire à des désagrément intestinaux (ex: diarrhées). De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Egalement, le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associé ou non à de la perte de poids).
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas d’autres méthodes (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle thérapie anticancéreuse en considérant à la fois la composition du microbiote intestinal et un système immunitaire humain. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe, 10 à 12 animaux, est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses pharmacocinétiques. Des analyses statistiques seront effectuées à chaque étape du projet afin de selectionner et valider des protocoles optimaux, de façon objective. Un nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe sera utilisé pour tester, sélectionner et valider différents protocoles expérimentaux.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période postopératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • Le suivi de la température et l'utilisation d'une chambre de réveil chauffée, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales • Un hébergement en groupe mais sous isolateurs ou en portoirs ou en cages ventilés (permettant un hébergement « sous bulles ») afin de réduire drastiquement les risques de complications pour les animaux à chaque étape du projet.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux jeunes adultes, implantation d'un microbiote (taille des animaux et atteintes de la maturité sexuelle) Animaux juvéniles, pour l'implantation d'un système immunitaire humain (tel que décrit dans la littérature) Animaux adultes, pour l'implantation des cellules tumorales (dès lors que le système immunitaire humain sera implanté / implantation entre 6 à 14 semaines)
Les cellules ganglionnaires intrinsèquement photosensibles de la rétine (ipRGCs) et l’agressivité : effet direct de la lumière bleue ?
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 22
Autres rongeurs : 65
843 rongeurs, souris, rats et rats africains, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Ils subissent des tests d'agressivité où les affrontements provoquent morsures et griffures, des injections dans l'œil sous anesthésie, une chirurgie du crâne et des injections quotidiennes pendant trois semaines, pour tester un effet direct de la lumière bleue sur le comportement agressif. Le porteur indique que la lumière peut modifier l'anxiété et l'agressivité et que les injections répétées causent inflammation, douleur et perte de poids, les animaux étant tués pour prélever le cerveau. Il présente le rat africain comme un modèle diurne "plus représentatif de l'humain" et justifie l'usage d'animaux par l'absence de logiciel reproduisant fidèlement le cerveau.
Objectifs
La lumière influence en profondeur la physiologie et les comportements des organismes vivants. Chez les mammifères, en plus de permettre la vision, la lumière influence de nombreuses fonctions biologiques via des cellules spécifiques sensibles à la lumière, localisées dans la rétine et activées par la lumière bleue: il s’agit des cellules mélanopsinergiques. Les cellules mélanopsinergiques projettent dans différentes régions du cerveau et permettent la régulation par la lumière de la physiologie et du comportement selon 2 mécanismes principaux : 1, la synchronisation de l’ensemble des fonctions biologiques avec le cycle jour/nuit, un effet qui implique l’horloge biologique centrale . 2, des effets directs sur de nombreux comportements via la projection des cellules mélanopsinergiques vers d’autres parties du cerveau. La société moderne vit sous une illumination quasi-permanente, en particulier à la lumière bleue (LED, smartphones, écrans d’ordinateurs). Il est connu que l’exposition excessive à ces lumières enrichies en bleu, en particulier en fin de période d’activité (soirée), peut provoquer des troubles des rythmes biologiques du sommeil, et divers effets comportementaux associés, notamment une augmentation de l’agressivité. Dans ce projet nous posons la question suivante : est-ce que la lumière bleue peut exercer un effet direct sur le comportement agressif, indépendamment d’une altération des rythmes biologiques? En effet, les projections des cellules mélanopsinergiques atteignent notamment les structures du cerveau impliquées dans le contrôle de l’agressivité. Les objectifs du projet sont 1) de caractériser les effets de la lumière bleue sur le comportement agressif chez des modèles animaux 2) identifier les populations cellulaires du cerveau impliquées dans cet effet de la lumière bleue et 3) comprendre le rôle de structures spécifiques contrôlant l’agressivité dans ces effets sur le comportement agressif. Afin d’exclure un effet mettant en jeu l’horloge biologique centrale, l’exposition à la lumière bleue aura lieu spécifiquement à des créneaux de jour, auxquels elle ne peut pas entrainer de décalage de cette horloge.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de générer de nouvelles connaissances sur les effets de la lumière bleue sur le comportement agressif. Ces connaissances pourraient permettre d’élaborer de nouvelles stratégies vis-à-vis de l’éclairage/exposition à la lumière (intensité et spectre) dans les animaleries, afin de susciter au minimum les comportements agressifs. Les résultats obtenus seront aussi informatifs quant aux potentielles nuisances (facilitation d’un comportement agressif) induites par l’éclairage à dominante bleue chez l’humain. Ceci pourrait permettre de définir de nouvelles normes d’exposition lumineuse (environnements collectifs, agressivité pathologique) afin de diminuer l’expression des comportements hostiles. Enfin, en plus de renforcer les connaissances actuelles sur le comportement agressif de la souris, ce projet permettra aussi d’obtenir des informations sur le comportement d‘un modèle peu connu à ce jour le rat africain. Ce dernier pourrait donc représenter un modèle d’agressivité ainsi qu’un modèle des effets de la lumière bleue sur la physiologie et le comportement, plus représentatif de l’humain que le modèle de souris.
Procédures
Un groupe d’animaux est soumis à un examen de l’œil d’une durée de 20 minutes. Un mois plus tard il sera soumis à trois tests comportementaux d’une durée de 1 à 5 minutes. Les animaux seront ensuite soumis à un nouvel examen de l’œil. Deux semaines plus tard ils recevront une injection dans l’abdomen d’une molécule qui empêche les effets de la lumière bleue sur l’organisme (durée injection 30 secondes). Ensuite ils seront soumis à un test comportemental d’une durée comprise entre 1 et 5 minutes. Un groupe d’animaux recevra une injection dans l’œil sous anesthésie locale et générale. Un autre groupe subit une chirurgie du crâne d’environ 45 minutes. Après 2 semaines de repos les animaux reçoivent une injection journalière dans l’abdomen pendant 3 semaines. A l’issue ils seront soumis à un test comportemental d’une durée de 1 à 5 minutes. Avenant: Les tests comportementaux seront répétés 3 fois maximum avec un intervalle de 10 jours entre les tests afin de laisser l’animal se reposer. Avenant : les animaux de la lignée Maoa KO subissent un prélevement de la queue environ 6 jours après la naissance entrainant une douleur légère et temporaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances suivantes sont attendues : 1) l’impact de la lumière bleue peut changer le niveau d’anxiété et d’agressivité des animaux ce qui est l’objet de la question posée. 2) les tests comportementaux peuvent induire un stress ainsi que des blessures liées aux affrontements lors d’un des tests (plaies dues aux morsures et griffures). 3) les animaux sont soumis à différentes injections causant des désagréments communs (inflammation, douleurs, stress, risque infectieux, anxiété, perte de poids) ou spécifiques.
Devenir
Les animaux sont mis à mort afin de récupérer leurs cerveaux qui serviront pour analyse.
Remplacement
La première partie de projet consiste à obtenir des informations sur le comportement des animaux en réponse à une lumière bleue. Il n’existe pas de moyens de s’affranchir de l’utilisation d’animaux pour obtenir une réponse comportementale. Les deuxièmes et troisièmes parties consistent à obtenir des informations sur la chimie et le fonctionnement du cerveau animal. Or à l’heure actuelle aucun moyen alternatif (ex : logiciels informatiques) ne permet de représenter assez fidèlement le cerveau animal pour obtenir de telles informations.
Réduction
Une approche statistique a été utilisée pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats fiables et robustes. Ce nombre est également appuyé par des études précédentes.
Raffinement
Les animaux ont à leur disposition du matériel pour pouvoir nidifier et ronger. Un tunnel en plexiglas est également ajouté à la cage. L’hébergement des animaux est optimisé afin de diminuer les affrontements au sein d’une cage. Les animaux isolés physiquement peuvent néanmoins se voir, s’entendre et se sentir. Avant chaque procédure les animaux participent à un entrainement afin de les habituer au contact avec l’humain et à la procédure. Toute procédure invasive potentiellement douloureuse est réalisée sous traitement antidouleur. L’'état général de l'animal ainsi que celui de chaque œil seront vérifiés quotidiennement et la souffrance éventuelle entrainée par les procédures est évaluée grâce au comportement et à l’aspect physique des animaux. En cas de souffrance, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et un traitement requis mis en place. Des points limites onté été établis permettant l'arrêt des procédures et ainsi réduire la souffra,ce animal. Une étude préliminaire est mise en place afin d’optimiser les données obtenues tout en minimisant l’impact sur les animaux.
Choix des espèces
Afin d’observer des réponses comportementales et des effets de la lumière sur l’œil et le cerveau il est indispensable d’utiliser des animaux. La connaissance approfondie de la génétique de la souris permet l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Cela donne accès à des outils indispensables pour l’étude des fonctions des structures du cerveau impliquées dans le comportement agressif. Le rat africain est un modèle animal diurne correspondant au mode d’activité de l’humain. Il possède également une rétine dont la composition est proche de la rétine humaine. Des informations comportementales complémentaires pertinentes pour l’humain seront alors collectées. L’agressivité des rongeurs semble décliner avec l’âge a l’instar des capacités motrices. Pour ces raisons nous avons choisi de jeunes adultes (2-4 mois). Cela permet d’utiliser des individus avec un comportement agressif encore développé. Nous utilisons également une tranche d’âge resserrée afin de s’affranchir des trop fortes variations d’agressivité liées l’âge.
Suivi du lignage des cellules souches et tumorales dans la glande mammaire in vivo en temps réel
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent des tumeurs mammaires apparaissant dès cinq semaines, reçoivent une injection de tamoxifène puis une fenêtre d'imagerie posée par chirurgie sous la peau, avant des séances d'imagerie sous anesthésie pouvant durer huit à dix heures. Le porteur indique une douleur et une perte de poids possibles après la chirurgie et prévoit d'utiliser les souris avant que les tumeurs n'atteignent les points limites. Il affirme avoir développé des organoïdes in vitro mais conclut qu'aucun modèle ne reproduit l'hétérogénéité tumorale et que la souris reste "essentielle" pour tracer les cellules dans la tumeur.
Objectifs
Le cancer est une maladie progressive et son évolution est associée à l'acquisition graduelle de nouvelles propriétés par les cellules. Il en résulte une grande hétérogénéité, dont la complexité est amplifiée par les interactions entre les cellules cancéreuses et leur environnement. Malgré les récents progrès, l'identité et le comportement des cellules tumorales au cours de la progression des cancers restent mal compris. Certains cancers émergent de cellules différenciées, d’autres à partir de cellules souches. Les cellules différenciées assurent la fonction d’un organe alors que les cellules souches sont requises pour la régénération tissulaire. Nous proposons un projet original qui devrait permettre de démêler l'hétérogénéité des tumeurs et découvrir quelles cellules sont à l'origine du cancer du sein. Notre objectif principal est d’étudier les relations hiérarchiques entre les différentes cellules à l’origine des tumeurs du sein et les mécanismes contrôlant leur plasticité, qui, une fois dérégulés, sont responsables de la formation du cancer. A ce jour, la plupart des études des cellules souches adultes sont basées sur des expériences sur des échantillons fixés, ce qui empêche de détecter des changements dans la localisation et la dynamique des cellules et de suivre le destin de ces cellules au cours du temps. Afin d’étudier les cellules souches ainsi que les premières cellules tumorales au cours du temps, nous caractériserons le comportement dynamique des cellules souches par imagerie en temps réel in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet va nous permettre d’étudier in vivo la dynamique des cellules et la compétition entre les différents clones au cours des premières étapes du développement tumoral. Tout d’abord, nous étudierons la prolifération et la migration des cellules qui changent leur destinée après l’activation d’un oncogène. Dans un second temps, nous étudierons la compétition entre différentes cellules au début du développement tumoral. Ce projet apportera des connaissances fondamentales concernant les premières étapes du développement tumoral et révèlera quelles mutations rendent les cellules plus compétitives et performantes au sein de la tumeur. . Ce projet nous permettra de visualiser les comportements dynamiques des différentes cellules tumorales et de leur progéniture clonale que nous suivons par traçage de lignage pendant le développement tumoral. Ceci sera couplé à d’autres analyses nous permettant d’identifier les cellules qui prennent part au développement de tumeurs mammaires. Ces résultats pourront à terme permettre d’identifier les cellules à l’origine des tumeurs dans des tumeurs humaines.
Procédures
Afin d’induire l’activation de l’enzyme permettant la visualisation par fluorescence des cellules d’intérêt dans nos modèles, une injection unique de tamoxifène non toxique par voie intra-péritonéale sera réalisée sur tous les animaux (durée du geste inferieur à 10 sec). Pour pouvoir suivre le devenir des cellules tumorales par imagerie, une petite incision sera réalisée au niveau de la peau des animaux anesthésiés pour y glisser une fenêtre d’imagerie (durée de la chirurgie 40 min). L’ensemble des animaux sera anesthésié minium 24h après la chirurgie pour être imagés. Pour une partie des animaux, une session unique d’imagerie sera faite, qui durera entre 8 et 10h et les animaux seront mis à mort à la fin de la session d’imagerie. L’autre partie des animaux aura plusieurs séances courtes d’imagerie (durée de l’anesthésie max 2h). Les séances d’imagerie seront réalisées à raison de 1 à 2 séances par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés développent à l’âge de 5 semaines des tumeurs palpables qui deviennent invasives à l'âge de 13 semaines et peuvent éventuellement former des métastases pulmonaires à l'âge de 16 semaines environ. Les animaux seront utilisés de 5 semaines à 10 semaines maximum évitant le développement de tumeurs atteignant les points limites. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gène de courte durée). À la suite de la chirurgie, des douleurs post-opératoires et une perte de poids peuvent apparaitre dans la semaine qui suivant la chirurgie. Pour éviter les infections, une antibioprophylaxie sera mise en place. L’imagerie en elle-même est indolore mais nécessite une anesthésie générale pour permettre la contention de l’animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Au fil des ans, notre équipe a déployé beaucoup d'efforts pour développer des modèles 3D in vitro, comme les organoïdes, qui soient physiologiquement pertinents pour analyser le comportement dynamique des cellules souches au cours du développement et de l'homéostasie tissulaire. Cependant, les cellules mammaires modifient leur comportement lorsqu’elles sont cultivées in vitro sous forme d'organoïdes et détachées de leur niche tissulaire physiologique, ce qui nous empêche d'utiliser cette technique pour toutes les questions concernant le potentiel de différenciation des cellules souches mammaires. De plus, les animaux seront essentiels pour tracer les cellules souches cancéreuses au sein de la tumeur, étant donné qu’il n’existe actuellement aucun modèle in vitro qui puisse récapituler l’hétérogénéité cellulaire tumorale.
Réduction
Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience sera réduit au minimum possible pour maintenir une signification statistique. Pour réduire au minimum le nombre d’animaux et exploiter au mieux les prélèvements, plusieurs types d'informations seront obtenues à partir du même animal. De plus, lorsque c’est possible, différents tissus seront prélevés sur le même animal. Des schémas de reproduction des souris transgéniques sont réalisés afin d’obtenir efficacement les cohortes de souris appropriées. L’imagerie intravitale permet le suivi longitudinal d’un même animal évitant ainsi de mettre à mort un lot d’animaux à chaque point d’analyse souhaité.
Raffinement
Les animaux sont manipulés le moins possible. Il est important de noter que les points limites sont soigneusement définis avec une surveillance attentive des signes cliniques. Des fiches d'évaluation clinique sont mises en place pour des projets spécifiques. Les souris seront surveillées soigneusement pour détecter tout signe de détérioration des conditions cliniques. Un examen complet, au moins hebdomadaire (fréquence adaptée à l’évolution), des souris développant des tumeurs permettra de détecter des signes précoces de détresse et de maladie (voir grille de score). La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et effectuée par une personne formée en chirurgie dans des conditions d’asepsie optimisées qui limiteront les nécroses tissulaires, les inflammations et les infections. L’animal sera opéré dans une pièce dédiée, calme, bien éclairée, avec peu de passage. Un cocktail analgésique et antibiotique sera injecté en pre-opératoire et post-opératoire.
Choix des espèces
L'organisation générale, le développement et le fonctionnement de la glande mammaire sont très similaires chez la souris et chez l’Homme. Le modèle souris est donc très utilisé dans la communauté scientifique afin d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement normal du tissu ainsi que de la tumorigenèse. De plus, la souris est un mammifère, donc le modèle animal de laboratoire le plus adapté permettant l’analyse de la glande mammaire et des tumeurs mammaires. Le suivi des lignages des cellules marquées pendant le développement des tissus sera réalisé pendant la puberté et chez l’adulte. Pour l’analyse des tumeurs mammaires, les souris utilisées auront entre 5 et 10 semaines (âge compatible avec le développement spontané des tumeurs mammaires dans notre modèle).
Régulation de l’homéostasie intestinale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
117 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées et, pour une partie, une fenêtre d'observation implantée dans l'abdomen suivie de séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie. Le porteur indique que la pose de la fenêtre et la perte de perméabilité intestinale peuvent provoquer douleur, perte de poids, diarrhée et déshydratation, toutes les souris étant tuées pour analyses. Il présente les retombées, sur le syndrome du côlon irritable ou la maladie cœliaque, comme des applications potentielles à long terme d'une recherche avant tout fondamentale.
Objectifs
L’intestin joue un rôle essentiel dans l’absorption des nutriments qui proviennent de notre alimentation. Aussi, du fait de son contact direct avec l’environnement, il est susceptible d’être soumis à des attaques bactériennes et biochimiques qui peuvent compromettre l’étanchéité de la barrière intestinale. Cette barrière est formée par une unique couche de cellules, cellules épithéliales, qui tapissent l’intestin. Pour maintenir l'intégrité du tissu, l'ensemble de l'épithélium est remplacé en 3 à 5 jours (chez la souris). Ce renouvellement est permis par la division des cellules souches qui se trouvent dans des invaginations du tissus appelées cryptes. À la sortie des cryptes, les cellules se différencient en cellules épithéliales (sécrétoires, absorbantes, et entéroendocrines). L’intestin est un bon modèle d’étude de la migration cellulaire car les cellules différenciées vont ensuite migrer pour enfin être éliminées dans la lumière intestinale. L’objectif général est de comprendre les processus physiologiques au niveau du tractus gastro-intestinal.
Bénéfices attendus
Nous pensons identifier un nouveau mode de régulation du colon. Nous prévoyons aussi que notre projet contribue à expliquer comment la barrière intestinale est maintenue intacte. En général, notre étude sera bénéfique pour la communauté scientifique intéressée par l’intestin. Les avantages à long terme seront de mieux comprendre comment l’intégrité de la barrière intestinale est maintenue, avec des potentielles applications pour des pathologies comme le syndrome du côlon irritable ou la maladie cœliaque.
Procédures
Une premier lot d’animaux recevra une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Alternativement, de 2 h jusqu’à 72 h avant la mise à mort, les souris recevront une unique injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen (durée du geste inférieure à 10 sec) Dans un second lot, les souris recevront une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec) et seront mises à mort après un jour de repos. Enfin un dernier lot d’animaux recevra une injection d’un produit non douloureux dans l’abdomen à raison d’une fois par jour pendant 1 à 5 jours (durée du geste inférieure à 10 sec). Nous implanterons ensuite une fenêtre abdominale sur les souris anesthésiée (durée du geste 20 minutes) pour réaliser des sessions d’imagerie sur souris anesthésiées (durée d’imagerie 120 minutes par jour, pendant 2-3 jours).
Impact sur les animaux
Suites aux interventions subies par les animaux, des conséquences directes et courtes sont à prévoir : - Douleur liée à l’injection intrapéritonéale - Stress lié à la contention pour l’injection intrapéritonéale Suites aux interventions subies par les animaux, des conséquences indirectes et longues (i.e. jusqu’à la mise à mort sont à prévoir : - Douleur, perte de poids, inflammation à la suite de la pose d’une fenêtre d’observation - Douleur, perte de poids, diarrhée, déshydratation et/ou constipation liées à la perte de perméabilité de l’intestin
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
L'intestin est un organe complexe qui implique de nombreux composants : bactéries, circulations sanguine et lymphatique, neurones, muscles, système immunitaire etc. Les objectifs de ce projet étant d'identifier le mode de fonctionnement du tissu ainsi que le maintien de son intégrité. La réduction à un système in vitro pourrait nous affranchir de découvertes pertinentes qui seraient liées à la complexité des interactions présentes dans l’intestin. Par exemple, comme la perturbation de l’étanchéité intestinale peut avoir des conséquences sur le système immunitaire, notre projet est étudiable seulement grâce à des études in vivo, impossible à remplacer par des approches in vitro. Cependant, certains aspects liés à l’intégrité de la barrière intestinale pourraient être explorés in vitro. À cette fin, nous générerons des organoïdes qui permettront de réduire le nombre de souris utilisées . De plus, nous utiliserons des méthodes substitutives partielles comme des explants de tissu observés ex vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables, soit entre 3 et 5 souris par expérience . Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts. Pour réduire la variabilité de l'échantillon, nous utiliserons autant que possible des compagnons de portée. Des expériences pilotes seront réalisées afin d’optimiser le niveau de perte d’adhésion entre les cellules épithéliales et la membrane basale. Ces expériences utiliseront des animaux des deux sexes et les tissus extraits seront utilisés à la fois pour l'histologie et l'extraction de protéines afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les croisements de souris seront optimisés pour produire tous les génotypes. Nous produirons un stock d'organoïdes à partir des mêmes souris pour les études in vitro de fonctionnalisation. Ces organoïdes peuvent être étendus, presque indéfiniment, afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires au projet et ainsi optimiser le nombre d’animaux. La prolifération et la migration des cellules seront étudiées dans la même souris. Ces souris seront également utilisées pour l'histologie et l'immunofluorescence. Cela permettra de réduire le nombre de souris nécessaires pour ces procédures. Notre analyse post-mortem sera faite à l’aveugle, ce qui assure l’impartialité des résultats obtenus.
Raffinement
- Pour les injections d’un produit non douloureux dans l’abdomen, une surveillance sera mise en place tous les jours jusqu’à la récupération post-mortem des tissus. Durant cette période, la mise au point de points limites permettra la détection de signes précoces de détresse ou de mal être avant que cela n’impacte les souris ou le projet. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront mis à mort - Pour la chirurgie, une gestion de l’analgésie-anesthésie est mise en place : les souris recevront des analgésiques en préopératoire ainsi que des anti-inflammatoires après la chirurgie. Nous utiliserons une anesthésie générale gazeuse. Durant le temps de la procédure nécessitant une anesthésie, un gel lacrymal empêchera le dessèchement oculaire et l’animal sera maintenu sur un coussin chauffant ou une chambre chauffante de manière à maintenir la température corporelle dans les constantes normales. L’animal est ensuite transféré dans une cage isolée (afin d’éviter toute lésion par une autre souris) et placée sur un tapis chauffant jusqu’à son réveil. De l’anti-inflammatoire sera ajouté à l’eau de boisson. Les animaux seront surveillés de près et mis à mort dès l’atteinte d’un point limite tel que décrit dans la grille de score.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. De plus, les bases de données d'expression de la souris, les lignées de souris et les protocoles déjà établis permettraient d'étendre facilement ce projet à l'avenir en utilisant des modèles déjà existants, ou de comparer les résultats du projet à différents ensembles de données provenant d'autres projets. Par ailleurs, la souris est très proche de l'Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c'est donc un excellent modèle d'étude de perméabilité intestinale ainsi que migration cellulaire, la structure de l’intestin étant similaire à celle de l’Homme. Des animaux adultes seront utilisés car nous somme intéressé par la migration cellulaire et les jonctions inter-cellulaires dans des processus physiologiques, lorsque le développement de l’animal est terminé.
Etude de la toxicité et de la génotoxicité de gaz à utilisation industrielle chez la souris après une exposition unique.
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de modéré à sévère. Elles sont enfermées quatre heures dans un réacteur, privées d'eau et de nourriture, et exposées à des gaz industriels jusqu'à des concentrations où la moitié des souris meurent, pour déterminer la concentration létale 50. Le porteur indique que l'exposition peut provoquer perte de poids, détresse respiratoire, tremblements, convulsions ou paralysie, les survivantes étant tuées 48 heures ou 14 jours après pour prélever poumons et moelle osseuse. Il justifie l'essai par la protection de l'environnement et des personnes exposées accidentellement à ces gaz destinés à remplacer le SF6.
Objectifs
Les gaz fluorés sont largement utilisés comme réfrigérants dans les équipements électriques de moyenne et haute tension ; et en particulier le gaz SF6 (hexafluorure de soufre). La réglementation liée à ces gaz tend à évoluer afin de les interdire de façon définitive car ce sont de puissants gaz à effet de serre et donc particulièrement nocifs pour l’environnement. Ce projet a pour objectif d’étudier la toxicité éventuelle de gaz susceptibles de remplacer le SF6 afin de protéger les personnes susceptibles d’y être exposées accidentellement. Pour ce faire, la toxicité aiguë et la génotoxicité de gaz seront évaluées chez la souris. Premièrement, nous évaluerons la toxicité aiguë de gaz après une inhalation unique chez la souris afin de déterminer la concentration létale 50 (CL50) qui correspond à la concentration à laquelle 50% des animaux décèdent suite à l’expérience. Ce paramètre permet de comparer les gaz entre eux quant à leur potentiel toxique. Pour cela, des souris seront exposées à 6 concentrations maximum du gaz à tester. Ensuite, nous évaluerons la génotoxicité de ces gaz afin de déterminer leur capacité à induire un dysfonctionnement ou une altération du génome en endommageant l’ADN. Pour cela, des souris seront exposées à 3 concentrations du gaz à tester (DMT, DMT/2 et DMT/4). La DMT correspond à la dose maximale tolérée, c’est-à-dire la dose la plus élevée qui sera tolérée sans faire apparaitre de signe clinique de toxicité important. Les animaux seront euthanasiés 48 heures après l’exposition et la moelle osseuse sera analysée pour évaluer l’impact du gaz sur le génome.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’étudier la toxicité éventuelle de gaz susceptibles d’être utilisés dans des équipements électriques à moyenne et haute tension afin de remplacer le SF6. En effet, le SF6 est un gaz à effet de serre important et d’ici quelques années son usage sera interdit en raison de son impact négatif sur l’environnement. Le premier bénéfice attendu est la protection de l’environnement. La toxicité des gaz susceptibles de remplacer le SF6 doit être testée chez l’animal afin de protéger les personnes susceptibles d’y être exposées accidentellement. Le second bénéfice attendu est la protection de la santé humaine.
Procédures
Lors des 2 procédures, les animaux sont exposés pendant 4h au gaz. Par la suite les animaux sont quotidiennement observés jusqu'à leur euthanasie 14 jours après l'exposition ou 48 heures après l'exposition. Pendant cette période, auncun prélèvement et aucune procédure n'est réalisée.
Impact sur les animaux
Les animaux étant enfermés durant 4 heures dans le réacteur permettant leur exposition au gaz, ils subissent un stress important. De plus, durant ces 4 heures, ils sont privés d’eau et de nourriture. Cette exposition peut provoquer une perte de poids significative dans les jours suivants. Les souris peuvent avoir une apparence générale modifiée (dos vouté, piloérection, irritation cutanée, irritation oculaire, irritation des muqueuses cutanées et respiratoires, comportement hypertonique ou hypotonique, vocalises anormales). Le système respiratoire peut également être atteint (hypo/hyper ventilation, râles, dyspnée). L’exposition au gaz peut aussi avoir un impact sur le système nerveux central (tremblements, inclinaison de la tête, convulsions, paralysie).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Un examen macroscopique des organes est réalisé et un prélèvement des poumons ou des 2 fémurs (pour prélèvement de moelle osseuse) sont effectués.
Remplacement
Nous évaluons la toxicité de gaz chez la souris après une exposition par voie inhalée. En effet, ces gaz utilisés dans les transformateurs électriques sont susceptibles d’être toxiques chez l’Homme lorsqu’ils sont inhalés de façon chronique ou accidentelle. Ainsi, il est important d’évaluer la toxicité chez la souris en testant la même voie d’exposition et ses répercutions au niveau des organes notamment au niveau pulmonaire. Aucune méthode alternative ne le permet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de toxicité aigüe, des analyses approfondies de la composition chimique d’un nouveau gaz à tester sont réalisées et sont comparées à celles de gaz d’ores et déjà testés lors d’études antérieures. Les données obtenues nous permettent de mieux cibler et diminuer le nombre de concentrations à tester (et ainsi de réduire le nombre de souris). Par exemple, pour un gaz, tester la toxicité de 5 niveaux de concentrations au lieu de 6 permet de réduire de 10 animaux. Pour l’étude de la génotoxicité, 5 souris mâles et 5 souris femelles sont nécessaires par niveau de concentration. Afin d’avoir une relation dose/réponse, 3 concentrations sont testées (dose maximale tolérée (DMT), DMT/2 et DMT/4). Les concentrations sont choisies en fonction des résultats des études de toxicité aiguë. Afin de réduire de moitié le nombre de souris, si l’évaluation de la toxicité aiguë ne montre pas de différence entre les mâles et les femelles, alors l’étude de génotoxicité sera réalisée seulement chez les souris mâles.
Raffinement
Tout d’abord, les animaux ne sont pas manipulés pendant au minimum 5 jours après réception pour ne pas les stresser et leur laisser le temps de s’habituer à leur nouvel environnement. Tout au long des expériences, les animaux sont hébergés par groupe pour favoriser la socialisation avec leur congénère. Les cages contiennent de l’enrichissement (igloos, tunnels, bois à ronger) afin de réduire le stress et pour favoriser le comportement d’espèce. Suite à l’exposition au gaz, les animaux sont surveillés quotidiennement avec attention : le poids est évalué tous les jours et un examen clinique est effectué au minimum une fois par jour pour permettre de détecter tout signe de douleur ou de souffrance. En fonction de l’état des animaux, une évaluation des points limites spécifiques à cette étude est réalisée. De plus, si un animal souffre et a du mal à s’alimenter ou à boire, de la nourriture gélifiée est disposée dans la cage. Dans le cas où un animal présente des signes de détresse, plusieurs visites sont effectuées dans la journée pour le surveiller.
Choix des espèces
Lors d'études de la toxicité aiguë par inhalation et de la génotoxicité, la réglementation oriente vers l'utilisation de jeunes rongeurs en bonne santé, c'est pourquoi notre choix se porte sur l'utilisation de souris jeunes adultes ayant un âge compris entre 8 et 12 semaines.
Etude des altérations de la signalisation calcique mitochondriale au cours de la progression de l’insuffisance cardiaque à fraction d‘éjection préservée
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Nourries d'un régime riche en gras et en sucre, complété pour certaines d'un traitement qui provoque une hypertension, des souris prennent rapidement du poids et développent un cœur plus gros qui se remplit mal. Au total, 162 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec jeûnes de six heures, prises de sang à la queue, test d'endurance sur tapis de course et, sous anesthésie, mesure de la pression dans le cœur par une sonde juste avant la mise à mort. Le porteur écrit vouloir "supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements", et indique que ces mêmes injections et prises de sang "peuvent entrainer un stress et une douleur". Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes.
Objectifs
Le diabète est en pleine expansion dans notre société. Or le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans cette dysfonction représente un challenge important pour les chercheurs et les cliniciens afin d’améliorer la qualité de vie des patients. La mitochondrie, source d’énergie au sein de la cellule cardiaque, a été montrée comme altérée dans cette maladie, notamment au niveau de la communication du signal calcium. Une structure appelée uniport est en charge de l’entrée du calcium dans la mitochondrie. L’uniport est un complexe composé de différents constituants protéiques. Une modification de la composition de l’uniport altère sa fonction, pour laisser entrer plus ou moins de calcium dans la mitochondrie. L’objectif de cette étude est de déterminer quelles sont les altérations de la composition et des interactions des différents constituants de l’uniport, son impact sur sa fonction et d’identifier des déterminants moléculaires pouvant l’expliquer (changement de composition lipidique…) au cours de l’évolution de la pathologie de cardiomyopathie diabétique. Ces informations permettront de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de préciser les modifications de la structure dans la mitochondrie en charge de la communication du signal calcium au cours de la progression de la maladie au niveau cardiaque, mais aussi dans les autres organes, afin d’envisager à terme le développement de nouvelles molécules plus spécifiques et avec une meilleure efficacité pour un plus grand nombre de patients insuffisants cardiaques.
Procédures
Le protocole dure au total 16 semaines. Les souris seront mises sous régime standard, sous régime enrichie en lipides et en sucrose (développement d’un stade précoce de la dysfonction contractile) ou sous régime enrichie en lipides et en sucrose complémenté par un traitement hypertenseur (développement d’un stade avancé de la dysfonction contractile). Le développement du diabète chez les souris sera mesuré par un test à 10 semaines. Pour cela, les souris seront mises à jeun pendant 6 heures, puis une injection de glucose ou d'insuline, selon le test, sera réalisée et la glycémie sera mesurée toutes les 15 minutes pendant 1 heure par prélèvement d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue (durée prise de sang : quelques secondes). Un test d’endurance sera également effectué à 15 semaines sur tapis de course (durée du test : 2 min d’habituation sur 3 jours consécutifs et 20 min maximum de mesure le jour du test). Une échographie sera effectuée à 12 et 14 semaines sous anesthésie légère (durée examen :
Impact sur les animaux
Nous nous attendons durant ce régime riche en sucre et en gras à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un dysfonctionnement cardiaque caractérisé par un cœur plus gros et un remplissage du cœur par le sang diminué, raison de l’étude. Toutefois, l’obésité et la dysfonction cardiaque/métabolique n’entrainent pas de surmortalité et n’empêchent pas la prise alimentaire et hydrique. L’ajout d’un traitement hypertenseur entraine une hypertension modérée qui aggrave la dysfonction cardiaque, sans entrainer de surmortalité, ni de dysfonctionnement alimentaire ou métabolique supplémentaire. Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) réalisés sous anesthésie générale. Le test sur tapis pourra entrainer un léger essoufflement. Lors des tests métaboliques, les injections et prises de sang peuvent entrainer un stress et une douleur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire et cellulaire) des différents organes.
Remplacement
Le recours à l’animal vivant est nécessaire pour cette étude car pour obtenir un modèle de cardiomyopathie diabétique impliquant un mauvais fonctionnement contractile du cœur suite à un dérèglement d’origine métabolique et multi-organe, un régime riche en gras et en sucre doit être mis en place sur plusieurs mois et l’analyse du diabète et de la fonction cardiaque doit être réalisée sur un animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables, soit au maximum 162 animaux sur 3 ans. Par ailleurs, les prélèvements des autres organes en parallèle du cœur ont été mutualisés sur chaque procédure afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis. Les souris sont soumises à une période d’habituation sur le tapis de course et une stimulation par la voix et à l’aide d’un pinceau a été mise en place en remplacement des stimulations par flux d’air. La mise à jeun courte de 6h avant les tests métaboliques ou 4h avant le sacrifice est réalisée au matin, ce qui correspond au début de période diurne pour les animaux (c’est à dire à leur période de plus faible activité et en situation post-prandiale). Pour la stabulation, les animaux sont placés à maximum 5 souris par cage et en respectant les groupes sociaux, dans un environnement enrichi (boules de coton, dôme) avec un change réalisé toutes les deux semaines quel que soit la diète utilisée.
Choix des espèces
La physiologie de la souris étant « proche » de celle de l’Homme, pour la problématique étudiée ici, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Les animaux auront 5-7 semaines lors de la mise en place du régime alimentaire pour 6 mois, menant à un âge de 21-23 semaines à l'issue de la procédure. La mise en place du régime dès cet âge permet le développement d’une cardiopathie diabétique.
Traitement de l’information nociceptive chez l’animal naïf et parkinsonien
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance du sans réveil au sévère. Elles subissent une biopsie de la queue, une chirurgie crânienne pouvant aller jusqu'à deux heures et des stimulations douloureuses répétées trois fois par semaine pendant un mois, avec des lésions reproduisant la maladie de Parkinson entraînant perte de poids et déficits moteurs. Le porteur précise que les altérations de la sensibilité à la douleur ne peuvent être soulagées car elles sont l'objet même de l'étude, dont le but reste fondamental, la compréhension d'une région cérébrale. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit les réseaux cérébraux en jeu, l'animal vigile étant présenté comme "indispensable".
Objectifs
Le traitement des informations douloureuses est un des éléments essentiels à notre survie. Il apporte en effet un signal d’alarme pour limiter les dommages que pourraient potentiellement subir l’organisme. Ces réponses impliquent des réflexes rapides, des mécanismes attentionnels et l’intégration plus complexe des informations liées aux stimulus douloureux et au contexte. La douleur peut également être considérée comme pathologique et/ou être associée à une pathologie. C’est notamment le cas dans la maladie de Parkinson, dans laquelle de nombreux malades rapportent des douleurs spontanées, mais également des réponses exacerbées à des stimulus douloureux (hyperalgésie) et des douleurs en réponse à des stimulations normalement non douloureuses (allodynie). L’objectif de ce projet est double. Il s’agit : 1 / d’évaluer l’implication d’une région cérébrale dans l’intégration des informations liées à une douleur aigue. 2/ d’évaluer les altérations de cette intégration dans le contexte des symptômes douloureux liés à la maladie de parkinson.
Bénéfices attendus
L'objectif premier de cette étude est fondamental et concerne une meilleure compréhension fonctionnelle d’une région cérébrale encore peu connue. Mais les données obtenues amèneront aussi des informations sur des différences ou non de réponse selon le sexe et selon l’état pathologique, ici pour mieux comprendre les bases de la douleur présente dans la maladie de Parkinson. Cette information constitue un point de départ pour ultérieurement évaluer cette région cérébrale comme cible anatomique thérapeutique potentielle dans le cadre de la symptomatologie de la maladie de Parkinson.
Procédures
Les animaux subiront une biopsie de queue autour de 6 jours post natal pour réaliser leur génotypage. Les animaux subiront une chirurgie de maximum 2h, et des tests comportementaux d’identification du seuil de sensibilité douloureuse et d’enregistrement de l’activité neuronale seront effectuées 3 fois par semaine, sur une période d’un mois et d’une durée moyenne allant de 10 minutes à 1h en durée selon les tests.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue nécessaire aux génotypage des animaux (autour de 6 jours post natal) induit une douleur légère de courte durée. La chirurgie peut entraîner une douleur postopératoire et une inflammation locale transitoire autour du dispositif des canules (peau du crâne). Les stimulations nociceptives entraînent potentiellement une douleur aiguë ponctuelle, objet de l’étude. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle reproduisant la complexité des réseaux de structures cérébrales mis en jeu dans cette étude. Ainsi, les réponses cérébrales et comportementales à des stimulations douloureuses nécessitent l’animal entier, vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire le nombre d’animaux, mais en obtenant le maximum d’information scientifique par test. Les effectifs maximum nécessaires pour conclure ont été calculés statistiquement, mais des analyses intermédiaires des résultats en cours d’expériences permettront de potentiellement réduire ce nombre.
Raffinement
Les animaux seront suivis afin de déceler tout signe de mal-être (perte de poids, blessure ou plaie ouverte, dégradation de l'état du pelage, dos arqué…). Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées. Après la chirurgie, des grilles d’évaluation seront utilisées pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargé du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichis (bâton et fissure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nid)
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler spécifiquement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que l’étude des comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés
Détermination de l’effet anti-cancer de molécules dans des modèles in vivo de cancer chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
7 230 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, plus de la moitié en sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par injection ou chirurgie, puis des traitements et un suivi par imagerie, développant tumeurs, métastases ou ascites pouvant affecter leur survie. Le porteur teste l'effet anticancéreux de molécules nouvelles ou repositionnées dans le développement préclinique de médicaments, présenté comme "indispensable" avant tout essai chez l'humain. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit un organisme entier permettant le développement de cancers et de métastases.
Objectifs
Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement préclinique fait en particulier appel à l’expérimentation animale, qui est une étape indispensable à la connaissance d’un futur médicament avant de l’administrer à l’homme. Au cours du développement préclinique, un grand nombre d’études sont effectuées afin de qualifier le candidat médicament sur le plan de la pharmacocinétique, de la toxicologie ou encore de l’efficacité. Ces études sont constitutives d’une partie du dossier de demande d’autorisation de mise sur le marché (AMM) du futur médicament et sont donc indispensables. Le cancer affecte des millions de personnes chaque année. Cette pathologie a donc des impacts sociaux et économiques majeurs sur les patients et le système de santé. Les thérapies actuellement disponibles pour traiter le cancer ont une efficacité limitée pour certaines indications comme par exemple le cancer du pancréas et les effets secondaires des traitements limitent considérablement leur utilisation. Il y a donc un besoin urgent de trouver de nouvelles molécules efficaces ayant un effet anti-cancéreux démontré. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet.
Bénéfices attendus
Des thérapeutiques efficaces et/ou aux effets secondaires limités sont manquants dans le traitement ou la prévention de cancers. Avec ces modèles, il est possible de mesurer les effets anti-cancer relatifs de nouvelles molécules ou de molécules en repositionnement. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet sur e développement des cancers.
Procédures
Les animaux recevront une greffe de cellules tumorales (soit par injection, soit par chirurgie). Au cours de l’expérience, les animaux recevront des traitements pour tester leur efficacité sur le développement du cancer. En fonction de la lignée de cellules cancéreuses injectées (luciférase), le système d’imagerie non invasive in vivo IVIS Spectrum sera utilisé une à deux fois par semaine pour une vingtaine de minutes par animal, après une anesthésie. Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour déterminer les scores des points limites.
Impact sur les animaux
Du fait de l’implantation de cellules cancéreuses, en fonction de l’origine des cellules cancéreuses et de la voie d’administration, l’animal va développer des métastases, des tumeurs solides ou liquides (cancer du sang) associés ou non à des ascites (accumulation de liquide dans l'abdomen), pouvant affecter sa survie (pour la procédure classée sévère). Nous n'attendons pas de nuisance liée à l'administration des traitements (doses non toxiques) ou de l'analgésique (cas des procédures chirurgicales) en dehors de celle induite par la piqure. De plus, les prélèvements de sang éventuels se feront en phase terminale sous anesthésie générale.
Devenir
Euthanasie pour récupérer les tumeurs, ascites liquides (accumulation de liquide dans l'abdomen) et différents organes pour analyses
Remplacement
Ce projet se focalise sur un modèle intégré nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ce système est indispensable pour reproduire la physiologie d’un organisme entier permettant le développement de cancer liquide/solide et la dissémination de métastases. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant ces procédures expérimentales. Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux pour pouvoir tester l’effet de traitements dans un contexte physiologique.
Réduction
Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux en accord avec la littérature existante ou nos expériences précédentes, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement (test non paramétrique). Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux.
Raffinement
Les animaux seront sous surveillance rapprochée avec surveillance plus fréquente lorsqu’une croissance tumorale rapide est attendue, si les tumeurs approchent du point final ou si l’état de l’animal se détériore. Lorsque la tumeur est externe, sa taille sera mesurée 2fois par semaine avec habituation à la contention et à l’apposition du pied à coulisse. Un diamètre maximal de 20mm est considéré, sous réserve d’euthanasier pour raison éthique. L’état et l’emplacement de la tumeur seront également inspectés régulièrement. De plus, la procédure non invasive IVIS sera utilisée pour suivre la croissance tumorale de toute lignée cancéreuse exprimant le gène de la luciférase. Les animaux trouvés dans des conditions moribondes et les animaux montrant une douleur sévère et montrant des signes de détresse seront mis à mort immédiatement. Les points limites sont définis selon les Directives de l’OCDE: perte de poids supérieure ou égale à 20%, distension abdominale avec prise de poids ne pouvant excéder +50%, hypothermie, absence prolongée de réponse volontaire à un stimulus externe, problèmes ambulatoires empêchant l’animal d’accéder à la nourriture ou à l’eau, difficulté à respirer, automutilation, blessure/ulcération de la peau. Avec certaines tumeurs, la masse corporelle n’est pas un indicateur idéal et dans ce cas l’atrophie musculaire ou l’émaciation seront les points limites considérés. Un tableau de suivi a été mis en place permettant de définir les points limites adaptés. Il y aura 5-6 souris par cage selon le poids de l’animal, avec nourriture et eau à disposition et enrichissement du milieu. Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (chirurgie) durant toute la procédure expérimentale. Les procédures de chirurgie seront effectuées par une personne habilitée et formée. Les animaux recevront un analgésique administré en phase pré- et post-opératoire. Afin d’optimiser l'expérience, les animaux seront randomisés selon la croissance tumorale ou selon le poids des animaux ; en plus de la tumeur/ des métastases/ de l’ascite, certains organes comme le foie, la rate et les poumons seront récupérés à la fin de l’étude et analysés. Les animaux sont sociabilisés (habitués à la présence des expérimentateurs) avant le début de l’étude.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles d’études très développés et caractérisés, du fait de leurs tailles et leurs spécificités, ils permettent l’étude et le suivi du développement tumoral d’un point de vue morphologique, histologique et moléculaire. Ils sont communément utilisés pour les études en cancérologie en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Différentes souches de souris pourront être utilisées. Des animaux immunodéficients sont classiquement utilisés pour ce type d’étude, ce qui permet l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Il s’agit d’un modèle non dommageable à l’état basal. Si les cellules greffées sont d’origine murine, des animaux immunocompétents seront utilisés. Ce sont des modèles de laboratoire bien connus avec suffisamment de données historiques. Ces projets permettront le suivi de l’impact de traitements sur la formation de cancer solide/liquide ou la dissémination de métastases après greffe de cellules cancéreuses chez la souris. Les animaux seront âgés de 5 à 8 semaines au moment de l’injection des cellules tumorales, à un stade de jeune adulte où le pouvoir prolifératif des cellules reste important sans avoir à toucher au développement normal de l’animal.
Etude du rôle des NETs dans la progression tumorale du cancer de la peau issus de patients atteints d’epidermolyse bulleuse dystrophique récessive.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes ou d'anticorps plusieurs fois par semaine, ainsi qu'une greffe de cellules de carcinome sous la peau, et développent des tumeurs cutanées pouvant gêner le déplacement et provoquer douleurs, vocalisations et agressivité. Le porteur teste des molécules ciblant l'immunité innée pour freiner la progression tumorale chez les patients atteints d'épidermolyse bulleuse dystrophique. Il indique avoir développé des modèles in vitro mais affirme qu'ils ne reproduisent pas la complexité de l'organe, d'où le recours aux souris.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact de certaines drogues ciblant l’immunité innée dans la progression tumorale des patients atteints d’épidermolyse bulleuse dystrophique récessive qui est une maladie génétique rare de la peau caractérisée par la formation de cloques, de plaies chroniques, et un risque accru de développer des cancers de la peau. Nos résultats obtenus in vitro montrent que les molécules auxquelles nous nous intéressons et qui régulent l’immunité innée favorisent le développement tumoral. Nous voulons maintenant transposer nos résultats in vivo chez la souris pour tester différentes drogues inhibitrices de l’action de ces molécules d’intérêt en prenant pour hypothèse qu’elles diminueront de la progression tumorale.
Bénéfices attendus
Notre étude, si elle est concluante, ouvrira des perspectives thérapeutiques pour traiter l’épidermolyse bulleuse en particulier et également permettra d’acquérir de nouvelles connaissances fondamentales sur le rôle de certains molécules immunitaires dans le développement des tumeurs dans d’autre maladies.
Procédures
- Injections intrapéritonéale : 20 secondes x nombre d’injection (quotidien pour les inhibiteurs, 3 fois par semaine pour les anticorps) par animal. - Injection intradermique sous anesthésie : 30 secondes par animal - Manipulation pour prise de poids : 15 secondes par animal
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus des animaux développant des tumeurs sont des problèmes de déplacements et des signes de douleurs (vocalisation, agressivité). Les effets indésirables définis comme toutes atteintes à une ou plusieurs des 5 libertés fondamentales définissant le bien-être des animaux placés sous la responsabilité de l’être humain, sont les suivantes : - Une altération du déplacement (faisant référence à une atteinte à la liberté fondamentale numéro 5 : liberté d’expression d’un comportement normal de son espèce). En effet, les animaux auront des tumeurs au niveau de la peau du dos, ce qui peux entrainer des problèmes de déplacements. – Des signes de douleurs (faisant référence à une atteinte à la liberté fondamentale numéro 4 : absence de douleur, de lésions et de maladie). En effet, l’apparition de tumeurs cutanées peut être à l’origine de douleurs, caractérisées par un comportement agressif de l’animal, des vocalisations, un manque de toilettage ou encore un dos vouté. - Des rougeurs peuvent apparaitre au niveau du site des IP (faisant référence à une atteinte à la liberté fondamentale numéro 4).
Devenir
Une fois les animaux mis a mort, les tumeurs primaires seront prélevés pour analyse post mortem. Les critères d’analyses des échantillons utilisés seront l’évaluation i) de la taille des papillomes/carcinomes ; ii) de la présence de neutrophiles/NETs dans les papillomes/carcinomes ; iii) de la fibrose tumorale. De plus, nous ne considérons pas comme un échec qu’un traitement n’aboutissent pas à un changement du nombre/taille des papillomes/carcinomes puisque la compréhension de ce critère nécessite l’analyse histologique/biochimique des échantillons à la fin de l’expérience.
Remplacement
Nos recherches ont décrit les cultures in vitro comme une méthode de remplacement pour l’étude du développement tumoral métastatique. Nous avons déjà développé des modèles in vitro permettant de vérifier le rôle des Neutrophil Extracellular Traps sur les capacités tumorales de carcinomes squameux de patients atteints d’epidermolyse bulleuse dystrophique récessive. Ces cultures ne récapitulent pas la complexité de l’organe (notamment les relations entre les cellules tumorales et les neutrophiles et les fibroblastes), nous avons donc recours aux animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est choisi pour détecter toute différence significative sur le volume tumoral avec un nombre de souris minimum. Les tests statistiques nous permettant de calculer le nombre de sujets nécessaires pour comparer les valeurs moyennes des groupes expérimentaux ont été réalisés via des tests de prévision statistique. De plus, les résultats obtenus au laboratoire in vitro permettent de réduire le nombre d’animaux. De même, les résultats déjà publiés avec ce modèle nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie. Toutes ces données nous ont permis de générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les souris Nude sont considérées comme une souche génétiquement altérée a phénotype potentiellement dommageable contenu de leur fragilité. Ainsi ces souris seront hébergées en condition SOPF (Specific Opportunist Pathogen Free) et cages individuelles ventilées. Les signes cliniques attendus des animaux développant des tumeurs sont des problèmes de déplacements et des signes de douleurs. L’implantation des cellules tumorales se fera sur un tapis chauffant, sans incision sous anesthésie générale. Afin d’évaluer le bien-être animal au mieux et de manière objective, nous avons établi des fiches d’évaluation du bien-être animal adaptées à cette procédure. L’état des animaux sera évalué 3 fois par semaine grâce à ces fiches d’évaluations et un score limite entrainera la mise à mort immédiate de l’animal. De plus, les résultats obtenus avec ce même modèle nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie et justifient les procédures proposées.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle des Neutrophil Extracellular Traps dans le développement de cellules de carcinomes squameux de patients atteints d’epidermolyse bulleuse dystrophique récessive. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. En outre, les modèles de tumeur primaire chez la souris sont couramment utilisés par la communauté scientifique, et nous ont déjà permis de dévoiler ; 1) le rôle des fibroblastes dans l’invasion tumorale 2) le rôle des Neutrophil Extracellular Traps dans le réveil des cellules tumorales ; 3) le rôle des Neutrophil Extracellular Traps dans la résistance aux chimiothérapies. De plus, le modèle d’implantation des cellules de carcinomes dans le derme de la souris a déjà été utilisé pour étudier le développement des carcinomes. Les injections de cellules de carcinomes squameux de patients atteints d’epidermolyse bulleuse dystrophique récessive seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines ce qui représentent l’âge adulte chez la souris. En effet, nous nous intéressons au développement des cancers de la peau chez l’adulte et non chez l’enfant. Les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront au maximum 56 jours après injection des cellules tumorales (ou lorsque le point limite sera atteint).
Etude du lien entre perturbations du microbiote et l’arthrite inflammatoire.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
286 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, la plupart en sévère. Elles portent une mutation qui déclenche une arthrite spontanée proche de l'arthrite humaine, avec gonflement douloureux des articulations, et reçoivent des antibiotiques dès la naissance, avec prélèvements d'urine, de sang à la joue, de lait maternel, gavages de sucres et isolement de 24 heures en cage métabolique. Le porteur veut établir un lien entre antibiotiques précoces et développement de l'arthrite, avec des retombées possibles sur la prescription chez l'enfant. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun système ne permet d'étudier l'arthrite hors du modèle animal, décrit comme "irremplaçable".
Objectifs
Les rhumatismes inflammatoires correspondent à une inflammation articulaire, appelée arthrite, dans le cadre de maladies générales de l'organisme avec un risque de handicap et une baisse de la qualité de vie. Les mécanismes aboutissant aux rhumatismes inflammatoires restent mal connus. Le corps humain est l'hôte d'une communauté microbienne, dont la plus importante est le microbiote qui réside dans les intestins. Les micro-organismes présents sont capables d’interagir avec différentes cellules immunitaires, qui agissent comme des sentinelles. Des études antérieures ont montré que les traitements antibiotiques étaient associés au développement de l'arthrite chez les enfants. Néanmoins, la méthodologie de ces études ne permet pas d’établir un lien causal, et les mécanismes par lesquels ces médicaments influencent la physiopathologie de l'arthrite restent inexplorés. D'autres études ont observé que la translocation de fragments de bactéries, présentes dans l'intestin, vers le système sanguin de l'organisme était augmentée chez les souris arthritiques. Un plus grand nombre de fragments de bactéries ont également été retrouvés dans le sang de patients atteints d'arthrite. Sachant que l'un des mécanismes d'action des traitements antibiotiques est la destruction des bactéries de l’intestin, cela provoque une augmentation de fragments bactériens dans l’intestin. Nous formulons alors l'hypothèse que le traitement antibiotique peut être responsable d'une augmentation significative de fragments bactériens libres capables de pénétrer dans l’organisme et d'augmenter la sévérité de l'arthrite. Ainsi, dans cette étude, nous étudierons le rôle des antibiotiques dans la physiopathologie de l'arthrite. L'exploration complexe du lien entre le tube digestif et l'arthrite inflammatoire nécessite d’être réalisée sur des animaux puisqu’à ce jour aucun système cellulaire in vitro ne permet de reproduire ces interactions complexes. Nous utiliserons un modèle murin transgénique qui développe spontanément une arthrite ressemblant à l'arthrite humaine. Seront étudiés les effets de différents types d'antibiotiques sur la translocation de fragments de bactéries, l'activation immunitaire et le développement de l'arthrite.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir un lien mécanistique entre le traitement antibiotique à un jeune âge et le développement ultérieur d'une arthrite inflammatoire. Les résultats pourraient influencer l'utilisation des antibiotiques chez les enfants, et éventuellement guider le choix des molécules à utiliser dans les populations à risque de développer une arthrite.
Procédures
L'urine sera collectée une fois par semaine chez les mères (enceintes et allaitantes) et les nouveau-nés après le sevrage, soit après contention avec la main du manipulateur et placement d'un tube collecteur au niveau de l'urètre ; soit en isolant la souris quelques instants dans une cage séparée pour une courte durée si nécessaire (moins de 30 minutes), l'urine présente dans la cage sera alors aspirée à l'aide d'une pipette. Afin de mieux comprendre l’effet des antibiotiques sur la perméabilité intestinale, nous réaliserons, une fois par semaine (S5-S10), le gavage de deux sucres, suivi d’une collecte d’urine de 24h. Les souris ne seront pas endormies pour la réalisation di gavage. La récolte des urines pour cette analyse sera fait à l’aide des cages métaboliques, des unités de détention délimitées de tous côtés, avec des surfaces partiellement grillagées ou non perforées pour les animaux de laboratoire qui permettent de recueillir les excréments et l'urine. Une fois par semaine, les selles sont récoltés en isolant les souris quelques instants dans une cage séparée (moins de 30 minutes). Des échantillons de sang sont prélevés sur la mandibule (sous-maxillaire) une fois par semaine. Il s'agit de piquer, à l'aide d'une aiguille fine, une zone de la joue de la souris connue pour avoir une veine facilement accessible. Cela permet de récupérer facilement 2 à 3 gouttes de sang, avec une cicatrisation rapide et un traumatisme limité pour la souris. La souris pourra être endormie à l'aide d'un anesthésique gazeux, afin de réduire le stress et l'inconfort de la procédure. Conformément aux recommandations actuelles, le volume prélevé sera inférieur à 7,5 % du volume sanguin total de l'animal. Le lait maternel peut être prélevé pour l'analyse post-traitement (S2), conformément aux procédures existantes dans la littérature. Les souris seront endormies comme décrit ci-dessus et placées sur le dos afin d'avoir accès à leur estomac et à leurs mamelles. Les souris peuvent être endormies à l'isoflurane (anesthésie gazeuse) si la procédure est inconfortable pour elles. Les mamelles seront massées pour stimuler la sortie du lait, qui sera récupéré à l’aide d’une pipette. Seule la moitié des mamelles sont utilisées, afin de laisser suffisamment de lait à la mère pour nourrir ses petits. Une biopsie peut être prélevée sur les nouveau-nés dès leur naissance, afin d'effectuer une étude génétique de la souris, pour s'assurer que la mutation génétique est toujours présente.
Impact sur les animaux
Ce projet de recherche a comme effet indésirable attendu l’augmentation de la sévérité de l’arthrite provoquant la douleur chez les souris selon les traitements reçus et leurs durées. L’arthrite évoluera par une augmentation du gonflement des articulations (principalement des pattes arrières) plus ou moins rapide et forte, pouvant devenir douloureuse lors de la marche. L’analyse de la perméabilité intestinale peut provoquer un inconfort supplémentaire, car le les souris seront mises à jeun, gavées et maintenues isolées (cages métaboliques) pendant 24h. Cependant, le stress additionnel provoqué par ces procédures n’augmente pas la sévérite de l’arthrite ni la mortalité des souris.
Devenir
Pour les souris en élevage, après 160 jours de vie, l’arthrite sera bien installée. Ainsi, prolonger leur durée de vie ou leur donner de nouvelles portées, risque de les rendre plus douloureuses. Pour éviter ce risque de diminution du bien-être, les souris seront euthanasiées à partir de 160 jours de vie. Concernant les souris nées sous différents traitements antibiotiques, les souris seront euthanasiées à 12 semaines de vie maximum. Les mères ayant mi-bas pourront être réintroduit dans la procédure d’élevage pour avoir une nouvelle portée, à partir de 160 jours de vie, elles seront euthanasiées.
Remplacement
Aujourd’hui, il n’existe pas de système permettant d’évaluer l’arthrite en dehors du modèle animal. En effet l’arthrite apparait selon des facteurs génétiques, environnementaux et hormonaux qui ne sont pas clairement connus et difficiles à reproduire en dehors du modèle animal. De plus, l’arthrite du modèle animal est très proche de celle retrouvée chez l’homme. Il n’existe pas non plus de modèle permettant de comprendre l’effet systémique des antibiotiques sur la sévérité. Notre modèle cherche à comprendre l’implication et l’interaction entre le système digestif et l’apparition ou le développement de l’arthrite. Il n’existe pas de méthode alternative pour comprendre l’interaction entre plusieurs organes différents. Pour cela, le modèle animal ne peut pas être remplacé.
Réduction
Le nombre d'animaux que nous estimons nécessaire repose sur notre expérience de la conception d’études de ce type et sur notre volonté à utiliser le moins d’animaux possible tout en nous permettant d’avoir assez de résultats pour réaliser une interprétation fiable des données. Ainsi, le nombre de souris est réduit au strict minimum pour obtenir des résultats pertinents statistiquement. Ce nombre tient compte du nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi éviter des erreurs d’interprétation.
Raffinement
Chaque souris aura à sa disposition du coton et/ou un abri dans sa cage pour se former un nid. Des morceaux de bois pourront être donnés à des souris isolées ou en faible effectif afin de permettre le jeu et l’exploration d’objet. Les souris seront hébergées en groupe de 6 individus maximum dans des cages sur des portoirs ventilés. Une exception existe, où les souris pourront être isolées durant leur gestation et selon les traitements. Dans ce cas, une surveillance accrue et davantage de coton et bois seront donnés à la souris isolée. En cas de souffrance d’un animal, une grille de score a été établie pour juger de l’intensité de la douleur. Ainsi, en fonction du score, des dispositions seront prises pour améliorer le bien-être. Cela peut aller de l’augmentation de l’enrichissement (coton, tunnel, buchettes), au dépôt de nourriture et d’eau dans la cage, à l’augmentation de la surveillance, arrêt de la procédure ou euthanasie de l’animal si le score de douleur est jugé trop important.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont la physiologie et le système immunitaire sont très proches de ceux de l'homme, et il existe des lignées avec des modifications conduisant à une inactivation des gènes, ce qui permet de reproduire des maladies et étudier les mécanismes sous-jacents. Les résultats expérimentaux obtenus chez la souris ont donc de fortes chances d'être transposés à l'homme. Le modèle murin d'arthrite inflammatoire chronique spontanée utilisé dans ce projet est très proche de l'arthrite observée chez l'homme. Il s'agit d'une souris chez laquelle est invalidé un gène qui empêche l'activation d'un récepteur impliqué dans l'inflammation, appelé récepteur de l'interleukine 1 (IL1). Par conséquent, ce récepteur est constamment stimulé, ce qui entraîne une suractivation de l'inflammation et la sécrétion de substances inflammatoires, tel que le l'interleukin-1. Dans le cas de ces souris, l'inflammation est présente dans les articulations, ce qui provoque leur inflammation. Dans la précédente demande d’autorisation de projets, nous avons remarqué que plus les souris recevaient des antibiotiques à un âge jeune, plus l’arthrite devenait précoce et sévère avec le temps. C’est pourquoi dans ce projet, nous donnerons des antibiotiques à des souris dès la naissance pour étudier le phénomène d’apparition de l’arthrite et les mécanismes biologiques impliqués chez l’enfant et au cours du temps. Ce projet permettra de mieux comprendre l’arthrite juvénile idiopathique (AJI) observée chez l’homme.
Etude d’efficacité comparée des thérapeutiques de traitement des MICI sur les symptômes comportementaux extra-digestifs
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
231 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Une colite est induite par du dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, avec douleur, perte de poids et prostration, puis les souris passent une batterie de tests comportementaux dont un test de nage forcée, certaines recevant un gavage d'antibiotiques et une transplantation fécale. Le porteur veut mesurer l'effet de traitements du microbiote sur les symptômes comportementaux de la maladie et indique que ces bénéfices sont à long terme. Sur le remplacement, il affirme que les alternatives sans animaux ne permettent pas l'étude comportementale.
Objectifs
Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de stratégies thérapeutiques de modulation de l’écologie microbienne intestinale en développement dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sur un plan comportemental. Le projet a recours à un modèle murin de référence de MICI : colite au dextran sulfate de sodium (DSS). Cette molécule soluble dans l’eau de boisson des animaux entraine une inflammation de la muqueuse intestinale, reproduisant ainsi les lésions existantes dans la maladie humaine et ses caractéristiques physiopathologiques. Les animaux seront étudiés sur un plan comportemental avec une batterie de tests successifs pour évaluer leur état d’anxiété, leur état de dépression, leur réaction au stress et leur capacité de socialisation. Ces tests seront menés de manière séquentielle pour tous les groupes d’animaux. Enfin, l’administration de thérapeutique sera réalisée et l’évaluation sera faite par une nouvelle séquence de tests comportementaux, afin de montrer un avantage ou non de la thérapeutique sur les aspects comportementaux de la colite au DSS. Ceci répondra à des questions de physiopathologie des symptômes psycho-comportementaux des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, et d‘étudier la réponse de ces symptômes aux stratégies thérapeutiques. Etant donné les expériences nécessaires à la mise en place du projet, un nombre minimal de souris a été fixé permettant une bonne analyse des résultats. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum sans entraver l’interprétation des résultats et leur significativité au plan statistique. Ainsi, un maximum de souris sera nécessaire pour une étude scientifique pertinente. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Par ailleurs, ils seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition en permanence.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’améliorer les connaissances sur le modèle de colite au DSS, notamment à court terme sur la faisabilité d’un modèle consistant en une répétition de cycles d’exposition. Le projet consiste en une étude pré-clinique de test d’hypothèse thérapeutique afin d’obtenir des données qui permettront des études en population humaine pour apporter une réponse thérapeutique aux symptômes extra digestifsneuro-comportementaux des MICI. Ces bénéfices du projet sont à long terme.
Procédures
Induction d'une colite inflammatoire par boisson au DSS (exposition de 5 jours par inductions) : - Procédure expérimentale 1 pilote : 6 groupes de 6 souris (un groupe par dosage), une seule induction, mise à morts d'une souris par cage (cages de 3) pour étude histologique et biologique à J5, J10 et J12. - Procédure expérimentale 2 : 6 souris, 2 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 3 : 9 souris, 3 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 4 : 45 souris, 3 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 5 : 90 souris, 2 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. Prélèvement sanguin par ponction de la veine mandibulaire avant les mises à mort pour dosage des différents marqueurs inflammatoires dans la procédure expérimentale 1 (36 souris concernées). Test comportementaux léger : 90 souris dans la procédure expérimentale 4, passés à 6 reprises, lors des pics inflammatoire et en fin de rémission pour chaque cycle. Test de la nage forcée : 30 souris dans la procédure expérimentale 4. Gavage antibiotique pour déplétion du microbiote intestinal pendant 3 jours consécutifs, puis gavage pour transplantation fécale le 4ème jour : 45 souris dans la procédure expérimentale 5, entre les 2 cycles d'induction.
Impact sur les animaux
Colite au DSS : douleur, perte de poids, prostration, stress pendant la durée d’exposition au DSS dans l’eau de boisson. Tests comportementaux : stress pendant une période réduite de quelques heures après le test.
Devenir
Mise à mort de toutes les souris à l’issue de chaque procédure pour étude et comparaison histologique et biologique de l'intestin.
Remplacement
Notre projet porte sur l’étude comportementale d’un modèle de colite inflammatoire. Les alternatives expérimentales aux animaux vivants ne permettent pas l’étude comportementale.
Réduction
Le nombre d’animaux destiné au projet a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux pour la PE1 et PE2 a été réduit au minimum pour permettre de construire de manière adapté le protocole final. Les PE3 et 4 nécessite un nombre plus important d’animaux du fait de la variabilité importante et inhérente aux analyses comportementales. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons. Du fait du faible nombre de données les analyses seront menées par des tests non paramétriques.
Raffinement
Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue lors de l’exposition au DSS sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Concernant le gavage de la PE5, celui-ci sera réalisé par un expérimentateur entrainé. Les cages d’hébergements seront enrichies (nid et bâton à ronger).
Choix des espèces
La souris est l’espèce référencée pour le modèle au DSS. Elle répond aux compétences de l’animalerie où l’expérimentation va être menée. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. Les animaux seront achetés à l’âge de 6 semaines, et seront utilisé dans le projet à l’âge de 8 semaines. L’âge adulte correspond aux données de la littérature en termes de modèle DSS et d’étude comportementale.
AVENANT Impact de la modulation β3-adrénergique sur la fonction vasculaire dans le choc septique expérimental
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Elles subissent une ligature et ponction caecale, chirurgie qualifiée de sévère qui provoque un choc septique, puis selon les séries une échocardiographie, la pose d'un cathéter carotidien, une injection de Bleu Evans ou une étude de survie sur cinq jours. Le porteur décrit une douleur traitée par buprénorphine et des séries écourtées à 18 heures pour limiter la souffrance, la série de survie étant suivie chaque jour avec mise à mort possible au point limite. Il affirme que le choc septique ne peut être modélisé in vitro et revendique un modèle proche des situations cliniques humaines, le plus utilisé dans la littérature.
Objectifs
La présente demande est un avenant au projet autorisé en cours. Le choc septique est défini comme la forme la plus sévère d’une infection caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Le choc septique est un problème majeur de santé publique, responsable de 15% des admissions et de 40% de mortalité en réanimation. Le choc septique est associé à une dysfonction du système cardiovasculaire et immunitaire. En effet, afin de combattre l’infection, l’organisme active une série de phénomènes au niveau vasculaire notamment pour permettre l’arrivée des globules blancs sur le site inflammatoire. L’activation excessive de ces mécanismes conduit entre autre à un phénomène d’hypotension (chute de la pression dans les vaisseaux) menant à un défaut d'apport en oxygène aux organes. La présence des récepteurs β3-adrénergiques (β3-ARs) au niveau vasculaire, dont la concentration croît durant une infection (inversement aux β1, β2-ARs), pourrait jouer un rôle dans l'hypotension. La vasodilatation excessive, responsable de l'hypotension, est contrée par l’organisme grâce à une modulation de la vitesse et de la force de contraction du cœur. L'utilisation de ligands β-adrénergiques, des β1-bloquants, permet ainsi de moduler la fonction cardiovasculaire dérégulée pendant l’état de choc septique via le système nerveux. En effet, il a été prouvé que l’administration de β1-bloquants lors du choc septique améliorait expérimentalement la réactivité vasculaire à un vasoconstricteur de vaisseaux de gros et petits calibres. Parallèlement, la quantité de sang éjectée par le cœur, était améliorée alors que les animaux présentaient la même fonction cardiaque et le même volume de fluide perfusé témoignant peut-être d’une moindre fuite liquidienne au niveau vasculaire induite par le choc septique. Les β1-ARs étant très peu présents dans les vaisseaux, notre hypothèse est que, durant le choc septique, la modulation des β3-ARs au niveau vasculaire modifie la vasoréactivité. L'hypothèse de ce travail est qu'en agissant sur les β3-ARs, les fonctions vasculaires et cardiaques des patients septiques pourraient être améliorées.
Bénéfices attendus
En mettant en évidence un effet de la modulation des β3-ARs sur la perte de la vasoréactivité dans le choc septique, il est attendu un bénéfice sur la prise en charge clinique du choc septique. En effet, un traitement modulant les β3-ARs pourrait améliorer la chute de la contraction vasculaire et diminuer la vasodilatation excessive conduisant à l’hypotension lors du choc septique.
Procédures
Les animaux (n=354) seront soumis à une procédure chirurgicale pendant 15 minutes, la ligature et ponction caecale, de type sévère conduisant à un état de choc septique. C’est 18 heures après cette intervention que les analyses in vivo et ex vivo (procédure 2) débuteront pour les animaux de la première série (n=178). Les animaux de la première série seront soumis à une évaluation hémodynamique par échocardiographie pendant 15 minutes et par l'implantation d'un cathéter carotidien pour une durée d'environ 15 minutes sous anesthésie. La mise à mort des animaux sera effectuée à la fin de la procédure de cathétérisme carotidien et permettra le prélèvement des organes et du sang permettant les analyses ex vivo (myographie, rapport poids humide/sec pulmonaire) et biochimiques. Les animaux de la deuxième série (n=110) traités pendant 24 heures seront soumis à une étude de survie sur 5 jours. Les animaux de la troisième série (n=66) recevront une injection de Bleu Evans (procédure de 10 minutes) dix-huit heures après la chirurgie CLP pendant une heure avant d'être mis à mort.
Impact sur les animaux
La ligature et ponction caecale, notre modèle, est une procédure chirurgicale sévère qui induit un choc septique chez l'animal. Cette procédure va induire une douleur chez l'animal qui sera traitée grâce à l'administration d'un analgésique, la buprénorphine à la posologie de 0,2mg/kg une heure avant la chirurgie, 3 heures après la chirurgie puis 1 fois/jour. Le stress et la douleur engendrés chez les animaux de la première et troisième séries sont limités dans le temps avec des analyses in vivo et des prélèvements suite à la mise à mort 18h après la chirurgie. Une observation de l'état général des animaux de la deuxième série sera réalisée chaque jour et dans le cas où un point limite est atteint, la mise à mort de l'animal pourra être décidée.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux (n=354) seront mis à mort à la suite des procédures pour réaliser le prélèvement des organes.
Remplacement
Tout d'abord, ce modèle est choisi par rapport à sa proximité avec les situations cliniques humaines. En effet, on ne peut pas modéliser le choc septique avec d’autres types de modèles, par exemple in vitro, puisqu’on étudie plusieurs fonctions biologiques et leurs interactions : fonction cardiaque, fonction vasculaire, et le métabolisme. De plus, il n’existe pour l’heure nulle autre expérimentation que le modèle animal afin de remplacer l’utilisation des souris pour les procédures expérimentales prévues dans ce projet (ligature et ponction caecale, échocardiographie, cathéter carotidien, perméabilité vasculaire). Enfin, ce modèle est le plus utilisé dans la littérature (modèle de choc septique multi-microbiens) et il est maîtrisé par le laboratoire.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, les mâles et les femelles seront utilisés. Dix animaux par groupe (séries 1 et 2) et six animaux par groupe (série 3) sont nécessaires afin de ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé par une approche statistique.
Raffinement
Pour le raffinement, les animaux ne seront pas manipulés dans la même pièce que celle où ils sont hébergés. Les souris sont hébergées à 5 maximum par cage individuellement ventilées de 500 cm². Elles auront de l'eau et de la nourriture à volonté. L’enrichissement du milieu se fera avec des petits abris, des tunnels, du sizzle pad ou des bâtons à ronger. Les gestes chirurgicaux sont maîtrisés par le personnel de l’étude permettant ainsi une manipulation plus rapide conduisant à un réveil et à une récupération plus rapide en post-opératoire. Plusieurs types de mesures seront effectués sur un même animal en traitant la douleur induite par injection sous-cutanée d’analgésique (buprénorphine) une heure avant, 3 heures après la chirurgie puis 1 fois par jour. Les chirurgies se feront sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Enfin, la durée de l’étude est courte (18 heures) pour la première et troisième séries d'animaux en post-opératoire afin de limiter les souffrances. Une observation des animaux de la deuxième série sera réalisée chaque jour, et dans le cas où un point limite est atteint la mise à mort pourra être décidée.
Choix des espèces
La souris C57BL/6 est une espèce fréquemment retrouvée dans la littérature sur le choc septique. Nos résultats seront ainsi plus facilement comparables avec la littérature. Le modèle animal dont nous avons accès est un modèle de souris rare KO pour le β1-AR, ce qui est un avantage pour les expérimentations puisque les animaux sont déjà connus des expérimentateurs. Les évaluations hémodynamiques, vasculaires et inflammatoires de ces souris KO pour le β1-AR subissant la CLP ou non permettront de mettre en évidence des effets modulatoires des β3-ARs en l’absence du β1-AR. Des souris de 20g-30g seront utilisées pour comparer avec les autres résultats dans la littérature, qui utilisent cette gamme de poids. Ces souris auront entre 12 et 16 semaines et les mâles et les femelles seront utilisés.