Procédures sévères
Impact de l’électrostimulation spinale sur l’inflammation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
843 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 462 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 381 opérées sans réveil. Selon les groupes, chaque animal subit une chirurgie puis l'injection d'une endotoxine bactérienne ou l'induction d'une arthrite ou d'une atteinte du système nerveux proche de la sclérose en plaques, avant des séances d'électrostimulation. Le porteur reconnaît que ces inductions peuvent provoquer une douleur sévère et que les impulsions électriques peuvent créer un inconfort. L'étude vise à mettre au point un électrostimulateur contre la polyarthrite et la sclérose en plaques, qu'il présente comme un "besoin" faute de traitements curatifs.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde (PR) et la sclérose en plaque (SEP) sont des maladies inflammatoires, caractérisées par une atteinte articulaire ou nerveuse respectivement évoluant vers la déformation et la destruction des articulations ou du tissu nerveux. La PR et la SEP sont une maladie autoimmune reconnue pour présenter un nombre anormal de cellules immunitaires dans les articulations ou le cerveau respectivement qui produisent des molécules inflammatoires, activant la destruction des tissus. Des études ont montré que le système nerveux pouvait réguler le système immunitaire via la libération des molécules (tels que l’acétylcholine, l’adrénaline ou la noradrénaline) lors de la stimulation de nerfs qui peuvent agir directement sur les cellules du système immunitaire. Dès lors, l’intervention sur l’activité des nerfs dans le but de modifier l’activité du système immunitaire est envisageable. Ainsi, chez l’homme la stimulation de nerfs est déjà utilisée pour le traitement de maladies comme l’épilepsie ou la dépression. De nos jours, plus de 50000 patients dans le monde sont implantés avec des micro-stimulateurs. Les effets de ces électrostimulations sont actuellement recherchés dans des maladies inflammatoires comme la PR. Deux modèles ont été développés chez la souris qui permettent d'induire des pathologies proches de la PR et de la SEP. Le but à long terme de notre projet est de développer un électrostimulateur visant à traiter la PR et la SEP. Dans un premier temps, notre objectif sera d’évaluer l’impact de l’électrostimulation des certaines nerveuses sur un modèle simple d’inflammation afin d’optimiser les paramètre de stimulation électrique. Dans un second temps nous recherchons à évaluer l'effet de l'électrostimulation de ces nerfs sur le développement de la PR et de la SEP dans des modèles murins.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de lutter efficacement contre l’arthrite rhumatoïde ni la sclérose en plaque. Les traitements les plus efficaces sont des traitements lourds, non curatifs et qui génèrent de nombreux effets secondaires. Par conséquent, le développement de traitements plus efficaces et sans effets secondaires est nécessaire pour lutter contre les maladies auto-immunes.
Procédures
La procédure 1 est une procédure chirurgicale terminale de moins de 3H sous anesthésie à l'isoflurane. Pour la procédure 2 : les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 40mn. Une semaines après cette chirurgie les animaux recevrons une injection intrapéritonéale infra létale d'endotoxine bactérienne puis seront mis à mort 90mn après. Un prélèvement sanguin sous anesthésie est prévu 90mn après injection de LPS en fin de procédure. Pour la procédure 3 et 4 : Les animaux subiront une procédure chirurgicale unique de moins de 40mn chacune. Une semaine après la chirurgie, les animaux seront immunisés par injection d'adjuvant complet de Freund et d'une protéine (soit le collagène pour la procédure 3 soit la myéline pour la procédure 4) par voie sous-cutanée puis électrostimulés (ou non) selon différents protocoles pendant 21 jours au maximum à raison de 12, 6, 3 et 2 sessions d’électrosimulations de 2 mn par jour. Aucun prélèvement n’est prévu durant ces procédures.
Impact sur les animaux
La procédure 1 de ce projet est sans réveil. Les nuisances seront donc inexistantes pour cette procédure sous réserve du respect des bonnes pratiques d'anesthésie. Les autres procédures seront réalisées sur des animaux ayant subi une chirurgie ce qui générera les nuisances suivantes : - Douleur associér à l’injection sous cutanée d’analgésique préopératoire ; - stress lié à la phase d’induction de l’anesthésie (isolement de l’animal dans une boite d’anesthésie) et à la phase post-anesthésique dans la cage de réveil ; - une inflammation au niveau des plaies chirurgicales et de la zone d’implantation ; - perte de poids dans les 2 à 3 jours suivants la chirurgie. Par ailleurs pour les procédures 2, 3 et 4 une douleur sévère pourra être observée soit suite à l'induction d'une inflammation systèmique par injection de molécule bactérienne (procédure 2), soit suite à l'induction d'une inflammation des articulations (procédure 3), soit suite à l'induction d'une inflammation du système nerveux central (procédure 4). Enfin, les impulsions électriques quant à elles pourraient également induire un inconfort transitoire ou des douleurs chez l'animal lors de la procédure.
Devenir
Pour toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort dès la fin de la procédure expérimentale pour des analyses anatomopathologiques et histologiques.
Remplacement
Il n’existe aucune méthode in vitro validée scientifiquement ou test in vitro connu qui offrirait une alternative à l’expérimentation animale pour répondre aux questions posées dans ce projet. Le phénomène d’inflammation par l’arthrite rhumatoïde ou la sclérose en plaque ne peut être étudié correctement in vitro car il s’agit d’un phénomène complexe et ne pouvant être étudié que chez l’animal, en intégrant l'ensemble de la biologie d'un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle expérimental in vivo est donc un pré-requis à la phase de développement clinique.
Réduction
Pour la procédure 1, le nombre de paramètre d’électrostimuation possible étant quasiment infini et, afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, nous utiliserons des modèles de régression linéaire. Nous estimons qu’au maximum 381 souris seront nécessaires à cette procédure. Ce nombre total de souris représente un nombre maximum sachant que nous ne pourrons mettre en expérimentation que des lots de 10 animaux étant donné les contraintes spatiales de notre animalerie et que des bilans seront réalisés tous les 20 souris à partir de la 50ième souris. Ainsi, si 10 paramètres électriques satisfaisants sont trouvés (activation des fibres splénique sans modifier la pression artérielle) avant la fin de la procédure, nous interromprons les expérimentations pour le procédure 1 et passerons à la procédure 2 pour tester ces 10 paramètres. Pour les procédures 2, 3 et 4, nous avons déterminé le nombre d’animaux par une approche statistique reconnue. En effet, notre stratégie d’expérimentation reposant sur la comparaison entre scores cliniques des animaux électrostimulé ou non, le test de puissance réalisé avec le logiciel G*power 3.1 nous donne le nombre d’animaux minimal pour obtenir des résultats significatifs en fonction des hypothèses avancées.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés dans des cages collectives avec un environnement enrichi (tubes en carton pour se cacher, briques de bois à grignoter). Une période d’acclimatation de 7 jours minimum aura lieu pendant laquelle aucun geste technique lié à la procédure expérimentale ne sera réalisé. Les chirurgies seront réalisées par du personnel ayant les compétences requises et les animaux seront sous anesthésie et analgésie ce qui évitera toute souffrance. Les effets potentiellement douloureux de l'électrostimulation seront évalués pour qu'il soit mis un terme à l'électrostimulation au plus tôt si des signes douloureux apparaissent. Les effets sur la le score clinique seront évalués sur un nombre d'animaux strictement suffisant pour évaluer les effets de l'électrostimulation à long terme (procédure 3 et 4). Enfin, des points limites ont été établis afin d’anticiper toute dégradation de l’état de santé général des animaux anesthésiés ou conscients et, le cas échéant, d’appliquer des protocoles de soins adaptés. Dans le cas où la santé de l’animal serait dégradée, une mise à mort sera réalisée immédiatement sur décision du responsable de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce souris sera utilisée en raison des données de la littérature démontrant une implication du système nerveux sympathique sur l’inflammation sur ce modèle. Il est également utilisé car il existe des modèles bien établis des pathologies auto-immunes (arthrite rhumatoïde et encéphalite) induits par immunisation. Utilisation d’animaux adultes car l’objectif est le développement d’un dispositif médical pour les sujets adultes (≥ 10 semaines)
Caractérisation d’un modèle murin du syndrome d’Ondine
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'étude porte sur des nouveau-nés porteurs d'une mutation du syndrome d'Ondine, une maladie qui perturbe le contrôle de la respiration, et le porteur compte comme intervention le fait que ces animaux meurent de leur pathologie. Chaque nouveau-né est tatoué, séparé de sa mère pour enregistrer sa respiration, puis anesthésié pour les prélèvements. Le porteur espère que ce modèle sera moins sévère que les précédents mais indique ne pas pouvoir exclure une mortalité précoce.
Objectifs
Chez l'Homme, le syndrome d'Ondine est une maladie génétique rare conduisant à une augmentation du taux de CO2 dans le sang par perte du contrôle automatique de la respiration et une absence des signaux d'alerte à un trop haut taux de CO2. Il est le plus souvent lié à des mutations dans le gène PHOX2B conduisant à une protéine trop grande. Les différents modèles murins de ce syndrome générés jusqu'à présent présentent un défaut de réponse à l’augmentation du CO2 en post natal conduisant à une mortalité précoce, dans les premières heures ou jours de vie. Notre projet a pour objectif de caractériser un nouveau modèle murin que l'on espère plus proche des patients, à savoir moins drastique. L’intérêt général du modèle souris, utilisée comme un modèle préclinique, repose essentiellement sur la proximité physiopathologique avec l’Homme (transférabilité des résultats) afin d'élaborer de nouvelles thérapies géniques translationnelles.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur le gène PHOX2B qui produit la protéine PHOX2B. Cette protéine est exprimée dans une population de neurones indispensable à la réponse respiratoire à l’augmentation du taux de CO2 dans le sang. Ces souris à la naissance ne présentent pas de réponse à cette augmentation de CO2 dans le sang et n'adaptent pas leur respiration en conséquence. Ce déficit est partiellement restauré chez les souris adultes si les animaux survivent. Les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre la pathologie du syndrome d’Ondine.
Procédures
Le fait que nos souris issues du croisement des deux lignées meurent de leur pathologie est considéré comme une intervention. Les animaux seront soumis à des manipulations et des tests non invasifs dès les premiers jours après la naissance. Les nouveau-nés seront tatoués sous une patte afin de pouvoir les distinguer. Ils seront également séparés de la mère pour l'enregistrement des paramètres respiratoires pendant 10 minutes 3 fois par semaine. Des anesthésies terminales seront réalisées pour réaliser les prélèvements.
Impact sur les animaux
Les autres modèles murins du syndrome d’Ondine présentent un défaut de réponse à l’augmentation du CO2 dans le sang en post natal conduisant à une mortalité précoce, dans les premières heures ou jours de vie. Nous espérons que notre modèle sera plus proche des patients et présentera un phénotype moins sévère. Nous ne pouvons cependant pas exclure des anomalies respiratoires conduisant à une mortalité prématurée des animaux. Les nuisances principales sont la séparation de la mère et les injections pour les anesthésies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'Humain, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier.
Réduction
Afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet, nous utiliserons un croisement d'animaux reproducteurs nous permettant d’obtenir théoriquement 50% d'individus sains et 50% malades. Des souris malades mâles et femelles seront étudiées pour réduire le nombre car la pathologie et identique chez les deux sexes. Notre étude consiste à comparer deux groupes d’animaux génétiquement différents. Nous montrons qu'il nous faut au moins 17 souris par groupe pour avoir des résultats statistiques. Afin de faire face à d’éventuelles pertes d’animaux ou incidents techniques, nous avons augmenté ce nombre de 15% et arrivons à un total de 20 souris par groupe. Dans la procédure, nous étudierons les animaux avec 2 types d’analyse. Nous aurons donc besoin de 80 animaux (2 génotypes x 2 analyses x 20 animaux).
Raffinement
Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. L'hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux. Ils sont hébergés dans des cages avec enrichissements, eau et nourriture ad libitum. La température, la luminosité, l'environnement sonore et l'hygrométrie sont contrôlés. La manipulation des animaux sera faite par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress. Le prélèvement pour génotypage par PCR est réalisé par biopsie à l'oreille et nous permet en même temps d'identifier nos souris afin de réduire la douleur et le stress. Le modèle que nous allons utiliser n’a jamais été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations très poussées des animaux et identifier de la manière la plus précoce l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la SBEA. La semaine avant la date prévue de mise bas, la souris gestante sera habituée aux odeurs qu’elle pourra sentir sur les nouveau-nés. Les nouveau-nés seront isolés de la mère dans une cage avec un tapis chauffant et un morceau du nid pour faire les enregistrements de la respiration avant de retourner avec leur mère.
Choix des espèces
Les rongeurs sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la commande respiratoire. La création de modèles génétiquement altérés permet de modéliser les mutations rencontrées chez les patients. Plusieurs modèles murins du syndrome d'Ondine existaient mais le phénotype est sévère et l'étude des nouveau-nés compliquée. Nous espérons que notre modèle murin sera moins sévère afin que l'on puisse étudier la respiration. Les souris seront utilisées dès le stade nouveau-né et dans les jours qui suivent afin de suivre la fonction respiratoire dès les stades les plus précoces de la pathologie.
Induction d’arthrite dans un modèle murin de production d’autoanticorps
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit treize injections et sept prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse pour déclencher une arthrite des pattes, décrite par le porteur comme la nuisance sévère du protocole. L'objectif est de mettre au point un modèle combinant production d'auto-anticorps et arthrite, en vue de tester de futurs traitements de la polyarthrite rhumatoïde humaine. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'autre alternative" et revendique le "besoin" d'un modèle réunissant les deux caractéristiques.
Objectifs
Ce projet permettra de développer un modèle d'arthrite « auto-immune ». Ce modèle murin permettra d'analyser la production d'auto-anticorps, la genèse de l'arthrite et potentiellement d'évaluation des solutions thérapeutiques destinées à la polyarthrite rhumatoïde.
Bénéfices attendus
Avoir un modèle murin qui combine la production d’autoanticorps et l’arthrite nous permettra de tester de nouvelles thérapies chez l’homme qui visent à éliminer les cellules B productrices des autoanticorps dans la polyarthrite rhumatoïde.
Procédures
Les souris vigiles seront injectées : 3 fois en sous cutané dans le dos avec une protéine ou la solution saline. 1 fois en sous cutané dans le dos ou en intrapéritonéal avec un composant bactérien. 9 fois en sous cutané dans le dos ou en intrapéritonéal avec des anticorps Les souris seront prélevées 7 fois dans la veine mandibulaire d’un volume de 0.1 ml de sang après une anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Des nuisances modérées comme des difficultés à se déplacer pendant quelques minutes, des démangeaisons sur le dos et la joue pendant quelques secondes peuvent se produire suite aux interventions (13 injections de composés pendant 5 secondes, 7 anesthésies gazeuses de 5 minutes, 7 prélèvements de sang de 10 secondes). La nuisance sévère est l’arthrite des pattes. L’ensemble des interventions listées ci-dessus est susceptible d’induire une arthrite chez les souris pendant quelques jours.
Devenir
A la fin du protocole, les 360 souris seront mises à mort pour analyser leur réponse immunitaire.
Remplacement
Il n’existe pas d’autre alternative à l’expérimentation animale qui permettrait d’analyser globalement la production des autoanticorps et le développement de l’arthrite. Chez l’homme, il est difficile d’analyser l’apparition des autoanticorps car ils peuvent apparaitre plusieurs années avant les signes cliniques de la maladie. Nous développons des traitements susceptibles de bloquer la production des autoanticorps et le développement de l’arthrite mais pour les tester nous avons besoin d’un modèle où les souris font à la fois des autoanticorps et une arthrite.
Réduction
Nous allons suivre pendant 60 jours ou 70 jours l’effet de l’injection de molécules susceptibles d’induire une arthrite sur des souris de 2 fonds génétiques. Nous utiliserons 30 souris par groupe pour pouvoir faire une analyse statistique. Nous allons tester 6 groupes de 30 souris pour chacun des 2 fonds génétiques. Le nombre total de souris sera de 360.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans une plateforme de gestion et d'acquisition du matériel d'animalerie pour les équipes de recherche. Chaque cage sera pourvue d’un enrichissement (nids, lanières et frisure papier) pour améliorer l’habitat des souris pendant le protocole. Le bien être des souris sera évalué par le responsable du projet et les zootechniciens quotidiennement pour suivre l’apparition d’arthrite. Une mesure systématique du gonflement des pattes sera faite à l’aide d’un pied à coulisse sur la souris. Un score de gravité sera attribué en fonction de l’inflammation et/ou de la déformation de chaque doigt et paume de l’animal. Les signes de souffrance seront aussi chiffrés de manière hebdomadaire dans une grille de score. De la nourriture et de l’eau gélifiée seront mis à disposition dans la cage si les souris montrent des difficultés à atteindre la nourriture et le biberon d’eau positionnés en haut de la cage. En cas d’atteinte des points critiques, la souris sera immédiatement retirée de l’étude et euthanasiée. Une anesthésie gazeuse sera réalisée pour les prélèvements de sang dans la veine mandibulaire. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole.
Choix des espèces
Nous allons choisir des souris qui ont des fonds génétiques à risque de développer une arthrite. Chez l’homme, les deux allèles HLA-DR qu’il exprime déterminent le risque pour un individu de développer une polyarthrite. C’est la raison pour laquelle nous souhaitons développer un modèle chez des souris BL6 qui expriment HLA-DRB1*04:01, allèle de susceptibilité à la polyarthrite ou des souris C3H dont les molécules H-2 ressemblent à HLA-DRB1*04:01. Des souris adultes âgées de 7 semaines d’un poids moyen de 25g seront testées dans un modèle murin de la polyarthrite rhumatoïde. Ce modèle tente de reproduire la polyarthrite et cette maladie touche plus fréquemment les adultes.
Traitement de la décompensation aigue de l’insuffisance cardiaque chronique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
388 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une partie subit une ligature chirurgicale d'une artère du cœur pour provoquer un infarctus, geste dont le porteur attend une mortalité de 20 à 30 %, suivie d'un gavage salé pour déclencher une décompensation cardiaque puis d'un cathétérisme qui sert de mise à mort. L'objet est de tester trois molécules sur l'insuffisance cardiaque aiguë décompensée, qui n'a pas de traitement. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit cette pathologie multifactorielle.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque aiguë décompensée (ICAD) représente un challenge thérapeutique majeur puisque, à ce jour, il n'existe pas de traitement. Notre hypothèse est que l'altération du métabolisme énergétique du cœur contribue à aggraver la dysfonction cardiaque menant à l’ICAD. En utilisant un modèle expérimental d’ICAD chez le rat, nous allons déterminer si des traitements pharmacologiques améliorant le métabolisme énergétique cardiaque préviennent la dysfonction cardiaque liée à l'ICAD. Ce projet, en ciblant le métabolisme énergétique cardiaque au cours de l'ICAD, permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués avec l’objectif de développer de nouvelles stratégies pharmacologiques pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients.
Bénéfices attendus
L'insuffisance cardiaque chronique est une maladie sévère touchant en Europe environ 6.5 millions de patients. Malgré les traitements actuels, l'insuffisance cardiaque chronique reste la première cause de mortalité parmi les maladies cardiovasculaires en France avec 32 000 morts prématurées chaque année. Cette morbi-mortalité élevée est due au fait que les traitements actuels n’empêchent pas la complication majeure de l'insuffiance cardiaque chronique : la décompensation aiguë. Cette dernière représente un challenge thérapeutique majeur puisque les traitements actuels de l’insuffiance cardique sont inefficaces sur celle-ci. Notre hypothèse est que l’altération du métabolisme énergétique cardiaque est un élément déclencheur de la dysfonction cardiaque lors de la décompensation aiguë de l'insuffisance cardiaque. Le but ultime de cette recherche est de démontrer que des traitements visant l’amélioration du métabolisme énergétique cardiaque pourrait donc constituer une nouvelle cible dans la décompensation aigue de l’insuffisance cardiaque. Nous espérons que cette recherche permettra la mise en place d’une nouvelle classe de traitements permettant de limiter le développement de la décompensation aiguë de l’insuffisance cardiaque chez des patients.
Procédures
Les animaux Wistar de la procédure 1 subiront une procédure chirurgicale (ligature coronaire) pour induire un infarctus du myocarde (n=258 ). Des prélèvements sanguins seront effectués une fois par mois sur tous les animaux de la procédure 1 et 2 sous-anesthésie gazeuse (isoflurane 2 %) de courte durée. Sur les rats survivants de la procédure 1 et les rats ZSF-1, un gavage en NaCl permettra d'induire la décompensation aigue. A ce moment, sera initié des traitements innovants (3 molécules) qui serons sans la nouriture donc voie peros et l'analyse des effets fonctionnels (IRM et échocardiographie cardiaque) sera effectué sous anesthésie pour une durée de 10 minutes/rat. La fonction rénale sera évaluée sous anesthésie gazeuse de 10 minutes/rat maximum pour l'injection du traceur fluorescent suivie d'un test à l'effort (durée 20 minutes) qui sera effectué dans la procédure 1 et 2 sur les animaux vigiles. Le protocole invasif (cathétérisme cardiaque) sera réalise sur des animaux profondément anethésiés et sera sans réveil.
Impact sur les animaux
La première procédure est classée sévère et la deuxième est classée modérée. Les deux procédures mènent à une insuffisance cardiaque. La première procédure est réalisée par une chirurgie cardiaque et la deuxième est induite génétiquement. La chirurgie dans la procédure 1 qui est une ligature coronaire entraine un taux de mortalité de 20% à 48h suivant la chirurgie et au court des 3 mois après ligature peut entrainer une mortalité de 20 à 30%. Il faut aussi tenir en compte que la mortalité après la décompensation par le NaCl dans nos deux modèles peut entraine une mortalité de 10%. Comme décrit dans la littérature la ligature coronaire est une chirurgie qui entraine un taux de mortalité important même avec une maitrise du geste donc pour un nombre attendu de 15 animaux dans chaque sous-groupe nous prenons en compte un pourcentage de mortalité de 30%, comme référer dans la littérature . Les naissances des tests d'effort sont une fatigue de l'animal qui est évalué par des chocs électriques, mais tout cela est prise en compte avec une fiche procédure qui d'écrit les points limite du test. Arrêt du test à l'effort au bout de 3 chocs électriques en 30 secondes ou de 5 chocs électrique en 1 minute. On replace l'animal dans sa cage une fois le test fini ou les points limite définie dans le protocole dépasser. Pour le cathétérisme cardiaque, l'animal subira une chirurgie pour insertion d'un capteur de pression dans la carotide pour obtenir les pressions volume au niveau du cœur du rat, chaque animal sera mise à mort à la fin du test. Il se peut que l'animal décède lors du test ce cathétérisme cardiaque.
Devenir
Pour les deux procédures tous les animaux seront mis à mort suite à l'évaluation invasive par cathétérisme cardique.
Remplacement
Dans l’objectif de limiter le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous mettrons en place certaines expériences in-vitro (tests de prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant, l’utilisation des animaux est rendue nécessaire, car il n’existe pas à ce jour de modèle de décompensation aiguë de l’insuffisance cardiaque in-vitro. Cela n'est pas possible d'appliquer des modèles alternatif puisque le développement de la dysfonction est multifactoriel et aucun approche in silico, in-vitro ou ex vivo ne permet l'implication de tout, c'est facteur dans le développement pour l'étude de ce type de médicament avec une visée cardiovasculaire.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque par échographie, IRM, de la fonction rénale, de la capacité d'exercice puis une mesure invasive hémodynamique. A la phase terminale nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avllons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats nécessaires afin de détecter une différence de 10% . Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie. Notamment, l’analyse répétée en échocardiographie / IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Une meilleure survie post-opératoire permet de limiter le nombre d'animaux par groupe dans le modèle d'infractus du myocarde. Les données et prélèvements obtenus des animaux témoins sains et des contrôles (infarctus du myocarde par ligature coronaire sans gavage au NaCl) seront réutilisés entre études pour limiter le nombre d'animaux. Nous allons d'abord évaluer les effets a court termegavage au NaCl, avec un mise à mort pour le groupe 1 à J3 et pour le groupe 2 et 3 à J14.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel,Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement controlé et stabilisé. Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Les rats perdant plus de 15 à 20% de leur poids seront euthanasiés. Pendant la chirugie, nous injectons une solution saline en sous- cûtanée pour maintenir l'hydratation de nos animaux. En post- opératoire une injection de glucose à 5% en IP est réalisée en ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Un traitement analgésique en pré-opératoire et en pré et post-opératoire, soit immédiatement après la chirurgie est réalisé suivi d'une injection toutes les 8h pendant 24h qui suivent l’opération. Nous allons dans ce projet utiliser essentiellement des rats mâles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.
Choix des espèces
Les expériences, in vivo, ne peuvent pas être remplacées par des études in-vitro à cause de la complexité de la pathogenèse de l’insuffisance cardiaque, qui nécessite des études fonctionnelles et physiopathologiques. En effet, des études dans notre modèle animal sont nécessaires pour comprendre les altérations globales cardiaques lors de la décompensation cardiaque (altérations simultanées des lymphatiques, des cellules immunitaires, des fibroblastes et du métabolisme des cardiomyocytes). Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les rats mâles Wistar jeunes adultes (200-220g) seront utilisés pour induire l'infarctus du myocarde. Cet âge est justifié par la meilleure résistance des animaux à la procédure de ligature coronaire permettant de ne pas augmenter le nombre d'animaux utilisés. Les Rats mâles ZSF-1 jeunes adultes arriveront à l'âge de 6 semaines pour une question de coût, mais seront utilisés à l'age de 24 semaines pour que la maladie cardiaque ait le temps de se développer.
Rôle de CD44 sur les fonctions des cellules immunitaires au cours des complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 464 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la souffrance va du modéré au sévère, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Génétiquement modifiées, elles reçoivent un régime gras ou alcoolisé, des injections de CCl4 pour induire une fibrose du foie, des prélèvements sanguins et un gavage. Le porteur indique que la défaillance hépatique peut provoquer une perte de poids de plus de 20 %, seuil qui déclenche la mise à mort. Il affirme devoir étudier la protéine CD44 dans un "organisme entier", aucune approche in vitro ne tenant compte des interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation chronique joue un rôle crucial dans le développement de ces maladies. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires et ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans des organes comme le tissu adipeux et l’intestin qui participent au développement des complications hépatiques. En particulier, dans ces maladies du foie, les fonctions de l’intestin sont dégradées et ceci contribue à l’activation des cellules immunitaires hépatiques. Notre objectif est comprendre comment ces cellules contribuent au développement des maladies du foie. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef impliquée dans la régulation des fonctions des cellules immunitaires et dans la progression des maladies chroniques du foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas cette protéine au sein de certaines cellules immunitaires et soumis à un régime alimentaire favorisant l’apparition des complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider in vivo le rôle de notre protéine d'intérêt dans le contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et d’autre part de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront soumis à un prélèvement sanguin en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine pendant 6 semaines. Une mise à jeun sera effectuée durant l'expérimentation d'une durée maximale de 4h ainsi qu'une seule administration orale de notre composé à l'aide d'une sonde gastrique.
Impact sur les animaux
Le présent projet comporte des contentions, injections intrapéritonéales et prises de sang à la queue qui sont des gestes induisant un léger inconfort ou une légère douleur chez les animaux. Comme conseillé dans la revue laboratory animals, le CCl4 sera administré par voie intra péritonéale (vs inhalation) avec alternance du point d’injection. Ce traitement est associé au développement de la fibrose hépatique sans perte de poids ni développement d’ascite ni trouble digestif attendus. Potentiellement, la conséquence la plus grave que les animaux pourraient subir serait une défaillance des fonctions du foie entrainant une difficulté pour s'alimenter et donc une perte de poids brutale de plus de 20% par rapport à la dernière pesée. Cependant, d'après nos expériences passées ainsi que celles de nos collaborateurs, ceci arrive rarement. Si une perte de poids supérieure à 10% par rapport à la pesée précédente est observée mais sans signe de souffrance (dos voûté, poil non entretenu, indifférence au milieu extérieur…), l’animal sera surveillé et repesé tous les 2 jours. Les animaux auront à disposition dans la cage des croquettes ainsi qu'un boudin de réhydratation. Si aucune reprise de poids la semaine suivante, il sera mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin d'analyser la réponse immunitaire au sein des organes d'intérêt.
Remplacement
Le but de ce projet est d'étudier le rôle de la protéine CD44 dans les fonctions des cellules immunitaires impliquées dans divers aspects de la physiopathologie des NAFLD et ALD, notamment dans la stéatose, l'inflammation, les lésions hépatocellulaires, la fibrogénèse et l’hépatocarcinogénèse. Les études in vitro ne tiennent pas compte de l'environnement nutritionnel et métabolique ou encore des interactions entre différents types cellulaires ou entre organes. Il nous est donc nécessaire d'étudier le rôle de cette protéine dans un organisme entier.
Réduction
Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de l'expérimentation permettra de limiter la sévérité de celles-ci. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir suffisamment de tissu biologique d'intérêt pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD sera effectuée à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour les procédures 2, 3, 4 et 7(souris mâles ou femelles), la mise sous régime alcool sera effectuée à environ 12-13 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 20g. Pour la procédure 5 (souris mâles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour la procédure 6 (souris mâles et femelles), l’isolation des cellules sera effectuée sur des souris adultes à partir de 7-8 semaines d’âge.
Validation de l’efficacité in vivo de molécules anti-tumorales dans des modèles syngéniques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
252 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales dans le pancréas, puis des injections trois fois par semaine pendant quatre semaines, pour tester des molécules contre le cancer du pancréas. Le porteur décrit des signes possibles comme la cyphose, la prostration, la perte de poids ou l'automutilation, les souris atteignant un score de souffrance élevé étant mises à mort. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" pour prouver un effet antitumoral dans un modèle "proche de l'être humain".
Objectifs
Le cancer du pancréas est une tumeur maligne très grave. Actuellement, il n'existe aucun traitement efficace, et cela constitue une urgence pour la recherche. Dans nos efforts pour lutter contre cette maladie, notre équipe de recherche a réussi à identifier une voie de signalisation qui conduit à l'expression de gènes pro-inflammatoires. En conséquence, nous avons développé des molécules qui interviennent dans cette voie de signalisation et qui se sont révélées très efficaces sur plusieurs organoïdes dérivés de patients. Les résultats prometteurs obtenus in vitro montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire.
Bénéfices attendus
Dans le cadre de ce projet, nous avons l'objectif d'évaluer si les molecules, sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal. Notre objectif final est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre des essais précliniques.
Procédures
Après une semaine de l'injection initiale de cellules tumorales par voie intrapancréatique, l'intervention durera environ 5minutes. Aprés, les animaux seront traités 3 fois par semaine par une injection intrapéritonéale d'une solution à l'aide d'une seringue pendant 4 semaines. L'intervention durera environ 20 à 30 secondes. Deux fois par semaine, la taille des tumeurs sera mesurée à l'aide d'un échographe. Cette intervention de mesure prendra environ 20 à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Nous pourrions observer un certain inconfort ou des lésions après l'injection des cellules tumorales. Des signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, diminution du poids de l’animal, automutilation, vocalises. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris dues à cette procédure, les injections répétées pourraient générer des lésions cutanées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus pour différents analyses.
Remplacement
Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que les composés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.
Réduction
Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 126 individus par modele celullaire (2 modeles: 4 groupes de 8 souris pour chaque somposé, 8 souris contrôle pour touts les composés, et 6 souris de plus au cas où certaines souris ne développeraient pas de tumeur) conformément à la règle de réduction. Le nombre de souris de chaque groupe a ete calculé avec Biosta TGV, avec un risque alpha de 5 % (valeur normale pour un paramètre) et une force statistique de 85%.
Raffinement
Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection des cellules intrapancréatiques pour le modèle d'allogreffes, celles-ci seront réalisées sous anesthésie et analgésie, et le gel échographique ainsi que la solution seront chauffés avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux. Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort.
Choix des espèces
Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’humain pour sa physiopathologie de tumeur cancéreuse (utilisation de souris développant un adénocarcinome pancréatique). Le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les animaux seront âgées de 4 semaines au moment de leur réception afin d’obtenir des souris adultes et en pleine forme (poids supérieur à 20g) au moment de commencer l’expérimentation. En effet, nous prévoyons une période d’acclimatation de 7 jours minimum après réception avant d’inoculer les cellules puis encore 1 à 2 semaines d’attente pour obtenir une tumeur visible par échographie. Le traitement commencera alors sur des souris âgées entre 7 et 8 semaines.
Evaluation des effets anti-allodyniques ou anti-hyperalgésiques d’une ou plusieurs molécules dans différents modèles de douleur associés à différents tests chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
3770 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 800 d'entre elles étant réutilisées pour de la formation et les autres tuées. Différents modèles de douleur inflammatoire, post-opératoire et neuropathique leur sont induits, avec stimulations douloureuses thermiques ou mécaniques des pattes, mise à jeun et prélèvements de sang, pour tester environ 80 candidats-médicaments analgésiques. Le porteur indique que les animaux des procédures sévères ne peuvent être réutilisés à cause de la douleur persistante et sont mis à mort. Il affirme que l'efficacité d'un analgésique ne peut être démontrée que chez l'animal vigile, la douleur associant une composante sensorielle et émotionnelle.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur (inflammatoire, post-opératoire, neuropathique) chez la souris et pour différent type de douleurs (mécanique, aigue, chronique). L’objectif de ce projet est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisés en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus (80 composés estimés). Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication de résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Cela peut se traduire par des crampes, le léchage de la patte douloureuse, une patte qui se recroqueville plus ou moins, une mauvaise cicatrisation/infection de la plaie. De plus selon les tests, les animaux sont soumis à la contention, isolés dans des compartiments (durée de 3minutes à maximum 2h30 selon le test) et une stimulation douloureuse thermique ou mécanique des pattes arrière est réalisée (durée de 1minute à 1.5 minutes selon le test). Les tests peuvent être réalisés sur plusieurs jours et peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans limite de 6 points de mesures. Les animaux pourront subir des nuisances liées à l’administrations de composés (durée de quelques secondes à 3 minutes maximum). Ils pourront être réalisés une seule fois ou plusieurs fois par jour. Les administrations répétées peuvent causer des lésions superficielles. Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé. Les prélèvements durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5 minutes.
Impact sur les animaux
Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne l’apparition de symptômes douloureux. Cela peut se traduire par des crampes, le léchage de la patte douloureuse, une patte qui se recroqueville plus ou moins, une mauvaise cicatrisation/infection de la plaie. Ces nuisances sont modérées à sévères. Pour une procédure , les animaux subissent une mise à jeun d’une durée maximale de 20h (nuisance modérée). Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal (nuisances légères < 1minute). Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (nuisance légère
Devenir
Les animaux des procédures sévères sont mis à morts, ils ne peuvent être ni replacés ni réutilisés à cause de la douleur persistante liée à leur pathologie. De plus, certains tests peuvent induire des douleurs intenses a posteriori. Enfin bien que les animaux ne présentent plus d’effets post-test, nous ne connaissons pas les impacts potentiels que les administrations de composés en systémique ou non ont pu réaliser. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. C’est pourquoi, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité. Dans le cas de certaines procédures les animaux ne présentant pas de signe de souffrance pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple).
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme
Réduction
Ces modèles sont couramment mis en place au sein de notre structure. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclut ou limiter à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse par nos clients. En fonction du design de chaque étude des analyses statistiques seront réalisées.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en plastique rouge, briquettes en bois, sizzle nest) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Les animaux sont hébergés par groupes sociaux de 3 à 8 ou 10 souris (selon le poids final attendu) dans des cages de dimensions appropriées selon la directive 2010-63. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimulus plus douloureux que nécessaire. Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant/le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers. Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés sont âgés d’environ 5 semaines au début de toutes les procédures. Ce stade a été choisi car il est adapté au développement des modèles, il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Production d’ascite de souris en vue de l’obtention d’anticorps monoclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Tests réglementaires
12 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce sont des femelles âgées réformées de l'élevage, qui reçoivent une injection de pristane provoquant une inflammation douloureuse du péritoine, puis un hybridome, pour produire un liquide d'ascite riche en anticorps destinés à des tests de diagnostic du D-Dimère. Le porteur indique que les animaux ne restent que 24 heures en état ascitique avant mise à mort et prélèvement. Il affirme que 83 pour cent des anticorps ont été transposés in vitro mais qu'un clone doit encore être produit sur souris, en invoquant aussi la "souveraineté nationale".
Objectifs
Le D-Dimère est un marqueur biologique de la formation et de la dégradation de la Fibrine, qui peut être mesuré sur sang total ou dans le plasma. Le D-Dimère a été largement étudié pour le diagnostic de la maladie thromboembolique veineuse (VTE), et est utilisé en routine pour cette indication. Il a également été évalué pour déterminer la durée optimale du traitement anticoagulant chez les patients souffrant de VTE, pour le diagnostic et le suivi de la CIVD (Coagulation lntraVasculaire Disséminée), ainsi que pour l'identification des patients à haut risque de VTE. Donc, la quantification du taux en D-Dimères joue un rôle important dans les décisions thérapeutiques. En France grâce à ces tests, ce sont près de 50000 à 100000 cas de phlébite qui peuvent être dépistés et traités par an. Plus récemment, il a été démontré que les patients infectés par la COVID-19, et présentant une forme grave de la maladie, présentaient un état de profonde inflammation conduisant à des taux élevés de complications thrombotiques comme la Thrombose Veineuse Profonde (DVT), l'Embolie Pulmonaire (PE), et la thrombose microvasculaire. Le marqueur le plus typique chez les patients avec COVID-19 et coagulopathie est une élévation de la concentration en D-Dimères. Ces trousses de diagnostics sont des kits I.V.D (In Vitro Diagnostic) enregistrés officiellement et marqués CE sous la réglementation « ISO 9001-2008 » et « 13485 ». Certains sont également FDA Approved. Les clones ont été développés et sélectionnés pour leurs spécificités et leurs rendements il y a plus de 25 ans. Suite à la demande des autorités de favoriser d’autres techniques de production, des démarches ont été entamées depuis 2007, pour le transfert des productions d’anticorps en culture « in vitro » et limiter ainsi le recours à l’utilisation de murins. A ce jour 83% des spécificités ont été transposées et 14 % sont en cours de transpositions. Seul 3 % des spécificités sont transposées partiellement. Des investigations et des essais sont toujours en cours afin de parvenir à produire l’ensemble des anticorps monoclonaux "in vitro" avec pour objectif qu’en 2030 l’ensemble soient produits in vitro. Aujourd’hui un clone doit encore être produit par la technique des ascites. Dans l’attente de la validation de ces productions in vitro, la production d’anticorps sur ascite de souris doit se poursuivre afin de ne pas créer une pénurie de kits de dépistage de certaines pathologies.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la production d’une quantité suffisante d’ascite à une concentration importante d’anticorps monoclonaux, de qualité, afin de pourvoir les quantités nécessaires à la confection des kits de dépistage des pathologies recherchées, et ce afin de limiter le nombre de souris utilisées. La quantité d’anticorps (Ac) produite par une seule souris permet de réaliser plus de 1400 dosages de D-Dimères et permet donc potentiellement de sauver autant de vies humaines.
Procédures
2 inoculation sous cutanée de buprénorphine sur animal vigile : 5 sec/animal Inoculation intrapéritonéale de pristane sur animal vigile : 2.5 sec/animal Inoculation hybridome sur animal vigile : 2.5 sec/animal Aucun prélèvement sur animal vigile
Impact sur les animaux
Aujourd’hui la production de ces anticorps sur ascite de souris, est réalisé ans des établissements européens et français selon le protocole préconisé par la CNREEA. L’injection d’adjuvant de type pristane (huile) provoque une inflammation du péritoine et active le système immunitaire. Cette inflammation est douloureuse dans les premières heures après l’injection. Afin de diminuer cette douleur et pour que l’animal récupère plus rapidement, une injection de buprénorphine (agoniste morphinique) préalable à celle du pristane est réalisée. La demi-vie de la buprénorphine c’est-à-dire son temps d’efficacité est de 4 à 6 heures. Les animaux sont donc observés et reçoivent une seconde injection de buprénorphine 4 heures après la première. Cela permet aux souris une meilleure récupération et diminue également le taux de mortalité.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort avant le prélèvement.
Remplacement
Suite à la demande des autorités de favoriser d’autres techniques de production, des démarches ont été entamées depuis 2007, pour le transfert des productions d’anticorps en culture « in vitro » et limiter ainsi le recours à l’utilisation de murins. A ce jour 83% des spécificités ont été transposées et 14 % sont en cours de transpositions. Seul 3 % des spécificités sont transposées partiellement. Malheureusement, la production en bioréacteur pour les différents clones, dont cette DAP fait objet, a modifié certaines caractéristiques de l'anticorps pour un clone et ne permet pas, à ce jour, de valider l'équivalence entre l'anticorps monoclonal "in vitro" et l'anticorps monoclonal "in vivo". Cette perte de qualité n’est pas acceptable ni autorisée par les autorités compétentes en raison du marquage CE et de la finalité diagnostic des produits. Des investigations et des essais sont toujours en cours afin de parvenir à produire l’ensemble des anticorps monoclonaux "in vitro" avec pour objectif qu’en 2030 l’ensemble soient produits in vitro. Aujourd’hui un clone doit encore être produit par la technique des ascites. Dans l’attente de la validation de ces productions in vitro, la production d’anticorps sur ascite de souris doit se poursuivre afin de ne pas créer une pénurie de kits de dépistage de certaines pathologies. Ces productions sont également réalisées dans des pays hors Union européenne, capables de produire la totalité des volumes nécessaires qui pourraient ainsi faire perdre en partie la souveraineté nationale et européenne ainsi que le contrôle du bien-être animal propre à la CNREEA.
Réduction
Le clone de cellules est sélectionné afin d’obtenir un volume d’ascite important à une concentration importante en anticorps dans le but de limiter le nombre de souris. La quantité d’ascite produite est en moyenne de 2.8mL/souris. Les animaux utilisés sont des souris anciennes qui ont un poids plus important et une productivité supérieure (multipliée par 2) par rapport aux souris jeunes adultes.
Raffinement
Les souris sont hébergées sur un lit de sciure avec des enrichissements de type lanières de cartons et tunnels afin qu’elles puissent se cacher, créer un nid afin de répondre à leurs besoins physiologiques. Elles sont soignées quotidiennement dans des conditions conformes à la réglementation A tout moment l’opérateur peut décider de l’arrêt du protocole s’il juge que l’animal est en détresse. Pour diminuer la douleur liée à l’inflammation provoquer par l’adjuvant, une injection de buprénorphine (agoniste morphinique) est effectuée avant et après l’adjuvant. La demi-vie de la buprénorphine c’est-à-dire son temps d’efficacité est de 4 à 6 heures. Cela permet aux souris une meilleure récupération et diminue également le taux de mortalité. La raison de l’utilisation de la buprénorphine est bibliographique. En effet il s’agit de l’anti-douleur préconisé dans cette production. Plusieurs essais d’optimisations ont été apportées : - Essais avec des AINS (Anti-inflammatoire Non Stéroïdien) n’ont pas été concluants et n’ont pas montrés une amélioration significative de l’état de l’animal car ce qui est recherché par l’injection de l’adjuvant, est une inflammation du péritoine et une activation du système immunitaire de manière à obtenir une grande quantité d’anticorps. - Essais menés pour éviter la manipulation et l’injection de buprénorphine aux souris : des gels aromatisés contenant un morphinique ont été placés dans la cage des souris ou dans l’eau des biberons. Ces deux essais n’ont pas été concluants car ils ne garantissaient pas que toutes les souris étaient correctement traitées avec l’anti-douleur : certaines étant sous-dosées et d’autres à l’inverse sur-dosées. Les souris sont mirées quotidiennement. Dès lors qu’une réaction est détectée par mirage de l’abdomen l’ascite de la souris est prélevée sur animal mort. Cette façon d’opérer permet aux animaux de ne rester que 24 heures en état ascitique et limiter la mortalité du fait d’une production exponentielle d’ascite. Des points limites prédictifs sont mis en place suivant une grille de scoring.
Choix des espèces
La souris est l’animal idéal pour la production d'anticorps monoclonaux et est, de ce fait, l'animal le plus utilisé. La souche utilisée est la lignée de souris consanguine BALBc, sur laquelle ont été développés tous les essais liés aux techniques d’obtention d’anticorps monoclonaux . Cette lignée permet d’obtenir un volume plus important d’ascite avec une concentration en anticorps supérieurs aux autres souches de souris. Ce sont des souris qui ont un poids plus important et une productivité supérieure (multipliée par 2) par rapport aux souris jeunes adultes. Elle produit des volumes satisfaisants d’antisérum présentant un titre élevé et une forte affinité vis à vis de l'antigène injecté. La quantité d’anticorps (Ac) produite par une seule souris permet de réaliser plus de 1400 dosages D-Dimères et permet donc potentiellement de sauver autant de vies humaines. Les animaux utilisés sont des souris BALBc femelles, anciennes reproductrices réformées chez l’éleveur. Ce sont des souris qui ont un poids plus important et une productivité supérieure( multiplié par 2) par rapport aux souris jeunes adultes.
Etude sur modèle murin du rôle des cosmétiques capillaires contenant du glycolate ou du glyoxylate dans l’apparition de la néphropathie oxalique
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système urogénital
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une crème lissante capillaire contenant du glycolate est appliquée sur leur pelage pendant 24 heures, avec port d'une collerette et gavage, pour vérifier si ces cosmétiques provoquent une insuffisance rénale par précipitation de cristaux. Le porteur indique un risque d'insuffisance rénale sévère, objet même de l'étude, avant mise à mort pour analyse des tissus. Il affirme que l'usage d'un "organisme vivant dans son ensemble" est "indispensable" pour tester l'effet cutané sur les reins.
Objectifs
L'insuffisance rénale aigue est une situation grave dans laquelle la fonction rénale est altérée et met en jeu le pronostic vital des patients. De nombreuses causes peuvent être retrouvées, parmi lesquelles des maladies rénales causées par la précipitation de cristaux: les néphropathies cristallines. Parmi ces maladies, les néphropathies dites oxaliques sont des maladies sévères avec un pronostic de récupération très sombre. Ces maladies ont comme déterminant commun la précipitation intra-rénale de cristaux d'oxalate de calcium. Elles peuvent être dûes à des maladies génétiques monogéniques (hyperoxalurie primaire) ou encore à des intoxications par de l'éthylène glycol. Très récemment, une équipe israélienne a rapporté la survenue de néphropathie oxalique chez des jeunes femmes dont le seul déterminant commun était l'application de crème lissante sur les cheveux à répétition. Hors, ces préparations contiennent de fortes doses de glycolate, le précurseur naturel de l'oxalate (le glycolate est transformé dans le foie en oxalate et libéré sous cette forme). Toutefois, les auteurs de cette étude n'ont pas pu apporter de preuve expérimentale de la toxicité de ce cosmétique, qui reste utilisé par de nombreuses personnes. Cete série de patiente concernait 26 patientes jeunes atteintes d'insuffisance rénale sévère, dont peu ont récupéré une fonction rénale normale. Récemment un cas similaire a été observé en France, la crême lissante utilisée a pu être récupérée. L'objectif de ce travail est de déterminer si les crèmes lissantes contenant du glycolate (notamment celle utilisée par la patiente française) sont effectivement responsables de la survenue de néphropathie oxalique dans un modèle murin. Si cela devait se confirmer, une alerte de pharmacovigilance sera lancée et le retrait d'un certain nombre de ces produits sera probablement envisagé.
Bénéfices attendus
Démonstration expérimentale du lien direct entre l'application de crème lissante capillaire et la survenue d'une insuffisance rénale aigue cristalline permettant de documenter le risque associé à cette pratique. Si cela devait se confirmer, une alerte de pharmacovigilance sera lancée et le retrait d'un certain nombre de ces produits sera probablement envisagé.
Procédures
La procédure consistera simplement à appliquer des crèmes lissantes le plus rapidement possible sur l'animal afin de ne pas induire de stress (2 minutes maximum). La souris sera exposée 24h à ce produit. Le prélèvement de "spots urinaires" le soir de l'application de la crème, et le lendemain de l'application de la crème (J1) Le spot urinaire: Il s'agit d'une miction spontanée de la souris. Un léger massage abdominal est appliqué pour favoriser la miction cette sera de courte durée 30 secondes environ . le gavage à l'aide d'une sonde appropriée pour souris ce geste sera court d'environ 30 secondes . La méthode d'euthanasie réglementaire sera éffectuée à la suite du prélèvement sanguin toujours sous anesthésie .
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet les animaux seront exposés à différentes crèmes qui seront appliquées sur le pelage sur animal vigile .Afin d'éviter toute digestion par léchage les animaux seront isolés durant une courte durée et disposent d'une collerette qui pourrait être source d'un stress de courte durée 30 minutes .Certains animaux receverons également un traitement par gavage impliquant une contention et l'introduction d'une sonde gastrique qui peut être source de stress et d'une sensation désagréable pour l' animal mais de courte durée (30 secondes ).Enfin il y a un risque de survenue d'une insuffisance rénale sévère consécutive à l'exposition aux crèmes ceci fait l'objet de cette étude .
Devenir
Euthanasie à la fin de la procédure pour procéder à l'analyse histologique et moléculaire des différents tissus.Tous les animaux de la procédure .
Remplacement
L'utilisation d'un organisme vivant dans son ensemble est ici indispensable, car il faut déposer le toxique supposé sur la peau pour tester son effet sur les reins .Ceci ne peut etre réalisé que sur des modèles animaux en l'état actuel des choses. Les modèles murins sont particulièrement appropriés pour le développement de modèles de néphropathie oxalique. Cette étude ne peut pas être réalisée sur des cellules ou des organoïdes.
Réduction
Des lots d'animaux suffisamment grands sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences de la toxicité entre les groupes d'animaux. Les tests statistiques adéquats seront ensuite utilisés pour comparer les 6 groupes entre eux.Au total pour ce projet 120 souris.
Raffinement
Le bien être animal est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose ,des dômes seront ajouté dans les cages afin que les animaux puissent se cacher et grignoter celui-ci pour confectionner un nid. Les animaux seront hébergés en portoir ventilés avec une acclimatation de 8 jours avant la procédure. Le personnel est formé spécifiquement dans le domaine avec une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur.l'exposition aux disfférentes crèmes sont de courte durée l'anesthésie et l'analgésie seront pratiquées pour le prélèvement sanguin terminal ,les points limites seront respectés pendant la durée du protocole .
Choix des espèces
L'utilisation d'un organisme vivant dans son ensemble est ici indispensable, car il faut déposer le toxique supposé sur la peau pour tester son effet sur les reins. Ceci ne peut être réalisé que sur des modèles animaux en l'état actuel des choses. La souris est un modèle de petite taille ,d'hébergement et pour lequel nous disposons de toutes les techniques d'analyses des résultas. Les souris seront utilisées à l'âge de 8 à 9 seamines correspondant au moment le plus propice à la précipitation de cristaux dans l'arbre urinaire.
Evaluation du rôle des intégrines β1 et β3 plaquettaires dans les saignements inflammatoires (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent selon les groupes une inflammation cutanée, pulmonaire ou cérébrale, ce dernier modèle incluant une chirurgie du cou pour provoquer un AVC, avec prélèvements de sang, injections et pose de cathéter à la queue. Le porteur indique une détresse respiratoire possible et des difficultés motrices et alimentaires liées à l'AVC, les animaux étant mis à mort sous anesthésie pour quantifier les saignements. Il affirme que le rôle des intégrines plaquettaires ne peut être étudié sans le métabolisme entier de la souris.
Objectifs
L’arrêt des saignements implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion du vaisseau, adhèrent, s’activent et agrègent pour former le clou plaquettaire qui limite le saignement. Il a été mis en évidence que les plaquettes jouent un rôle particulièrement important également dans l’arrêt des saignements en conditions inflammatoires. En effet, l’inflammation induit un recrutement des neutrophiles qui traversent la paroi vasculaire entrainant la formation de brèches vasculaires. Les plaquettes jouent alors leur rôle et colmatent les brèches. Cependant, les mécanismes impliquant les plaquettes dans ce processus restent encore peu compris à ce jour. Ce projet vise donc à évaluer l’importance d’une famille de récepteurs présents à la surface des plaquettes, les intégrines β1 et β3, dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension des mécanismes impliquant les plaquettes dans l’arrêt des saignements inflammatoires, ce qui à terme pourrait conduire à une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Pour l’inflammation cutanée, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à des injections intradermiques et rétro-orbitales et à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h). Pour l’inflammation pulmonaire, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h) et à une inoculation intranasale. Pour l’inflammation cérébrale, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à des injections rétro-orbitales, à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h), à une chirurgie au niveau du cou qui permettra d’induire un AVC (maximum 30min) et à une imagerie IRM (maximum 1h).
Impact sur les animaux
Un effet indésirable attendu est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire, un saignement au niveau du point de prélèvement ou d’injection. De plus, une inflammation locale sera observée. Dans le modèle pulmonaire, on pourra observer une surcharge de liquide dans les poumons conduisant à une détresse respiratoire légère à modérée. Pour le modèle d’AVC, on s’attend à des douleurs suite à la chirurgie, à des difficultés motrices et pour s’alimenter dues aux manifestations de l’AVC.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux encore anesthésiés sont mis à mort afin de prélever et quantifier les saignements dans les tissus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’importance d’une famille de récepteurs présents à la surface des plaquettes, les intégrines β1 et β3, dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire. Ce processus fait intervenir de multiples types cellulaires (plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales), il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par d’autres méthodes du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus complet.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 10 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison de moyennes des résultats obtenus pour chaque groupe d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie et analgésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures • Par utilisation de gel ophtalmique pour protéger les yeux de l’animal sous anesthésie • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Par l’application d’une goutte de tétracaïne sur l’œil après les injections retro-orbitale pour réduire la douleur au réveil. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
Ce travail s’appuie sur des travaux effectués sur la souris démontrant le rôle primordial des plaquettes dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire. Afin de pouvoir comparer nos résultats avec ceux publiés, il est nécessaire de réaliser ce modèle dans la même espèce animale. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Étude du rôle des macrophages dans le développement du cancer buccal.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1008 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 541 d'entre elles étant réutilisées et les autres tuées. Elles reçoivent une biopsie de la queue à la naissance, un cancérigène dans l'eau de boisson pendant deux à quatre mois qui provoque des tumeurs de la langue, et un gavage, les tumeurs entraînant des difficultés d'alimentation et une perte de poids. Le porteur indique que les animaux sont mis à mort pour prélever les organes et que les parents reproducteurs sont euthanasiés après six mois. Il affirme que seules des souris génétiquement modifiées permettent d'étudier le rôle des macrophages dans ce cancer.
Objectifs
Le carcinome à cellules squameuses oral (OSCC) est le cancer de la langue le plus courant, touchant principalement les fumeurs, les personnes alcooliques ou porteuses d’un papillomavirus. Malgré sa prévalence, il reste peu étudié en comparaison avec d’autres cancers. Les macrophages sont connus pour s'infiltrer dans divers types de tissus cancéreux, contribuant à la progression tumorale en favorisant l'angiogenèse, la métastase ou le développement d'un environnement immunosuppresseur. A l’inverse, certains sous-types de macrophages vont avoir un rôle antitumoral, notamment aux prémices du développement tumoral. La diversité et les fonctions spécifiques de sous-populations de macrophages lors du développement de l’OSCC sont encore peu claires. En effet, l'hétérogénéité des macrophages et le rôle des différentes populations dans la promotion de la croissance tumorale font encore l'objet de controverses. De plus, la plupart de cette caractérisation reste très superficielle car réalisée chez l'homme. A travers l’utilisation de modèles animaux permettant de supprimer spécifiquement et localement les macrophages de la langue, nous proposons d’étudier leur rôle au cours du développement tumoral de l’OSCC.
Bénéfices attendus
Les cancers de la tête et du cou sont le sixième type de cancer le plus courant. Ils regroupent plusieurs types de cancers qui se développent souvent dans les cellules squameuses tapissant les surfaces muqueuses de la cavité buccale, du pharynx, du larynx ou de la cavité nasale. Toutefois, le cancer de la bouche est le type le plus fréquent des cancers de la tête et du cou, avec environ 377 700 nouveaux cas et 177 700 nouveaux décès signalés chaque année dans le monde. L’OSCC est le cancer de la bouche le plus courant, représentant 90% de tous les cancers buccaux et se trouvant le plus souvent sur la langue. Malgré les traitements disponibles tels que la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, les taux de mortalité et de morbidité restent élevés, avec un taux de survie à 5 ans et après traitement de moins de 50%. De plus, selon l'Observatoire mondial du cancer, l'incidence de l’OSCC devrait augmenter d’au moins 40% d'ici 2040, ce qui en fait une préoccupation majeure de santé actuelle et future. Ce projet va nous permettre de comprendre la dynamique des macrophages dans un cancer encore trop peu étudié, tant chez l'homme que chez la souris. L'utilisation d'un modèle unique va donc nous permettre d'aller plus loin dans la compréhension du rôle des macrophages dans le développement de la maladie, ainsi que des mécanismes moléculaires impliqués, que ce soit au stade précoce ou tardif du développement. À terme, ces données pourraient donc ouvrir la voie à de nouvelles voies thérapeutiques en particulier celles impliquant l’immunomodulation.
Procédures
1008 souris se verront prélever un morceau de queue 7 à 10 jours après leur naissance. 314 souris seront soumises à un traitement avec une molécule cancérigène ajouté à l'eau de boisson pendant des périodes allant de 2 à 4 mois maximum. 84 souris seront traitées avec une molécule cancérigène ajouté à l'eau de boisson pendant 4 mois et seront traitées avec une molécule qui permet à notre modèle murin de fonctionner, à travers un gavage de moins de 10 secondes par voie orale 2 fois à 7 jours d'intervalle.
Impact sur les animaux
- Une biopsie de la queue sera réalisée sur les animaux entre 7 et 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le réseau neuronal de cette partie est encore sous-développé. - L'induction de l'OSCC se fait par la prise d'une molécule cancérigène diluée dans l'eau de boisson pendant une durée maximale de 4 mois. Au fur et à mesure de son développement, ce cancer provoque des lésions sur la langue, entraînant finalement l'apparition de tumeurs. Ces lésions et tumeurs induisent des difficultés d'alimentation, entraînant une perte de poids à la fin du protocole. - L'administration d'une molécule par voie orale à l'aide d'une seringue avec embout flexible), permettant à notre modèle murin peut entraîner un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration, qui dure environ 10 secondes.
Devenir
Après 6 mois d'accouplement, les parents sont euthanasiés. Les bébés sont utilisés pour (i) remplacer les parents, (ii) être utilisés dans ce projet ou être utilisé dans de futures projets. À la fin des procédures, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes.
Remplacement
Les données de la littérature ont montré que chaque type de macrophage exprime un profil d’expression de gènes unique lui permettant de réaliser des fonctions propres à ce sous-type. Ce profil d'expression de gènes est induit par un ensemble de signaux fournis par son microenvironnement direct. Nous anticipons que le développement de la tumeur fournira un nouvel environnement et donc de nouveaux signaux instructifs permettant la différenciation de nouveaux sous-types de macrophages. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre le macrophage et le microenvironnement de la tumeur. Ces interactions sont basées sur le recrutement de cellules circulantes, la présence de macrophages linguaux différenciés avant l’apparition de la tumeur, dont on ne sait pas reproduire le profil in vitro, et un profil évolutif des cellules tumorales au cours du temps qui possèdent également leur propre profil. De plus, les macrophages pourraient également impliqués dans le recrutement ou la communication avec d’autres cellules immunitaires circulantes, dont on ne pourra pas connaître la nature exacte si les expériences in vivo ne sont pas effectuées. Enfin, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique, le niveau de risque acceptable et l'écart de moyennes attendu entre les groupes expérimentaux et contrôles. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour les analyses des données.
Raffinement
De la nourriture en gelée sera ajoutée à chaque cage dès le début du traitement. Des bâtonnets de bois seront également ajoutés pour permettre le limage naturel des dents, qui seront contrôlées de manière hebdomadaire et coupées si nécessaire. Une surveillance renforcée sera mise en place deux fois par jour si les souris perdent plus de 10 % de leur poids initial, présentent une diminution de leur mobilité ou un pelage hirsute. Les souris seront euthanasiées en cas de perte de poids supérieure à 20 %, de comportement sévèrement altéré (vocalisations spontanées, automutilation, immobilité et absence de réaction) ou d'anomalie physique (piloérection, dos arrondi). Le statut de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les conditions d'hébergement des souris respectent la DIRECTIVE 2010/63/UE : - Les cages utilisées dans les zones ont une surface de 530 cm2. Il est possible d'y héberger 5 souris adultes d'un poids >= à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Les souris sont donc élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. - Du coton ou du sizzle pad pour confectionner des nids est introduit dans chaque cage. - Les animaleries bénéficient d'une Température régulée à 21°C, d'une Hygrométrie contrôlée, ainsi que d'une photopériode contrôlée (250 lux à un mètre du sol). - Les animaleries sont calmes (58Db).
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est nécessaire pour répondre de manière irréfutable aux questions posées. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte, à partir de 6 semaines jusqu'à la fin du traitement, puisque nous nous intéressons au rôle des macrophages lors du développement tumoral à l’âge adulte.
Les neurones inhibiteurs longue distance de l’hippocampe: des tours de contrôle dysfonctionnelles ?
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3770 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié classée en souffrance sévère et l'autre en souffrance légère. Les animaux subissent des chirurgies d'induction d'une épilepsie chronique, des injections de virus, l'implantation de dispositifs d'enregistrement, puis de l'imagerie calcique, des enregistrements EEG et des tests comportementaux cognitifs et émotionnels, avant prélèvement de l'encéphale. Le porteur décrit les crises d'épilepsie, le maintien en cage individuelle pendant huit à douze semaines et les chirurgies répétées du crâne comme des atteintes sévères au bien-être des animaux non-humains. Les souris au génotype non souhaité, classées en léger, ne subissent que le génotypage avant mise à mort.
Objectifs
L’épilepsie du lobe temporal, type le plus fréquent d’épilepsie incurable, se caractérise par des crises d’épilepsie souvent générées dans l’hippocampe. Toutefois, l’ampleur des altérations cognitives, anatomiques et fonctionnelles chez les patients suggère que la maladie implique le dysfonctionnement d’un large réseau de régions cérébrales, bien au-delà de l’hippocampe seul. Il est crucial d’étudier les mécanismes qui contrôlent les interactions entre l'hippocampe et les autres régions du cerveau pour mieux comprendre les échecs fréquents des thérapies actuelles, dont celles ciblant l’hippocampe. Nous nous intéressons à un type de neurones qui jouerait dans des conditions normales un rôle de « tour de contrôle » entre différentes régions du cerveau : les neurones inhibiteurs à projection longue. Nous pensons qu’un dysfonctionnement de ces neurones pourrait jouer un rôle primordial dans le réseau épileptique. Pour le vérifier, nous combinerons imagerie calcique et enregistrements électrophysiologiques in vivo sur des souris épileptiques en comportement avec des virus rétrogrades ciblant les neurones inhibiteurs à projection longue-distance. Ainsi, nous examinerons le rôle pathologique de ces neurones dans les altérations à grande échelle liées à l’épilepsie du lobe temporal et déterminerons les potentiels bénéfices de leur manipulation au niveau thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'apporter une preuve de concept de l'importance de neurones inhibiteurs particuliers, qui connectent l'hippocampe avec d'autres régions cérébrales, dans les altérations à grande échelle associées à l'épilepsie du lobe temporal. En cas de succès, ces neurones pourraient être la cible de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant de formes incurables d'épilepsie.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux seront amenés à subir plusieurs types d'intervention : a) un génotypage (optionnel), b) des chirurgies d'induction d'un état chronique d'épilepsie (1-4h), c) des chirurgies (30-90minutes) d'injection de virus chez l'adulte ou à P0 (optionnel), d) des chirurgies d'implantation de dispositifs d'enregistrements par électrophysiologie ou par imagerie calcique, e) des mesures de leur activité neuronale (maximum 1h en imagerie, 24/7 en EEG télémétrique, une technique permettant d'enregistrer les crises d'épilepsies sur des animaux libres de leurs mouvements), f) des tests de leur comportement afin d'analyser leurs fonctions cognitives ou émotionnelles, réputées altérées en condition d'épilepsie (1/2 journée). A la dernière étape du protocole expérimental, l'encéphale sera prélevé sous anesthésie profonde pour analyser les tissus
Impact sur les animaux
Dans le cas d’animaux subissant l’ensemble d’une procédure, l’ensemble des nuisances ou effets indésirables attendus sont de classe sévère et peuvent être résumés selon les points suivants: - Le stress lié au maintien des souris adultes en cages individuelles après induction de l'épilepsie et pendant la majeure partie de la procédure (soit généralement 8-12 semaines) afin de limiter les bagarres et faciliter le suivi, - l'inconfort et le stress généré par les interventions (optionnelles) sur des souriceaux nouveau-nés et leur maintien transitoire hors de la cage maternelle pour observation pendant 2h30 à 3h30 - L'expression de crises d'épilepsie, condition dommageable au bien-être animal - L'inconfort associé au réveil post-chirurgical et le risque infectieux lié aux anesthésies et interventions chirurgicales répétées (craniotomie, implantation) afin de réaliser des injections intracérébrale et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale – Les démangaïsons pouvant être provoquées par les sutures de la peau du crâne. Dans le cas de l'utilisation de lignées transgéniques, les animaux au génotype non-souhaité sont classés en léger puisqu’ils ne subissent qu'une intervention (génotypage).
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux subissent une anesthésie profonde terminale afin de prélever l'encéphale et d'effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Notre but est de comprendre le rôle d'un type de neurones particuliers de l'hippocampe dans des désordres cognitifs et électrophysiologiques à large-échelle associée à l'épilepsie du lobe temporal. Par conséquent, l'utilisation de modèles in vitro (que nous utilisons régulièrement par ailleurs) n'est pas applicable pour ce projet-ci. En termes de modèle animal, les souris sont un excellent modèle animal par rapport à d'autres existants parce qu'elles reproduisent fidèlement les altérations cardinales observées chez les patients souffrant d'épilepsie du lobe temporal, sont capables de réaliser des tests de comportement transposables chez l'homme (à la différence d'autres animaux tels les poissons zèbres) et comptent d'autres avantages (vitesse de reproduction, capacité de transgenèse).
Réduction
Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés : Nous utilisons une procédure raffinée d'induction de l'épilepsie qui augmente considérablement le taux de réussite de la procédure, et limite par conséquent le nombre d'animaux nécessaires pour générer des cohortes d'animaux épileptiques chroniques. De plus, nous privilégions chaque fois que cela sera possible l’utilisation d’animaux sauvages (appelés aussi wildtype ou WT) combinée à des constructions AAV spécifiques des neurones inhibiteurs afin de limiter quand cela est possible le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des souris du génotype voulu. Le cas échéant, nous utiliserons des lignées transgéniques telles que GAD-Cre, PV-Cre ou SOM-Cre disponibles dans le laboratoire.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs stratégies de raffinement afin de limiter l'impact de nos expérimentations sur le bien-être des animaux: - Les animaux sont hébergés dans des cages avec un environnement enrichi (composé d'igloos cartonnés, de tunnels en carton et de papier foisonnant), en présence d'eau et de nourriture ad libitum - Notre procédure raffinée d'induction de l'épilepsie, basée une échelle des symptômes et sur l'injection de caféine, permet de prévenir la survenue des stades les plus sévères du status épilepticus (associés à de la souffrance et la mort). - Chaque intervention invasive (e.g., chirurgie) est effectuée dans des conditions d'analgésie et d'anesthésie optimales. - Nous mettons un soin particulier à constamment surveiller les constantes biologiques et la souffrance des animaux , particulièrement dans les heures et jours suivant les interventions invasives (e.g., induction de l'épilepsie, chirurgie) jusqu'à la mort des animaux. Des grilles de suivis ont été mises en place, et le personnel a reçu toutes les habilitations nécessaires, notamment pour améliorer le bien-être des animaux (manipulation, enrichissement), reconnaitre les signes éventuels d'inconfort ou de souffrance, et pratiquer les gestes adaptés en fonction.
Choix des espèces
Les souris modèles d'épilepsie manifestent des symptômes comparables à ceux dont souffrent les patients souffrant d'épilepsie du lobe temporal (génération de crises, troubles cognitifs et de l'humeurs, altérations histologiques). Ils sont donc un excellent modèle pour cette maladie humaine, et sont utilisés de manière routinière dans le laboratoire. L'induction de l'épilepsie est effectuée sur des souris agées de 2 mois environ, un stade favorisant la survie des animaux, ainsi que le taux d'induction de l'épilepsie. Les enregistrements (imagerie calcique, électrophysiologie) et les tests comportementaux s'effectuent 6-12 semaines plus tard, à un stade où les animaux ayant subi le protocole d'induction ont subi des altérations histologiques conduisant à une épilepsie chronique (se manifestant par des crises spontanées récurrentes, des désordres cognitifs ainsi que que des altérations histologiques).