Procédures sévères
Clearence du potassium par des astrocytes dans le cerveau de souris normale et épileptique.
- Enseignement supérieur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Une partie subit un état de mal épileptique provoqué par injection, maintenu trente minutes, que le porteur reconnaît douloureux et impossible à réaliser sous anesthésie, avant que le cerveau ne soit prélevé pour des analyses ex vivo. Les souris qui ne se réalimentent pas ou perdent plus de 15 % de leur poids sont exclues et tuées. Le porteur présente la modélisation informatique comme une piste future tout en concluant que seul l'animal permet aujourd'hui d'étudier l'"organisme entier".
Objectifs
Ce projet de recherche découle d'un projet plus vaste que notre équipe mène depuis cinq ans, visant à comprendre comment les rythmes naturels du corps influent sur le fonctionnement normal et anormal du cerveau. Cette question revêt une importance particulière pour la santé humaine, car toutes les fonctions de notre organisme suivent un rythme quotidien, et ces rythmes sont perturbés en cas de maladies telles que l'épilepsie, la deuxième maladie neurologique la plus répandue après la migraine. Environ 30% des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux actuels. Les recherches sur l'épilepsie ont traditionnellement ciblé les neurones, mais notre projet se concentre sur les cellules gliales, en particulier les astrocytes, qui jouent un rôle crucial dans le soutien métabolique du cerveau. Les études ont montré des fluctuations importantes dans les concentrations d'ions essentiels (sodium, potassium, chlorure) chez les sujets épileptiques, en particulier une augmentation du potassium. Notre objectif est de comprendre pourquoi cette régulation est perturbée, si elle est liée au dysfonctionnement des astrocytes, et quels mécanismes astrocytaires de la clairance du potassium sont affectés. Nous cherchons à répondre à ces questions pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Lors des crises épileptiques, on observe une augmentation temporaire du potassium à l'extérieur des cellules du cerveau, aussi bien chez les patients que dans des modèles animaux (rats, souris) et des préparations du cerveau de rongeurs en laboratoire. Cette élévation de potassium est ainsi un marqueur universel de la crise épileptique. Bien que les mécanismes précis de cette perturbation puissent varier entre différentes espèces, son origine commune semble être les astrocytes, des cellules gliales du cerveau. En étudiant comment les astrocytes éliminent le potassium dans les tranches du cerveau de souris, nous cherchons à comprendre comment cette fonction est normalement assurée dans le cerveau humain et comment elle est altérée lors de l'épilepsie. Actuellement, aucun traitement antiépileptique ne cible spécifiquement les astrocytes. Les résultats de notre projet ouvriront des perspectives pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre collaboration avec l'équipe des Neurosciences Théoriques est essentielle. Ces chercheurs modélisent l'activité des réseaux neuronaux dans différentes parties du cerveau, tant dans des états normaux que pathologiques. La régulation du potassium extracellulaire est une variable clé dans leurs modèles. Pour que leurs simulations reflètent la réalité, elles doivent s'appuyer sur des données expérimentales. Les expériences que nous prévoyons dans le cadre du projet fourniront ces données, permettant d'améliorer la précision des modèles. Ces modèles améliorés offriront ensuite la possibilité de prédire le comportement du réseau neuronal dans différentes conditions, y compris en réponse à des médicaments, sans recourir à des expérimentations sur des animaux de laboratoire. Ainsi, notre projet contribuera à développer et exploiter une approche informatique (in silico) pour mieux comprendre et traiter l'épilepsie.
Procédures
Les souris seront soumises à plusieurs injections intrapéritonéales : 1 à 3 injections d'une molécule pro-convulsante ou de sérum physiologique dans le cas des souris témoins, et une injection d'une molécule anti-convulsive.
Impact sur les animaux
Le projet s'appuit sur l'utilisation du modèle animal d'épilepsie généralisée qui reproduit les caractéristiques principales de l'épilepsie du lobe temporal (ELT) chez les humains, y compris les crises épileptiques et les problèmes de mémoire. Malheureusement, pour induire cette épilepsie, nous devons provoquer un état convulsif initial chez les souris non affectées, appelé "status epilepticus". Cet état est douloureux, mais nous ne le laissons durer que 30 minutes, puis nous l'arrêtons en administrant un médicament anti-convulsivant. Il n'est pas possible d'anesthésier les animaux pendant cette induction, car le status epilepticus est défini par des mouvements et des comportements spécifiques qui seraient complètement supprimés par une anesthésie. La classification de la gravité de cet état de mal est cruciale, car elle nous permet de déterminer précisément quand il commence, nous donnant ainsi un contrôle sur sa durée. L'induction de l'épilepsie en déclenchant cet état de mal est la seule méthode disponible pour créer un modèle animal de l'épilepsie du lobe temporal.
Devenir
Après le déclenchement du "status epilepticus" les souris deviennent épileptiques et elles seront utilisées pour les expérimentations ex vivo qui cible à étudier la clairance du potassium dans les tranches de cerveaux épileptiques et sains.
Remplacement
Les dernières décennies ont été marquées par d'importants progrès dans le domaine de la modélisation des fonctions cérébrales. Des projets internationaux tels que The Virtual Brain et le Human Brain Project ont considérablement enrichi nos connaissances sur les mécanismes de la mémoire et du traitement de l'information dans le cerveau humain. Les nouvelles procédures informatiques permettent aux médecins neurologues d'extraire davantage d'informations de l'EEG et de l'imagerie cérébrale. Les modèles mathématiques récents peuvent décrire certains aspects du fonctionnement d'une cellule nerveuse ou d'un réseau neuronal. Cependant, aucun outil informatique ne permet de modéliser l'ensemble du répertoire de l'activité cérébrale, qu'elle soit physiologique ou pathologique, car les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents ne sont pas encore connus. La seule voie pour les découvrir passe par l'exploration du modèle animal. Le foyer de la crise épileptique est localisé dans une région du cerveau, mais une fois déclenchée, la crise peut se propager et envahir plusieurs régions, voire l'ensemble du cerveau. Étant donné que le cerveau contrôle toutes les fonctions de l'organisme, son dysfonctionnement peut affecter d'autres organes vitaux tels que le cœur ou l'estomac, qui à leur tour influent sur le fonctionnement du cerveau. Ainsi, l'épilepsie dépasse le cadre d'une pathologie purement neurologique, c'est pourquoi son exploration requiert l'accès à l'organisme entier, une possibilité que aucune autre approche ne nous offre pour l'instant.
Réduction
Un cerveau (une souris) sera utilisé pour la préparation de plusieurs tranches (4-6) qui seront ensuite utilisées simultanément sur deux postes expérimentaux ce qui permettra soit d'obtenir lors de la même session les données de deux types (deux protocoles expérimentaux différents, un par poste), soit de cumuler plus de données d'un type (le même protocole appliqué sur deux postes expérimentaux).
Raffinement
Ce projet présente des approches pertinentes visant à réduire la douleur, la souffrance, le stress et l'inconfort chez les animaux de laboratoire, en particulier les souris. Une procédure d'induction du statut épileptique individualisée a été mise en place. Après la première injection d'une substance épileptogène, ne représentant qu'un tiers de la quantité totale, le comportement de chaque souris est surveillé. La décision d'administrer les injections suivantes est basée sur la réaction individuelle de la souris à la première injection, réduisant ainsi le temps de souffrance et accélérant le rétablissement post-induction. Le suivi quotidien des animaux est également adapté à chaque individu. Les souris qui ne parviennent pas à se nourrir se voient fournir de la nourriture par l'expérimentateur jusqu'à ce qu'elles puissent le faire elles-mêmes. Si une souris n'est pas capable de se nourrir seule dans les deux jours suivant l'induction du statut épileptique, elle est exclue du projet et euthanasiée par inhalation de CO2. Le bien-être des animaux est privilégié en ce qui concerne leurs conditions d'hébergement. Ils sont regroupés par 3 à 5 selon la taille de la cage, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. L'environnement est enrichi de maisonnettes et d'objets divers. Des observations indiquent que les animaux épileptiques présentent des crises moins sévères lorsqu'ils sont hébergés en groupe (DOI: 10.1523/ENEURO.0179-18.2019). Pour minimiser le stress, les animaux sont manipulés et pesés 3-4 fois par semaine avant la procédure d'induction de l'épilepsie et pendant la phase latente. Cependant, une fois devenus épileptiques, toute manipulation non nécessaire est évitée, car elle peut augmenter leur niveau de stress et déclencher des crises épileptiques. Les animaux sont observés quotidiennement, leur état étant évalué à l'aide de la grille d'expression faciale (DOI: 10.1038/nmeth.1455). Une souris présentant des signes de souffrance de niveau 1 ou 2 est pesée. Si son poids a diminué de plus de 15 % par rapport à celui observé pendant la phase latente, elle est exclue du projet et euthanasiée. Si le poids reste constant mais que la souris montre des signes de souffrance de niveau 2 pendant plus de deux jours consécutifs, elle est également exclue du projet et euthanasiée.
Choix des espèces
Le caractère méconnu du fonctionnement cérébral implique que ce projet ne peut pas se passer de l'utilisation d'animaux afin d'en déterminer les mécanismes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour réaliser ce travail. Ce projet utilise les souris comme modèle animal, qui, avec le rat, sont l'espèce le plus pertinentes car des nombreuses études montrent que les régions cérébrales impliquées dans l'épilepsie sont conservées entre les rongeurs et l’Homme. Parce que ce modèle reproduit les caractéristiques principales de l’épilepsie, les résultats de notre étude permettront de mieux extrapoler les mécanismes cette pathologie chez l’Homme. Les modèles d'épilepsie chez les souris sont déjà validés par les travaux antérieurs de notre équipe (doi: 10.1126/sciadv.aat5979, doi: 10.1073/pnas.2013972118) Nous utiliserons les animaux adultes, à partir de 5 semaines. Nous allons étudier l'épilepsie de l’adulte, donc il nous faut utiliser les animaux qui ont passé la phase de croissance rapide qui dure, selon la documentation technique de Charles River les cinq premières semaines de vie (www.criver.com/products-services/find-model/fvb-mouse?region=29www.criver.com /products-services/findmodel/fvb-mouse?region=29). Donc nous allons utiliser les souris âgées de plus de 5 semaines.
Modèle murin de syndrome de détresse respiratoire aiguë ( SDRA)
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
575 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Toute la colonie subit une phalangectomie, ablation d'une phalange, et 280 souris reçoivent une instillation d'acide chlorhydrique ou de lipopolysaccharide dans la trachée pour provoquer un syndrome de détresse respiratoire aiguë. Ces 280 souris sont tuées pour les prélèvements, tandis que 295 sont gardées vivantes pour la reproduction ou d'autres procédures. Le porteur affirme que seul le modèle animal permet une véritable translation vers la clinique.
Objectifs
Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est une affection fréquente en réanimation et responsable d’une mortalité élevée. Il se caractérise par des lésions alvéolaires diffuses et une hypoxémie sévère. Actuellement, seule une approche protectrice de la ventilation mécaniques a permis de réduire la mortalité associée au SDRA au cours des derniers années. Le récepteur des produits avancés de la glycation (RAGE pour Receptor for Advanced Glycation End-products) est ubiquitaire et est largement retrouvé dans les cellules alvéolaires . Il a de nombreux ligands et son activation entraine divers mécanismes de régulation intra cellulaire : apoptose, inflammation ou prolifération. Nous avons participé à démontrer que RAGE joue un rôle dans la pathogénie du SDRA. D’autre part, notre équipe a pu mettre en évidence les effets bénéfiques d’une sédation inhalée par sévoflurane chez des patients présentant un SDRA à travers un essai monocentrique, contrôlé et randomisé. En effet, le sévoflurane, un agent halogéné largement utilisé pour l'anesthésie générale en salle d'opération, améliorait l’oxygénation, diminuerait les niveaux alvéolaires et plasmatiques de sRAGE, forme soluble de RAGE, par rapport à une sédation par agent intraveineux. Nos objectifs sont multiples et visent à mieux comprendre et caractériser l’utilisation de la sédation inhalée en réanimation au travers d'une approche translationnelle via des études de recherche clinique et de recherche fondamentale. Ce projet a pour but d'améliorer notre compréhension des mécanismes physio-pathologiques mis en jeu lors de l’utilisation de sévoflurane et de mieux caractériser le rôle de la voie de signalisation liée à RAGE. Les modèles murins de SDRA décrits dans ce projet ainsi que des modèles cellulaires in vitro d’agression épithéliale réalisés en parallèle, permettront de caractériser l’effet du sevoflurane lors de l’agression pulmonaire.
Bénéfices attendus
L’instillation intra-trachéale d’acide chlorhydrique ou de lipopolysaccharide reproduit dans le modèle murin, les caractéristiques majeures du SDRA humain. Les concentrations des formes solubles de RAGE dans le plasma et le lavage brocho-alvéolaire (LBA) sont des bons marqueurs de l’atteinte pulmonaire et de sa résolution au cours du SDRA expérimental. L'utilisation de souris knock-out pour RAGE (déjà disponibles à l'animalerie) permettra de mieux décrire les implications de la voie RAGE au cours du SDRA et de sa résolution. L'exposition au sévoflurane pourrait mettre en évidence les effets de cet halogéné sur l'atteinte pulmonaire et pourrait ainsi être une possible stratégie thérapeutique pour les patients en réanimation.
Procédures
L'ensemble de la colonie subira une phalangectomie = 575 animaux. Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à plusieurs procédures: -anesthésie générale pour l'ensemble des animaux constituant les groupes expérimentaux (140 animaux utilisés dans le modèle murin de SDRA par instillation d'acide chlorhydrique (HCl) et 140 dans un modèle murin de SDRA par instillation de lipopolysaccharide (LPS) = 280 animaux. Sur les 140 animaux pour chaque modèle, 80 animaux subiront chacun, une instillation intra-trachéale soit d'HCl, soit de LPS sous anesthésie générale afin de créer un SDRA expérimental. Un animal de chaque condition expérimentale sera imagé à j0-j1-j2 et j4 = 6 animaux pour chaque modèle de SDRA donc, un ensemble de 12 animaux seront imagés : injection en rétro-orbital sous anesthésie générale d'un agent de contraste couplé à une fluorescence. Ces 12 animaux seront soumis à une injection par jour donc ils subiront 4 injections. Ces 12 animaux seront euthanasiés à j4.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont une détresse respiratoire aigüe à j0 après instillation d'HCl ou LPS.
Devenir
Dans le cadre de la procédure de phalangectomie, les animaux seront tous garder en vie car ils seront destinés aux autres procédures ou aux futures reproductions. Dans les 2 procédures d'instillation, les animaux seront euthanasiés par injection de penthobarbital afin de réaliser les prélèvement post-mortem.
Remplacement
Des alternatives non animales sont disponibles au sein de notre équipe. L'axe de recherche translationnelle de notre équipe sur les implications du récepteur membranaire RAGE au cours du syndrome de détresse membranaire aigüe (SDRA) comporte des investigations cliniques et des expérimentations sur modèles cellulaires. Pourtant, seule l'utilisation de modèles animaux nous permet d'envisager une véritable translation entre les données obtenues in vitro et les données cliniques.
Réduction
En accord avec les principes éthiques des 3Rs, il a été convenu de considérer un nombre minimal d’animaux pas groupe pour réduire le nombre total d’animaux utilisés mais permettant d'établir la significativité statistique. Nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles pour nos expériences. En prenant en compte ces considérations, le nombre d'animaux nécessaires à ce projet sera de 575 souris.
Raffinement
La douleur sera réduite au minimum. En effet, les souris seront sous anesthésie générale tout le long de l'expérimentation. L'utilisation d'hypnotiques à action analgésique permet de couvrir l'analgésie per- et post-procédurale. Les animaux non sacrifiés à j0 seront replacés dans leur cage de stabulation avec nourritue et boisson à volonté, sur tapis chauffant en salle de réveil. Ils seront remis en salle de stabulation dès qu'ils seront en mesure d'exprimer les comportements normaux de leur espèce. Les animaux seront examinés 1 fois/jour (comportement global, paramètres vitaux, détresse respiratoire) jusqu'à leur sacrifice à j1; j2 ou j4. Quoiqu'il en soit, la procédure d'anesthésie engendrera un stress dû à la contention de l'animal que l'on ne peut pas éliminer.
Choix des espèces
Par rapport à d'autres modèles animaux, notre Choix du modèle murin est justifié d'une part car ce modèle est translationnel, qui permet à la fois l'étude de la phase aigüe d’agression alvéolaire et la phase de résolution de l'atteinte, n'est à ce jour décrit et validé que chez la souris (Patel B et al, Eur Respir J 2012; Jabaudon M et al, Am J Respir Crit Care Med2015), ensuite, il s'agit de l'espèce la plus appropriée pour l'étude des effets d'une absence d'expression du gène de RAGE au cours du SDRA. En effet, notre projet comporte à la fois l'étude de souris sauvages et celles de souris knockout pour RAGE.
Evaluation des effets anti-allodyniques ou anti-hyperalgésiques d’un ou plusieurs composés dans différents modèles de douleur inflammatoire associés à différents tests chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
9 660 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, la plus grande part en catégorie sévère. Une douleur inflammatoire est provoquée par injection ou chirurgie, pouvant aller jusqu'à une polyarthrite, puis les animaux subissent des stimulations mécaniques, thermiques et chimiques répétées à l'état vigile pour tester des candidats analgésiques. Le porteur indique que ces modèles douloureux et stables interdisent de réutiliser les animaux, tous tués en fin de phase. Il évoque des effectifs qui pourront être "revus à la baisse par nos clients", signe d'une activité de prestation.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. Le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur inflammatoire et pour différents types de douleur (mécanique, thermique). Ces modèles et tests sont couramment décrit au sein de la communauté scientifique. La douleur inflammatoire est associée à des phénomènes d’inflammation qui perdurent anormalement. Il s’agit par exemple de douleurs articulaires. Dans des conditions normales, l’inflammation aiguë est essentielle pour protéger l’organisme contre les agents pathogènes ainsi que pour favoriser la réparation des tissus. À l’inverse, une inflammation chronique, qui dure 6 semaines ou plus, entraîne des lésions tissulaires et des douleurs indésirables. Les modèles in vivo, aident à comprendre les mécanismes physiopathologiques responsables de la génération de douleurs inflammatoires chroniques et permettent l’identification de nombreux candidats médicaments analgésiques L’objectif de ce projet est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisés en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs inflammatoires et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires anti-inflammatoires non-stéroidiens : ulcères, …). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication de résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
- Induction des modèles : chirurgie ou injection sous cutanée plantaire qui dure moins d’une minute en contention ou d’une injection intra-articulaire (genou/cheville) sous anesthésie gazeuse qui dure moins d’une minute. - Tests : stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. - Test : stimulation chimique : environ 40min - Répétitions des tests :plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. - Contention et isolement de l’animal. - Administration de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire), durée de quelques secondes. - Répétitions des traitements : ils peuvent être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux). Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. - prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les modèles décrits dans ce projet sont des modèles de douleur inflammatoire ou post opératoire. Les autres nuisances liées au développement de ces modèles sont des gonflements (procédures 1 et 4 à 7, nuisances modérées à sévères selon l’inflammation), le développement éventuel d’une polyarthrite (procédures 4 et 6, nuisances sévères) . De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang unique ou répétés afin d’évaluer la pharmacocinétique du composé.
Devenir
Une grande partie des modèles utilisées ici sont des modèles stables dans le temps. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. Certains modèles montrent un retour au seuil de base mais les mécanismes inflammatoires ont une mémoire, réinduire ces animaux pourraient entrainer une réponse différente, ils deviendraient difficiles de les comparer entre eux. Nous ne pouvons donc pas exclure un impact potentiel lors de la réutilisation des animaux. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Ces modèles sont couramment mis en place au sein du laboratoire. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclut ou limiter à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse par nos clients. En fonction du design de chaque étude des analyses statistiques seront réalisées.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimulus plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre de tests themiques, le choix des températures est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (stimulus non douloureux pouvant être ressentie comme douloureux par des animaux pathologiques). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant/le permettant : chirurgie, prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du monde scientifique. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés dans l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles à adolescents lors de l’induction de la pathologie (28-45 jours ). Pour le modèle de méniscectomie partielle, les animaux utilisés sont au stade adulte (12semaines). Ces stades ont été choisis car ils sont adaptés au développement des modèles. Ils permettent un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Evaluation d’un nouveau substitut vasculaire construit par ingénierie tissulaire à partir du cordon ombilical humain EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Des miniporcs Aachen, choisis parce qu'ils grandissent peu au cours d'un suivi qui peut durer un an, sont calmés par injection, transportés vers un second établissement, puis opérés sous anesthésie générale par une petite ouverture du thorax pour recevoir un pontage du cœur avec un greffon tiré d'une artère de cordon ombilical humain, l'une de leurs artères coronaires étant bouchée. 54 cochons vont être utilisés, tous classés en souffrance sévère, et le porteur estime la mortalité de ce protocole à environ 20 %. Réveillés, ils sont suivis de six semaines à un an, avec une à trois anesthésies supplémentaires pour des échographies et une imagerie des coronaires sous produit de contraste. Tous sont tués à l'issue pour des analyses de tissus.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est la validation d'un greffon artériel construit par ingénierie vasculaire à partir d'artère de cordon ombilical humain pour un pontage cardiaque chez un modèle animal de cochon. Ce greffon totalement d’origine humaine ainsi validé permettra de proposer un produit « prêt à l’emploi » à usage clinique sans problème de rejet. Le projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour finalité de proposer un greffon naturel humain sans problème de rejet afin de répondre à un problème majeur de Santé publique : les pathologies cardio-vasculaires dont le principal traitement repose sur le pontage coronarien. Pour pratiquer cette intervention, il est nécessaire de disposer de greffons vasculaires. Or aujourd’hui, les sources possibles reposent sur les autogreffes de patients ou les greffons synthétiques. Ils présentent chacun de nombreux inconvénients tels que les complications liées à leurs prélèvements pour l’un et au fait qu’ils sont peu adaptés pour remplacer des greffons de petits diamètres pour l’autre. La validation du greffon chez l’animal le plus proche de l’homme en terme de physiologie nous permettra de disposer de données pré-cliniques pour évaluer ce greffon avant son implantation chez l’homme.
Procédures
Dans l'établissement utilisateur 1 (hébergeur), Les animaux auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress dû à la manipulation. Après transport dans l'établissement utilisateur 2 (de chirurgie) , une perfusion intraveineuse sera posée afin de permettre une anesthésie générale. Une fois totalement endormi et sous traitement anti-douleur, ils subiront une intervention chirurgicale avec mini-ouverture du thorax afin de mettre en évidence le cœur et nous procéderons au pontage avec l'artère d'intérêt et occluerons une des artères du cœur afin de mettre le cœur dans les conditions physiologiques identique à la clinique. L'animal sera alors réveillé et suivi entre 6 semaines et 1 an. Durant cette phase, les animaux subiront entre 1 et 3 anesthésies supplémentaires selon le groupe afin de réaliser des tests indolores (échographie cardiaque et imagerie des coronaires) pour lesquels le produit de contraste (Xenetix) sera injecté pour estimer la perméabilité du greffon.
Impact sur les animaux
La principale nuisance est la réalisation d’une chirurgie intra-thoracique chez le cochon et le maintien en vie de l’animal pendant une longue période post-opératoire. Cette longue période est nécessaire afin de s’assurer que le greffon reste perméable même à distance de l’opération.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des prélèvements de tissus nécessaires aux analyses histologiques.
Remplacement
Ce travail a traversé différentes phases d'études notamment in vitro avant d'atteindre la phase préclinique sur les cochons en tant que modèle de gros animaux. Des évaluations mécaniques et histologiques de ce greffon sont réalisés avant implantation, ce qui nous permet d'étudier et de nous assurer des propriétés du greffon, tout en remplaçant les animaux et réduisant le nombre d'animaux utilisés. Les résultats intéressants obtenus in vitro ont montré les réelles capacités de cette prothèse vasculaire. Ces résultats prometteurs nécessitent donc en vue d’essais cliniques, une validation via une vraie étude comparative sur les Aachen minipigs qui présentent des similitudes importantes d’un point de vue anatomique et physiologique avec l’homme.
Réduction
Des évaluations mécaniques et histologiques du vaisseau sont réalisées avant greffe afin de valider ses propriétés et de n'implanter que des vaisseaux de qualité. Ceci permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les différences intergroupes sont évaluées par le test statistique convenant à notre étude « Anova à plusieurs facteurs ». En tenant compte de la mortalité restimée pour ce modèle à environ 20%, 54 cochons sont nécessaires afin d’obtenir une étude statistiquement exploitable.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en box collectif afin de limiter l’angoisse, le stress des animaux en respectant le quota d’animaux par box. Les cochons seront intubés, sédatés et reçoivent un traitement antalgique continu par morphinique en intra-veineux pendant toute l'opération. L’animal sera scopé, c’est-à-dire que sa fréquence, son rythme cardiaque et respiratoire seront suivis en continu. Toute modification de ces paramètres signale un réveil, une douleur ou un inconfort de l’animal et induirait alors un réajustement immédiatement des traitements permettant de limiter les souffrances au maximum. En suivi post-opératoire : Prise d’antibiotiques en prévention d'office pendant les 7 jours suivants l'opération avec des comprimés à croquer 2 fois par jour ainsi qu'un traitement antalgique par patch pendant 3 jours au minimum et plus si nécessaire. Un protocole d’anticoagulation oral est mis en place ainsi que des soins locaux antiseptiques aux abords des points chirurgicaux. Les animaux seront hébergés à l'animalerie dans un premier temps en box individuel mais permettant tout de même un contact olfactif, visuel et sonore avec des congénères présents dans les boxes en face. Ceci permettra de limiter l'angoisse et le stress des animaux. Le milieu reste enrichi avec des jouets adaptés (balles, cordes à mordre...). Les animaux seront remis en groupe selon leur état de récupération (estimé à 2 semaines).
Choix des espèces
Les Aachen minipigs ont été choisis comme modèle animal pour ce projet pour 2 raisons. Ce modèle possède une physiologie comparable à l’homme sur le plan myocardique et coronarien et permet d’implanter le greffon vasculaire dans des conditions chirurgicales similaires. De plus, le suivi des animaux s’effectuant sur une durée pouvant aller jusque un an, il faut un modèle animal qui evolue peu au niveau staturo-pondéral.
Transplantation d’organoïdes dans la capsule rénale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
128 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie transplantant des organoïdes sous la capsule du rein gauche, que leur croissance rend non fonctionnel, le porteur reconnaissant que ce développement peut provoquer une douleur. Les organes sont prélevés après la mise à mort. Ce projet vise à mettre au point la technique chirurgicale en vue d'un projet ultérieur de plus grande ampleur sur le cancer de l'estomac.
Objectifs
Le tractus gastro-intestinal supérieur comprend l’œsophage et l’estomac reliés par une zone de transition (ZT). Il y a deux types de cancer de l’estomac chez l’homme : distal (partie basse) et proximal (ZT). L'incidence du cancer de l'estomac distal a diminué, tandis que celle des cancers de la ZT a connu une augmentation rapide. Dans le laboratoire nous avons mis en place la culture de ‘’mini-organe’’ ou organoïdes de ces zones de transition gastrique à partir de tissus de souris. Ces organoïdes en culture ont une taille ne dépassant pas 1-2mm. L'objectif du projet est de mettre au point une technique chirurgicale de transplantation de ces organoïdes sous la capsule rénale de souris immunodéficientes afin de permettre à ces structures tridimensionnelles de se développer de façon plus importante (>10 mm) et de se différencier. La capsule rénale a été choisie comme site de transplantation pour sa localisation proche de la surface au niveau dorsal, ce qui rend son accès facile et la récupération de l’animal plus rapide, ainsi que pour son innervation importante et le rôle de son microenvironnement dans la croissance et maturation des organoïdes. En effet, la transplantation d’organoïdes intestinaux dans la capsule rénale montre une maturation complète au bout de 6 semaines dans la littérature. L’objectif est de reproduire cette maturation avec nos organoïdes de zone de transition gastrique. Des études préliminaires de différenciation in vitro ont été effectuées et la différenciation obtenue est partielle. En effet, à la zone de transition gastrique se trouve une glande protectrice qui sécrète du mucus in vivo. Les organoïdes dérivés de ces zones de transition conservent cette glande, cependant le milieu de différenciation ne permet pas la production de mucus d’où la nécessité de différencier les structures in vivo, grâce au microenvironnement présent. L'objectif est de mettre au point les conditions expérimentales qui seront utilisées, après autorisation, dans un futur projet de plus grande ampleur de l’équipe.
Bénéfices attendus
Le tractus gastro-intestinal supérieur comprend l’œsophage et l’estomac reliés par une zone de transition (ZT). L'incidence des cancers de la ZT a connu une augmentation rapide. Dans le laboratoire nous avons mis en place la culture de ‘’mini-organe’’ ou organoïdes de ces zones de transition gastrique à partir de tissus de souris. Ces organoïdes en culture ont une taille ne dépassant pas 1-2mm. L'objectif du projet est de mettre au point une technique chirurgicale de transplantation de ces organoïdes sous la capsule rénale de souris immunodéficientes afin de permettre à ces structures tridimensionnelles de se développer de façon plus importante (>10 mm) et de se différencier. Notre modèle d’organoïdes nous permettra de comprendre les mécanismes de transformation à l’origine des cancers de la ZT et donc dans le futur développer des traitements ciblés. De plus, l’utilisation d’organoïdes permet de réduire de façon notable l’utilisation de modèles animaux.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale visant à transplanter des organoïdes (mini-organes) dans le rein. La procédure chirurgicale dure environ une heure en prenant en compte le temps nécessaire pour que l'analgésique soit effectif, le temps nécessaire pour anesthésier l'animal, la durée de la procédure (30 minutes au maximum) et le temps de réveil. Chaque animal sera soumis à la procédure une seule fois. Les animaux seront également pesés et évalués selon une grille de score (durée de la manipulation entre 5 et 10 minutes par animal) le jour de la chirurgie, 24h et 48h après ainsi que deux fois par semaine pendant 4, 5, 6 ou 8 semaines après la chirurgie, ce qui peut générer un stress.
Impact sur les animaux
La greffe se fera dans la capsule rénale du rein gauche, ce qui, après croissance et différenciation des organoïdes, rendra le rein non fonctionnel. La chirurgie implique une anesthésie qui présente un risque d’hypothermie ainsi qu’une incision entrainant la réalisation de points de suture au niveau dorsal, ce qui peut créer une gêne ou une douleur chez l'animal. Les animaux seront manipulés pour pesées et évaluations du bien-être le jour de la chirurgie, 24h et 48h après, ainsi que deux fois par semaine pendant 4, 5, 6 ou 8 semaines après la chirurgie, manipulation susceptible de générer un stress. La chirurgie dure environ 30 minutes, et l’animal sera anesthésié pendant environ 45 minutes. La pesée et l’évaluation du bien-être dure environ 5 à 10 minutes par animal. La croissance des organoïdes dans le rein peut également induire une douleur chez l’animal.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires à nos analyses.
Remplacement
Le tractus gastro-intestinal supérieur comprend l’œsophage et l’estomac reliés par une zone de transition (ZT). A la ZT gastrique se trouve une glande protectrice qui sécrète du mucus in vivo. Les organoïdes dérivés de ces zones de transition conservent cette glande. Des études préliminaires de différenciation in vitro ont été effectuées et la différenciation obtenue est partielle, en effet, la production de mucus n’est pas conservée in vitro, d’où la nécessité de différencier les structures in vivo grâce au microenvironnement présent. Il est également nécessaire à la croissance des organoïdes jusqu'à la taille requise, la taille maximum étant limitée in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au maximum pour ce protocole. Tout d’abord, nous n’utiliserons que 4 souris par condition, nombre minimum nécessaire afin de confirmer la reproductibilité des résultats. Ensuite, les organoïdes utilisés pour la transplantation ne seront pas produits avec de nouvelles souris mais proviendront de stock congelés. Afin de déterminer la quantité d'organoïdes la plus efficace pour la transplantation, et de connaître la durée de croissance pour établir les temps d'analyses les plus intéressants pour notre projet futur, nous allons tester plusieurs combinaisons. Nous testerons 4 quantités d'organoïdes (en se basant sur la littérature) ainsi que 4 temps d'analyse différents pour ces 4 quantités. Pour ces temps d’analyse, nous nous basons sur le fait que la transplantation d’organoïdes intestinaux dans la capsule rénale montre une maturation complète au bout de 6 semaines dans la littérature. Le type d’organoïdes transplanté dans notre protocole étant différent, le temps nécessaire à la différenciation peut varier.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/ heure ; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit). Les normes les plus strictes en matière de soin et de surveillance des animaux seront appliquées. Toutes les manipulations sont réalisées dans un environnement stérile afin de maintenir le statut sanitaire exigeant (particulièrement pour des animaux immunodéficients) et tout le matériel utilisé est stérile. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’administration d’un analgésique) en fonction d’une grille de score de bien-être adaptée à notre modèle, comprenant des points limites entraînant l'arrêt de la procédure pour les animaux concernés. Les animaux seront hébergés en groupe pour un enrichissement social et afin de respecter l'instinct grégaire de cette espèce. La nourriture et l'eau sont fournies ad libitum. Du matériel de nidification (dôme, coton, copeaux compressés) est mis à disposition des animaux. Les locaux d'hébergement sont séparés des locaux d'expérimentation. Les animaux destinés aux procédures expérimentales feront l’objet d’une phase d’acclimatation dans les locaux dédiés au suivi de l’expérimentation. Cette phase sera de 7jours pour les animaux produits sur site. Les animaux seront pesés et évalués à l’aide d’une fiche de score le jour de la chirurgie, 24h et 48h après ainsi que deux fois par semaine pendant 4, 5, 6 ou 8 semaines après la chirurgie. Si nous observons une déshydratation nous administrerons une solution saline. Nous utiliserons des analgésiques pour réduire la douleur due à la chirurgie. L’analgésie sera effectuée à 24H et 48H après la procédure chirurgicale. L’administration se fera par voie sous cutanée pour une diffusion plus longue. Une analgésie préopératoire sera effectuée en voie sous cutanée 30 minutes minimum avant l'intervention. La transplantation des organoïdes dans la capsule rénale est préférable qu’une transplantation au niveau gastrique car cela permet d’effectuer une chirurgie moins invasive et donc d’avoir une récupération plus rapide des animaux.
Choix des espèces
La réalisation de greffe demande l'utilisation de modèle immunodéficient, et ce modèle est disponible chez la souris. De plus, les organoïdes transplantés proviennent de tissus murins, l'espèce doit donc rester consistante. Des animaux adultes (6-12 semaines) seront analysés à 4, 5, 6 ou 8 semaines après la procédure chirurgicale pour suivre le développement et la différenciation des organoïdes. L’âge a été déterminé pour avoir un poids équivalent entre les animaux et pour s’assurer de la maturité. C’est également l’âge qui sera utilisé dans le projet futur dans lequel s’inscrit cette mise au point de protocole.
Rôle thérapeutique de la voie hème oxygènase/monoxide de carbone (HO-1/CO) au cours de l’infarctus du myocarde
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 64
192 souris et 64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit sous anesthésie une thoracotomie puis une ligature de l'artère coronaire pendant soixante minutes provoquant un infarctus, avant de recevoir des composés libérant du monoxyde de carbone. Le cœur est prélevé après la mise à mort. Le porteur décrit une procédure "bien maîtrisée" et justifie le recours à deux espèces par la comparaison avec la littérature, les bénéfices thérapeutiques restant annoncés au conditionnel.
Objectifs
L'infarctus du myocarde (IM) reste l'une des principales causes de morbidité et de mortalité. Les lésions tissulaires au cours de l'IM provoquent la libération de molécules toxiques connues sous le nom de "Danger Associated Molecular Pattern". (DAMP), qui aggravent les lésions cardiaques et stimulent l'inflammation. Nous faisons l’hypothèse que l’hème agisse comme un DAMP important dans l'IM car des quantités importantes d'hème présentes dans le tissu cardiaque, peuvent être libérées pendant l’infarctus, et pourraient favoriser les dommages cardiaques s'il n'est pas correctement neutralisé ou dégradé. Bien que le tissu cardiaque ait la capacité de neutraliser l'hème dans des conditions normales, ces systèmes de protection intrinsèques ne suffisent pas lorsque la quantité d'hème devient excessive comme dans le cas de l’IM. Cependant, une stratégie thérapeutique nécessite de nouvelles approches pharmacologiques car les mécanismes responsables des lésions myocardiques après un infarctus sont multiples et encore mal définis. Le but principal de ce projet est donc d’étudier non seulement le rôle de l'hème en tant que DAMP mais également de vérifier si l'hème peut stimuler certains facteurs de protection dans le cœur pendant l'infarctus du myocarde. De plus, nous évaluerons l'effet pharmacologique de nouvelles molécules (HYCOs) qui pourraient être très efficaces pour neutraliser les effets délétères de l'hème et favoriser la protection contre l'inflammation et les lésions tissulaires pendant l’IM. Pour ce projet, la plupart des expériences sur l'IM seront réalisées sur des souris afin que nous puissions 1) comparer nos résultats avec des données antérieures publiées dans la littérature avec le même modèle et 2) avoir la possibilité de tester l'effet spécifique des HYCOs. Néanmoins, certaines expériences clés seront répétées dans le modèle du rat comme "preuve de concept", une étape essentielle pour vérifier que l'efficacité de nos molécules est reproduite dans différentes espèces. Les objectifs finaux seront de déterminer le rôle de l'hème et les effets bénéfiques des HYCO dans l'IM.
Bénéfices attendus
Il s'agit d'un projet visant à tester les effets pharmacologiques des composés libérant du CO et capable d'activer le facteur de transcription Nrf2 dans l'infarctus du myocarde. Cette étude nous fournira des informations nouvelles et importantes concernant l'applicabilité thérapeutique de la voie HO-1/CO dans les maladies ischémiques.
Procédures
Dans le modèle d'infarctus du myocarde chez la souris et le rat, chaque animal sera soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie complète. La chirurgie consiste en une thoracotomie suivie d'une ischémie par ligature de l'artère coronaire gauche pendant 60 minutes et d'une reperfusion. La procédure chirurgicale complète nécessite environ 90 minutes, moment auquel les animaux seront placés dans une chambre de réveil pour maintenir la température corporelle et l'oxygénation et pour se remettre de la chirurgie. Après l'infarctus, les souris seront traitées avec les composés par injection intrapéritonéale (i.p.) ou voie orale tous les 3 jours jusqu'au jour 7 ou jour 30. Chaque administration (i.p. ou orale) ne durera pas plus de 5 secondes. A 7 ou 30 jours après l'infarctus, l’effet thérapeutique des composés sera monitoré au niveau fonctionnel par échographie qui durera qui ne durera pas plus de 30 min. A la fin des expériences les animaux seront placés sous anesthésie profonde, un prélèvement de sang sera effectué et le coeur sera excisé.
Impact sur les animaux
Le degré de sévérité de la procédure de l'IM, bien maîtrisée, est quand même considéré de classe sévère. Nous prendrons donc toutes les précautions pour éviter tous les nuisances indésirables de cette procédure. L' IM est exécutée sous anesthésie générale et des analgésiques seront injectés après la procédure pour réduire la douleur, l'effet indésirable le plus important causé par cette procédure. Les animaux seront gardés dans une chambre dédiée et suivi pour s'assurer de son bien-être jusqu'à leur réveil et rétablissement complet de la chirurgie.
Devenir
Comme nous avons besoin de collecter les coeurs pour une analyse metabolique, génique et biochimique à la fin de chaque protocole expérimental, tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Avant de finaliser et d'optimiser les protocoles du projet, nous avons initialement synthétisé 20 composés et testé leurs effets bénéfiques sur les cardiomyocytes en culture remplaçant ainsi l'utilisation de milliers de souris. L’ensemble de ces 20 composés avait la capacité de libérer efficacement du CO et d'exercer une activation de Nrf2 mais seulement 2 composés sur 20 n'ont montré aucun effet cytotoxique aux concentrations utilisées précédemment pour des composés similaires. Ces tests in vitro nous ont permis de sélectionner les 2 meilleurs composés, en fonction également de leur structure chimique diversifiée. Malgré la réduction du nombre de composés à tester in vivo, l'utilisation de souris et de rats est nécessaire car c'est le seul moyen d'évaluer l'action pharmacologique et l'efficacité de nos composés spécifiques contre l'infarctus du myocarde (IM) (voir "Reduction"). Le modèle d'IM est standard et fortement utilisé par les chercheurs de différents laboratoires afin d'évaluer les actions protectrices de nouveaux médicaments.
Réduction
Les tests in vitro (Remplacement) nous ont permis de sélectionner les 2 meilleurs composés et nous a ainsi permis de réduire significativement le nombre de composants qui seront testés in vivo. Pour chacun des groupes étudiés (groupes "sham" vs. groupes traités) dans les 3 procédures proposées, nous utiliserons 8 animaux en raison de leur variabilité, pour obtenir des données significatives et afin d'avoir une puissance statistique suffisante. Chaque protocole nécessite son propre contrôle. Nos résultats seront comparés à certains résultats de la littérature, ce qui contribuera à éviter la réitération de certains essais déjà réalisés avec d'autres molécules aux mêmes propriétés. Après avoir collecté des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques. Deux types de tests seront utilisés en fonction des groupes comparés : le test Student si nous comparons deux groupes et le test Anova si nous comparons plus de deux groupes. Ce dernier sera suivi d'un post test de type Bonferroni. Les résultats seront jugés significatifs si la P-valeur est inférieure à 0.05 et si la différence entre les lots témoin et traité est inférieure ou égale à 2 avec une puissance de 0.9, comme publiée déjà, et ceci avec des effectifs de 8 animaux dans chaque groupe. A noter que la procédure 1 (souris C57/BL6) nous permettra de définir le mode d'administration le plus efficace des notre composés permettant ainsi de réduire le nombre de souris dans la procédure 2 (souris Nrf2KO) ainsi que le nombre de rats dans la procédure 3.
Raffinement
Pour minimiser la douleur et la souffrance des animaux, nous mettrons en place les points limites décrits dans chaque procédure. Pendant leur séjour à l’animalerie, les animaux auront à leur disposition des balles de coton pour nidifier ainsi que des feuilles de kraft pour jouer/se cacher et des bâtons de bois pour jouer/se cacher et feront l'objet d'une surveillance quotidienne. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale (induction de l’IM et examens à J7 ou J30). La douleur chirurgicale est prise en charge par des antalgiques. Un antalgique (buprénorphine, 0.1 mg/kg en sous-cutané) sera administré avant la chirurgie ainsi q’un anti-inflammatoire (kétoprofen 5 mg/kg en sous-cutané) après la chirurgie (IM). En cas de fortes hémorragies ou de troubles cardiaques, l’animal sous anesthésie sera mis à mort par injection de doléthal (150 mg/kg, i.p.).
Choix des espèces
La souris C57BL/6 est un modèle largement utilisé pour étudier l'effet de nouveaux composés thérapeutiques et leur efficacité dans les maladies cardiovasculaires. De manière analogue, les modèles d'infarctus du myocarde chez la souris et le rat ont été établis et bien décrits dans la littérature. Les souris Nrf2KO ont été largement utilisées ces dernières années pour déterminer l'effet protecteur spécifique induit par divers composés capables d'activer le facteur de transcription Nrf2. Le choix de ces espèces de souris et rat se justifie par le fait que nous devons également comparer nos données avec les nombreuses études présentes dans la littérature utilisant exactement les mêmes modèles de IM. Nous utiliserons à la fois des souris et des rats au stade de jeunes adultes (8-10 semaines). Les procédures utilisées pour provoquer l’IM sont couramment effectuées sur des souris et des rats âgés de 8 à 10 semaines, ce qui nous permettra de comparer nos propres résultats avec des études antérieures déjà publiées sur le même sujet.
Mémoire Innée et PDAC
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une irradiation, une greffe de moelle osseuse par injection rétro-orbitale sous anesthésie et une greffe de tumeur du pancréas, développant une pathologie que le porteur qualifie de "potentiellement grave". Le projet étudie la mémoire du système immunitaire face au cancer du pancréas. Le porteur affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible, tout en décrivant des travaux in vitro déjà menés en co-culture.
Objectifs
L'adénocarcinome pancréatique (PDAC) est un problème majeur de santé publique, avec une survie à 5 ans, tous stades confondus, estimée à 11% en France. Malgré les efforts pour mieux comprendre les mécanismes de résistance aux traitements, pour développer de nouvelles stratégies de prise en charge et pour rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques, de nouvelles connaissances et des approches originales pour relever ce défi sont nécessaires. Le PDAC se caractérise par un remodelage profond du paysage immunitaire afin d'atténuer l’inflammation anti-tumoral. Donc, un défi pour cibler les cellules immunitaires dans le cadre d'un traitement anticancéreux consiste à identifier les facteurs clés qui contrôlent les réponses inflammatoires anti-tumorales et pro-tumorales. Ce projet vise à mieux comprendre comment la système immunitaire s’adapte vis à vis des tumeurs, et notamment le PDAC. Dans cet objectif, nous allons mettre en place un procédure pour pouvoir étudier l’inflammation et les mechanisms moléculaires qui l’accompagne dans les cellules immunitaires avant et après adaptation à un tumeur. Ceci sera fait par bias de greffe de moelles osseuses de souris avec ou sans tumeurs dans des souris seins auxquelles nous allons greffer des tumeurs par la suite. Ces informations auront un impact important sur notre compréhension de la résistance immunitaire et des traitements utilisant des thérapies immunitaires pour le PDAC.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra d'évaluer l'héritabilité et la présence de la mémoire dans le compartiment des cellules souches du système immunitaire. Ces informations auront un impact important sur notre compréhension de la résistance immunitaire et des traitements utilisant des thérapies immunitaires pour le PDAC.
Procédures
Les animaux seront soumisent à 1 procédure chirurgicale (durée 40 minutes), 1 irradiation (durée 12 minutes), 1 injection rétro-orbitaire sur des souris anesthésiées (durée 7 minutes), et 2 prises de sang rétro-orbitaire sur des souris anesthésiées (durée 7 minutes chaque).
Impact sur les animaux
Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie potentiellement grave. L'anesthésie constituera une nuisance sur les animaux. Les manipulations, le court jeune avant transplantation ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse. Autres nuissances éventuels pourraient être induit lors de l’irradiation (peur/détresse), le site de l’injection retro-orbital des greffes de moelles faites sous anesthésie, l’injection éventuelles d’analgésésiques post-opératoire, et des piqures retro-orbital pour les prélèvement de sang post-greffe de moelle (douleur lié au lésion de la piqure).
Devenir
Tous les animaux seront mise à mort à l'issue de chaque procédure, ou plus tôt selon les points limites, pour la prélevement et l'analyse des organes.
Remplacement
Des alternatives non animales ne sont pas disponible dans ce domaine pour aborder les questions scientifiques posés. Cependant, l'utilisation de modèles tumoraux orthotopiques murin permet d'étudier l'environnement tumoral et de reproduire l’hétérogénéité tumorale qui ne peut être recréé in vitro (i.e. un seul organe isolé) ou chez une espèce autre que les mammifères. Ce modèle se prête également aux greffes de moelle osseuse qui sont nécessaires pour étudier la transmission de la mémoire immunitaire. De plus, leur utilisation dans de nombreux projets scientifiques a permis des avancées significatives et le transfert vers des essais cliniques. Des modèles in vitro avec des cellules de moelle osseuses murin mise en co-culture avec des organoides de tumeur pancréatique murin, pour étudier les mécanismes moléculaires associé à l’activation des macrophages issue de souris avec PDAC ou sans tumeur et ensuite exposés aux signaux émis des cellules cancéreuse, ont déjà été accomplis.
Réduction
Le nombre d'animaux/groupe expérimental nécessaire pour obtenir une signification statistique a été défini en déterminant : - le test statistique à utiliser : ANOVA et test post-hoc (Tukey) pour comparer les 2 groupes expérimentaux entre eux. - l'effet biologique et la dispersion attendus, cette estimation a été faite en fonction des données bibliographiques et/ou des résultats antérieurs obtenus par le laboratoire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. Les contraintes par rapport à la douleur, la souffrance et l’angoisse dans le cadre de l’expérimentation présentées dans le projet seront réduites par une surveillance accrue avec des points limites spécifiques et adaptés. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Nous utiliserons aussi une lampe chauffante pour maintenir les animaux au chaud lors des chirurgies avec maintien de l’enrichissement, de la socialisation et de l’alimentation. Les chirurgies sont faites sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L'espèce choisie est la souris C57BL/6, car elle permet le transfert adoptif de cellules immunitaires et tumorales. Elle est couramment utilisée en oncologie et dans la recherche sur les cellules souches. Les conditions expérimentales de transplantation de nos modèles tumoraux (a) et hématopoiétiques (b) sont clairement exposés dans la littérature scientifique du domaine. Les souris doivent être âgées de 6 à 8 semaines au moment de greffe. Cet âge est nécessaire pour que le système immunitaire soit mature.
Evaluation du rôle des intégrines β1 et β3 plaquettaires dans les saignements inflammatoires (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Selon les modèles, elles subissent une inflammation de la peau, des poumons ou du cerveau, dont un AVC provoqué par chirurgie, avec injections rétro-orbitales et pose d'un cathéter à la queue. Le porteur indique que le modèle pulmonaire peut provoquer une détresse respiratoire et le modèle d'AVC des douleurs et des difficultés motrices. Les souris sont tuées encore anesthésiées pour quantifier les saignements dans les tissus.
Objectifs
Ce projet sera réalisée dans deux établissements utilisateurs. L’arrêt des saignements implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion du vaisseau, adhèrent, s’activent et agrègent pour former le clou plaquettaire qui limite le saignement. Il a été mis en évidence que les plaquettes jouent un rôle particulièrement important également dans l’arrêt des saignements en conditions inflammatoires. En effet, l’inflammation induit un recrutement des neutrophiles qui traversent la paroi vasculaire entrainant la formation de brèches vasculaires. Les plaquettes jouent alors leur rôle et colmatent les brèches. Cependant, les mécanismes impliquant les plaquettes dans ce processus restent encore peu compris à ce jour. Ce projet vise donc à évaluer l’importance d’une famille de récepteurs présents à la surface des plaquettes, les intégrines β1 et β3, dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension des mécanismes impliquant les plaquettes dans l’arrêt des saignements inflammatoires, ce qui à terme pourrait conduire à une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Pour l’inflammation cutanée, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à des injections intradermiques et rétro-orbitales et à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h). Pour l’inflammation pulmonaire, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h) et à une inoculation intranasale. Pour l’inflammation cérébrale, les animaux anesthésiés sont soumis à des prélèvements de sang à la queue, à des injections rétro-orbitales, à la pose de cathéter au niveau de la queue permettant une perfusion continue d’un traitement (maximum 1h), à une chirurgie au niveau du cou qui permettra d’induire un AVC (maximum 30min) et à une imagerie IRM (maximum 1h). Toutes les interventions sont faites dans l’EU1, sauf l’IRM qui est réalisée dans l’EU2.
Impact sur les animaux
Un effet indésirable attendu est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire, un saignement au niveau du point de prélèvement ou d’injection. De plus, une inflammation locale sera observée. Dans le modèle pulmonaire, on pourra observer une surcharge de liquide dans les poumons conduisant à une détresse respiratoire légère à modérée. Pour le modèle d’AVC, on s’attend à des douleurs suite à la chirurgie, à des difficultés motrices et pour s’alimenter dues aux manifestations de l’AVC.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux encore anesthésiés sont mis à mort afin de prélever et quantifier les saignements dans les tissus.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’importance d’une famille de récepteurs présents à la surface des plaquettes, les intégrines β1 et β3, dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire. Ce processus fait intervenir de multiples types cellulaires (plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales), il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par d’autres méthodes du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus complet.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 10 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison de moyennes des résultats obtenus pour chaque groupe d’animaux.
Raffinement
Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Par l’application d’une goutte de tétracaïne sur l’œil après les injections retro-orbitale pour réduire la douleur au réveil • Par l’injection de lidocaïne 4 mg/kg et de buprénorphine 0.1 mg/kg 10 min avant la chirurgie dans le modèle d’AVC pour réduire la douleur Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
Ce travail s’appuie sur des travaux effectués sur la souris démontrant le rôle primordial des plaquettes dans l’arrêt des saignements en condition inflammatoire. Afin de pouvoir comparer nos résultats avec ceux publiés, il est nécessaire de réaliser ce modèle dans la même espèce animale. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.
Evaluation des effets anti-allodyniques ou anti-hyperalgésiques d’une ou plusieurs molécules dans différents tests de douleur chez le rat .
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
7 925 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, modéré et sévère, la plupart tués à l'issue et 3 000 réutilisés. Ils reçoivent des stimulations mécaniques ou thermiques douloureuses et des administrations répétées de composés par de multiples voies, une des procédures étant classée sévère. Le projet teste des candidats analgésiques dans des modèles de douleur, comme prestation pour des clients. Le porteur affirme que seule l'étude chez l'animal non-humain vigile permet de mesurer la douleur et non la seule nociception.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. D’une part, le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur et tests comportementaux et pour différents types de douleur (mécanique, thermique). D’autre part, certains tests visent à évaluer les effets secondaires de composés pharmacologiques issus de différentes classes. En effet, une utilisation abusive s’est développée ces dernières années dans l’utilisation des opiacés mettant à jour une crise appelée « crise des opioïdes ». De plus, d'autres composés (alternatifs auc opiacés) provoquent généralement une forte sédation, une somnolence et ont donc un impact sur la démarche et la coordination motrice. C’est pourquoi il est nécessaire de développer de nouvelles molécules antalgiques de référence tout en limitant les effets secondaires. Ces tests sont couramment décrit dans la littérature et sont réalisés fréquemment au sein de la communauté scientifique. L’objectif de ce projet est donc de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisées en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des tests de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients mais aussi à destination du domaine de la santé animale. A plus court terme, la publication de certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Tests : stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux seront également soumis à la contention ou isolés dans des compartiments le temps des tests. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les nuisances liées aux tests sont dues à l’application d’un stimulus douloureux ou non (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal (nuisance légère 1 min). Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (légère 1 min) ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité possible mais réduite (nuisance légère, 4h maximum). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle, nuisance légère 1 min). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites (sédation, posture anormale). Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance légère 3 min). Les animaux de la procédure 11 subiront les nuisances liées à la mise à jeun (modérée, maximum 24h). Les animaux de la procédure 12 subiront des nuissances liées à l'adminsitration répétée de composés (nuisance sévère).
Devenir
Tester des composés pharmacologiques en développement ne permet pas la réutilisation des animaux pour à nouveau leur administrer d'autre composés. En effet, les molécules pharmacologiques peuvent avoir un impact sur l'immunité, les structures anatomiques... De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité. Néanmoins, dans le cas de certaines procédures les animaux ne présentant pas de signe de souffrance et pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple) sous réserve de ne pas augmenter la sévérité.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Ces tests sont couramment mis en place au sein de la communauté scientifique. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place. Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclut ou limiter à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse par nos clients. En fonction du design de chaque étude des analyses statistiques seront réalisées.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Les animaux sont hébergés par groupes sociaux (de 2 à 5) selon la directive 2010-63. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre de tests thermiques, le choix des températures ou de la gamme de filaments est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (c’est-à-dire la réponse à un stimulus non douloureux chez l’animal sain). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, traitements particulies. Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention dans le monde scientifique. Chez ces espèces la démonstration de la capacité à ressentir la douleur est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles à adolescents (4-7semaines). Ce stade a été choisi car il est adapté au développement des modèles, il permet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Production de réactifs et de tissus dans le cadre de la production et du contrôle qualité des vaccins commercialisés ou en développement
- Production de routine
- Tests réglementaires
Cochons d'Inde : 1000
Lapins : 250
Furets : 80
1 000 cobayes, 700 souris, 250 lapins et 80 furets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de sans réveil à sévère. Ils reçoivent des injections d'antigènes, parfois avec un adjuvant pouvant provoquer des réactions locales sévères, ou une inoculation du virus de la grippe pour les furets, avant un prélèvement de sang par ponction cardiaque terminale sous anesthésie. Le sang et les anticorps ainsi produits servent au contrôle qualité de vaccins commercialisés. Le porteur affirme que ces réactifs d'origine animale sont "obligatoires" et sans alternative in vitro disponible.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’assurer la fourniture des produits biologiques d’origine animale, nécessaires à la réalisation des tests de contrôle qualité assurant la mise sur le marché de lots de vaccins. 2 sous-objectifs : • La production de réactifs d’origine animale : Procédure 1 : prélèvement de sang de cobaye pour utilisation des globules rouges. • La production d’anticorps contre différents antigènes : Procédures 2 à 8 : productions d’antisérum sur lapins, souris ou furets (réactifs pour test Elisa ou séroneutralisation d’un antigène d’intérêt).
Bénéfices attendus
L’entreprise compte sur ces réactifs pour la mise à disposition de nombreux vaccins à l’échelle mondiale.
Procédures
Les durées représentent le temps pendant lequel les animaux sont anesthésiés. Quant aux injections et inoculations, le geste lui-même dure quelques secondes. Procédure 1 : 1 prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez le cobaye (durée totale de la procédure : 30 minutes). Procédure 2 : 1 inoculation intranasale de virus grippal sous anesthésie générale (30 minutes), prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez le furet (30 minutes) (durée totale de la procédure : 14 jours). Procédure 3 : 3 injections en sous-cutané scapulaire (30 minutes par injection) + 2 injections en intra-veineuse d’antigène polio (30 minutes par injection) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez le lapin (30 minutes) (durée totale de la procédure : 28 jours). Procédure 4 : 4 injections en intra-veineuse d’antigène Dengue (30 minutes par injection) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez le lapin (30 minutes) (durée totale de la procédure : 42 jours). Procédure 5 : 3 injections intra-musculaire et sous-cutané d’antigène Vi (30 minutes par injection) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez le lapin (30 minutes) (durée totale de la procédure : 56 jours). Procédure 6 : 2 injections en sous-cutané scapulaire d’antigène Vi (30 minutes par injection) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez la souris (30 minutes) (durée totale de la procédure : 28 jours). Procédure 7 : 2 injections en sous-cutané scapulaire d’une solution d’anatoxine pertussis purifiée adsorbée (30 minutes par injection) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez la souris (30 minutes) (durée totale de la procédure : 28 jours). Procédure 8 : 1 injection en sous-cutané scapulaire vaccin pertussis acellulaire (30 minutes) ; prélèvement de sang intracardiaque terminal sous anesthésie générale chez la souris (30 minutes) (durée totale de la procédure : 28 jours).
Impact sur les animaux
La production de réactifs d’origine animale consiste en un prélèvement de sang terminal chez le cobaye, sous anesthésie générale. Aucune douleur n’est infligée aux animaux. La production d’anticorps contre différents antigènes peut nécessiter l’utilisation d’adjuvant, afin d’optimiser la réponse immunitaire de l’animal, et ainsi, utiliser le moins possible d’animaux. Ce composant peut entrainer des réactions de type allergique ou des réactions locales aux sites d’injection. Le degré de gravité peut être sévère lorsque l’animal subit ces réactions locales (douleur au point d’injection avec altération de l’état général). La prise en charge de ces réactions se fait sous la supervision du vétérinaire et inclut l’usage d’analgésique afin de réduire cet impact.
Devenir
Les animaux inclus dans ce projet ne peuvent être ni replacés, ni réutilisés, ni adoptés pour le 2 raisons suivantes : • Pour des raisons HSE, l’injection d’un agent pathogène ne permet pas d’envisager la sortie de ces animaux des animaleries. • Les 8 procédures de ce projet ont pour but de récolter un volume maximal de sang ou de sérum sur les animaux utilisés, et ainsi utiliser le moins possible d’animaux pour la production de ces réactifs.
Remplacement
L’utilisation des réactifs d’origine animale décrits dans ce projet est obligatoire: 1/ Absence d’alternative in vitro et utilisation préconisée dans la réglementation : a/ Cas des globules rouges de cobayes - préconisations : o par l’Organisation Mondiale pour la Santé dans les rapports techniques (TRS) pour la recherche de virus hémadsorbants. Par exemple :TRS 910 sur le vaccin poliomyélite inactivé. o Par la Pharmacopée européenne. Exemple : la monographie générale (2.6.16) « Virus hémadsorbants » qui s’applique à ne nombreux vaccins. b/ Cas du sérum de furet – exigence de l’Agence Européenne du Médicament pour les vaccins antigrippaux. EMA/CHMP/BWP/426390/2017 Questions and answers on the Haemagglutination Inhibition (HI) test for qualification of influenza vaccine (inactivated) seed preparations 2/ Absence d’alternative in vitro disponible adaptée à l’utilisation visée (cas des autres anticorps polyclonaux) : Ces réactifs sont utilisés à des fins de séroneutralisation ou de dosages immunochimiques in vitro (exemple : ELISA). Nous travaillons sur les alternatives possibles (exemples : ligands alternatifs et combinaison de plusieurs anticorps monoclonaux). Pour les réactifs concernés dans ce projet, la solution de remplacement n’est pas encore disponible car il est nécessaire d’obtenir une performance au moins équivalente au réactif actuel pour valider la nouvelle méthode.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est calculé au plus juste de façon à répondre aux besoins de tests sur la période (quantité de réactifs). Ce calcul tient compte des durées de péremption des réactifs d’origine animale produits mais aussi des évolutions technologiques pour les tests considérés et des perspectives de marché pour les vaccins produits. Des études de prolongation des durées de péremption ont permis d’étendre la durée d’utilisation des réactifs.
Raffinement
Pour les procédures ou d’effets indésirables sont attendus, des points limites sont mis en place afin d’éviter aux animaux toutes atteintes potentielles à leur bien être tout au long des dites procédures. Souris : Elles sont hébergées en groupe dans des cages avec litière contenant plusieurs enrichissements : des plateformes anti-noyades, des dome-home (abris en carton) pour créer des barrières visuelles, des neslets (carrés de coton) utilisés pour la nidification. Cobayes : Ils sont hébergés en groupe dans des cages contenant plusieurs enrichissements : des buchettes en bois à ronger, des huttes pour créer des barrières visuelles, du foin de Crau pour compléter leur alimentation. Lapins : Le projet est en cours d’améliorer l’enrichissement de l’environnement avec hébergement en groupe supérieur à deux individus, sur litière, avec plusieurs enrichissements à disposition : du foin frais pour compléter leur alimentation, des jeux type balles. Procédure n°3 : Production d’antisérum polio sur lapins gradée sévère : mise au point d’un scoring de la douleur et des points limites associés, pour la prochaine campagne de production. Furets : Les furets sont hébergés en binôme, sur litière dans des enclos au sol, avec parois transparentes. Plusieurs enrichissements sont à leur disposition : des hamacs, des jeux de cachette, des balles, des abris en inox pour s’isoler… Un temps de jeux et d’échanges avec les techniciens en charge du soin de l’espèce est prévu quotidiennement. Pour chacune de ces espèces, des récompenses alimentaires (graines et fruits secs) leur sont distribuées après un acte jugé stressant ou douloureux.
Choix des espèces
Souris : La souris est un modèle qui permet la production d’anticorps en faible quantité. Il s’agit d’une espèce facile à héberger, y compris en confinement (à la différence des grandes espèces) lorsque les antigènes utilisés nécessitent ce type d’hébergement. Il s’agit d’une espèce pour laquelle les signes cliniques locaux sont peu fréquents après immunisation. Cobaye Pour la fourniture des globules rouges l’espèce cobaye est expressément mentionnée dans les textes règlementaires. Le test a été validé avec cette espèce. Lapin : Le lapin est utilisé fréquemment pour la production d’anticorps. Il s’agit d’une espèce facile à héberger, y compris en confinement (à la différence des grandes espèces) lorsque les antigènes utilisés nécessitent ce type d’hébergement. Son gabarit permet de recueillir un volume de sérum important ce qui limite le nombre d’animaux utilisés. Enfin, son système immunitaire répond activement aux protocoles d’immunisation. Furet : Le furet est utilisé pour la fabrication des anticorps grippe. Cette espèce est très sensible au virus grippal et produit des anticorps séroneutralisants, à la différence des autres espèces habituellement utilisées en expérimentation animale.
Préparation de fractions microsomales de foies ou de reins de rongeurs
- Production de routine
- Tests réglementaires
Rats : 270
180 souris et 270 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une injection unique d'un inducteur d'enzymes, puis leur foie ou leurs reins sont prélevés sous anesthésie mais sans analgésie, le porteur jugeant l'absence d'analgésique "indispensable" pour éviter des interférences avec le produit. Ces organes servent à fabriquer le S9, un réactif utilisé dans les tests réglementaires de génotoxicité. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'équivalent de synthèse au S9 et que les animaux ne sont traités qu'en fin de stock.
Objectifs
Des tests reglementaires réalisés sur cellules et bactéries en culture, requis pour évaluer le potentiel génotoxique de produits en développement avant leur mise sur le marché, nécessitent l'utilisation d'un système biologique permettant de mimer les phénomènes de métabolisation par le foie ou le rein. Ce système est appelé S9. Il est fabriqué à partir de foies ou reins prélevés chez le rongeur (rat ou souris) après administration unique d'un activateur pour produire les enzymes du métabolisme et permet au laboratoire de constituer des stocks qui seront utilisés dans les tests reglementaires.
Bénéfices attendus
L'iutlisation de S9 dans les études réglementaires est obligatoire. La préparation de S9 permet permet de générer des stocks qui seront utilisés dans de telles études.
Procédures
Le produit n'est administré qu'une fois à des lots d'animaux (6 lots de 6 animaux chacun, rat ou souris) par voie intrapéritonéale. La substance n’a qu’une incidence légère sur l’animal (il s'agit d'une substances induisant la production d'enzymes du métabolisme) et les volumes administrés sont dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Les animaux sont exposés au produit 5 jours avant prélèvement sous anesthésie des foie ou reins qui serviront à la fabrication du S9. les animaux sont mis à mort au moment du prélèvement des organes.
Impact sur les animaux
Nuisance légère: injection unique par voie intrapéritonéale: les animaux peuvent ressentir une douleur passagère au point d'injection. Nuisance légère: stress de l'anésthésie. Nuisance sévère: retrait du sang et prélèvement des organes sur animal anesthésié sans analgésie (indispensable pour éviter des interférences lors de l’utilisation du produit)
Devenir
Le foie ou les reins sont prélévés sur animaux anésthésiés pour préparer le S9. Les animaux sont donc mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
Le S9 est une fraction de foie ou de rein servant de système d’activation métabolique pour les tests réglementaires in vitro qui sont requis pour évaluer le potentiel génotoxique des produits testés au laboratoire (médicaments, produits chimiques…), et établir les dossiers de demande d’autorisation à fournir aux autorités compétentes. Le S9 de rat/souris est le plus communément utilisé dans les études réglementaires et recommandé par les lignes directrices de l'OCDE des protocoles qui utilisent le S9. Il n'existe pas d'équivalent de synthèse (chimique par exemple) au S9 qui est alors fabriqué à partir de foie et/ou reins de rongeurs. La préparation de S9 permet au laboratoire de générer des stock qui seront utilisés dans les tests reglementaires.
Réduction
Le traitement d'animaux pour générer des stocks de S9 n'est réalisé qu'une fois le stock sur le point d'être épuisé afin que des animaux n'aient pas été mis à mort inutilement. Une estimation du stock nécessaire est faite avant toute mise en place de la procédure afin de traiter le minimum d'animaux possible
Raffinement
Les volumes administrés sont dans des limites appropriées à la taille et à l’espèce de l’animal. Le traitement de nouveaux animaux pour générer le S9 n'est prévu qu'en fin de stock. La substance administrée n’induit pas de stress ou de douleur. Cependant, après traitement, un suivi comportemental et clinique est effectué. Les observations portent sur les modifications de la peau, des poils, des yeux et des muqueuses, l'appareil respiratoire, le système circulatoire, le système nerveux central et autonome, l'activité somato-motrice et le comportement. Puis observation des diverses manifestations de tremblement, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie, sommeil et coma. Tout animal montrant des signes cliniques modérés et/ou intenses, ou une perte de poids importante (>20% ) fait l'objet d'une mise à mort. Pour retirer le sang et prélever les organes l'animal est anesthésié et il n'est pas possible d'utiliser un analgésique pour éviter les interférences quand le produit sera utilisé.
Choix des espèces
Le S9 de rat/souris est le plus communément utilisé dans les études réglementaires et recommandé par les lignes directrices des protocoles qui utilisent le S9. Au maximum, 90 animaux sont utilisés par an (54 rats, 36 souris) soit 450 animaux (270 rats, 180 souris) sur 5 années d’autorisation de projet. La préparation est décrite dans de nombreuses publications qui stipulent ques les animaux doivent être traités à l'âge de 5 à 10 semaines
Etude pilote pour le suivi par imagerie de lymphocytes T humains greffés chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur greffe des lymphocytes T humains, puis des médicaments sont testés pour activer un "gène suicide" censé détruire ces cellules en cas d'effet indésirable, avec injections, pesées et imageries sous anesthésie. Le porteur indique que la greffe peut provoquer une atteinte de la peau et du poil, une perte de poids et une baisse d'activité, d'intensité modérée à sévère. Il s'agit d'une étude pilote sur douze animaux, et le recours à la souris est déclaré "indispensable" pour valider in vivo un résultat déjà obtenu in vitro.
Objectifs
Les lymphocytes T font partie d’une catégorie de globules blancs qui jouent un rôle très important pour les défenses de l’organisme. Ces cellules sont responsables de la réponse immunitaire cellulaire visant à détruire les agents pathogènes, aussi bien les bactéries que les cellules cancéreuses. L’idée d’utiliser ces lymphocytes T pour le traitement de certains cancer est en plein développement. Le principe de ces thérapies consiste à prélever des cellules immunitaires d’un patient (ici, les lymphocytes T), pour les modifier génétiquement et les lui réinjecter dans le but de reconnaître puis éliminer les cellules cancéreuses. Aujourd’hui de nombreux essais cliniques ont démontré l’efficacité des thérapies par ces cellules dans l’élimination des cellules tumorales chez l’animal et l’humain, particulièrement les leucémies et lymphomes. Cependant, leur efficacité est contrebalancée par de fréquents effets secondaires indésirables tel que la production massive de substances toxiques suivie par un syndrome de neurotoxicité. Ces effets secondaires empêchent l’utilisation de ces cellules comme traitement de première intention chez les patients. Dans ce projet nous souhaitons démontrer la possibilité de pouvoir éliminer de façon contrôlée ces cellules génétiquement modifiés si des effets indésirables apparaissaient, élargissant ainsi les applications cliniques de ces cellules. Pour contrôler ces cellules en clinique chez l’homme, elles peuvent être équipées de gènes « dit suicide » qui sont activables par des médicaments cliniquement approuvés. L’activation du gène suicide par le médicament va déclencher la mort du lymphocyte T. Nous avons démontré le concept in vitro en substituant le gène suicide par un gène luminescent et montré que le médicament permettait d’activer le gène luminescent en activant un signal luminescent dans la cellule. L’objectif de ce projet est de valider le concept in vivo, déterminer les médicaments et les doses efficaces, permettant d’activer la production du signal de luminescent dans des lymphocytes T humains greffés chez la souris.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de cette étude pilote préclinique est la validation de systèmes de sécurité, inductibles et contrôlés, permettant d'éliminer des lymphocytes T greffées chez un patient en cas d’effets secondaires graves pour le traitement de pathologies. Cette sécurité vise à perfectionner considérablement les protocoles actuels de ces cellules et favorisera leurs utilisations en première intention améliorant ainsi la prise en charge des cancers et le traitement de certaines pathologies auto-immunes.
Procédures
Les souris seront soumises à une pesée hebdomadaire soit 8 pesées d'une durée de moins de 30 secondes (réalisées sur animal vigile). Si une perte de poids était observée, des pesées supplémentaires seront réalisées deux fois par semaine ou tous les jours. Deux à trois injections maximum sur animal anesthésié, d'une durée de moins de 30 secondes, seront réalisées. Deux à trois injections maximum sur animal vigile, d'une durée de moins de 15 secondes, seront réalisées. Chaque animal sera également soumis à 3 ou 4 imageries d'une durée de 5 minutes réalisées sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Un stress, de courte durée de moins de 30 secondes, pourra être généré au moment des contentions des souris et lors des pesées hebdomadaires. Du stress sera également généré lors des anesthésies d'une durée de 5 à 10 minutes maximum. Les injections pour l'inoculation des lymphocytes et des médicaments pourront également générer une douleur d'intensité légère de courte durée (10 à 15 secondes). Des nuisances d'intensité modérée à sévère, sur une durée de un à plusieurs jours, en lien avec la greffe des lymphocytes T chez la souris pourront apparaitre. Ces manifestations se caractérisent par une atteinte de l'intégrité de la peau, du poil, une perte de poids, une modification de l'activité.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus pour des analyses.
Remplacement
Des tests in vitro réalisés ont montré que les médicaments étaient capables d'activer la production d'un signal luminescent dans des lymphocytes T humains. Nous souhaitons maintenant valider le concept in vivo aussi l'utilisation du modèle souris est indispensable.
Réduction
Il s'agit d'une étude pilote sur petit effectif d'animaux, 12 animaux au total, 3 par groupes, 4 groupes d'animaux qui nous permettra de valider les médicaments, leur posologie et les manifestations cliniques de la greffe de lymphocytes T humains chez la souris.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant 5-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Les pesées seront réalisées sur animal vigile par contre tous les autres gestes techniques seront réalisés sur animal anesthésié afin de diminuer le stress et l'inconfort de l'animal. Tout au long de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins adaptée.
Choix des espèces
Nous utiliserons comme modèle la souris. Cette souris n'a pas de cellules immunitaires ce qui évite le rejet des lymphocytes T humains. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 15-20 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules humaines.