Procédures sévères

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour tester une thérapie combinée de réparation de la moelle épinière. Elles subissent une lésion médullaire sous anesthésie, une injection de biomatériau puis des séances de stimulation magnétique, avec des tests de locomotion. Le porteur indique attendre une paralysie des membres postérieurs et une difficulté à se déplacer pour se nourrir et s'abreuver après le réveil. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative satisfaisante" et que la récupération fonctionnelle après lésion "ne peut être mesurée que sur l'animal".

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière entraînent un handicap à vie avec des conséquences socio-économiques lourdes et restent à ce jour sans traitement. La complexité des lésions médullaires entrave la réparation par une mauvaise revascularisation, la libération de molécules toxiques, et la formation de cavités ; exacerbées par une ischémie et une inflammation persistante. Ainsi, les thérapies efficaces devront combiner des approches synergiques pour surmonter ces multiples obstacles. Notre projet est basé sur l'injection après lésions médullaires d’implants de biomatériaux, sous forme d’hydrogel, qui améliore la réparation des tissus et la récupération fonctionnelle. L'efficacité de cet hydrogel sera optimisée avec la stimulation magnétique répétitive de faible intensité et le recrutement des cellules souches endogènes spinales épendymaires. Nous comptons ici déterminer l’efficacité de cette combinisaison thérapeutique à recruter les cellules souches médullaires au site de lésion. Pour cela nous utiliserons 240 souris transgéniques qui permettront de suivre le devenir de ces cellules après lésion et mise en place des thérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet s’intéresse aux lésions de la moelle épinière et à leur traitement. En particulier, nous souhaitons ici tester une combinaison thérapeutique et l’effet de celle-ci sur le recrutement et la différenciation des cellules souches médullaires. Une meilleure compréhension des mécanismes qui concourent au recrutement de ces cellules après mise en place de thérapies innovantes permettrait, sur un plus long terme, d’envisager de proposer cette combinaison thérapeutique dans le cadre de la prise en charge des bléssés médullaires chez l’Homme.

Procédures

Cette étude sera réalisée sur 240 souris (120 males et 120 femelles). L’ensemble de ces souris recevra 5 injections de produit recombinant (une injection par jour pendant 5 jours par voie intra-péritonéale, chaque injection durera moins d’une minute), la première injection étant effectuée 15 jours avant la lésion. Quinze jours après la première injection, sur l’ensemble de ces souris sera réalisée une lésion de la moelle épinière sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. Tous les animaux opérés recevront une injection d’antalgique 20 minutes avant la chirurgie et une seconde 6 heures après la chirurgie . Le jour de l’opération 120 souris (groupes chitosan LlrMS+chitosan) recevront une injection de 2µl de biomatériau directement dans la zone de lésion, cette procédure pendra 10 minutes et rallongera donc la chirurgie de 10 minutes pour ces animaux. Le jour de la chirurgie, les animaux recevront deux injections de produit permettant de suivre la division des cellules (100µL par injection, 2 injections IP séparées de 6h). Le lendemain et jusqu’au 15ème jour après la lésion, 120 souris (groupe LlrMS et groupe LlrMS+chitosan) bénéfieront de la stimulation magnétique de basse intensité pendant 10 minutes (10hz pendant 10 secondes suivies de 20 secondes sans stimulation avec une intensité de 10 mT). Ces stimulations magnétiques se feront sur des animaux vigiles. Sur ces 240 souris, 80 réaliseront des expériences de locomotion non-contrainte, ces expériences sont non-invasives et non douloureuses. Ces expériences nécéssitent de réaliser quatre cessions par temps expérimentaux (2, 4, 8 et 16 semaines après la réalisation de la lésion). Chacune des cessions durera 15 minutes.

Impact sur les animaux

- Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie - Paralysie des membres postérieurs - Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s’abreuver après le reveil

Devenir

L’ensemble des animaux (240 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (16 semaines maximum après la transsection médullaire) afin de procéder au prélévement de la moelle. Les souris ayant subis des lésions médullaires (240 souris), ne peuvent de ce fait pas, même si cela était possible d’un point de vue expérimentale, faire l’objet d’un don ou bien d’une « réutilisation ».

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer le recrutement des cellules souches, ainsi que la récupération fonctionnelle de l’animal suite à une lésion de la moelle épinière.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué à partir d’études précédentes, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 à 10 animaux et les expériences fonctionnelles nécessitent un minimum de 10 animaux. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6 par groupe. L'utilisation de 10 animaux pour certaines expériences se justifie par la variation pouvant être observée notamment lors des tests fonctionnels (motivation des animaux).

Raffinement

Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés. Par ailleurs, les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisèment d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.

Choix des espèces

Ce projet s’intéresse aux lésions de la moelle épinière et à leur traitement. En particulier, nous souhaitons ici tester une combinaison thérapeutique et l’effet de celle-ci sur le recrutement et la différenciation des cellules souches. Une meilleure compréhension des mécanismes qui concourent au recrutement de ces cellules après mise en place de thérapies innovantes permettra dans le futur de les proposer aux personnes souffrant de lésions traumatiques de la moelle épinière. Cela nécessite la mise en place de modèles comparables aux pathologies humaines. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de modèles animaux. En particulier, nous étudions les cellules souches épendymaires ce qui nécéssite l'utilisation d'une lignée de souris transgénique afin de pouvoir suivre le devenir de ces cellules au cours du temps. Les animaux utilisés seront agées de 8 semaines, les lésions médullaires chez l’Homme concerne le jeune adulte, de ce fait afin de mimer au mieux ces lésions, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines.

72 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour comparer cinq candidats vaccins contre la fièvre hémorragique de Crimée-Congo. Elles sont vaccinées puis infectées par le virus, les douze souris non vaccinées devant développer perte de poids, dos voussé, fourrure ébouriffée, faciès émacié et léthargie jusqu'à un point limite atteint en quatre à cinq jours. Trente-six animaux sont tués au pic de la maladie, les autres subissant des prélèvements sanguins rétro-orbitaux avant mise à mort. Le porteur affirme qu'il est "impossible" de tester in vitro le degré de protection d'un vaccin et que le recours à des "organismes entiers" reste "indispensable".

Objectifs

Le projet se réalise dans 2 établissements utilisateurs. L’objectif de ce projet est de développer un vaccin contre la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHF). Il s’agit ici de déterminer quels seront les meilleurs candidats vaccins contre le virus CCHF parmi ceux que nous avons développé au laboratoire. En effet, des constructions vaccinales ont été réalisées et produites en quantité injectables mais seule une expérimentation animale peut permettre de tester leur efficacité à protéger contre CCHF. Pour cela, des souris, qui ont déjà été validées dans un modèle d’infection par le virus CCHF seront vaccinées à l’aide d’une première dose de vaccin environ 2 mois avant infection et une dose de rappel un mois après la première injection. Les animaux seront ensuite infectés par le virus pour tester le niveau de protection conféré par les vaccins. Cinq candidats vaccins seront testés en comparaison avec un groupe de souris n’ayant reçu que le milieu de resuspension des candidats vaccins, qui ne confère aucune protection contre le virus CCHF. Cette expérimentation permettra non seulement de valider l’efficacité de nos candidats vaccins mais aussi de les comparer entre eux pour définir celui ou ceux qui peuvent être engagés plus avant dans leur développement.

Bénéfices attendus

L’aire de répartition du virus CCHF s’étend et atteint déjà l’Europe de l’Ouest. Cette progression est principalement liée à la circulation des tiques du genre Ixodidae qui sont vecteurs de ce virus. Le virus CCHF infecte les humains et peut provoquer une fièvre hémorragique dont le taux de mortalité atteint 40%. Les humains se contaminent soit par morsure de tique soit par contact avec des fluides contaminés d’animaux infectés. En effet, les animaux d’élevage (bovins, caprins…) s’infectent suite à des morsures de tiques et peuvent répliquer le virus et le transmettre même s’ils ne sont pas symptomatiques. Les éleveurs et les personnels d’abattoirs sont donc à risque accru de contracter la maladie. Ce virus représente donc un problème de santé publique contre lequel il faut se prémunir. Comme très souvent dans le cas des infections virales aigües, la vaccination constitue une prophylaxie efficace en absence de traitements antiviraux. A ce jour, aucun vaccin contre le virus CCHF n’est commercialisé. Notre projet met à l’étude des candidats vaccins pour lesquels la plateforme vaccinale a déjà été éprouvée et l’innocuité du vecteur testée. Dans le cadre de ce projet, nous avons produit plusieurs candidats vaccins contre le virus CCHF et la phase suivante pour déterminer leur efficacité est de démontrer leur capacité à induire une réponse immunitaire protectrice contre l’infection par ce virus. Parmi les cinq candidats vaccins qui seront testés au cours de la même expérimentation, et grâce aux échantillons biologiques collectés auprès des animaux vaccinés (ou non) et infectés, nous pourrons évaluer l’efficacité du vaccin, vérifier l’absence de persistance virale et mesurer la synthèse d’anticorps spécifiques du virus. L’utilisation des animaux pour cette phase de validation est donc justifiée au vu de l’impact potentiel sur l’Homme de ce virus et pour la mise en place d’une prophylaxie. L’analyse des résultats de ce protocole permettra de mieux comparer l’efficacité des différents vaccins (quels candidats vaccins permettent la survie de tous les animaux d’un même groupe) et d’évaluer leur immunogénicité (quels sont les antigènes qui promeuvent la meilleure protection contre le virus).

Procédures

Les animaux seront en expérimentation pour deux périodes successives dans deux animaleries distinctes pour une durée totale d’environ 3 mois. Animalerie 1 : Dans cette animalerie, après répartition en 6 groupes de 12 animaux (6 mâles + 6 femelles par groupe, 5 vaccins testés soit 1 vaccin différent pour chaque groupe et un groupe non vacciné), les 72 animaux subiront les interventions suivantes : - Identification au sein d’un même groupe par encoches au niveau des oreilles. - Quatre anesthésies, deux pour l’injection des vaccins (primo-vaccination + rappel) à un mois d’intervalle et deux pour des prélèvements sanguins pour analyse génétique. Chaque animal sera anesthésié pendant environ 10 à 15 minutes le temps d’être vaccinés ou prélevés. Chacun des gestes effectués sur les animaux dans l’animalerie A1 ne durera pas plus de 2 à 3 minutes. Animalerie 2 : La seconde période est celle de l’infection avec le virus pour évaluer l’efficacité de protection des vaccins testés. - Tous les animaux subiront une première anesthésie au cours de laquelle une puce leur sera implantée pour mesurer leur température corporelle et où ils seront infectés avec le virus. Cette anesthésie durera environ 15 à 20 minutes pour chaque animal. - A J4 post infection, c’est-à-dire au pic des symptômes de la maladie provoquée par le virus, 36 animaux seront anesthésiés puis mis à mort afin de prélever le maximum de sang ainsi que leurs organes. - A J10 post infection, les animaux survivants seront anesthésiés pour leur prélever du sang. Cette anesthésie durera environ 10 à 15 minutes pour chaque animal. - Enfin, tous les animaux survivants à la date fixée de fin de protocole seront anesthésiés avant mise à mort afin de prélever le maximum de sang ainsi que leurs organes pour analyses anatomopathologiques. Au cours de chaque anesthésie, les animaux seront pesés. Chacun des gestes effectués sur les animaux dans l’animalerie A2 ne durera pas plus de 4 à 5 minutes.

Impact sur les animaux

Dans l’EU1/2, peu d’effets indésirables sont à prévoir. Les animaux subiront quatre anesthésies au cours d’un protocole d’environ deux mois et demi au cours desquelles il sera procédé à deux injections de vaccins et deux prélèvements de sang. Les plateformes vaccinales testées dans ce protocole ont déjà été utilisées et n’ont pas causé d’effets secondaires chez les animaux à l’exception d’une fièvre modérée dans les heures suivant l’injection. Les nuisances attendues devraient donc être très faibles. La prise de sang peut causer des hématomes mais la faible fréquence de prélèvements devrait limiter l’impact sur les animaux. Dans l’EU2/2, tous les animaux (n=72) subiront une anesthésie au cours de laquelle ils seront implantés d’un puce télémétrique sous-cutanée ente les épaules et ensuite infectés avec un virus pathogène. Les animaux non-vaccinés (n=12) devraient manifester rapidement les signes cliniques de l’infection avec perte de poids, dos voussé, fourrure ébouriffée, faciès émacié et léthargie pour atteindre un score clinique limite ou un point limite en 4 à 5 jours environ. Les animaux vaccinés ne devraient pas présenter de signes cliniques durant cette même période. Après la mise à mort des animaux à J4 (n=36), les animaux survivants (n=30) seront anesthésiés et un prélèvement sanguin rétro-orbital sera pratiqué. Les nuisances associées à ces gestes seront les mêmes qu’en post-vaccination.

Devenir

Certains animaux seront mis à mort au cours de la procédure afin de comparer au pic de la maladie induite par le virus si les vaccins les ont bien protégés en comparant leurs paramètres virologiques et anatomopathologiques avec ceux du groupe contrôle. Tous les animaux survivants seront mis à mort à la fin de l’étude dans les locaux de l’animalerie 2. Les animaux ayant survécus à l’infection grâce aux vaccins devront être étudiés en détail à travers l’étude de leurs organes et de leur sang qui seront prélevés en fin de protocole afin de vérifier si le virus inoculé persiste ou non dans l’organisme des animaux vaccinés.

Remplacement

Il est impossible à l’heure actuelle de déterminer par des expérimentations in vitro le degré de protection que peut conférer une solution vaccinale et donc de conclure sur l’efficacité de celle-ci. Le recours à des organismes entiers reste indispensable pour éprouver les candidats vaccins.

Réduction

Dans ce projet, 6 groupes de 12 animaux seront constitué : 5 groupes reçoivent chacun un vaccin différent, le sixième groupe constituant le groupe contrôle. Après vaccination, tous les animaux sont infectés avec un virus qui provoque la létalité dans ce modèle de souris. Afin de mesurer la protection induite par les vaccins au cours de l’infection, la moitié de l’effectif de chaque groupe est mise à mort au pic de la maladie afin de collecter le maximum d’échantillons biologiques pour analyser qualitativement et quantitativement la protection par rapport aux animaux non vaccinés. La mise à mort de six animaux par groupe constitue un minimum nécessaire pour évaluer la reproductibilité des observations d’un animal à l’autre et réaliser des tests statistiques robustes de comparaison de groupes. La comparaison de la survie entre animaux vaccinés et non vaccinés est donc établie sur un effectif de 6 animaux dans chaque groupe ce qui garantit également une analyse statistique de qualité : courbes de survie et analyse comparative des données issues de l’analyse des prélèvements biologiques effectués sur les animaux au moment de la mise à mort. La réduction du nombre d’individus dans chaque groupe pourrait altérer de façon significative la qualité de l’analyse des données, compromettant ainsi l’ensemble de la procédure et l’intérêt du recours à cet effectif animal pour évaluer l’efficacité de ces vaccins.

Raffinement

EU1/2 Les animaux, du fait de leur immunodéficience, seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes (SPF) avec des cages autoclavées avec nourriture et boisson stériles pour éviter tout risque de contamination microbienne indésirable. Chaque geste technique (injections, prélèvements) sera réalisé sous poste de sécurité microbiologique (PSM) et une désinfection avant et après de la zone à injecter/prélever sera réalisée par application de vétédine. Tous les gestes techniques (injections et prélèvements) sont réalisés sous anesthésie afin de protéger les expérimentateurs des risques liés à la manipulation d’OGM MOT de classe 2. Ces anesthésies permettront de diminuer la douleur qui aurait pu être provoquée par l’injection du vaccin ou le prélèvement sanguin. Après chaque anesthésie, les animaux peuvent présenter transitoirement une fatigue post-anesthésie et/ou un déshydratation transitoire. Un enrichissement de l’environnement, une réhydratation des animaux à l’aide de sérum physiologique par voie sous-cutanée, l’ajout de gel hydrique ainsi que de friandises peuvent être appliqués ainsi qu’un réchauffement si besoin. EU2/2 La réalisation des gestes techniques sous anesthésie (injections et prélèvements) permet de réduire grandement le stress des animaux et d’éviter des contentions longues. Le faible nombre de prélèvements effectués permet de réduire le nombre d’anesthésie et les effets associés (perte d’appétit, fatigue post-anesthésie). Malgré le confinement strict lié aux activités de l’EU 2/2, les conditions d’hébergement classiques sont maintenues. Des observations journalières seront réalisées afin d’évaluer l’état de chacun des animaux selon une matrice de score établie pour ce modèle et selon le virus utilisé et les signes cliniques attendus. En période de week-end avant challenge viral, un système de vidéosurveillance permettra de visualiser si les animaux ont toujours de la nourriture et de la boisson. À tout moment, en cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en zone sera programmée pour procéder à une observation des animaux et à une possible décision d’arrêter le protocole.

Choix des espèces

Il a été démontré qu'une ligné ede souris était susceptible à l’infection par le virus de la fièvre hémorragique de Crimée Congo (CCHF) et en reproduisait la physio pathogénèse observée chez l’Homme. Ce modèle de souris a également été utilisé dans le cadre de plusieurs essais vaccinaux contre le virus CCHF. Il s’agit donc d’un modèle adapté pour comparer les différents candidats vaccins et évaluer leur efficacité. Les animaux utilisés seront des adultes (à partir de 2 mois). Il est nécessaire que le développement de leur système immunitaire soit mature pour évaluer au mieux la réponse immune mise en place suite à la vaccination.

200 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont isolés quatre jours puis reçoivent un appât anticoagulant, avant une surveillance quotidienne sur 28 jours et une mise à mort dès les premiers signes d'empoisonnement. Le porteur décrit des hémorragies, un état de faiblesse et une anémie conduisant à la mort, et empoisonne ainsi des rongeurs pour homologuer des produits destinés à tuer des rongeurs. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible, la réglementation imposant de tester l'appétence et la mortalité sur les espèces cibles.

Objectifs

La lutte contre les rongeurs est un enjeu de santé publique et un enjeu économique majeur pour l’industrie agro-alimentaire. En plus des mesures classiques d’hygiène et de conception des bâtiments, la politique de lutte contre les rongeurs fait appel à des appâts anticoagulants. Ces appâts sont consommés par les rongeurs et ils ont un effet biocide. L’utilisation de ces biocides est considérée comme étant la méthode chimique létale la plus efficace. Tous les anticoagulants ont le même mécanisme d’action, ils inhibent les facteurs de la coagulation sanguine, dits « vitamine K1 dépendants », conduisant à un trouble de la coagulation. Ce trouble de la coagulation engendre de la mortalité dans la population de rongeurs diminuant ainsi les problèmatiques liées à une surpopulation. La toxicité de ces anticoagulants est connue et souvent déjà bien évaluée in vitro et in vivo. Cependant, la réglementation exige de nouveaux tests in vivo si la composition d’un traitement évolue (e.g. : concentration, appétence augmenté, passage d'une formulation liquide à une formulation solide). En effet, le changement de composition peut entrainer une modification du comportement des rongeurs face à l’appât. Selon la réglementation, ces produits modifiés doivent être obligatoirement testés conformément à des recommandations précises avant de pouvoir être mis sur le marché. L’entreprise à l’origine de cette DAP est prestataire pour d’autres entreprises. Ces entreprises lui délèguent les tests nécessaires à l’homologation de leurs produits anticoagulants rodenticides ou le cas échéant la ré-homologation imposée par la législation après 5 ans d'utilisation commerciale. Les procédures réalisées dans ce projet permettent de tester l’appétence et l’efficacité d’un rodenticide sur rat et/ou souris (mesure de la consommation et de ses effets). Les résultats de ces procédures permettrons de jugué quant à l'homologation du produit ou non. Cette demande d’autorisation de projet, encadre différents produits et formulations de produits provenant de différents délégataires. Les principes actifs de ces produits sont tous des anticoagulants perturbant le métabolisme de la vitamine K. Les résultats des procédures alimentent un dossier réglementaire très strict permettant de réaliser des demandes d’autorisation de mise sur le marché. Ces autorisations sont obligatoires et positivement bien encadrées.

Bénéfices attendus

La gestion problématique des déchets de consommations et des poubelles a intensifié un fait ayant toujours existé, la présence de rats et de souris en contact direct avec l’être humain. Comme pour beaucoup d’espèces vivantes, une prolifération intense engendre des conséquences négatives. Dans notre cas, la prolifération de rats et de souris peut avoir des conséquences sanitaires (droit de retrait pour le rammassage des containers poubelle, leptospirose, transmission de diverses bactéries et helminthes), cela peut entrainer des dégâts sur les ressources alimentaires (10% à 15% des pertes mondiales :consommés/contaminés/jetés) et les rongeurs sont à l'origine de dégâts matériels conséquent (en France : coût annuel des dégâts = environ 38 millions d'euros, galeries, accès aux bâtiment, sites de passage souillés, câbles rongés, accidents liés au dysfonctionnement). De plus les proliférations de rongeurs ont un impact très négatif sur l'image des sites infestés et une répercution économique et sociale importante sur ces sites (fermetures d'écoles, industrie agroalimentaire fermé par le autorités sanitaires, restaurant, boulangeries). Quant aux particuliers concernés par ces infestations la répercussion psychologique n'est pas négligeable. Le développement de produits rodenticides plus performants est un élément important de la lutte contre la prolifération des rongeurs. L'utilisation d'anticoagulants est le moyen chimique le plus efficace pour diminuer la pression parasitaire. Ces anticoagulant doivent être homologués, aussi la réalisation de tests réglementaires est indispensable à la mise sur le marché de ces produits. De plus, les rodonticides ne présentant pas les résultats attendus par la réglementation ne seront pas autorisés. Donc ce projet permet d’empêcher la mise sur le marché de produits inefficaces. Or l'utilisation de produits inefficaces peut être à l’origine de résistances pour la cible (rongeurs) mais demeurer mortel pour des espèces non-ciblées (eg.chien). Aussi Il est très important de tester ces produits afin d'écarter les produits inefficaces. En résumé, il y a des avantages économique, écologique, sociale et sanitaire à la mise sur le marché de produits efficaces, or cette mise sur le marché nécessite la réalisation des tests décrits dans ce projet comme préconisé par la loi et la réglementation.

Procédures

Les animaux seront maintenus en cage individuelle (isolement) durant 4 jours. Les cages des animaux isolés sont à proximité de cages contenant des congénères afin de conserver un contact visuel, sonore et olfactif. Les cages individuelles contiennent un enrichissement supplémentaire (abris et du coton). Durant 4 jours, un produit anticoagulant est proposé à la consommation en libre choix en regard d’une alimentation habituelle. Quotidiennement durant 28 jours, les animaux sont sortis de leur cages et doucement manipuler durant moins de 10 minutes afin d’observer leur orifices (nez, yeux, bouche oreille, anus appareil génital) et d’être pesé. Lorsque les animaux présentent les signes cliniques d’une intoxication aux anticoagulants, alors afin de limiter la souffrance des animaux, ils sont mis à mort.

Impact sur les animaux

Au regard de leur nature sociale, l’isolement des individus (rats et souris) durant 4 jours est une source de mal-être chez le rat et la souris. C'est à pondéré avec un maintien des individus à proximité d’autres cages afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif avec leurs congénères. Nous n'attendrons pas d'observer d'intoxications graves dues aux anticoagulants. En effet ceux-ci entrainent des hémorragies, occasionnant différents maux et troubles significativement négatifs : hémorragies interne et externe entrainant un état de faiblesse et d'apathie, sans douleurs mais susceptible de provoquer un mal-être et dont l'issue est une anémie aigüe entrainant la mort. Aussi, il est inconcevable d'attendre la mort par intoxication aux anticoagulants. Aussi, une observation régulière des animaux permettra de déceler les animaux commençant à présenter des signes négatifs d’intoxication (prostration, pelage, léthargie, décoloration des extrémités ou saignements); ces points limites permettront d’effectuer une mise à mort très en amont de la mort liée à l’anticoagulant. La sortie, l'auscultation et la pesé régulière des animaux peut être une source d'angoisse surtout si cela se cumule avec un mal-être/souffrance existante aussi une période d'habituation permettra de diminuer les contraintes liées à ces manipulations.

Devenir

Attendre une intoxication létale aux anticoagulants est inenvisageable. Sont mis à mort les animaux montrant des signes précoces d’un empoisonnement aux anticoagulants. La mise à mort permet d’éviter des souffrances inutiles à l’animal. Si l'animal ne présente pas de signes cliniques permettant de juguer quant à son empoisonnement, il est néanmoins victime d'une fragilité au niveau de la coagulation pouvant perdurer plusieurs mois. Cette fragilité de coagulation pourrait se révéler cliniquement en dehors du temps d'observation prévu par la procédure et engendrer des souffrances importantes si une mise à mort n'est pas réalisée à temps. Ce risque de fragilité de coagulation est trop important pour envisager une réutilisation des animaux. Aussi, les animaux ayant reçu l’anticoagulant sont euthanasiés à la fin des procédures.

Remplacement

Il n'y a pas de stratégie de remplacement possible. En effet, la réglementation impose de tester l'attractivité alimentaire du traitement (consommation) et les effets du traitement (mortalité). Ces critères ne peuvent être observés que sur animaux vivants, le comportement de consommation en particulier ne peut être simulé. De plus, la réglementation impose que ces produits soient testés sur les espèces cibles, c’est à dire rats et souris. il y a donc une obligation réglementaire empêchant ce remplacement par d'autre espèces animales.

Réduction

Dans le cadre d’une Autorisation de mise sur le marché (AMM) d’un produit produit biocide de type anticoagulant, les essais règlementaires soumis au législateur doivent être mis en place selon des recommandations strictes. Pour chaque formulation à l’étude, il est recommandé de tester à minima 10 animaux par espèce ciblée. Pour chaque formulation et selon la revendication du produit, des tests pourront être conduit sur les 2 espèces ou sur une espèce. Ainsi, si un produit à l’étude cible les rats et les souris alors 20 animaux sont utilisés dans la procédure (10 rats et 10 souris). La loi exige de tester un minimum de 10 animaux; nous souhaitons utiliser le moins d'animaux possible, aussi nous ne testerons que le minimum d’individus préconisé soit 10 animaux par procédure. Un test statistique sera réalisé afin de vérifier si la consommation et la mortalité sont identiques entre les 2 sexes, le cas échéant ces taux seront calculés en prenant en compte la population entière. Le nombre d’animaux définit suffira à déterminer la tendance statistique nécessaire pour voir si le produit testé est suffisamment consommé (≥20% de la ration alimentaire) et s’il permet une mortalité efficace (≥90% des animaux testés). Afin de ne pas inclure inutilement des animaux dans les procédures, nous ne testons pas d'animaux témoin. Nous nous basons sur une survie théorique de 100% des individus témoin en nous basant sur les périodes d'acclimatation et d'habituation qui précédent le test. Afin d'éviter un biais de placement pour la mesure de la consommation, l'emplacement du produit est inversé quotidiennement avec l'emplacement de l'aliment de laboratoire habituel (aliment extrudé ou biberon d'eau).

Raffinement

Phase d'Acclimatation : durée = 7 jours minimum , acclimatation le cas échéant à la salle, à l’aliment, aux procédures d’hébergement, aux congénères. Phase d'Habituation : Durée = 7 jours. Afin d’individualiser les animaux, un signe distinctif est réalisé au marqueur indélébile sur leur queue. Afin d’habituer les animaux aux manipulations et au manipulateur, celui-ci réalise différentes actions sur les animaux. Quotidiennement, le manipulateur consigne pour chaque animal : l’état du pelage, des yeux et des oreilles et le comportement de l’animal. Pour chaque animal, le manipulateur saisit délicatement l'animal, le sort de la cage, réalise une brève observation et le pèse. Lors de la brève observation, le manipulateur vérifie l’état des différents orifices (bouches, oreilles, nez, anus, appareil génitale). La masse des animaux et la masse d’aliment non-consommé est consignée quotidiennement, puis une masse déterminée d’aliment est mise à disposition. Ainsi, le manipulateur prend connaissance du comportement "normal" de chaque animal et pourra le comparer à celui de l'animal sous anticoagulant. De plus, l'animal habitué réagira moins aux manipulations lorsqu'il sera sous anticoagulant, ce qui évitera l'accumulation de contraintes. Phase d’isolement : durée = 4 jours . Lors de l’hébergement individuel, l’environnement est enrichi (cachette + coton). Les animaux sont placés dans des cages transparentes à proximité d’autres cages afin de maintenir un contact visuel, auditif et olfactif avec leurs congénères. Après ces 4 jours d'isolement, les rongeurs femelles sont regroupés. Les mâles non-agressifs seront regroupés suivant leur affinité et groupe de départ. Sinon, ils seront maintenus isolés. Phase d’observation de la mortalité (J+2 à J+21) : Signes précoces d’intoxication ou de morbidité = mise à mort. Afin d’éviter des souffrances inutiles aux animaux, l'observations des points limites en regard d'un score au delà duquel les animaux sont mis à morts est mis en place. Les cages et éléments d’élevage sont adaptés à l’espèce et au nombre d’animaux. Si une baisse de poids supérieure à 10% est observé, alors de l’aliment humidifié et de l’eau gélifiée seront fournis à l’animal. À la suite de chaque réalisation de procédure, une analyse rétrospective sera réalisée pour le comité éthique afin d'améliorer d'un point de vue "éthique animal" la procédure (affinement des points limites, des observations ...).

Choix des espèces

Les produits sont destinés à limiter la surpopulation indésirable de rongeurs en agriculture, en industrie ou en milieu urbain. La réglementation exige l’utilisation des espèces cibles comme modèle expérimental. L’utilisation de rongeurs est appropriée puisque les produits testés ont pour destination une utilisation sur rats et souris. Bien que les traitements anticoagulants ciblent les rongeurs « sauvages », nous utilisons des souches de laboratoire. En effet, en plus de la contrainte d’obtention, d’habituation et du risque sanitaire, la récupération d’individus sauvages est en soit une source de stress et de mal-être chez l’animal. Une souche de laboratoire « non résistante » nous permet de réaliser plus efficacement l’observation des points limites. Les souches testées sont quasiment identiques aux souches sauvages. Nous utiliserons des adultes afin de conserver une certaine homogénéité dans la consommation interindividuelle de produit à l’étude. Ainsi, nous conservons une relative maitrise de l'intensité et du délais avant apparition des effets toxiques. Ainsi, nous pouvons anticiper de manière plus fine et donc mieux gérer la souffrance et détresse. Dans un objectif de réutilisation, les animaux utilisés seront idéalement d’anciens reproducteurs issus des laboratoires d’élevage. Nous utiliserons des animaux âgés de plus de 6 mois et de moins de 1,5 an, cela correspondant à la fourchette d'âge observée dans la nature, de plus les individus sont de masses relativement homogènes et donc plus facilement comparables.

1 050 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une greffe de cellules cancéreuses dans le fémur, provoquant des douleurs osseuses et un risque de fracture, puis subit des stimulations mécaniques et thermiques répétées, pour tester des molécules contre la douleur cancéreuse sans traiter le cancer lui-même. Le porteur indique que les animaux ne peuvent être gardés au-delà de dix-huit jours après l'injection des cellules et sont ensuite tués. Il affirme que la douleur, "expérience sensorielle et émotionnelle", ne peut être étudiée que chez l'animal vigile.

Objectifs

La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. Les patients atteints de cancer peuvent ressentir des douleurs dans 30-50% des cas. Ces douleurs ont plusieurs origines (70% liées directement au cancer dues à des lésions tissulaires, et 20% dues aux traitements agressifs, 10% d’origine inconnu). Les métastases surviennent chez 65-80% des patients dans le cas des cancers du sein et de la prostate notamment. La douleur liée au cancer est un des principaux symptômes chez les patients atteints de cancer métastatiques (Sein, poumon, prostate). Les principales conséquences des métastases sont le risque de fractures, des hypercalcémies, des syndromes de compressions nerveuses et des douleurs. De nombreux facteurs peuvent contribuer à la douleur tel qu’une pression accrue sur les os et les nerfs des microfractures ou fractures dues à une réduction progressive de l'intégrité structurelle de l'os, d'une lésion des fibres nerveuses sensorielles dans l'os. Sans réelle solution pharmacologique, ces patients sont donc soumis à des douleurs de plusieurs origines. Les thérapies classiques ne suffisent pas à soulager les patients et présentent de nombreux effets secondaires. L’objectif de ce projet est de proposer des modèles et tests pertinents qui permettront l’évaluation de l’efficacité de nouvelles molécules à visée analgésique qui pourront ensuite être utilisés en clinique. Le but, à long terme, étant de mieux traiter les patients souffrant de douleurs cancéreuses et de limiter les effets secondaires des composés utilisés.

Bénéfices attendus

Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des modèles de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients. A plus court terme, la publication scientifique pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.

Procédures

Induction du modèle : chirurgie sous anesthésie afin d’induire le modèle. Tests : stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.

Impact sur les animaux

Le modèle décrit dans ce projet induit des douleurs osseuses liées à la pousse tumorale dans le fémur. Les animaux ont une fragilité de l’os. Ils présentent donc un risque de fracture et la progression d’une tumeur extra-osseuse (nuisances sévères). Les animaux peuvent aussi présenter des postures anormales dans le but de soulager la douleur, ceci pouvant entrainer une perte de poids ou une altération de la locomotion (nuisances modérées). Les nuisances liées aux tests sont liées à l’application d’un stimulus douloureux (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal (nuisance légère, durée quelques secondes). Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité réduite mais possible (nuisance légère de quelques minutes à plusieurs heures). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle, nuisance légère). Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites. Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang unique ou répétés afin d’évaluer la pharmacocinétique du composé (nuisance légère

Devenir

Le modèle de ce projet est un modèle de douleur cancéreuse. Nous essayons de traiter la douleur mais pas le cancer en lui-même. Aucun traitement efficace n’existe pour ce cancer et les traitements actuels ne sont pas sans effets secondaires. Les animaux ne peuvent donc pas être gardés plus de 18jours après l’administration de cellules cancéreuses. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles et les données générées précédemment.

Raffinement

Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Les animaux sont hébergés par groupes sociaux (selon le poids final attendu) de 2 à 6 selon la directive 2010-63. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : soins post opératoires, aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, sous cutanée de NaCl ou de Glucose en post chirurgie ou en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention par le responsable du bien-être animal. Chez ces espèces la démonstration de la capacité à ressentir la douleur est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux péri-adolescents (4-6semaines ; 150-200g le jour d’induction du modèle). Ce stade a été choisi car les animaux ne sont plus en pleine croissance. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.