Procédures sévères

880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont isolées socialement pendant 24 heures ou six semaines, reçoivent des injections de cocaïne et subissent des chirurgies, des tests comportementaux et des prélèvements sanguins submandibulaires que le porteur reconnaît pouvoir provoquer des hémorragies et des lésions de l'os maxillaire. L'objectif est d'étudier l'effet de l'isolement sur la rechute à la cocaïne, les retombées thérapeutiques et sociales restant énoncées comme des perspectives. Le porteur qualifie le modèle murin d'"incontournable" en neurosciences et juge "indispensable" de travailler sur un animal "entier".

Objectifs

En Europe, les troubles d’usage de substances psychoactives représentent un problème majeur de santé publique, avec environ 83,4 millions d’adultes, soit 29% de la population européenne, ayant consommé une ou des substances psychoactives au cours de l’année écoulée. Parmi ces substances, l’usage de cocaïne est en constante augmentation, notamment en raison d’une importante production massivement importée (64.000 saisies représentant 213 tonnes pour l’année 2019), qui conduit à la banalisation de son usage et le développement de comportement d’addiction. Un aspect important de cette pathologie est le risque élevé de rechute lorsque les usagers essayent d’arrêter ou simplement de contrôler leur consommation. En effet, parmi les patients pris en charge pour troubles d’usage de cocaïne, 50% ont déjà été pris en charge antérieurement pour le même trouble. Bien que les travaux de recherche fondamentale et clinique aient apporté de solides connaissances sur les mécanismes mis en jeu lors de la transition entre un usage récréatif et les troubles de l’usage, la compréhension des phénomènes de rechute reste limitée. Entre autre, l’environnement social des consommateurs semble pouvoir à lui seul participer au phénomène de rechute. Notamment, une majorité de consommateur indique souffrir d’un isolement social et d’un sentiment de solitude qui pourraient être, en partie, à l’origine des comportements de rechute. Dans ce contexte, ce projet vise à évaluer, dans un modèle murin, l’impact de l’isolement social aigu (24 heures) et chronique (6 semaines) sur les comportements liés à la cocaïne et en particulier le comportement de rechute.

Bénéfices attendus

Ce projet a le potentiel d'apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur la manière dont notre système nerveux fait face et s'adapte à l'isolement social et sur la manière dont les conditions sociales peuvent participer aux troubles liés à l'utilisation de substances psychoactives, notamment la cocaïne. Cet aspect fondamental aidera à développer de nouvelles approches thérapeutiques. Par exemple, au niveau préclinique, notre étude apportera de nouvelles cibles neuroanatomiques pour les protocoles de stimulation magnétique transcrânienne afin de traiter certaines des conséquences de l'isolement social. En ce qui concerne les applications sociales, ces travaux aideront également les acteurs sociaux à mieux communiquer avec les personnes souffrant de troubles liés à l'usage de substances et leur famille en expliquant comment les conditions sociales peuvent aider ou aggraver leur(s) trouble(s). Ainsi, à terme, ces travaux pourraient avoir un impact positif direct sur la vie quotidienne des personnes souffrant d’isolement social et/ou de troubles de l’usage de substances et un impact économique indirect en réduisant les troubles associés à l’isolement social et en améliorant la qualité de vie de patients atteints de troubles de l’usage de substances.

Procédures

Le but de ce projet est d’étudier l’effet de l’isolement social sur les comportements d’addiction. Ainsi trois groupes de de souris seront utilisés : le premier restera groupé, le second sera isolé pendant 24h et le troisième sera isolé pendant 6 semaines. De plus, des injections aigues (1 injection unique; 30 secondes) ou chroniques [5 injections au total (1/jour) ; 30 secondes par injection] ainsi que des tests comportementaux (durée maximum 10 min) seront réalisés sur animaux vigiles. Les différentes procédures expérimentales mettront en jeu des prélèvements sanguins (maximum de 6 prélèvements par souris ; 2 prélèvements/jour au maximum avec au moins 1h entre chaque prélèvement; chaque prélèvement durera au maximum 30 sec) ainsi que des chirurgies (durée maximum 1h). L'ensemble de ces nuisances possibles sera évalué et traité afin de réduire la souffrance animale.

Impact sur les animaux

L’ensemble des procédures nécessitent un isolement social (objet de ce projet) d’une partie des animaux. Cet isolement sera soit aigu (24h) soit chronique (6 semaines) et peut créer un stress important aux animaux. Certaines des procédures de ce projet nécessitent des chirurgies pouvant induire une douleur modérée, une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. Les injections aigues ou répétées de cocaine peuvent induire un état de dépendance physique. De plus, la répétition des injections peut provoquer une douleur aigue transitoire, une inflammation locale au niveau du site d’injection, voire une induration. Les stimulations aversives induisent un stress transitoire aux animaux. Les prélèvements sanguins par voie submandibulaire peuvent induire une hémorragie ou encore des dommages à l’os maxillaire.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l’évaluation de comportement de type addictifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vigile.

Réduction

Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 20 animaux/groupe pour le comportement, 10 pour les analyses immunohistologiques et d’analyse d’activité calcique. Bien que de nombreux groupes contrôles soient nécessaires pour ce projet (animaux groupés vs isolés, saline vs cocaïne, contrôle des virus utilisés) et que les deux sexes seront utilisés les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation d’enregistrement longitudinaux permettra de réduire grandement le nombre d’animaux nécessaire pour cette partie du projet. De même, la combinaison de procédures comportementales avec des procédures de prélèvement sanguins permettra de ne générer qu’une cohorte de souris pour répondre à deux questions scientifiques.

Raffinement

Avant isolement et tout au long des expériences pour les animaux témoins, les souris sont hébergées en cage collective, dans un milieu enrichi (matériel de nidification et bâton)), et observés quotidiennement par l’expérimentateur, ou une personne compétente de façon à maximiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. A l'exception du milieu enrichi (matériel de nidification et bâton), aucune condition spécifique ne sera mise en place pour les animaux isolés. L'objectif de cette étude étant d'évaluer l'effet de l'isolement social sur les comportements d'addiction, nous ne souhaitons pas ajouter d'éléments d'enrichissement qui pourraient être des éléments confondants, perturbant les interprétations des résultats. Ainsi, les animaux isolés seront hébergés dans des conditions identiques à celles des animaux groupés à l'exception de la présence de congénère. Pour chacune des procédures, des points limites adaptés ont été définis. Le bien-être animal sera évalué tout au long de l’isolement en prenant notamment en compte l’état général de l’animal, son poids et sa réactivité à la manipulation, permettant d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire. De plus, après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué plus spécifiquement afin de rapidement pouvoir émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale Enfin, le bien être animal sera également évalué lors des protocoles expérimentaux, nécessitant des injections intrapéritonéale répétée, afin d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur et la vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale.

Choix des espèces

Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier et complexe afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences. La souris est également une espèce sociale, permettant ainsi l’étude des effets de l’isolement social sur les comportements. Enfin, les outils viraux nécessaires à ce projet ont été développés et validés chez la souris, qui apparait encore donc comme le modèle le plus adapté à ce projet. Des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g) car l’étude des comportements dans nos différents modèles nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures.

Deux séances d'imagerie par semaine sous anesthésie pendant quatre mois au plus, et une prise de sang chaque semaine à la joue : 675 souris dépourvues de système immunitaire et irradiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. La déclaration en compte 600 en souffrance modérée et 75 en souffrance sévère. Greffées de cellules cancéreuses humaines par la veine de la queue ou, sous chirurgie, dans la rate, elles reçoivent ensuite des lymphocytes T dits "non conventionnels", issus de donneurs sains, dont l'équipe veut faire un traitement "universel" contre leucémies, lymphomes et cancers du poumon, du sein et du foie. Le porteur choisit la souris pour son comportement "bien connu et proche de l'humain", qui rendrait la douleur facile à évaluer, et prévoit chez ces souris irradiées et greffées infections, diarrhée, paralysie ou insuffisance respiratoire.

Objectifs

L’immunothérapie, une avancée majeure en médecine, a bouleversé la façon dont nous luttons contre le cancer et d’autres maladies. Contrairement aux traitements traditionnels, tels que la chimiothérapie ou la radiothérapie, qui ciblent directement les cellules cancéreuses, l’immunothérapie tire parti du système immunitaire du patient (système de défense de l’organisme contre les infections) pour combattre la maladie. Dans notre projet, nous nous concentrons sur plusieurs types de cancers hématologiques (leucémie et lymphome) et de cancers « solides », notamment les cancers du poumon, du sein et du foie. Notre objectif est de trouver une nouvelle approche qui pourrait être utilisée pour traiter ces cancers de manière plus efficace. L’une de nos stratégies consiste à utiliser des cellules du système immunitaire appelées lymphocytes T. Ces cellules sont des gardiens du système immunitaire qui patrouillent dans notre corps pour détecter et éliminer les menaces, y compris les cellules cancéreuses. Cependant, il existe deux types de lymphocytes T : les lymphocytes « conventionnels » et les lymphocytes T « non conventionnels ». Les lymphocytes T « conventionnels » sont des guerriers spécialisés qui sont parfois difficiles à obtenir chez les patients, en particulier s’ils ont déjà reçu des traitements agressifs. De plus, ils peuvent causer des effets secondaires indésirables, comme la destruction de cellules saines de notre corps. Nous explorons donc une approche novatrice en utilisant des lymphocytes T « non conventionnels ». Ces cellules proviennent de donneurs en bonne santé et pourraient être utilisées pour stimuler le système immunitaire du patient afin de lutter contre les cellules cancéreuses. Ce serait une sorte de traitement universel, efficace pour différents types de cancers, indépendamment du patient. Notre travail vise à rendre ces thérapies plus accessibles, moins coûteuses et à réduire les effets secondaires, tout en offrant un nouvel espoir à ceux qui luttent contre le cancer du poumon, du sein, du foie et d’autres types de cancer.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à démontrer la possibilité d’utiliser une autre population de cellules du système immunitaire permettant de traiter les patients atteints de cancer. Cette nouvelle stratégie thérapeutique éviterait les problématiques actuellement rencontrées avec des traitements similaires. La validation de nos hypothèses dans un modèle animal servira de base au développement de stratégies thérapeutiques innovantes pour améliorer les taux de guérison de pathologies cancéreuses graves.

Procédures

Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » applicable à différents cancers (cancer du sang, du poumon, du sein, du foie). Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux consistant tous en l’injection de cellules cancéreuses soit par voie intraveineuse (veine de la queue, durée moins d’une minute sur souris éveillée) soit par injection dans la rate (par chirurgie sous anesthésie et analgésie, durée 15 minutes) dans des souris dépourvues de système immunitaire et préalablement irradiées (cela permet d’augmenter la greffe des cellules cancéreuses et leur multiplication). Après l’établissement de la tumeur (en quelques jours), notre thérapie cellulaire sera injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute). La progression de la tumeur et donc l’efficacité de notre immunothérapie cellulaire seront suivis par imagerie sous anesthésie générale (durée de la session : 15 min) 24h après le début l'injection du traitement puis deux fois par semaine pendant toute la durée de l'étude, soit 4 mois maximum. Afin de compléter l’étude sur l’utilisation de cette population de cellules particulière en thérapie des cancers, nous serons également amenés à traiter un lot de souris avec la molécule connue pour activer nos cellules d’intérêt thérapeutique (administration par injection dans l’abdomen ou dans la veine de la queue au maximum tous les 2 jours, sans anesthésie ; durée de l’injection moins d’une minute). Nous testerons aussi la nécessité d’une 2e voire d’une 3e injection de nos cellules « médicament » pour éradiquer la tumeur. Nous évaluerons également la capacité de nos cellules à rester dans l’organisme et à prévenir une rechute en administrant une seconde dose de cellules tumorales. Chaque semaine, une prise de sang (1 à 2 gouttes prélevées au niveau de la veine de la joue sur souris éveillée) sera effectuée pour suivre la présence des cellules thérapeutiques (durée du prélèvement: 30 s; sur une période de 4 mois maximum).

Impact sur les animaux

Dans les différents modèles de cancer utilisés dans ce projet, l’étape d’irradiation rend la souris fragile aux infections et peut favoriser la présence d’une diarrhée et induire une perte de poids. Le développement des tumeurs peut lui aussi entraîner des nuisances telles que la douleur, une paralysie, une perte de poids, ou une insuffisance respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires). L’injection intraveineuse de cellules tumorales peut également causer du stress et de la douleur au moment de l’injection. En revanche, l’imagerie, bien que non invasive peut provoquer du stress lié à la manipulation. Pour cette procédure, les souris sont préalablement anesthésiées avec de l’isoflurane. L’anesthésie gazeuse peut perturber la régulation de la température corporelle des souris, et la répétition fréquente de ces anesthésies (deux fois par semaine pendant toute la durée de l’étude et à 24h d'intervalle au moment du début du traitement) peut avoir un impact sur leur bien-être. Les prélèvements de sang à la mandibule (réalisés une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure) peuvent provoquer une légère douleur temporaire et du stress. Comme leur nom l’indique, ces prélèvements peuvent entraîner un saignement mineur au site de ponction, généralement contrôlé en appliquant un légère pression. La chirurgie nécessaire à l’injection des cellules cancéreuses au niveau de la rate implique l’ouverture de la paroi abdominale. Cela peut entraîner des douleurs post opératoires, des problèmes de cicatrisation de la plaie chirurgicale et des effets secondaires tels qu’une infection, une hypothermie, une réaction inflammatoire locale et une altération temporaire du comportement alimentaire.

Devenir

Tous les animaux seront systématiquement euthanasiés au maximum 4 mois post-injection si pas d’atteinte du point limite. Les organes liés au système immunitaire, ainsi que ceux associés à notre population thérapeutique d’intérêt (comme le poumon et les muqueuses intestinales), seront prélevés en post-mortem pour une analyse au niveau cellulaire.

Remplacement

Pour tester l’efficacité de nos différentes thérapies, nous avons d’abord réalisé de nombreuses expériences en laboratoire (in vitro). Ces expériences nous ont permis de valider certaines réponses des cellules aux traitements, en utilisant différentes techniques dont des modèles en trois dimensions appelés sphéroïdes. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de notre nouvelle approche thérapeutique sans utiliser un modèle animal entier vivant.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant deux fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. De plus la mesure bi-hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle-ci devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple). Les imageries seront réalisées sous anesthésie. Lors de cette mesure de bioluminescence, nous effectuerons un suivi clinique des souris et établirons un score selon des critères de poids, d’apparence des poils, de mobilité, de comportement ainsi que de rythme respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) et des observations post-opératoires telles que l’état de la plaie et les déplacements de la souris après l’opération (pour la tumeur du foie, nécessitant une chirurgie).La chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées et ayant reçu au préalable l’administration d’anti-douleur, administration qui sera poursuivie dans les jours qui suivent.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles murins de cancers du sang, du poumon, du sein ou encore du foie sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales), les pathologies étudiées se développant chez les individus adultes.

592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont infectées par gavage avec des selles humaines porteuses de la microsporidie E. bieneusi, une partie recevant en plus un immunosuppresseur par injections répétées et des ponctions sanguines rétro-orbitales jusqu'à six fois en six semaines. Le porteur décrit des diarrhées, des douleurs abdominales et une perte de poids pouvant atteindre le point limite de 20 %, au-delà duquel les souris sont mises à mort. Il affirme que le parasite n'est pas cultivable in vitro et juge l'animal vivant "indispensable", tout en reconnaissant que plusieurs bénéfices cliniques avancés restent à démontrer.

Objectifs

Les microsporidies constituent un vaste ensemble d’eucaryotes intracellulaires pouvant infecter de nombreux hôtes. Chez l’Homme, les espèces les plus fréquemment isolées sont responsables de diarrhées profuses, particulièrement graves chez les immunodéprimés car sans traitement elles évoluent vers la chronicité et peuvent aboutir au décès du patient. Enterocytozoon bieneusi est l’espèce isolée dans plus de 90% des cas. De nombreuses interrogations concernant cette espèce sont encore sans réponse, notamment au sujet (i) de la physiopathologie concernant par ex. la dose infectieuse, les sites de persistance chez l’hôte, les cellules recrutées au site d’infection, la réponse immunitaire, (ii) de la thérapeutique concernant les molécules efficaces (le seul traitement dont l’efficacité a été démontrée, la fumagilline, n’est plus commercialisé depuis 2019), la durée de traitement, ... Les travaux expérimentaux sur cette espèce sont difficiles car elle n’est pas cultivable in vitro et les modèles animaux sont réduits. En effet, seuls les essais sur singes immunodéprimés ou sur cochons gnotobiotiques ont permis l’établissement d’une infection, tandis que des infections uniquement transitoires ont pu être obtenues chez des souris immunodéprimées et des rats athymiques ou chimiquement immunodéprimés. Au sein de l’espèce E. bieneusi, de nombreux génotypes existent, dont la plupart possède des spécificités d’hôtes. Les rongeurs étant naturellement infectés par certains de ces génotypes, nous émettons l’hypothèse que les échecs précédemment décrits dans la littérature concernant l’établissement d’un modèle souris sont liés à l’utilisation de génotypes non adaptés à cet animal. Du fait de nos travaux, nous possédons une très large collection de selles positives pour E. bieneusi de différents génotypes. Les objectifs du projet sont de mettre au point et de caractériser un modèle de souris infectées par E. bieneusi afin de répondre aux interrogations énoncées plus haut. Pour cela, des souris seront infectées par voie orale avec des selles humaines positives pour E. bieneusi. Nous disposons de données préliminaires démontrant le succès de notre protocole d’infection.

Bénéfices attendus

Comme développé dans le paragraphe 5.5.1, bien que responsable de plus de 90% des cas de microsporidiose intestinale, de nombreuses interrogations concernant E. bieneusi sont sans réponse, en grande partie du fait de la difficulté à travailler sur ce pathogène non cultivable et sans modèle animal. Les résultats issus de ce projet permettront de répondre à certaines de ces interrogations. En effet, ce projet devrait permettre de faire progresser les connaissances scientifiques fondamentales sur cette espèce en apportant des données sur les points suivants: dose infectieuse, barrière d’espèce, site de multiplication et de dormance chez l’hôte infecté, réponse immunitaire et identification de protéines immunogènes. Ce projet devrait également permettre de faire progresser la prise en charge des microsporidioses humaines en démontrant l’efficacité ou l’inefficacité des molécules actuellement utilisées, notamment le nitazoxanide dont l’indication a été donnée du fait de son efficacité sur d’autres parasitoses, sans preuve scientifique. Si seule la fumagilline démontre son efficacité, cela permettra d’obtenir des arguments forts pour la reprise de production du médicament par l’industrie pharmaceutique. La fumagilline étant responsable d’une thrombopénie, le patient doit être hospitalisé pendant toute la durée du traitement, soit 15 jours. Cette durée a été validée historiquement chez le patient infecté par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Il est suspecté qu’une telle durée de traitement pourrait être réduite avec une efficacité équivalente, réduisant ainsi les durées d’hospitalisation et donc les frais de santé. Ce projet pourrait permettre de valider ou non la réduction de la durée de traitement. L’intérêt du screening dans les selles d’un patient pour valider l’efficacité d’un tel traitement n’est pas non plus démontré mais pourra être évalué dans ce projet chez la souris (par exemple si recherche sur selles négative au bout de 7 jours, alors le traitement pourrait être arrêté, si résultat positif on pourrait conseiller de poursuivre le traitement jusqu’à 15 jours), et ainsi apporter des arguments pour proposer une étude chez l’Homme (type protocole de recherche clinique).

Procédures

-gavage avec le pathogène (ou un liquide neutre pour les groupes contrôle) sur animal vigile, 1 seule fois pour tous les animaux: 592 souris, soit quelques secondes par souris -ponction sanguine au niveau du sinus rétro-orbital sous anesthésie générale, les ponctions seront répétées 6 fois en 6 semaines : 12 animaux, ponction d'une durée inférieure à 10 secondes -injection molécule immunosuppressive (dexaméthasone) sur animal vigile, en intra-péritonéal, à raison de 6 injections en 6 jours: 288 animaux, soit quelques secondes par souris -gavage par des molécules à visée thérapeutique (ou un liquide neutre pour les groupes contrôle), une fois par jour pendant 14 jours : 192 souris, soit quelques secondes par souris

Impact sur les animaux

Les effets attendus sur les souris sont ceux associés à une infection intestinale (extrapolation sur la base des symptômes observés chez les humains) : douleurs abdominales, ballonnements, diarrhées aqueuses, perte de poids. Ces douleurs pourraient se traduire chez l’animal par la prostration, le hérissement du poil, des expressions faciales (gonflement du museau et des joues, oreilles et vibrisses vers l'arrière, plis visibles autour des yeux). Chez l’Homme immunocompétent, ces symptômes durent entre 3 et 4 semaines ; chez l’immunodéprimé, ils persisteront jusqu’à rétablissement de l’immunité ou prise d’un traitement spécifique anti-microsporidien. Concernant les effets indésirables associés au traitement spécifique : - une diminution du nombre de plaquettes est décrite chez l’Homme lors de la prise de fumagilline. D’après le résumé des caractéristiques du produit, la dose que nous utiliserons sur la durée prévue n’est pas associée à la survenue d’effets indésirables graves. Ainsi des saignements pourraient avoir lieu (par exemple en cas de blessures). - le nitazoxanide est associé à une toxicité hépatique. Cela pourrait se traduire par un ictère (coloration jaune des muqueuses), visible au niveau oculaire. - concernant la molécule test, il n’y a pas de données chez l’animal.

Devenir

Les souris seront toutes sacrifiées à la fin du projet pour récupérer les tissus et le sang, en vue d’analyses complémentaires.

Remplacement

Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle in vitro permettant le développement d’E. bieneusi. Il y a peu de publications à ce sujet probablement car beaucoup de tentatives se sont soldées par des échecs. Il semble que le cycle de multiplication ait déjà pu être initié in vitro mais que rapidement celui-ci avorte. L’utilisation d’animaux vivants apparait indispensable pour étudier à l’échelle globale d’un individu l’impact d’une infection par E. bieneusi et permettre d’identifier des sites de multiplication et de dormance dans un organisme infecté, ainsi que de caractériser sa réponse immunitaire. L’efficacité du traitement et la durée d’excrétion des parasites sous traitement ne peuvent également être validés qu’à l’échelle d’un individu.

Réduction

Nous utiliserons les souris sur-numéraires issues de reproductions de souris (reproductions visant à l’obtention de génotypes spécifiques au sein du laboratoire). Cela permettra donc de ne pas sacrifier ces animaux par ailleurs en bonne santé alors qu’ils pourraient être utiles pour d’autres recherches. Le nombre d'animaux utilisés pour cette manipulation a été réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les expérimentations seront couplées afin de permettre de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Par exemple, les souris infectées pour tester la charge infectieuse limite seront aussi utilisées pour évaluer l’item sur l’efficacité de la thérapeutique. Les révisions d’articles (reviewing) se durcissant, il est maintenant nécessaire de réaliser les expérimentations sur mâles et femelles, raison qui nous contraint à augmenter le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon les standards prévus par la règlementation, en groupes sociaux (compte tenu du fait que les souris sont des animaux grégaires), dans un environnement adapté et enrichi. Les animaux auront libre accès à l'eau et à la nourriture. Afin d'éviter les comportements agressifs, les animaux d'une même cage seront tous du même sexe, ne seront jamais plus de 6 et un enrichissement sera proposé avec des maisons en plastique. Les animaux étant nés dans notre animalerie, les groupes par cage seront les mêmes que ceux constitués lors du sevrage. Une période d’acclimatation sera réalisée avant le début de la procédure (une semaine). Les animaux d’une même cage auront subi la même infection. Nous utiliserons un système de score de manière à limiter au maximum la souffrance et à définir des points limites. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour évaluer tout changement de comportement et/ou de motricité et perte de poids. Si des signes de douleur sont observés, une injection sous-cutanée d'analgésique sera réalisée. Si un animal remplit des critères préalablement définis associés à une souffrance, ainsi qu’une perte de poids supérieure à 20% (points limites), le responsable du projet décidera de la mise à mort.

Choix des espèces

Le fond génétique des souris a été choisi car le laboratoire pratique, dans le cadre d’autres expérimentations, des reproductions sur le même fond génétique pour l’obtention de génotypes spécifiques, et certaines souris issues de ces reproductions ne sont pas conservées. Différents âges d’infection seront utilisés, entre 7 et 18 semaines, afin de mimer la situation en vie réelle (jeunes enfants rarement atteints, population adulte) et s’affranchir de l’effet « âge ».

163 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 68 d'entre eux et sévère pour 95. Porteurs d'une dystrophie musculaire proche de la maladie de Duchenne, ils subissent un prélèvement sanguin au niveau de l'œil, des mesures de force musculaire par contraction, un test d'agrippement et un conditionnement de peur de cinq minutes par jour pendant cinq jours. Le porteur reconnaît que la mesure de force peut être douloureuse et que le conditionnement repose sur un stimulus stressant. Il affirme que les questions posées ne peuvent être obtenues que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie du cœur et des muscles squelettiques. Au fur et à mesure que la maladie progresse, la faiblesse musculaire peut entraîner des difficultés fonctionnelles, telles que des difficultés à monter les escaliers ou à se lever d'une chaise. La maladie évolue lentement et tous les patients atteints deviennent dépendants d'un fauteuil roulant. Chez les patients en fauteuil, la faiblesse des muscles intercostaux et du diaphragme entraîne une insuffisance respiratoire. Les anomalies cardiaques se traduisent par une hypertrophie des cavités cardiaques entraînant une cardiomyopathie dilatée, qui conduit au décès des patients vers l'âge de 30 ans. La DMD est causée par des mutations d'un gène situé sur le chromosome X, qui entraînent des anomalies dans l'expression de la protéine appelée dystrophine, dont la fonction est de protéger la membrane des cellules musculaires lors de la contraction. La dystrophine est également exprimée dans le cerveau. À ce jour, le rôle des différentes formes de dystrophine dans le cerveau n'a pas été suffisamment décrit. Les objectifs de ce projet sont d'une part de caractériser l'évolution de la maladie chez un modèle génétique animal de la DMD que nous venons de créer, d'autre part de le comparer à des modèles proches mais génétiquement disctincts, en vue de préciser le rôle de chacune des formes de dystrophine dans le fonctionnement cérébral.

Bénéfices attendus

Une fois bien décrit, notre souhait est de pouvoir utiliser ce modèle pour développer des traitements efficaces. En outre, ce modèle nous aidera à comprendre la fonction spécifique d'une des formes de la protéine Dystrophine dans le développement et le fonctionnement du cerveau. Cette connaissance précise permettra d'éclairer les décisions à venir sur le choix des futures stratégies thérapeutiques à évaluer pour traiter certes les muscles des patients, mais aussi les déficits mentaux dont certains patients sont atteints.

Procédures

Les animaux seront prélevés une fois au sinus rétro-orbitaire avant la mise à mort, sous a'anesthésie générale qui requiert une injection sous-cutanée qui dure 5 secondes. Le prélèvement sanguin dure moins de 30 secondes. La durée d'un enregistrement de l'activité électrique cardiaque est de 15 minutes. La durée d'un enregistrement de l'activité ventilatoire est de 30 minutes. La durée d'une séquence de test d'agrippement est de 20 minutes. La durée d'un enregistrement de force est de 90 minutes, anesthésie comprise. La durée du conditionnement de peur est de 5 minutes par jour, pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire. Nos analyses sur un modèle proche ont révélé que jusqu'à l'âge de 10 mois, les anomalies fonctionnelles des rats DMD ne causent pas de problème majeur pour la vie quotidienne des animaux (rythme circadien, toilettage, alimentation, sommeil, état général). Au-delà de 10 mois d'âge, la force musculaire des rats diminue, leur muscles masticatoires sont moins efficaces et ils ont tendance à moins s'alimenter, ce qui justifie une vigilance accrue pour prévenir une baisse de masse pondérale. Nous appliquerons toutes les méthodes qui ont prouvé leur efficacité pour maintenir les animaux qui vieilliront dans un état de bien-être, jusqu'à l'atteinte d'une combinaison de points limites qui déclenchera la mise à mort compassionnelle. Lors de la caractérisation neurologique qui accompagne l'évolution de la maladie, les animaux seront soumis à un stimulus stressant inconfortable mais léger, destiné à évaluer leur capacité de mémorisation associative. La mesure de force provoque une contraction musculaire qui pourrait être douloureuse. Nos animaux seront donc sédatés, anesthésiés et toute douleur, même légère, sera prévenue par une prémédication adaptée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Nous souhaitons avec ce projet répondre à des questions qui ne peuvent être obtenues que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante. Par exemple, nous allons évaluer l'influence d'une forme particulière de la protéine appelée Dystrophine sur le développement et l'architecture de l'encéphale des animaux, ainsi que sa contribution sur des fonctions cognitives et comportements complexes qui requièrent une coordination fonctionnelle entre plusieurs régions de l'encéphale. Lorsque nous pourrons répondre à des questions avec des cellules ou des dispositifs de pseudo-organes nourris et connectés entre eux par un réseau microfluidique, nous le ferons pour éviter tout recours non justifié à l'animal vivant.

Réduction

Notre laboratoire a cumulé de nombreuses données sur ce modèle de rats DMD. Les calculs de puissance statistique nous recommandent d'utiliser 8 rats par groupe, ce que nous avons validé avec d'autres projets terminés. Nous avons optimisé la correction des données avant analyse statistique. Puis, nous utilisons une analyse statistique adaptée à chaque type de comparaison, selon des critères stricts admis par la communauté scientifique. Par ailleurs, en raison du nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé de nombreuses données qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il a donc été possible de réduire les cohortes d'animaux sans perte d'information biologique robuste.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage respecte l'alternance jour/nuit. Les rats, des animaux sociaux, sont hébergés avec des congénères, l'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur arrivée à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (évolution irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Additionnellement, les analyses prévues ont toutes été optimisées afin de minimiser le nombre d’anesthésie/injection/stress et dérangement subis par les animaux. Tous les tests pouvant être réalisés lors de la même anesthésie ont été regroupés et les tests réalisés sur animaux réveillés sont également rassemblés afin de limiter le stress et la fatigue induite par le dérangement des animaux pendant leur période de repos.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris mdx, mondialement utilisé, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin de DMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Pour la caractérisation phénotypique et l'étude de la survie, nous allons utiliser des animaux de l'âge de 3, 6 et 12 mois afin de suivre les animaux à chacune des étapes décisives de la trajectoire de la maladie : initiation de la maladie avec mort précoce des muscles et perte de gain pondéral quotidien, plateau de la maladie installée avec perte de capacité de réparation musculaire par sénescence précoce des cellules souches et enfin, dégradation clinique et évaluation post-mortem de l'ensemble des biomarqueurs pour créer un jeu de données de référence utilisable dans les futurs essais précliniques.

4 macaques rhésus vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour l'un et sévère pour trois d'entre eux. Ils reçoivent des injections d'une neurotoxine qui provoque un syndrome parkinsonien, avec akinésie sévère et perte de la capacité à se mouvoir et à se nourrir pendant deux à trois semaines, puis subissent une chirurgie du cerveau de trois à quatre heures pour tester des nanoparticules magnétiques, un test de rigidité musculaire en évaluant les effets. Le porteur reconnaît un risque d'hémorragie cérébrale et de douleurs post-opératoires. Il qualifie le recours au primate d'"indispensable" et invoque la "nécessité" de reproduire chez le singe une méthode déjà utilisée chez l'humain.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est une maladie neurodégénérative caractérisée par la dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques d’une structure spécifique : la substance noire. Cette pathologie est caractérisée par des symptômes moteurs et non moteurs suite à une désorganisation du fonctionnement des circuits neuronaux. Une des structures cérébrales clés impliquées dans la physiopathologie de la MP est le noyau sous-thalamique (NST). Ce noyau a été la cible de la stimulation cérébrale profonde (SCP) chez le singe, puis chez l’Homme afin de contrecarrer les symptômes moteurs de la MP. Notre projet a pour but de mimer les effets bénéfiques de la SCP chez des primates non-humain (PNH) rendus parkinsoniens en utilisant une autre stratégie, celle des nanoparticules magnétoélectriques (NME) injectées dans la structure cible : le NST. Il a pour objectif principal l’amélioration des symptômes moteurs caractérisant la MP après activation des NME chez un modèle de PNH rendu parkinsonien. Dans cette étude, l’utilisation du PNH, du fait de sa proximité avec l’Homme en termes d’anatomie cérébrale et de répertoire comportemental, nous permettra de transposer plus facilement les résultats à l’Homme, comme ce fut le cas pour la SCP.

Bénéfices attendus

Ce projet a une visée thérapeutique humaine. Il a pour but de développer une approche alternative moins invasive que la SCP qui pourra être utilisée chez le patient parkinsonien. En effet, cette dernière nécessite actuellement l’implantation d’électrodes au niveau du NST qui peut engendrer des hémorragies, des infections tout le long du câble et des cicatrices cutanées. Aussi, les NME fonctionnent sans connexion filaire et donc l’implantation d’un stimulateur sous-cutanée ne serait pas nécessaire. Outre, son bénéfice quant à l’amélioration des symptômes de la maladie de Parkinson, cette nouvelle technologie pourrait, si elle s’avère efficace, être utilisée comme une alternative à la SCP dans de nombreuses autres pathologies neurologiques et psychiatriques.

Procédures

- Le modèle expérimental de la maladie de Parkinson chez le singe est obtenu par 5 injections (1 par jour, durée moins de 30 secondes) d'une neurotoxine - La chirurgie stéréotaxique est d’une durée de 3 à 4 heures (1h pour l’anesthésie l’intubation et l’installation de l'animal, 45 min pour la ventriculographie et l’injection stéréotaxique, puis 1h en fin de chirurgie pour nettoyer la plaie, recoudre, et surveillance du réveil). - L’activation des NME par l’émission d’un champ magnétique dure quelques minutes, elle est réalisée avant et après la chirurgie. - Le test comportemental consiste à évaluer la rigidité musculaire qui quantifiera l’activité des muscles flexeurs et extenseurs du bras de l’animal en réponse à un mouvement répétitif passif de l’avant-bras. Ce test durera au maximum 15 min.

Impact sur les animaux

- L’induction d’un modèle parkinsonien par injection de MPTP provoque une akinésie sévère chez les NPH (symptômes de la maladie de Parkinson). Elle a pour conséquence d’induire une bradykinésie, entrainant une diminution ou une perte de la capacité à se mouvoir et se nourrir eux-mêmes et une perte de poids. Ces effets peuvent durer entre 2 et 3 semaines. - L’administration d’anesthésique chez le singe peut induire une accélération du rythme cardiaque ou encore des problèmes respiratoires. - L’injection des NME par stéréotaxie pourrait induire une hémorragie cérébrale, des douleurs post-opératoires ainsi qu’une infection de la plaie. - L’activation des NME par l’émission d’un champ magnétique n’induit aucun effet délétère à l’animal.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure pour réaliser les analyses histologiques

Remplacement

Le choix de cette espèce s'explique par le fait que l'anatomie et le fonctionnement du cerveau, ainsi que la motricité, sont proches de ceux de l'homme. De plus, le PNH possède un répertoire comportemental complexe et proche de celui de l'homme, ce qui est indispensable pour étudier des processus cérébraux complexes tels que les différents comportements moteurs étudiés, classiquement observés chez les patients souffrant de la maladie de Parkinson. De plus, la SCP a été premièrement mise au point chez le singe avant son utilisation chez l’Homme d’où la nécessité de répéter ce schéma.

Réduction

4 animaux seront utilisés afin de réduire au maximum le nombre d’animaux dans cette étude. Ce nombre correspondant au nombre minimal d’animaux qui permet d’obtenir une analyse statistiquement valable des résultats. Aussi, le suivi dans le temps des animaux permet de collecter plusieurs données ce qui réduit le nombre total d'animaux. Nous allons réutiliser un animal venant d’une autre étude pour le groupe contrôle, et réduire à n=3 le groupe expérimental afin de respecter au maximum la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc). Les deux premiers mois constitueront la phase d’habituation (manipulation par l’expérimentateur et évolution dans l’environnement de travail). Pour s'assurer au mieux du bien- être des animaux, leur état de santé sera évalué quotidiennement par le personnel compétent sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition, etc. Enfin, pour limiter le stress des animaux, des stratégies d'habituation sont mises en place pour qu'ils participent activement et volontairement aux différentes procédures. L’IRM et la chirurgie stéréotaxique seront réalisées après sédation et sur animal anesthésié. Différents paramètres vitaux sont surveillés tout au long de la chirurgie (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, saturation en oxygène, température par sonde intra-rectale). Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident avec le vétérinaire de la conduite à tenir en fonction des points limites généraux comme la perte de poids qui sera évaluée sur une période hebdomadaire et pratiquée sans contention. Selon le scorage de l’animal il recevra une surveillance accrue et les mesures nécessaires sont prises pour améliorer son bien-être. Des points limites spécifiques sont mis en place suite à l’injection de la neurotoxine: MPTP (obtention d’un modèle expérimental de la MP modéré à sévère). L’akinésie sera surveillée et l’animal sera alimenté avec un supplément nutritionnel riche en calories 2 fois/jour, pendant 7j. L'utilisation de matelas souples/changements fréquents de position seront effectués pour prévenir les escarres à titre préventif. Le traitement L-DOPA sera proposé pour soulager l’akinésie. Les dyskinésies seront aussi scorées pour adapter le traitement L-Dopa.

Choix des espèces

Dans le cadre de cette étude, l’utilisation du modèle animal et plus particulièrement le primate non-humain (espèce Macacca Mulatta) reste indispensable. C’est le modèle animal de choix pour étudier les comportements moteurs impactés par la maladie de Parkinson. De plus, le PNH, du fait de sa proximité avec l’Homme à la fois sur le plan anatomique cérébrale et comportemental, permet de facilement transposer les résultats à l’Homme. Les animaux utilisés seront âgés de plus de 4 ans car on peut considérer que le développement du système nerveux central a atteint sa pleine maturité à cet âge. Ce paramètre est important à respecter puisqu’il nous permettra de comparer plus aisément les résultats obtenus chez ces animaux avec les caractéristiques observés chez l’homme à l’âge adulte.