Procédures sévères

1085 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 485 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sous la peau ou dans la trachée, développent un cancer du poumon suivi chaque semaine par imagerie sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyse. L'objectif est de repérer des protéines dérégulées qui favorisent la progression du cancer du poumon. Le porteur décrit un système "GO/No GO" pour limiter les effectifs et retient des souris immunodéficientes pour y greffer des cellules humaines.

Objectifs

Le profilage multiomique des tumeurs humaines a révélé que les cancers du poumon non-à- petites cellules (CBNPC) présentent souvent des mutations pour une protéine appelée KEAP1, qui est un régulateur essentiel du stress oxydatif dans les cellules. Les CBNPC présentant des mutations pour KEAP1 sont caractérisés un stade clinique avancé, un phénotype métastatique, des caractéristiques d'évasion immunitaire et une résistance à la chimiothérapie et aux inhibiteurs de points de contrôle immunitaire. Toutefois, la façon dont les mutations de KEAP1 favorisent la progression du CBNPC n'est toujours pas comprise. Nous avons récemment identifié un mécanisme moléculaire par lequel les mutations de KEAP1 pourraient modifier les niveaux d'une autre protéine qui joue un rôle important dans la formation des métastases, cette protéine est appelée BACH1. Nous avons découvert que l'accumulation de BACH1 dans ces tumeurs favorise la dissémination tumorale et est corrélée à une faible survie chez les patients atteints de CBNPC. Ces résultats soutiennent l'hypothèse selon laquelle les mutations de KEAP1 dans le CBNPC favorisent l'altération des niveaux de protéines qui favorisent la progression de la tumeur. Sur la base de cette hypothèse, l'objectif de ce projet serait de tester d'autres protéines qui pourraient être dérégulées par les mutations de KEAP1 et favoriser la progression du cancer du poumon.

Bénéfices attendus

Jusqu'à présent, l'inhibition pharmacologique du protéasome (c'est-à-dire la machinerie de dégradation des protéines) est un outil prometteur pour lutter contre le myélome multiple. Il y a également de plus en plus de preuves qu'une mauvaise régulation de la dégradation des protéines est importante dans le cancer. Malheureusement, la pan-inhibition du protéasome n'est pas spécifique. Notre objectif est d'améliorer la connaissance des détails biochimiques qui définissent un événement spécifique de dégradation des protéines afin de fournir, dans le contexte du cancer du poumon, de nouvelles cibles pharmacologiques spécifiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections. Les animaux subiront une transplantation de cellules tumorales soit au niveau sous-cutanée (1 injection durant 1 min / animal) ou intra-trachéale (au maximum 5min) réalisés sous anesthésie. Enfin, le développement de la pathologie sera suivi hebdomadairement par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris) et l'administration de luciférine dédiée à ce suivi.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des injections. Les animaux seront transplantés avec des cellules tumorales et développeront donc une pathologie humaine potentiellement grave. L'anesthésie constituera une nuisance sur les animaux. L'ensemble des manipulations, dont l'imagerie optique, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de caractériser ex-vivo le développement tumoral et métastatique en fonction des conditions expérimentales.

Remplacement

Pour réaliser une étude, nous devons manipuler l'expression génétique des cellules de mammifères. Afin de minimiser l'utilisation d'animaux vivants, toutes nos recherches feront d'abord l'objet d'une caractérisation détaillée in vitro à l'aide de cellules cultivées et de systèmes de protéines purifiées. Cependant, différents aspects de nos résultats in vitro doivent être validés in vivo pour d’une part prendre en compte l'impact du métabolisme et du microenvironnement tumoral sur nos manipulations génétiques et d’autre part, afin de pouvoir déchiffrer le rôle des composants du système Ubiquitine-Protéasome (UPS) dans les mécanismes de la tumorigenèse, lors de la propagation métastatique et vis à vis de l'échappement de la tumeur à l'action du système immunitaire.

Réduction

Ce projet sur 5 ans présente un nombre maximum de 1085 souris, cependant ces études seront menées avec un système de GO/No GO. Une première étape permettra de vérifier l’intérêt de cibler certains acteurs de la voie de l'hème-ubiquitine dans un modèle de cancer du poumon des plus permissifs pour la croissance tumorale (souris immunodéficientes). Seules les études concernant les gènes validés au cours de cette première étape seront poursuivies et cela, de manière séquentielle, afin de pouvoir interroger les rôles du système immunitaire et/ou du contexte tissulaire sain péri-tumoral dans le développement de la pathologie en impliquant que le minimum nécessaire d’animaux. Pour toutes les études, une planification minutieuse sera effectuée et des mesures seront prises pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et la gravité des procédures menées. Le nombre de souris utilisées dans ces études a été déterminé par une analyse statistique de la variance typique des modèles tumoraux pulmonaires et de la taille de l'effet anticipé. Enfin, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons l'imagerie optique par bioluminescence, qui permet le suivi in vivo de la croissance tumorale de manière non invasive. Afin d'obtenir des informations sur la propagation à distance des tumeurs sans impliquer d'animaux supplémentaires, à la fin du protocole et après mise à mort, nous quantifierons également les éventuelles métastases dans les organes cibles de la pathologie.

Raffinement

Les animaux sont gardés dans notre animalerie contrôlée où ils présentent un comportement normal et, sans intervention, une durée de vie typique. L'hébergement est effectué conformément aux réglementations locales et européennes, sous le contrôle d'un vétérinaire et avec l'aide d'un personnel technique qualifié. Les animaux seront ainsi hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit) et afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés et/ou de coton. Notre institute tient un registre du nombre de souris utilisées et les responsables locaux vérifient régulièrement que toutes les lois, conventions, lignes directrices et codes de conduite nationaux et internationaux soient respectés. Les normes les plus strictes en matière de soins et de surveillance des animaux seront appliquées. Les animaux feront donc l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Lorsque les procédures sont terminées, les méthodes approuvées pour sacrifier l'animal sont utilisées.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. Nous considérons que les modèles d'allo- et de xénogreffe sont nécessaires pour étudier les effets de nos manipulations génétiques et de nos futures approches pharmacologiques sur la croissance et la dissémination des tumeurs. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de cette approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (murine). Il est également important de noter que des modèles de souris ont déjà été utilisés pour étudier l'impact de la stabilité des protéines dans les mécanismes de régulation de la tumorigenèse y compris par nous avec le même type d’approche. Conformément aux données de la littérature, pour les expériences de greffe, les cellules seront transplantées à des souris « jeunes adultes »âgées de 5 à 8 semaines.

1 224 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 504 étant classés en souffrance sévère. Un modèle de maladie de Parkinson leur est induit, puis ils subissent des gavages quotidiens jusqu'à huit semaines, des tests moteurs et cognitifs et un isolement à jeun pour mesurer le transit intestinal, avant mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique attendre perte de poids, troubles moteurs, cognitifs et gastro-intestinaux liés au modèle. Il conclut qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit l'ensemble des symptômes et qu'il est "nécessaire" de travailler sur un "organisme entier".

Objectifs

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative qui représente un problème majeur de santé publique. Son diagnostic clinique repose sur des symptômes moteurs : rigidité, tremblements, altération des réflexes posturaux et bradykinésie. Il existe de nombreuses autres complications dues à cette maladie : troubles cognitifs et sensoriels, douleurs, troubles du sommeil par exemple. Quatre-vingts pour cent des patients atteints de la maladie de Parkinson ont également des troubles gastro-intestinaux, qui précèdent généralement l’apparition des troubles moteurs, et qui empirent avec la progression de la maladie. Il s’agit généralement de constipation, mais aussi de reflux ou de gastroparésie. L’étiologie de la maladie de Parkinson reste mal connue même si l’on sait que des facteurs environnementaux tels que l’exposition à des pesticides favorisent son développement. Le modèle de maladie de Parkinson induit par l’administration de roténone (pesticide) chez le rongeur est très documenté. Ce modèle induit des lésions comparables à celles retrouvées chez les malades : troubles moteurs, perte de neurones dopaminergiques, et accumulation d’α-synucléine. De plus, il a été montré que la roténone induit des symptômes gastro-intestinaux et une altération du microbiote intestinal chez le rat. Des études précliniques montrent que les probiotiques pourraient avoir un effet bénéfique dans les différents symptômes de la maladie de Parkinson. Le projet ici proposé s’articule en 2 étapes : la première consiste à développer un modèle préclinique de la maladie de Parkinson chez le rat via une administration par voie orale de roténone, la seconde consiste à tester les effets potentiellement bénéfiques de probiotiques avec ou sans substances pharmacologiques sur ce modèle.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer l’efficacité de probiotiques associés ou non avec des substances pharmacologiques sur les symptômes neurologiques et gastro-intestinaux induits par la maladie de Parkinson. Cette maladie touche environ 1% de la population de plus de 60 ans et représente un problème majeur de santé publique, d’autant plus que son incidence croît en raison du vieillissement de la population. Les traitements actuels ont une efficacité qui ne perdure pas dans le temps avec de nombreux effets secondaires, il est donc important de développer de nouveaux traitements.

Procédures

Les traitements nécessiteront des gavages quotidiens sur animaux vigiles. Ceux-ci seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l'animal et avec des sondes souples pour limiter les irritations et auront lieu pendant 8 semaines maximum. Des test comportementaux qui évaluent les performances motrices et cognitives seront également réalisés sur des animaux vigiles. Ceux ci auront lieu pendant une semaine maximum et pourront varier entre 2 et 15 minutes. Enfin, certains animaux pourront être mis à jeun et isolés quelques heures afin d’évaluer le temps de transit intestinal.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, différents symptômes sont attendus puisqu’il s’agit de reproduire les symptômes de la maladie de Parkinson décrits dans la littérature scientifique : perte de poids, troubles moteurs, cognitifs et troubles gastro-intestinaux. Certains traitements nécessiteront des gavages quotidiens sur animaux vigiles. Ceux-ci seront effectués par du personnel expérimenté pour limiter le stress de l'animal et avec des sondes souples pour limiter les irritations et auront lieu pendant 8 semaines maximum. Un stress dû à l’isolement des animaux lors de la mesure du temps de transit peut également avoir lieu.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin d’effectuer des prélèvements d’organes pour des études histologiques.

Remplacement

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative complexe avec des symptômes qui touchent différents organes. Les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire l’ensemble des symptômes de cette maladie, il est donc nécessaire de travailler sur un organisme entier.

Réduction

La variabilité des réponses aux effets d’un traitement donné par voie orale chez le rongeur justifie une taille minimale de groupe de 12 animaux par condition expérimentale. Un effectif inférieur exposerait à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus par une analyse de la variance. En cas de résultat significatif, les différences entre chaque groupe et le groupe contrôle seront explorées à l’aide d’un test de comparaisons multiples adapté.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies. Les administrations par voie orale seront effectuées sur des animaux vigiles par du personnel expérimenté, à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations. Les symptômes moteurs induits par un traitement à la roténone seront évalués quotidiennement, et un raffinement de l’hébergement sera mise en place si ceux-ci sont importants (e.g. croquettes posées sur le sol de la cage ou la mise à disposition d’aliment semi-liquide pour faciliter la prise alimentaire). Les animaux seront observés attentivement en respectant les points limites mis en place. Ils seront mis à mort en cas de dépassement des points limites mis en place pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse.

Choix des espèces

Après une étude de la littérature scientifique, les rongeurs sont des modèles fréquemment décrits. Le rat a été choisi car les quantités de fèces qu'il génère sont plus importantes que chez les souris, ce qui permet de limiter le nombre d'animaux utilisés. Etant donné les modèles décrits dans la littérature, des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures.

2 550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 2 250 étant classées en souffrance sévère. Rendues obèses puis diabétiques par injection de streptozotocine, molécule que le porteur décrit comme "particulièrement toxique", elles subissent des prélèvements sanguins répétés et divers tests avant mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur reconnaît que ce projet "n'est pas le plus adapté en termes de réduction" et qu'un nombre important d'animaux est prévu du fait d'une mortalité attendue après l'injection. Il conclut que la culture cellulaire ne peut se substituer à la souris pour reproduire l'atteinte multi-organique du diabète.

Objectifs

Le diabète de type 2, associé à l’obésité, est associé à des atteintes nerveuses et rénales. Les atteintes nerveuses sont des conséquences invalidante du diabète détériorant la santé et la qualité de vie des patients. Elle se traduit par de l’incontinence, des désordres gastrointestinaux, des douleurs chroniques, des sensations de froid ou de chaud continues, une transpiration excessive, des défauts sexuels, une intolérance à l’effort ou encore des malaises. La conséquence la plus grave étant les altérations nerveuses au niveau cardiaque pouvant entrainer la mort. Les atteintes rénales touchent 20 à 40% des patients atteints de diabète. Elles peuvent entrainer une dialyse à vie dont le seul traitement consiste en la transplantation de nouveaux reins. Ces atteintes ont également des conséquences très importantes sur les fonctions cardiovasculaires augmentant le risque de maladies cardiovasculaires. Aujourd’hui, aucune stratégie thérapeutique efficace n’est envisagée dans le cadre de ses conséquences du diabète. Les seules stratégies envisagées sont le contrôle de la glycémie par les anti-diabétiques classiques et des recommandations diététiques et/ou le traitement par antidépresseurs dans le cas de la neuropathie. Ainsi, la mise en place d’un modèle animal diabétique présentant ces atteintes nerveuses et rénales permettrait aux clients de tester des molécules anti-diabétiques sur ces atteintes nerveuses et rénales ou bien de tester des molécules protégeant les reins et les nerfs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra le développement de nouveaux médicaments ciblant les complications rénales et nerveuses du diabète. Ce projet permettra également un gain de connaissance sur le développement de ces complications associées au diabète.

Procédures

- Les animaux subiront des prélèvements répétés de sang à la veine caudale, en vigile et au sinus retroorbitaire sous anesthésie gazeuse ou locale au cours de l’étape de screening, en milieu de traitement, au cours du test de tolérance au glucose et de la mesure de la vidange gastrique, en respectant les recommandations éthiques. Les prélèvements de sang effectués en cours d'étude se feront en respectant les volumes ciculant et les périodes de récupérations pour les prélèvements uniques et répétés. - Les animaux subiront diverses types d’injection notamment lors de la phase d’induction avec la streptozotocine, molécule induisant le diabète, la phase de traitement, le test oral de tolérance au glucose, la mesure de l'éléctrocardioagramme et du débit de filtration glomérulaire. Les volumes d’administration respecteront les recommandations éthiques. -Les animaux seront stimulés au niveau des pattes arrières lors du test de sensibilité mécanique. Le nombre de mesures n'ira pas au delà de 5, avec une minutes de repos entre chaque mesure. Une phase d'habituation sans stimulation de 30 minutes sera prélalablement effectuée - Les animaux subiront des mise à jeun notamment avant le test de tolérance oral au glucose, la mesure du débit de filtration glomérulaire et l’euthanasie. - Les animaux seront isolés 2 à 18 heures lors de la mesure du débit de filtration glomérulaire et lors de la mise en cage à métabolisme. Enfin, lors de leur mise à mort, dans le but de récupérer leur cerveau, un prélèvement sanguin maximal sous anesthésie générale sera réalisé et les animaux seront perfusés avec de la saline et/ou de la formaline par injection intracardiaque sur coeur battant et la confirmation de la mort se fera par l’arrêt permanent de la circulation.

Impact sur les animaux

La molécule utilisée pour induire le diabète et les complications associées est particulièrement toxique et peut altérer l’état général de l’animal les quelques jours qui suivent l’injection. Une fois, l’état stabilisé il ne se détériore part au cours des 2 mois d'étude. Notre équipe SBEA ainsi que le personnel formé a mis en place la surveillance des signe cliniques afin d'anticiper la mort de l'animal et éviter sa souffrance prolongée et réaliser l'euthanasie dans les conditions éthiques. L’augmentation de la prise hydrique, de la production d'urine et des niveaux de glucose sanguins sont les caractéristiques du diabète. Le traitement testé sur ce modèle préclinique aura pour but d’améliorer leur diabète et les atteintes nerveuse et rénale. Aucun effet indésirables est attendu au cours de la phase de traitement . Aucun effet indésirable est attendu après le test de tolérance au glucose et les prélèvements de sang associés ou l’électrocardiogramme. L’analyse de la sensibilité mécanique au niveau des pattes peut induire un inconfort ou possiblement une douleur. La mesure de la fonction rénale nécessitant une anesthésie isoflurane et une injection intraveineuse a des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil, modifie la vision dans le cas de l’injection au sinus rétro-orbitaire, ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser la collecte d'organe nécessaire aux analyses qui permetrront de valider ou non l'efficacité des traitements testés.

Remplacement

Le diabète est une pathologie touchant de nombreux organes et la neuropathie et la néphropathie sont des conséquences de ce dérèglement multi organique qui se passe de façon séquentiel dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. La culture de neurones et de cellules rénales peut être envisagée dans un premier temps et constitue un des axes de recherche et développement de la société. Cependant cette méthode, bien qu'elle puisse diminuer l'utilisation d'animaux à des fins de recherche, ne pourra pas se substituer à l'utilisation de ces derniers puisque les commorbidités citées sont la conséquence de ce déréglement multi-organique. L'utilisation de la streptozotocine pour induire le diabète peut être également remplacé par l'utilisation d'animaux spontanément diabétique grâce à des mutations génétiques et sont des modèles auxquels la société s'attarde dans ses axes de recherche et développement.

Réduction

Ce projet n’est pas le plus adapté en termes de réduction. En effet, pour le modèle de souris obèses puis injectées à la streptozotocine, un nombre important d’animaux doit être envisagé pour l’injection de streptozotocine puisqu’un taux de mortalité et d’absence de réponse est attendu. Cependant, nous optimisons le nombre d’animaux utilisé en proposant de réaliser toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie ou sa résolution le cas échéant sur un même animal. De plus, nous réduisone également le nombre d'animaux utilisé dans le groupe dit sain, non malade puisqu'aucune mortalité n'est attendu dans ce groupe.

Raffinement

En termes de raffinement, les animaux obèses sont hébergés par 3 ou par 4 pour respecter les normes d’hébergement compte-tenu du poids et puisque la souris est un animal social. De l’enrichissement est également ajouté dans les cages d’hébergement afin que la souris puisse y faire son nid. Suite à l’injection de streptozotocine, l’état physique des souris est monitoré et scoré 2 fois par jour les 14 jours suivant l’injection de streptozotocine, c’est-à-dire jusqu’à stabilisation du phénotype diabétique. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution saline est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Dans le cas d’atteintes sévères, l’animal est euthanasié. L’injection de solution saline en cas de déshydratation se fera selon les volumes d’injection saccepté éthiquement. Ces mêmes volumes seront utilisés lors de la phase de traitement.

Choix des espèces

La souris est un modèle bien connu pour l'étude du diabète.

60 rats âgés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 48 étant classés en souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par chirurgie, suivi d'injections d'apeline, de jusqu'à sept prélèvements sanguins, d'imageries répétées et de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur indique que l'infarctus peut entraîner une perte de mobilité, des troubles de la déglutition avec risque d'asphyxie et de mort, et une perte de poids. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne prend en compte l'ensemble de ces paramètres et décrit le rat comme donnant les déficits "les plus comparables" à ceux de l'humain.

Objectifs

L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) constitue la première cause d’handicap acquis chez l’homme, la 2ème cause de démence et la 3ème cause de mortalité en France. Elle est causée par l’obstruction d’une artère cérébrale par un caillot de sang (=ischémie). Cette occlusion réduit de manière conséquente l'apport en oxygène et en nutriments des cellules cérébrales et engendre ainsi une crise énergétique. Cette dernière est à l'origine d'une destruction rapide et définitive d’une zone du cerveau. Malgré l’avancée des traitements permettant la désobstruction de ces vaisseaux sanguins cérébraux, 50% des patients traités gardent des séquelles aussi bien motrices que cognitives. Bien qu'une zone cérébrale soit définitivement détruite suite à l'ischémie, la zone se trouvant à sa périphérie peut encore être secourue. Cette zone demeure sensible aux changements tels que la création de nouveaux vaisseaux ou la réorganisation des neurones ce sont les mécanismes de plasticité vasculaire et neuronale qui sont le pivot de la récupération pos-AVC. Suite à une ischémie, ces différents mécanismes compensatoires sont activés, cependant ils s'avèrent fréquemment insuffisants pour assurer une reperfusion efficace. C'est pourquoi, plusieurs pistes expérimentales sont étudiées pour améliorer la récupération post-AVC. Parmi ces pistes, le couple Apeline (un peptide)/APJ (son récepteur) font l'objet d'un intérêt croissant. Ce couple joue un rôle important dans le système cardiovasculaire, le métabolisme énergétique, et l'angiogenèse (création de nouveau vaisseaux sanguins) aussi bien physiologique que tumorale. La littérature récente, suggère que ce couple de molécule aurait un effet neuroprotecteur après une lésion aigue d’ischémie-reperfusion cérébrale. Cependant, ces études se limitent à une administration unique d’Apeline le jour de l’ischémie et les bénéfices comportementaux ne sont évalués qu'à très court terme.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel neuroprotecteur d'injections répétées d’Apeline dans un contexte d’accident vasculaire cérébral chez un modèle murin. À ce jour, ceci n’a jamais été rapporté dans la littérature. Nous suivrons églement la récupération fonctionnelle ainsi que cognitive des animaux. En effet, les troubles cognitifs induits par l'AVC ont des répercussions négatives sur la qualité de vie du patient, sur le taux de mortalité dans les 4 années suivant l’AVC, et représentent un impact médicosocial considérable pour la société. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le but de réduire ces troubles cognitifs. L’Apeline est un peptide dont l’effet neuroprotecteur est décrit en per- opératoire. Néanmoins, dans ce modèle, les conséquences neurovasculaires de l’administration d’apeline sont encore très peu décrites. Ce projet à donc pour objectif de mettre en évidence l’intérêt d’un traitement répété sur une durée plus longue et ainsi d’évaluer l’impact de ce traitement sur la réduction des altérations moléculaires, motrices et cognitives après la survenue d’un AVC.

Procédures

Toutes les procédures expérimentales seront réalisées sous anesthésie (isoflurane ou sévoflurane). Les animaux seront soumis à une chirurgie (acte chirurgical d'environ 30 minutes) visant à induire l'ischémie cérébrale. Les animaux seront soumis à des injections dans le but de leur administrer le traitement (de 1 à 3 injections selon le groupe). Les animaux seront soumis à un maximum de 7 prélèvements sanguins à la queue lorsqu'ils seront endormis. Les tests comportementaux seront réalisés à J1, J7 et J14 de manière à évaluer la sévérité de la lésion ainsi que la récupération post-AVC. Ces tests durent de 15 à 20 minutes par animal lors de chaque session de test. Les imageries auront lieu à J2, J3, J8 et J17 post-ischémie et devraient durer 30 minutes chacune. Des frottis vaginaux seront effectués à J0 et J17.

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite des prélèvements sanguins itératifs, de petits volumes, qui seront effectués suite à la pause d'un cathéter au niveau de la veine caudale et pourraient engendrer de petites lésions au niveau de la queue ainsi qu'une douleur au moment de la piqure. La première nuisance est l'acte chirurgical en soi. Par la suite, la chirurgie va avoir pour conséquence de générer un infarctus cérébral conduisant à une perte de mobilité plus ou moins transitoire et d’intensité variable. De même, la zone incisée puis suturée engendre une plaie cutanée. Durant les premières heures, l'animal ne sera peut-être pas capable de boire ou manger, car il peut présenter des troubles de la déglutition, entrainant fausse route, asphyxie et décès. Une perte de poids peut être observée dans les jours suivants la chirurgie. Les imageries sont réalisées relativement tôt après la chirurgie et de manière répétée au cours du protocole pouvant engendrer un stress pour l’animal. L’anesthésie prolongée lors de la chirurgie et des imageries peut induire un risque d’hypothermie. Plusieurs injections intraveineuses de radiotraceurs dans les veines caudales seront réalisées et pourraient engendrer une douleur au niveau de la zone d'injection. Des frottis vaginaux seront effectués à J0 et J17,et pourraient être à l'origine de légère gènes au niveau du vagin suite aux pipetages répétés. Enfin, les animaux seront soumis à divers tests comportementaux, sensorimoteurs et cognitifs, au cours du protocole qui pourrait engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après la dernière imagerie à J17 pour obtenir des tissus cérébraux destinés à des analyses histologiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

L'étude de l'effet d'un médicament sur les suites d'un accident vasculaire cérébrale (AVC), nécessite de prendre en compte l'étude des lésions cérébrales et les impacts moteurs et sensoriels qui en découlent. De nos jours, aucun modèle in vitro ne permet de prendre en compte l'ensemble de ces paramètres. C'est pourquoi, nous avons choisi un modèle d'obstruction temporaire de l'artère cérébrale moyenne chez le rat, car en plus d'être bien d'écrit dans la littérature, il permet d'obtenir les déficits les plus comparables à ceux observés chez l'Homme. De plus, cette espèce permet l'obtention de prélèvements sanguins répétés avec un volume suffisant sans impacter le bien être de l'animal.

Réduction

Cette étude nous permettra d’évaluer s’il existe ou non, un effet du traitement répété à l’Apeline sur la réduction du volume final de l’infarctus/réduction des troubles cognitifs dû à la survenue d’un AVC. Nous prévoyons un maximum de 60 rats pour cette procédure. Pour évaluer le modèle AVC chez la rat au cours du temps nous utiliserons l’imagerie moléculaire in vivo, technique permettant des études non invasives, longitudinales, multiparamétriques et quantitatives, ce qui permet de minimiser le nombre d’animaux nécessaire. Le modèle d'AVC chez le rongeur a des impacts physiologiques et fonctionnels interindividuels très variés. Dans notre étude nous évaluerons les effets d’un traitement précoce d’Apeline sur 3 jours sur la récupération au cours des 2 premières semaines post-AVC. Nous nous baserons sur notre expérience du modèle chez le rat pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour prendre en compte la variabilité interindividuelle et utiliser différentes méthodes d'analyses moléculaires.

Raffinement

Les chirurgies, prélèvements sanguins, les injections intraveineuse et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l'animal ainsi que son réveil rapide. Les rats anesthésiés seront toujours placés sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale et/ou générale par injection sous cutanée de morphinique. Pendant une heure après la chirurgie, une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post-opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour la prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, rat prostré, en retrait, ou une perte de poids, par exemple, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20% du poids initial, l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile. Les conditions d’hébergement sont classiques et comprennent des animaux hébergés en groupe, avec accès à la nourriture et l’eau sans restriction . Les cages seront enrichies de tunnels et de la nourriture humidifiée sera placée dans la cage pour faciliter l'accès aux croquettes (rendu plus difficile en raison des séquelles motrices) mais aussi contribuer à la réhydratation. En cas de mort du congénère, l'animal survivant pourra être associé à un autre animal pour éviter la sollitude au cours du protocole.

Choix des espèces

Le rat présente des similitudes anatomo-fonctionelles avec l'être humain au niveau du système vasculaire cérébral (contrairement à la souris). De plus, les mécanismes cellulaires sous-jacents à la mort neuronale, induit par l'AVC chez le rat sont également proches de ce qui a été observé chez le patient. Il permet, en outre, à partir de tests comportementaux ou moléculaires de vérifier l'efficacité de nouvelles stratégies de rééducation dans des études précliniques. De part la difficulté du modèle AVC et les nombreuses pertes qu'il peut engendrer, aucune étude n'a, à notre connaissance, adapté ce modèle à des rats plus âgés. Pourtant, l'incidence de l'AVC augmente avec l'âge et l'apparition de nombreuses commorbidités. Ainsi, nous avons choisi de tester un traitement pharmacologique chez des rats plus âgés, de 6 à 8 mois, permettant d'augmenter la transférabilité de notre étude à la clinique. Pour se faire, des rats femelles âgées de 6 à 8 mois seront utilisées dans cette étude et auront atteint un poids compris entre 300g et 400g (stable depuis le 4ème mois).