Procédures sévères
Evaluation in vivo de la synergie de traitement par le composé MER-1, le temozolomide et la radiothérapie dans un modèle de greffe orthotopique de cellules de glioblastome humain chez la souris immunodéprimée. (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
128 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une greffe intracérébrale de cellules de glioblastome humain, puis six séances de radiothérapie, des traitements répétés et un suivi par bioluminescence sous anesthésies répétées. Le porteur reconnaît que la tumeur cérébrale entraîne des effets délétères "non réversibles" et une accoutumance liée aux anesthésies à la kétamine, et prévoit un test d'évitement d'obstacle pour suivre les animaux. Il affirme que le remplacement "n'est pas possible", le développement du glioblastome dépendant selon lui de phénomènes complexes liés au statut hormonal.
Objectifs
Les gliomes constituent l'un des groupes de tumeurs cérébrales les plus fréquents chez l'adulte. La forme la plus sévère est le glioblastome dont la survie médiane n'excède pas 15 mois. Ces tumeurs touchent préférentiellement les hommes et les femmes ménopausées, suggérant un rôle protecteur des hormones féminines (œstrogènes). Des études sur des modèles de rongeurs indiquent que les œstrogènes limitent l'agressivité de la tumeur et sont bénéfiques pour la survie des patients atteints de ce type de tumeur. Cependant, aucune donnée n'est aujourd'hui disponible sur les modalités de réponses des cellules tumorales aux œstrogènes. Ceci apparait donc comme un axe de recherche majeur. Dans une étude préliminaire, nous avons analysé les données moléculaires de patients atteints de glioblastomes et identifié qu'un récepteur était justement plus présent chez les femmes qui survivent longtemps avec une tumeur cérébrale que chez les hommes qui présentent un pronostic plus sombre. In vitro, nous avons montré pour la première fois que l'activation de ce récepteur par une molécule bloque la multiplication des cellules tumorales. La combinaison de cette molécule avec le traitement de radio et chimiothérapie actuellement prescrit contre les glioblastomes conduit à un effet anticancéreux amplifié. A terme, l'utilisation de cette molécule pourrait constituer une stratégie thérapeutique nouvelle, ce que nous voulons démontrer dans une étude "in vivo" (sur modèle animal), en étudiant les réponses selon le sexe.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet constitueront une base pour proposer l'utilisation du composé étudié pour le traitement des glioblastomes. En effet, ce projet innovant permettra de mieux comprendre les processus responsables des différences de survenue des glioblastomes et de réponse au traitement entre les hommes et les femmes. En cas de résultats probants, cela permettra d'apporter de nouvelles voies de stratégies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant des agonistes (molécules interagissant avec des récepteurs membranaires) de certains récepteurs des œstrogènes dans le cas du traitement de tumeurs chimiorésistantes marquées par un échec thérapeutique (chimiosensibilisation).
Procédures
- Xenogreffe intracérébrale (1 seule itération à J0) : durée=45 min - Imagerie bioluminescence (au minimum 10 injections itératives IP) : durée 15 min - Traitement par radiothérapie (6 itérations) : durée 10 min pour chaque session - Traitement par le composé +/- combiné au temozolomide (12 itérations) : durée 1 min par traitement. Test d'éviction d'obstacle (3 fois par semaine ) : durée 5 min.
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l’implantation même du glioblastome (apparition d’une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus, non réversibles. Schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine selon le timing dans le projet) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques (kétamine) peut être observée. Les administrations quotidiennes du composé étudié conduisent à un dérangement journalier des animaux. Les injections intra-péritonéales répétées pourront conduire à une réaction cutanée modérée.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. Ainsi 80 souris seront mises à mort dès lors de l'atteinte d'un point limite (étude efficacité/survie : 40 souris femelles et 40 souris mâles) ou plus précocement à l'issue du schéma de traitement de chaque groupe (souris "satellites" : 24 souris femelles et 24 souris mâles ). La mise à mort des souris "satellites" à la fin du schéma de traitement est justifiée de part la nécessité de réaliser des analyses histologiques et biochimiques pour pouvoir caractériser l'impact de chaque modalité de traitement.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte pas possible puisque le développement des glioblastomes dépend de phénomènes biologiques complexes (influence des hormones naturellement présentes chez les souris mâles ou femelles ...). En l'occurrence, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Des études préliminaires ont déjà été réalisées in vitro mais aussi en biologie moléculaire et ont donné des résultats très encourageants. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.
Réduction
- Dans le cadre de ce projet, les expérimentations seront menées de façon prospective, tout d’abord en réalisant l’étude sur les animaux « satellites » mâles et femelles de chaque groupe (24 souris mâles et 24 souris femelles avec un effectif de 6 souris par groupe de traitement). Si nos hypothèses concernant l’analyse des signatures moléculaires sont vérifiées (franchissement de la BHE=barrière hémato-encéphalique (barrière agissant comme un filtre protégeant le cerveau)), alors le projet sera secondairement mené sur les souris dédiées à l’étude d’efficacité/survie (de la même façon 40 souris mâles et 40 souris femelles avec un effectif de 10 souris par groupe de traitement). En raison du nombre important de souris dans l’étude, notre démarche consistera à réaliser successivement plusieurs séries d’animaux. Ces dernières seront ainsi constituées de représentants de chaque groupe et de chaque sexe pour éviter un biais expérimental. - Concernant le nombre de souris satellites : il s’agira de comparer, indépendamment chez les mâles ou les femelles, l’effet des traitements par rapport au groupe contrôle par l’analyse de marqueurs histologiques et moléculaires. Ces types d’analyses sont très fiables et ne nécessitent qu’un effectif réduit pour mettre en lumière un effet, s’il existe. Ainsi on estime - à priori - que même si l’effet des traitements sera faible, un effectif de 6 souris / groupe sera suffisant pour révéler une différence significative via des tests statistiques. Concernant le nombre de souris en suivi de croissance tumorale, de la même façon la comparaison se fera indépendamment chez les mâles et les femelles. Ainsi, sur la base de nos précédentes études, on estime que l’effet des traitements aura un effet faible sur la croissance tumorale. Au minimum 6 mesures (bioluminescence) seront réalisées en suivi de traitement. Après simulation, le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe est ainsi trouvé à n = 10 pour garantir une approche statistique pertinente.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique mélange kétamine/xylazine, désinfection plaie, chirurgie aseptique, suivi post-opératoire rigoureux) puis à la suite de la xénogreffe (pesée 3 fois/semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale). Une vigilance accrue sera également menée lors de la fenêtre temporelle d'administration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'état sanitaire individuel des animaux, conditions de transport de façon à éviter au maximum stress des animaux). Un suivi quotidien garantissant le bien-être optimal des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau de boisson et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger, hébergement en portoir ventilé). Quel que soit le groupe, nous ne laisserons en aucun cas les animaux mourir de mort dégradée et anticiperons cette dégradation en réalisant nous-mêmes la mise à mort dès que les points limites définis apparaitront (perte de poids et problème de motricité essentiellement).
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles rongeurs (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris mâles ou femelles seront âgées de 6-12 semaines au moment des greffes (22 à 30g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.
Impact environnemental d’écoaliments à basse teneur en azote utilisés en élevage porcin
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Nourris d'aliments expérimentaux, dont des régimes à très basse teneur en protéines, des porcs de 30 ou 60 kg passent 14 des 28 jours de l'essai dans des cages à digestibilité de 52 cm sur 117, réduites pour les empêcher de se retourner et recueillir leurs fèces sans urine. 60 porcs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, six par régime. L'essai mesure leur croissance, leur digestion et leurs émissions gazeuses, pour réduire l'impact environnemental de la production porcine "en maintenant les performances de croissance des animaux", la réduction devant se vérifier "au kg de porc produit". Tous sont tués à la fin par une injection de T61 sous anesthésie, parce qu'ils auront consommé des acides aminés de synthèse pas encore autorisés dans l'alimentation porcine.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de quantifier les effets de stratégies alimentaires à très basse teneur en protéines associées à une gestion optimisée des effluents sur les performances de croissance des animaux, sur l’utilisation digestive et métabolique par les animaux, sur la répartition de l’azote entre urine et fèces avec des répercussions potentielles sur la composition des effluents, les émissions gazeuses associées et leur potentiel de valorisation.
Bénéfices attendus
Notre hypothèse est que nous pouvons réduire l’impact environnemental de la production porcine en maintenant les performances de croissance des animaux. Pour que la réduction d’impacts obtenues au kg d’aliment produit soit conservée au kg de porc produit, il faut que les performances de croissance soient maintenues.
Procédures
Les animaux seront logés dans des cages à digestibilité de dimension : 52 x 117cm pendant 14 jours sur les 28 jours d'expérimentation.
Impact sur les animaux
La mesure de l’utilisation digestive d’un aliment chez le porc nécessite de collecter totalement les fèces des animaux, qui ne doivent pas être contaminées par l’urine. Ainsi, il est nécessaire de placer les animaux dans des cages à digestibilité (dimensions : 52 x 117cm) dont les dimensions sont réduites afin d’empêcher l’animal de se retourner tout en lui maximisant l’espace disponible. Les cages sont ainsi équipées d’un système de parois ajourées mobiles et de barreaux permettant de maintenir le contact entre les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérimentation car nous allons tester des acides aminés de synthèse pas encore autorisés sur le marché de l'alimentation porcine (leucine, isoleucine, histidine). La mise à mort des porcs sera effectuée par injection intraveineuse de T61 (association d’embutramide, d’iodure de mébenzonium et de tétracaïne hydrochloride à la posologie de 1ml/10kg de poids vif) sous anesthésie (Imalgène IM à la posologie de 15mg/kg de poids vif).
Remplacement
L’objectif de ce projet est de tester l’incorporation d’aliments à moindres impacts environnementaux en condition d’élevage sur l’utilisation digestive des écoaliments, les émissions gazeuses à l’échelle de l’animal et la composition et valorisation des effluents. Ces objectifs ne peuvent être atteints par des méthodes mathématiques ou in vitro et nécessitent le recours à une étude in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux de l’essai et le dispositif expérimental mis en place ont été déterminés sur la base d’essais antérieurs afin d’atteindre le niveau de précision souhaité pour évaluer avec précision l’effet des écoaliments en élevage de porcs. Des protocoles similaires conduits dans l’unité ont utilisés entre 4 et 6 porcs par régime pour obtenir une précision satisfaisante dans les valeurs de digestibilité. En conséquence, nous conduirons nos mesures avec 6 porcs par régime.
Raffinement
La collecte totale des déjections sur des animaux entravés est à l’heure actuelle la seule méthode permettant de mesurer la digestibilité d’un aliment avec une grande précision. Les cages dans lesquelles seront hébergés les animaux seront équipées de barreaux et seront toutes placées dans la même pièce pour maintenir un contact visuel, auditif et olfactif entre les porcs. L’appétit, l’ingestion d’eau, le comportement des animaux ainsi que l’état de la cage seront observés au moins deux fois par jour par le personnel technique afin de détecter des blessures éventuelles, des diarrhées ou des troubles respiratoires. Tout animal présentant l’un de ces troubles fera l’objet d’une prise en charge immédiate.
Choix des espèces
La cible de l’étude est le porc en croissance-finition. Nous allons utiliser un croisement répandu dans les élevages commerciaux français (Piétrain X (Large White X Landrace)). Les animaux seront des porcs d’un poids vif de 30kg en début d’essai pour l'étude des aliments croissance et de 60kg en début d’essai pour l'étude des aliments finition. Nous avons choisi de travailler avec des animaux dont le poids vif moyen atteint au cours de l’étude correspond au poids vif moyen des porcs en phase croissance et en phase finition.
Etude du rôle de MKP1 dans le développement des troubles de l’humeur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
580 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Un état de type dépressif leur est imposé par deux modèles de désespoir, dont une induction de "désespoir acquis" par une méthode non précisée, suivie du test d'évitement, de la nage forcée cinq jours de suite, de la suspension par la queue et de la préférence au saccharose. Le porteur décrit ces atteintes de façon succincte et encadre les procédures par des points limites. Il affirme qu'il lui est "impossible" de recourir à des méthodes alternatives, seul l'animal vigile permettant selon lui d'évaluer les conséquences émotionnelles.
Objectifs
Le but de ce projet est de comprendre le rôle de MKP1 dans le développement de troubles dépressifs dans le but d'établir des traitements plus adaptés contre la dépression. Nous utiliserons un modèle de dépression induite par de stress aigu (modèle de désespoir acquis) afin d'étudier l'expression de MKP1 par qPCR chez des souris susceptibles et résistantes à ce modèle de dépression en les comparant aux souris contrôles. Dans ce même modèle, nous allons utiliser des souris qui n'expériment pas le gène codant pour la protéine MKP1 ainsi que leurs congénères WT afin de déterminer si la seule absence de MKP1 suffit à empêcher le développement d'un comportement de type dépressif suite à l'induction du désespoir acquis. Avenant: Suite aux résultats obtenus, notre hypothèse principale est que MKP1 semble être nécessaire au développement de troubles de type dépressifs sur le long mais pas sur le court terme. Afin de confirmer ou infirmer notre hypothèse, nous souhaitons étudier le rôle de MKP1 dans un autre modèle de désespoir (MDC), qui est chronique, contrairement au modèle de désespoir acquis qui se base du du stress aigu. Cet avenant servira d'expérience pilote à l'établissement d'une nouvelle saisine utilisant ce modèle, si les résultats sont concluants.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle de MKP1 dans le développement de troubles de type dépressifs. Avenant: Utiliser un modèle de désespoir chronique nous permettra de savoir si MKP1 est nécessaire au développement de troubles dépressifs sur le long terme, alors que cela ne semble pas être le cas sur le court terme.
Procédures
Les animaux du modèle du learned helplessness subiront (objectif 1 et 2 qui correspondent aux procédures 1, 2 et 3): pour les animaux contrôles: environ 10 min de test d'évitement actif ; pour les animaux LH: 2 séances de 50 min d'induction du modèle + environ 10 min de test d'évitement actif. Avenant: Les animaux de l'avenant seront soumis au test de préférence au saccharose en continu, au modèle de nage forcée 10 min/ jour pendant 5 jours consécutifs + 10 min de nage le 32ème jour, une fois à la pulvérisation d'eau sucrée et une fois au test de suspension par la queue.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à un développement de troubles de type dépressifs pour les souris WT et à une absence de ces troubles pour les souris KO. Avenant: Nous nous attendons à un développement de troubles de type dépressifs pour les souris WT et à une absence de ces troubles pour les souris KO.
Devenir
Procédure 1: n=300 animaux max qui sont maintenus en vie et passent en procédure 2 (n=240 max) ou en procédure 3 (n=60 max). Procédure 2: n=240 animaux max qui sont maintenus en vie passent en procédure 3. Procédure 3: n=300 animaux max mis à mort. Procédure 4: n=40 animaux max mis à mort.
Remplacement
Nous ne pouvons pas avoir recours à des méthodes alternatives pour réaliser un tel projet. Il est nécessaire d’évaluer les effets conséquences émotionnelles sur l’animal vigile. Il nous est donc impossible pour cette étape de travailler sur un modèle autre que l’animal.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous génotypons les animaux avant les expériences afin de n'utiliser uniquement ceux dont nous avons besoin (WT et KO). Nous effectuons également les manipulations par petits lots d'animaux afin d'arrêter les expériences lorsque le nombre d'échantillons de bonne qualité est atteint, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés à long terme.
Raffinement
Les expériences menées sont encadrées par des points limites adaptés, et construites de manière à ce que les souris subissent le moins de stress/angoisses/souffrances possible (transport via un tunnel, enrichissement dans la cage...).
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. De plus, le modèle de la souris nous permettra de pouvoir utiliser une lignée de souris dont le gène codant pour MKP1 a été inactivé (knock-down) afin d'approfondire notre étude. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (critères: début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Maintien d’une banque de tumeurs épithéliales mammaires humaines par des approches de xénogreffes orthotopiques chez la souris immunodéficiente.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
904 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par chirurgie une greffe de tumeur mammaire humaine, parfois suivie d'une résection, pour entretenir une banque de xénogreffes issues de patientes atteintes de cancer du sein. Le porteur suit la croissance tumorale au pied à coulisse et prévoit des points limites, avant une mise à mort permettant de prélever la tumeur ou de cartographier les métastases sur de nombreux organes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité tissulaire d'une tumeur, seule la greffe in vivo la restituant selon lui.
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent et le plus meurtrier chez la femme, à l’origine d’un peu plus de 11 800 décès par an en France. C’est une maladie complexe. Il existe de nombreux sous types de tumeurs mammaires qui ont des profils histologiques, génétiques et génomiques variés expliquant une évolution clinique différente. Cette hétérogénéité constitue à l’heure actuelle un des freins majeurs à une prise en charge thérapeutique optimale des patientes. Le développement de modèles précliniques mimant la complexité de la maladie est donc indispensable pour définir au mieux le traitement de demain. Pour cela, nous avons établi, dans un précédent projet (#01152.03), une banque d’une cinquantaine de xénogreffes (également appelée xénobanque) issues de tumeurs de patientes atteintes de cancer du sein (PDXs : Patient Derivated Xenograft) qui ont été archivées sous forme d’ampoules. Ce modèle a été démontré comme mimant parfaitement la biologie de la tumeur chez la patiente avec des profils histologiques, génomiques et transcriptionnels identiques (Marangoni et al., CCR 2007; Reyal F et al., BCR 2012; Derose et al., Nat med 2011). Il a également été démontré que ces modèles de xénogreffe reproduisent fidèlement la réponse aux thérapies conventionnelles observée chez les patientes (Zhang et al., Cancer Res 2013). Par ailleurs, cette xénobanque a permis d’initier la caractérisation du rôle des cellules souches cancéreuses (CSCs) présentes au sein de la tumeur et qui est à l’origine de 20 % des cancers du sein (Müller et al., 2020 ; Arfaoui et al., 2019, Guégan et al., 2019). Cette xénobanque sera donc au centre de notre projet qui aura 3 objectifs principaux: 1/ La préservation de la xénobanque; 2/ La caractérisation du développement métastatique des échantillons de la xénobanque; 3/ Le déploiement de la xénobanque dans des tests précliniques.
Bénéfices attendus
La préservation de la xénobanque réalisée grâce à ce projet permettra notamment de poursuivre la carctérisation de du développement métastatique des échantillons de cette banque et de mieux comprendre le rôle des CSCs dans ce processus permettrait de développer de nouvelles approches thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge des patientes atteintes de cancer du sein. Le matériel issu de cette xénobanque sera également utilisé pour l’étude des thérapies ciblant les CSCs en combinaison avec des traitements de chimiothérapie conventionnels (#16487-2018082108541206 v3), le développement de traitements ciblant la maladie métastatique (#21988-2019080815368654 v4) et l’étude de l’impact de la radiothérapie seule sur les CSCs ou combinée avec une thérapie capable de radiosensibiliser les CSCs (#26523-2020070810304662 v2). In fine, le renouvellement de cette xénobanque nous permettra d'approfondir nos connaissances sur le cancer du sein, son développement métastatique, sa résistance thérapeutique et plus particulièrement les CSCs pour pouvoir, espérons un jour, proposer une thérapie ciblée pour chaque patiente.
Procédures
L'ensemble des animaux subira une procédure chrirugicale (sous anesthésie) lors de l'implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire qui durera approximativement 15 minutes. Dans le cas de la procédures 2, les souris seront soumis à une procédure chirurgicale supplémentaire de résection de la tumeur qui durera 10-15 minutes.
Impact sur les animaux
L'ensemble des animaux subira une procédure chrirugicale lors de l'implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire. La nuisance de ces actes chirurgicaux sera prise en compte par l'application d'une anesthésie générale, d'une analgésie post-operatoire et l'utilisation d'un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Les éventuelles nuisances liées à la croissance tumorale seront détectées au plus tot à l'aide d'une grille de score de la douleur intégrant des points limites les plus précoces possibles.
Devenir
A l'issue de la Procédure 1, les souris seront sacrifiées et les tumeurs seront prélevées, dissociées et soit réinjectées dans des glandes mammaires pour nos autres projets soit pour réaliser des ampoules pour notre xénobanque. Suite à la Procédure 2, les souris seront sacrifiées et différents organes seront prélevées afin de réaliser la cartographie métastatique de chaque souris (coeur, poumons, cerveau, rate, reins, foie, ovaires, cage thoracique, squelette).
Remplacement
Sur le plan physiopathologique, une greffe orthotopique de cellules tumorales obtenue chez un animal présente des caractéristiques, non pas identiques, mais similaires à celles d'une tumeur humaine, avec une complexité tissulaire impossible à reproduire in vitro. De même, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, l’angiogenèse péritumorale, le contexte cytokinien, sont des mécanismes cruciaux lors de la croissance tumorale et qui ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.
Réduction
Nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant la réalisation d’ampoules et de nos différentes études. De plus, lorsque cela sera possible, les mêmes animaux serviront aux étapes de rafraichissement et d’amplification. Ce projet de maintien d'une banque de xénogreffes nécessitera donc 904 souris immunodéficientes de type NSG.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs : la mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse. Les procédures de transplantation seront réalisées sous anesthésie associée à une analgésie afin d’éviter toute douleur. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’apport d’un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de lanières de papier et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Des souris adultes pubères de 6 à 10 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, après le développement du tissu épithélial mammaire. En effet, le développement de la glande mammaire est un processus postnatal. A la naissance, chez la souris, le rudiment mammaire comprend un canal primaire bien formé et quelques ramifications secondaires. La glande mammaire reste quiescente jusqu’au début de la puberté (4 semaines), puis les canaux mammaires s’allongent et se ramifient intensivement, envahissant progressivement tout le stroma adipeux qui entoure la glande.
Evaluation du potentiel anti-thrombotique d’anticorps anti plaquettaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du modéré au sévère, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent plusieurs modèles de thrombose par pincement de l'aorte, chlorure de fer ou ponction de la carotide, un modèle d'accident vasculaire cérébral classé sévère sur vingt-quatre heures, et des modèles d'inflammation cutanée et pulmonaire. Le porteur décrit après réveil une prostration, une activité réduite et des troubles respiratoires, et évoque des souris humanisées pour la protéine GPIb. Il affirme que ces processus sont trop complexes pour des modèles in vitro "pas assez sophistiqués" et teste des anticorps anti-plaquettaires.
Objectifs
Les plaquettes jouent un rôle principal dans l’arrêt du saignement mais elles sont également impliquées dans la thrombose artérielle. Le complexe GPIb-V-IX est le récepteur clé des plaquettes au facteur Willebrand (FW). Cette interaction assure l’adhérence des plaquettes au sous-endothélium lésé. Le complexe GPIb-V-IX joue un rôle important dans la croissance du thrombus il est donc une cible anti-thrombotique reconnue. Il participe également à la formation du clou hémostatique et il est possible que son ciblage entraine un risque hémorragique. Nous avons généré trois anticorps qui bloquent l’interaction entre le complexe GPIb-V-IX humain et le facteur Willebrand. Nous avons montré ces anticorps inhibent in vitro la formation d’un thrombus dans une chambre de perfusion avec du sang humain. L’objectif du projet est d’évaluer le potentiel anti-thrombotique de ces 3 agents en les comparant à d’autres agents déjà validés dans des modèles de thrombose expérimentale. En parallèle nous utiliserons d’autres modèles in vivo pour évaluer le risque hémorragique. Ces modèles seront réalisés dans des souris humanisées pour la GP1b humaine (hGP1b), la GP1b murine étant remplacée par la GP1b humaine. Les plaquettes présentent des microfilaments d’actine impliqués en hémostase. La dynamique du cytosquelette d’actine correspond à un ensemble de processus d’assemblage et de désassemblage, dynamique indispensable pour le bon fonctionnement des cellules. Ces processus sont notamment régulés par les protéines de la famille des MICAL responsable d’oxydations, dont MICAL1 présent au niveau plaquettaire. De plus, il a été mis en évidence que ces oxydations sont importantes au niveau cardiovasculaire. Le rôle de MICAL1 plaquettaire sera évalué en thrombose artérielle grâce aux modèles de lésion mécanique suite au pincement de l’aorte abdominale ; lésion chimique suite à l’application d’un tampon imbibé de chlorure de fer sur la carotide ; lésion de la carotide par une piqure d’aiguille.
Bénéfices attendus
Le complexe GPIb-V-IX joue un rôle important dans la croissance du thrombus il est donc une cible anti-thrombotique reconnue. Il participe également à la formation du clou hémostatique et il est possible que son ciblage entraine un risque hémorragique. Nous avons généré trois anticorps qui bloquent l’interaction entre le complexe GPIb-V-IX humain et le facteur Willebrand. Nous avons montré que ces anticorps inhibent in vitro la formation d’un thrombus dans une chambre de perfusion avec du sang humain. L'évaluation de ces 3 agents pourrait conduire à l'identification d'un nouvel antiplaquettaire n'induisant pas de risque hémorragique, pouvant ainsi déboucher sur des essais cliniques afin d'en tester la sécurité et l'efficacité chez l'Homme. D'autre part, MICAL1 (responsable d'oxydations) est impliqué dans la dynamique du cytosquelette d'actine indispensable au bon fonctionnement des cellules. Il a été mis en évidence la présence de nombreuses oxydations au niveau cardiovasculaire. L'évaluation du rôle de MICAL1 plaquettaire en thrombose artérielle pourrait faire progresser les connaissances scientifiques et notamment mieux comprendre les mécanismes impliqués en thrombose artérielle.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Un modèle de thrombose par pincement mécanique sur l'aorte de la souris anesthésiée, une procédure classée sans réveil. 432 souris y seront soumises. La procédure dure 30 minutes - Un modèle de thrombose au chlorure de fer sur carotide de souris anesthésiée, une procédure classée sans réveil. 112 souris y seront soumises. La procédure dure 30 minutes. - Un modèle de thrombose par ponction d'une carotide de souris anesthésiée, une procédure classée sans réveil. 112 souris y seront soumises. La procédure dure 30 minutes. - Un modèle d'AVC (procédure chirurgicale) classé sévère auquel 80 souris seronts soumises. La procédure dure 24h. - Un modèle d'inflammation cutanée par formation de complexes immuns (rpA d'Arthus) induit par injections intradermiques et rétro-orbitale, classé modéré auquel 80 souris seronts soumises. La procédure dure 4h. - Un modèle d'inflammation pulmonaire induite par l'innoculation intranasale de LPS, classé modéré auquel 80 souris seronts soumises. La procédure dure 24h.
Impact sur les animaux
Les 3 modèles de thrombose sont des procédures sans réveil réalisées sous anesthésie. On pourra s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Pour le modèle d'AVC ischémique, durant l'anesthésie on peut également s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire. Au moment du réveil, on s'attend à un impact sur le comportement (activité réduite voire prostration), sur l'apparence physique (apparence des poils, paupières fermées), sur la nutrition, sur la température et également sur la motricité (rotation). Pour le modèle d'Arthus, durant l'anesthésie on peut également s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire. Au moment du réveil, on s'attend à un impact sur le comportement (prostation) et sur l'oeil (fermeture de la paupière). Pour le modèle de saignement pulmonaire, durant l'anesthésie on peut également s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire. Au moment du réveil, on s'attend à un impact sur le comportement (prostration) et la respiration (accélération, sifflements).
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer le rôle d’un récepteur antiplaquettaire humain dans des processus complexes et intégrés que sont la thrombose, l’AVC hémorragique ou encore les saignements en conditions inflammatoires. Ces processus sont particulièrement complexes et font intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que des conditions hémodynamiques (vaisseaux, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 16 souris/groupe au maximum pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Nous utiliserons des tests de Mann-Whitney pour la comparaison de 2 groupes et un test Kruskal-Walis post-test Dunn pour les comparaisons multi-groupes.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Les animaux, entre 2 et 6 par cage, ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées au maximum afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Pour ce faire, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédures. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter la souffrance et l’inconfort de l’animal. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un traitement approprié contre la douleur leur est administré. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répandus et maitrisés. Les techniques de mutagénèse dirigée ont permis de générer des souris exprimant la GPIb humaine (hGPIb) et des souris déficientes en MICAL1 spécifiquement au niveau mégacaryocytaire et plaquettaire. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constitue un outil original et unique. Des souris hGPIb, MICAL1-/- et WT âgées de 8 à 24 semaines seront utilisées dans les procédures 1,2,4,5,6. Cet âge correspond à la période où les souris pubères et ne présentant pas encore de modifications biologiques dues au vieillissement. Pour la procédure 3, le vaisseau doit être strictement calibré. L’écart d’âge entre les individus sera restreint entre 8 et 10 semaines.
Etude d’un nouveau transporteur d’oxygène pour la conservation du greffon chez un modèle de transplantation hépatique chez le porc
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
64 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, 32 donneurs sous anesthésie sans réveil et 32 receveurs en souffrance sévère. On prélève le foie des donneurs, tués pendant l'intervention, puis on le greffe aux receveurs suivis dix jours avec prélèvements sanguins quotidiens avant leur mise à mort, pour tester une méthode de conservation des greffons à base d'hémoglobine de ver marin. Le porteur signale des complications post-opératoires possibles et un stress lié à l'hébergement individuel. Il affirme que cette technique doit "impérativement" être testée sur l'animal avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
L’objectif de notre étude est d’améliorer la conservation des greffons hépatiques en ischémie froide par utilisation d’une technique de perfusion intermittente avec adjonction aux solutions utilisées d’un transporteur d’oxygène d’origine animale (à base d'hémoglobine de ver arénicole). Nous étudierons la survie d’animaux greffés et la reprise de fonction des greffons hépatiques conservés à l’aide d'une méthode de perfusion intermittente, alternative à la méthode de référence de perfusion hypothermique continue (HOPE). La perfusion intermittente sera réalisée avec une solution de conservation additionnée ou non de M101 saturé en O2. Les performances de ces traitements seront comparées au contrôle négatif (CS) et au contrôle positif (HOPE).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la mise en place d'une nouvelle méthode de conservation des greffons hépatiques avant transplantation chez l'Homme. Cette méthode plus simple et moins coûteuse que la méthode de référence (HOPE) permettrait d'accroître le nombre de foies transplantables et de faciliter leur acheminement vers les centres de transplantation.
Procédures
Les animaux donneurs de foie seront anesthésiés et soumis à une euthanasie sans réveil préalable dès que la procédure de prélèvement du foie sera terminée. Les animaux receveurs seront réveillés après la transplantation hépatique de manière à suivre les conséquences post-opératoires durant 10 jours. Durant cette période, des prélèvements sanguins quotidiens seront réalisés (3 tubes de 5 ml) via le cathéter veineux préalablement implanté. La viabilité de l'organe transplanté sera évaluée au 10ème jour post-opératoire. Les animaux seront donc anesthésiés une seconde fois pour une intervention sans réveil, nécessaire à la récupération du foie pour les analyses exploratoires.
Impact sur les animaux
Les animaux receveurs seront conservés 10 jours après transplantation hépatique. Des conséquences post-opératoires négatives peuvent exister, mais il est prévu une surveillance quotidienne de ces animaux ainsi qu'une analgésie adaptée durant et après l'intervention chirurgicale. Ces animaux devront cependant être hébergés dans un environnement différent de leur environnement d'élevage, en cages individuelles, ce qui peut occasionner un stress psychosocial léger même les animaux ont toujours des contacts visuels et auditifs avec des congénères.
Devenir
Les animaux donneurs de foie seront euthanasiés durant l'intervention chirurgicale sans réveil puisque leur survie sans foie n'est pas possible. Les animaux receveurs de foie transplantés seront réveillés et gardés en vie durant 10 jours pour évaluer les conséquences de l'intervention et la viabilité de l'organe transplanté. Ces mêmes animaux devront être euthanasiés au 10ème jour de manière à prélever le foie transplanté pour analyses.
Remplacement
L’objectif de notre étude est d’améliorer la conservation des greffons en ischémie froide par mise en œuvre d’une perfusion intermittente de l’organe avec adjonction d’une solution contenant un transporteur d’oxygène d’origine animale, à base d'hémoglobine de ver arénicole. Cette nouvelle technique doit impérativement être testée sur un modèle animal pertinent avant de l’appliquer à une étude clinique chez l’Homme, et de représenter une éventuelle alternative à la méthode de référence par perfusion hypothermique oxygénée continue (HOPE).
Réduction
Comme précédemment validé et publié, un effectif de 5 animaux par groupe représente le strict minimum nécessaire pour observer des différences significatives entre modes de conservation des greffons avant transplantation, mais nous avons décidé d’inclure 8 animaux par groupe pour garantir une puissance statistique satisfaisante. Les différences entre groupes seront analysées par des ANOVA à 2 facteurs suivies de tests de Tukey pour les comparaisons multiples.
Raffinement
Les techniques d’anesthésie et de chirurgie employées utilisent des appareillages de pointe et seront réalisées par des chirurgiens spécialistes de la transplantation hépatique chez l’Homme, avec l’aide de personnels compétents en anesthésie et analgésie porcine. Le suivi et l’analgésie post-opératoires des animaux seront effectués par des personnels compétents de manière à réduire la douleur et la souffrance des animaux. Toutes les interventions seront réalisées sous anesthésie générale et respecteront la charte nationale d’éthique sur l’expérimentation animale.
Choix des espèces
Le porc est l’animal de référence pour l’expérimentation médicale sur les greffes d’organes. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont particulièrement proches de ceux de l’Homme. Porcs en croissance (30-35 kg)
Étude de l’impact du statut métabolique sur l’activité hémicanal des cellules gliales du tronc cérébral
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère selon les groupes. Elles subissent un jeûne de 24 heures, un régime gras ou une injection de lipopolysaccharide induisant une anorexie inflammatoire, avant d'être décapitées sous anesthésie pour prélever le tronc cérébral, afin d'étudier le rôle de la connexine Cx43 dans la balance énergétique. Le porteur indique que le jeûne provoque une perte de poids allant jusqu'à 15% et que le produit inflammatoire entraîne anorexie, hyperalgésie et évitement social. Il conclut à l'absence de "méthode de substitution" pour étudier ces mécanismes.
Objectifs
L’obésité et l’anorexie induite par la maladie sont des problèmes de santé publique majeurs caractérisés par une rupture de la balance énergétique (équilibre entre les dépenses énergétiques de l’organisme et les apports par la prise alimentaire). Le complexe vagal dorsal (CVD) et l’hypothalamus médiobasal sont des régions cérébrales clés du contrôle de cette balance. Ils contiennent des réseaux de neurones sensibles à de multiples signaux informant du niveau des réserves énergétiques de l’organisme. Ces neurones interagissent avec les cellules gliales qui sont indispensables à l’activité neuronale dans de nombreux processus métaboliques et cognitifs. La façon dont les cellules gliales contribuent au contrôle de la balance énergétique reste cependant à explorer. Ce projet cherche à tester si les cellules gliales du CVD et de l’hypothalamus médiobasal sont capables de moduler leur communication lors de modifications du statut métabolique et d’informer les neurones impliqués dans le maintien du poids corporel. Dans ce contexte, nous focalisons notre attention sur le rôle d’une protéine, la connexine (Cx43), grâce à laquelle les cellules gliales communiquent entre elles et émettent des substances neuroactives. La Cx43 permet de constituer des hémicanaux s’ouvrant sur le milieu extracellulaire par lesquels les cellules gliales peuvent émettre des substances neuroactives. L’objectif du projet est d’évaluer comment les hémicanaux constitués de Cx43 (Cx43HC) sont affectés par le statut nutritionnel et le statut métabolique des animaux. Nous faisons l’hypothèse que des molécules libérées par les Cx43HC pourraient participer à la régulation de la balance énergétique et que l’ouverture des hémicanaux pourrait être modifié selon le métabolisme énergétique ou le statut nutritionnel pour réguler le passage de telles molécules. Pour tester notre hypothèse, nous souhaitons réaliser des expériences in situ sur des tranches aigües de tronc cérébral et d’hypothalamus et des analyses biochimiques pour mettre en évidence des modifications de la perméabilité des Cx43HC. Les résultats attendus de ce projet devraient permettre de mieux comprendre les mécanismes de rupture de la balance énergétique tout en identifiant des cibles potentielles d’intérêt thérapeutiques pour lutter contre l’obésité ou l’anorexie induite par l’inflammation.
Bénéfices attendus
Pour comprendre comment les hémicanaux constitués de Cx43 (Cx43HC) sont affectés par le statut nutritionnel ou une modification du métabolisme énergétique, nous évaluerons l’activité des hémicanaux constitués de Cx43 (Cx43HC) dans un modèle in situ de tranches hypothalamiques et de tronc cérébral. Ce modèle nous permet de déterminer le degré d’ouverture des HC lors d’un défi énergétique (jeûne, anorexie induite par l’inflammation, régime obésogène court). Cette approche sera complétée par des analyses biochimiques qui permettront d’identifier des modifications post-traductionnelles associées à une variation de la perméabilité des Cx43HC dans les mêmes conditions de rupture de la balance énergétique. Pour ce projet, nous testerons les effets de 3 conditions connues pour affecter le statut nutritionnel et métabolique des animaux : -un jeûne de 24h (procédure 1), -un régime enrichi en graisse de 3 jours (procédure 2), -une anorexie inflammatoire induite par le lipopolysaccharide (LPS ; injection ip unique ; 0,4 mg/kg à 0.1 mL/10g de poids corporel, 1h30 avant la mise à mort, procédure 3). Les souris concernées seront ensuite anesthésiées et après vérification de l’atteinte d’un pallier chirurgical d’anesthésie par l’absence de réflexe au pincement de la patte, les souris seront mises à mort par décapitation. Cette méthode de mise à mort est la seule qui préserve intacte la structure du bulbe rachidien étudiée. Leurs cerveaux seront extraits en vue : 1/ de tester l’activité hémicanal sur un modèle de tranches aigües de tronc cérébral et d’hypothalamus. 2/ d’analyser les modifications post-traductionnelles associées aux modifications du statut énergétique et témoignant d’une modification de la perméabilité des Cx43HC.
Procédures
Pour comprendre comment les hémicanaux constitués de Cx43 (Cx43HC) sont affectés par le statut nutritionnel, nous évaluerons l’activité des hémicanaux constitués de Cx43 (Cx43HC) dans un modèle in situ de tranches hypothalamiques et de tronc cérébral. Ce modèle nous permet de déterminer le degré d’ouverture des HC lors d’un défi énergétique (jeûne, anorexie induite par l’inflammation, régime obésogène court). Cette approche sera complétée par des analyses de biologie moléculaire qui permettront d’identifier des modifications post-traductionnelles associées à la perméabilité des Cx43HC lors de modification du statut nutritionnel. Ce projet nécessite l’utilisation de 60 souris mâles. Pour ce projet, nous testerons les effets de 3 conditions connues pour affecter le statut nutritionnel : un jeûne (durée 24h), un régime alimentaire enrichi en graisse (durée 72h) et une anorexie inflammatoire induite par injection aigue de lipopolysaccharide (durée 1h30). Les souris concernées seront ensuite anesthésiées (Kétamine/Xylazine 120 mg/kg et 16 mg/kg respectivement ; ip 0,1 ml/10g) et leurs cerveaux seront extraits en vue : 1/ de tester l’activité hémicanal sur un modèle de tranches aigues de tronc cérébral et d’hypothalamus. -12 animaux seront mis à jeun pendant 24h (n=12) -12 animaux seront soumis à 3 jours de régime alimentaire enrichi en graisse (n=12) -12 animaux seront exposées à l’anorexie inflammatoire consécutive à une injection de Lipopolysaccharide (0,4 mg/kg ; ip 0,1 ml/10g) pendant 1h30 (n=12) 2/ d’analyser les modifications post-traductionnelles associées aux modifications du statut énergétique et témoignant d’une modification de la perméabilité des Cx43HC. Pour ces analyses, 8 animaux sont nécessaires par groupe (3x8 = 24, soumis aux différents régimes). Ainsi, 20 animaux seront soumis à un jeûne, 20 animaux seront soumis à un régime enrichi en graisse et 20 animaux feront l’objet de la procédure induisant une anorexie inflammatoire.
Impact sur les animaux
Les procédures utilisées ont pour objectif de tester l’impact du statut nutritionnel sur l’activité hémicanal dans un modèle in situ. L’accomplissement de cet objectif implique des modifications contraignantes du statut énergétique des animaux. -Le régime enrichi en graisse est connu pour ne générer aucune douleur, souffrance ou angoisse chez la souris et nous n’attendons pas de nuisance associée au régime. -Le jeûne de 24h est une source de stress pour l’animal, entrainant une perte de poids corporel importante chez les animaux représentant jusqu’à 15% du poids corporel ainsi que des modifications du statut métabolique (shift vers une oxydation lipidique au détriment de l’oxydation glucidique). -L’injection aigue de lipopolysaccharide est classiquement utilisée pour induire une anorexie inflammatoire chez les animaux. Ce traitement engendre un état de maladie transitoire des animaux, dont les symptômes (anorexie, hyper ou hypothermie, hyperalgésie, inactivité, somnolence, évitement social et libération d’hormone de stress) culminent à 6-10h post injection et se résolvent en 24h. Ces symptômes restent limités pour la durée d’exposition sélectionnée pour ce projet (1h30). La contention avant les injections intrapéritonéale et retrouvée dans toutes les procédures est une source de stress pour l’animal. Les souris seront mises à mort, par décapitation sous anesthésie générale profonde au moment correspondant à la fin du la durée d’exposition prévue pour chaque procédure (après 3 jours d’exposition au régime enrichi en graisses ; après 24h de jeûne ; 1h30 après l’injection de LPS).
Devenir
Les souris seront mises à mort par décapitation sous anesthésie générale profonde pour des analyses physiologiques post-mortem.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de la consommation alimentaire du poids corporel ou permettant d’étudier l’activité hémicanal.
Réduction
Notre expertise nous permet de définir au plus juste le nombre d’animaux nécessaire aux mesures post-mortem terminales après 3 procédures de modification du statut nutritionnel (24h de mise à jeun ; exposition durant 1h30 à l’anorexie inflammatoire induite par une injection de LPS ; ou après 3 jours d’un régime alimentaire enrichi en lipides). -Pour chaque expérience in situ utilisant des tranches aigues d’hypothalamus et de tronc cérébral, 12 animaux sont nécessaires à l’obtention d’une puissance statistique suffisante. Ce nombre d’animaux a été déterminé à partir de précédentes études réalisées sur des tranches d’animaux naïfs (mise à mort réglementaire). Le complexe vagal dorsal du tronc cérébral est une petite structure qui limite le nombre de tranches disponibles (environ 3 tranches par animal). La mesure du taux d’ouverture des hémicanaux Cx43 nécessite de comparer des tranches incubées dans trois solutions différentes (condition sans agent pharmacologique : aCSF), avec un large bloqueur des hémicanaux (contrôle négatif), et avec un agent pharmacologique spécifique des hémicanaux de connexine 43. Au moins 2 tranches par condition sont nécessaires. Il faut donc 2 animaux par expérience. Pour obtenir la puissance statistique appropriée, 6 expériences indépendantes sont nécessaires.12 animaux par procédure in situ seront donc utilisés. -Pour les analyses biochimiques (niveaux protéiques et modifications post-traductionnelles), 8 animaux par groupe sont nécessaires à l’obtention d’une puissance statistique suffisante. Ce nombre d’animaux a été déterminé à partir de précédentes études d’analyses de niveaux protéiques, des méthodes utilisées en routine au sein de notre équipe de recherche. Au total ce projet prévoit l’utilisation de 60 animaux, dont 36 animaux pour les analyses in situ et 24 animaux pour les analyses biochimiques.
Raffinement
Toutes les procédures mentionnées dans ce projet sont réalisées en routine au laboratoire. Les animaux utilisés seront commandés au minimum un semaine avant le début de la procédure pour permettre une période d’acclimatation à l’animalerie. L’hébergement des animaux se fait avec un enrichissement du milieu, dans un environnement à température et hygrométrie contrôlées et un cycle jour/nuit 12h/12h. Les animaux font l’objet d’un suivi quotidien, avec la mise en œuvre d’actions adaptées lors d’éventuels franchissement des points limites ou points d’arrêt. Un animal montrant des signes de souffrance avant le début d’une procédure recevra un traitement analgésique morphinique et n’intègrera la procédure qu’après retour à un état normal. Cette précaution évite toute amplification des nuisances liées à la procédure en raison d’un problème intercurrent. A la fin des procédures la mise à mort par décapitation est réalisée sous anesthésie générale pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Toutes les procédures mentionnées dans ce projet ont déjà été mises au point chez la souris dans notre équipe. Les animaux utilisés seront de jeunes souris adultes (7 semaines d’âge) au démarrage de l’expérimentation. Le choix de ce stade de développement est guidé par la volonté de réaliser des expériences chez la souris adulte et parce que le modèle in situ est optimisé pour des souris de 7 semaines. Ce stade de développement est classiquement choisi pour les expériences in situ chez les animaux considérés adultes.
Développement dans un modèle porcin d’un biomatériau pour la prévention des fistules salivaires en chirurgie cervico-faciale
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
38 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une laryngectomie totale, chirurgie lourde pouvant provoquer une fistule salivaire, des infections et des complications, pour mettre au point un biomatériau censé prévenir ces fistules après ablation du larynx chez l'Homme. Le porteur reconnaît que "les effets indésirables pourront être importants" et prévoit la mise à mort en cas de souffrance persistant plus de 24 heures. Il justifie le recours au porc par la volonté de "se rapprocher des conditions humaines" avant les premiers essais cliniques.
Objectifs
Notre projet à pour but de développer dans un modèle porcin un biomatériau innovant sous la forme d'un film double couche pour la prévention des fistules salivaires chez l'Homme. Il s'appuie sur des résultats préliminaires concernant le design de biomatériaux à base d'alginate.
Bénéfices attendus
Les cancers ORL, ou cancers de la tête et du cou, représentent la 4ème cause de cancer en France. La (pharyngo)laryngectomie totale, qui consiste en la séparation définitive entre l'axe respiratoire et l'axe digestif (néopharynx), est une intervention courante pour le traitement des cancers pharyngo-laryngés. Cependant, la complication la plus fréquente de cette chirurgie est la fistule salivaire (incidence de 20 à 65%), soit une fuite de salive entre les sutures du néo-pharynx. La salive, en s'écoulant dans le cou, entraine une morbidité élevée (augmentation de la durée d’hospitalisation, reprise chirurgicale, risque de rupture vasculaire et de décès par rupture de la carotide). Il n'existe aucune solution actuellement pour réduire l'incidence des fistules salivaires. Notre biomatériau présente donc un intérêt dans l'amélioration du post-opératoire et de la qualité de vie des patients subissant une laryngectomie totale.
Procédures
1. Laryngectomie totale sur tous les animaux, 1 demi-journée maximum comprenant anesthésie/chirurgie/réveil, 2. Suivi des animaux post-chirurgie, au moins 30 minutes à 1h une fois par jour, le suivi sera effectué plusieurs fois par jour en post-opératoire immédiat, 3. Prélèvement sanguin le lendemain de la chirurgie, 5 jours après et avant euthanasie, quelques secondes à maximum 1 minute, 4. Euthanasie des animaux et prélèvement tissulaire, environ 10 minutes entre administration du sédatif et euthanasie.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une laryngectomie totale conduisant potentiellement à une fistule salivaire. Même si une analgésie sera mise en place et que les animaux seront observés plusieurs fois par jour au moins lors du post-opératoire immédiat pour limiter la douleur et l'inconfort des animaux, les effets indésirables pourront être importants (risque d'infection, de complications lors de la chirurgie, apparition de fistules par exemple).
Devenir
Les animaux ayant subi une chirurgie lourde, ils ne pourront pas être réutilisés pour d'autres expérimentations. De plus, les molécules utilisées n'ont pour la plupart par d'AMM porc. Les animaux ne peuvent donc pas être remis sur le marché pour la consommation humaine.
Remplacement
Le projet BIOFISS vise à développer un biomatériau innovant pour la prévention des fistules salivaires. Une première étape de ce projet, non décrite dans cette demande d'autorisation, consistera à vérifier la biocompatibilité du biomatériau sur un modèle de pharyngotomie de rat. Avant de pouvoir proposer les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est ensuite nécessaire de vérifier l’efficacité de ce biomatériau sur des modèles de porcs laryngectomisés pour se rapprocher des conditions humaines.
Réduction
Pour la première étape du projet, aucune étude statistique n'a été faite, cette étape consistant à développer le modèle de porc laryngectomisé. Cependant, afin de réduire si possible le nombre d'animaux prévus pour cette étape, soit 8 porcs, deux porcs seront tout d'abord opérés et suivis pendant 1 mois avant de réaliser l'opération sur les 6 porcs suivants. En fonction des résultats obtenus sur les deux premiers porcs, le nombre total de porcs utilisés pour la mise au point du modèle pourra donc être revu à la baisse. Pour la seconde étape du projet, le principal critère d'évaluation est le taux d'animaux sans fistule après mise en place du biomatériau sur des porcs laryngectomisés. En utilisant un plan A'Hern (alpha=10%, 1-beta=80%, et p0=45%, p1=70%), 20 animaux doivent être inclus dans le bras expérimental à savoir biomatériau. Comme le bras contrôle n'est là que pour estimer un taux de réussite, 10 animaux seront inclus dans le bras contrôle. Par conséquent, 30 animaux doivent être inclus pour la deuxième étape du projet.
Raffinement
Les porcs seront hébergés en groupe avant la chirurgie puis seront hébergés dans des boxs individuels leur permettant de se sentir, s'entendre et se voir dans une certaine mesure, sans leur permettre de se toucher et d'arracher les pansements et le biomatériau. Leur environnement sera enrichi avec de la musique pour couvrir les bruits des expérimentateurs, des balles, des ballons et des objets à mâcher. Ils seront hébergés sur une litière de copeaux afin de favoriser leur comportement fouisseur. Ils seront observés au moins une fois par jour y compris les weekend et jours fériés, et encore plus fréquemment les jours suivants la chirurgie. Les animaux seront suivis pendant 1 mois après l'opération, mais en cas de signes de souffrance persistant plus de 24h, les animaux seront euthanasiés avant la fin de l'étude.
Choix des espèces
Un modèle de laryngectomie totale chez le porc a déjà été décrit pour la recherche sur la transplantation laryngée (Birchall et al. (2011), Murison et al. (2009)), mais les animaux ont été gardés en vie peu de temps et l’objectif n’était pas le contrôle des fistules salivaires. Afin de valider et de se familiariser avec la procédure, ce modèle de porc laryngectomisé sera repris dans ce projet et une laryngectomie avec gastrostomie sera réalisée sur 8 animaux. Les animaux seront des animaux sevrés (arrivée dans l'Etablissement Utilisateur à 28 jours) mais assez jeunes pour pouvoir être manipulés facilement lors de la chirurgie et des soins post-opératoires (entre 20 et 25 kg au moment de la chirurgie au maximum).
Effet d’un entraînement intensif sur des paramètres in vivo et ex vivo chez un modèle de rat Wistar sain.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Vingt rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié suit six semaines d'entraînement intensif sur tapis roulant, tous passant un test d'effort poussé jusqu'à l'épuisement, classé sévère, avant des prélèvements de sang sous anesthésie puis une ponction cardiaque terminale. Le porteur indique que l'animal récupère dans les vingt secondes suivant l'arrêt de l'effort et qu'il est récompensé par un morceau de pomme. Il affirme qu'on ne peut pas prélever tous les organes d'un humain après entraînement et qu'aucun modèle cellulaire ou informatique n'apporte de réponse intégrative.
Objectifs
Les types d’entraînement physique reconnus comme étant les plus bénéfiques sur la santé sont le continu (à intensité modérée pendant une durée relativement longue (1h ou plus)) et l’intermittent (de courtes fractions de haute intensité avec des intervalles de récupération réguliers). Les effets bénéfiques de ces deux types d’entraînement sont très étudiés chez l’homme, particulièrement chez des patients présentant des facteurs de risque de maladies cardiovasculaires, sans que les mécanismes physiologiques ne soient bien compris. Le modèle choisi pour ce projet est le rat de souche Wistar. Même si, de par sa quadrupédie, la biomécanique de la course ne ressemble pas à celle de l’homme, tous les mécanismes physiologiques induits à l’exercice sont retrouvés chez cet animal qui comprend la tâche à réaliser. De plus, il présente l’avantage d’être représentatif de la population humaine car chaque rat répondra individuellement à l’entraînement auquel il sera soumis et c’est exactement ce que nous recherchons pour cette étude. L’entraînement de type intermittent sur des rats sains, mis en place et validé au laboratoire, a montré qu’il exacerbait davantage les capacités oxydatives par rapport à un entraînement continu tout en ne diminuant pas l’index d’adiposité. Ce résultat est tout à fait intéressant car très controversé dans la littérature, ce qui interroge sur les mécanismes physiologiques qui relient les tissus musculaire et adipeux avec de l’intermittent. Notre laboratoire va se doter d’un tapis de course calorimétrique. Cet équipement permet une mesure directe de la VO2max (indice de la capacité maximale aérobie d’un individu), complémentaire des mesures dites "de terrain" que nous réalisons habituellement avec la mesure de VMA (Vitesse maximale aérobie). Un des premiers objectifs est donc de maîtriser et de comparer ces deux outils. En effet, peu de laboratoires font directement correspondre ces deux méthodes d’exploration du métabolisme aérobie. Le second objectif concerne la mise au point d’une co-culture des cellules primaires (cellules musculaires striées squelettiques-adipocytes) issues des animaux « entraînés » afin de comprendre notre précédent résultat (pas de diminution de l’index d’adiposité) en étudiant entre autres les molécules impliquées dans l’inflammation (myokines et adipokines).
Bénéfices attendus
Tous les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes physiologiques impliqués dans les bénéfices de l’entraînement intensif sur l’organisme au profit de la santé humaine. A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur la compréhension des mécanismes in vivo du métabolisme aérobie (mesuré par la détermination du quotient respiratoire obtenu directement par le test de VO2max), les activités enzymatiques plasmatiques et les marqueurs inflammatoires (prélèvements sanguins in vivo). Ces mécanismes sont aussi explorés sur les tissus prélevés après mise à mort. A moyen terme, la mise en place de co-cultures muscles-adipocytes à partir d’animaux entraînés, permettra de vérifier la durabilité des effets de l’exercice ex-vivo, et d’explorer la communication de ces populations de cellules (par le biais des adipokines et des myokines) sans repasser par un animal. A plus long terme, ces données sur cellules, en plus de proposer une alternative à l’expérimentation animale, seront une vraie plus-value sur la compréhension des mécanismes induits par l’entraînement intensif, surtout sur le tissu adipeux car les données bibliographiques sont contradictoires et principalement ciblées sur des pathologies métaboliques.
Procédures
Tous les animaux (n = 20) sont soumis à deux prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse au niveau de la veine latérale caudale aux âges de 7 et 12 semaines. Ils réalisent tous un test de capacité maximale aérobie (appelé test de VO2max) à l’âge de 8 semaines et seuls les animaux entraînés en intermittent intensif (HIIT, n=10) referont ce test (à 11 et 14 semaines) pour réajuster l’entraînement à leurs capacités individuelles. Le jour du test, ils ne feront pas leur séance d’entraînement et récupèreront 48 heures avant de reprendre l’entraînement. L’entraînement HIIT individualisé (n = 10) débute à l’âge de 9 semaines et perdure 6 semaines consécutives à raison de 5 séances/semaine d’une durée de 36 min/jour. Les animaux non entraînés (n = 10) ne courent pas mais sont manipulés quotidiennement de la même façon que les animaux entraînés.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : - le stress mais ce dernier sera largement réduit par une contention et manipulation journalières des animaux par les mêmes concepteurs sur toutes les techniques utilisées. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse. - La fatigue liée au test de capacité maximale aérobie (VO2 max) d’une durée de 25 minutes maximum. Ce test est considéré comme une procédure sévère dans l’annexe de l’Arrêté du 1er février 2013 relatif à l’évaluation éthique et à l’autorisation de projet car nous atteignons l’épuisement de l’animal (point limite). Cependant, dès l’arrêt de l’exercice, l’animal est mis au repos et il récupère dans les 20 secondes suivantes. Il explore son environnement, et se toilette tout de suite après l’arrêt du test.
Devenir
Nous devons travailler sur des prélèvements d’organes et c’est la raison pour laquelle, à l’issue de notre projet, tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Notre travail porte sur une étude intégrative et non invasive des effets de l’entraînement physique intensif sur le métabolisme aérobie et anaérobie chez des individus sains. A l’heure actuelle, les mesures de VO2 max sont réalisées chez l’homme mais nous ne pouvons pas récupérer tous ses organes pour étudier les mécanismes physiologiques à l’issue d’une période d’entraînement. Il n’est pas non plus possible de remplacer le modèle animal actuel par des cellules ou des modèles bioinformatiques car ces méthodes alternatives n’apportent pas de réponses intégratives. Par contre, nous souhaitons réaliser une co-culture primaire d’adipocytes-cellules musculaires sur les animaux ayant suivis notre procédure expérimentale. A terme, si la méthode fonctionne, elle constituera une méthode alternative aux expérimentations sur l’animal.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au strict minimum pour que les résultats soient statistiquement exploitables et pour nous donner une marge de 10 % en cas d’échec (liés au refus de courir pour le groupe HIIT). Les tests statistiques utilisés seront des ANOVA multifactorielles (2 facteurs à étudier : âge, exercice) pour des données qui seront gaussiennes, avec des groupes à petits effectifs. Si les données ne sont pas gaussiennes, un test non paramétrique sera utilisé (test U de Mann et Whitney). De plus, après mise à mort des animaux, la mise en place de co-culture muscle-tissu adipeux permet de dupliquer les expériences sans repasser par l’animal. Cette technique nous permettra, à terme, de réduire le nombre d’animaux à utiliser dans nos futurs projets.
Raffinement
Tout au long du protocole, les conditions de stabulation sont réalisées dans un souci de bien-être de l’animal et ils sont suivis quotidiennement (tables de suivi de soin fournies en annexe). Toute la procédure expérimentale est réalisée par du personnel à jour de leur maintien de compétence et parfaitement formé aux techniques mises en œuvre dans cette demande. Avant de démarrer le protocole d’entraînement intensif, les animaux sont habitués sur le tapis roulant à marcher, puis à courir jusqu’à atteindre 30 min de course quotidienne environ, pendant au minimum 4 jours. Cette étape est primordiale : elle permet à l’expérimentateur et à l’animal de créer une confiance qui conditionne la réussite de la tâche à accomplir. Les vitesses sont maintenues sur des durées adaptées à l’aptitude des rats et leur compréhension de l’exercice. Le test de capacité maximale aérobie (VO2 max) est toujours réalisé seul le vendredi (pas de séance d’entraînement ce jour-là) pour que les animaux soient au repos pendant 2 jours avant de reprendre l’entraînement le lundi suivant. A l’issue de chaque séance d’entraînement, les animaux sont récompensés par un petit morceau de pomme. Les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie gazeuse (isoflurane induction 4%, maintien 2%), et la ponction cardiaque terminale sous anesthésie générale (Kétamine 1000 à 100mg.kg-1/Xylazine à 2%, à 10 mg/kg-1).
Choix des espèces
Le rat est un animal doué et intelligent qui peut être conditionné à l’activité physique, en particulier la souche Wistar. Les mécanismes physiologiques de l’activité physique sur ce modèle sont très proches de ce qui se déroule chez l’homme. Tous les protocoles démarrent à l’âge de 5 semaines et se terminent à l'âge de 15 semaines
Étude de l’impact de l’immunosénescence sur l’inflammation du colon
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite aiguë leur est provoquée par du dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, après un mois de tamoxifène et cinq injections de composés sénolytiques, pour étudier le rôle du vieillissement immunitaire dans l'inflammation du côlon. Le porteur indique que la colite provoque douleur et diarrhée et qu'aucun traitement antidouleur ne sera donné pour ne pas fausser la réponse inflammatoire, une grille de score fixant le point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les interactions entre les compartiments cellulaires d'un organe.
Objectifs
Le vieillissement est souvent associé à l’apparition de maladie inflammatoire chronique favorisant le développement de pathologies tel que les cancers coliques ou la colite. L’une des causes majeures de ce problème pourrait être l’accumulation de cellules sénescentes (CS) au sein du système immunitaire, ce qu’on appelle l’immunosénescence. En effet, ces CS sont un type cellulaire dont la proportion s’accroît avec le vieillissement et qui a la capacité de promouvoir l’inflammation, inhibant ainsi le système immunitaire et l’empêchant de réagir correctement à des pathologies qu’un organisme plus jeune pourrait éradiquer facilement et rapidement. Le but de ce projet est d’étudier le rôle de l’immunosénescence dans l'inflammation intestinale ainsi que la sensibilité de cette dernière a certains composés identifiés comme « anti-sénescences », mais plus connus sous le terme sénolytiques.
Bénéfices attendus
Ces recherches permettront d’identifier la senescence comme cible thérapeutique pour lutter contre les multiples maladies associe à l’âge et en lien avec l’inflammation tel que le cancer ou les colites.
Procédures
Pour mener à bien ce projet, nous induirons une colite aiguë, donc une maladie inflammatoire, chez des souris jeunes (8 semaines) et d'âge mûr (12 mois) en les traitant pendant une semaine avec du dextran sulfate sodium (DSS) dissout dans l’eau de boisson. Cette procédure peut engendrer une douleur et est classée comme « sévère ». Pour le bien-être des animaux, nous avons établi une grille de score visant à définir des seuils à partir desquels un traitement analgésique sera administré et un point limite à partir duquel l’expérience sera arrêtée. Les souris traitées au DSS appartiendront à 2 types de modèles murins transgéniques différents cars permettant soit de marquer les CS à l’aide d’une protéine fluorescente, soit de les dépléter. Pour activer ce système transgénique, les souris devront être exposées au préalable un mois à du tamoxifène mais à une concentration n’induisant aucun effet négatif sur la santé de l’animal. Enfin, une partie des souris sera également traitée avec des sénolytiques afin de voir les conséquences de la déplétion pharmacologique des CS sur le déroulement de la colite, et notamment s’ils peuvent compléter la déplétion génétique du modèle murin. Pour résumer les souris seront nourries avec de la nourriture mélangée a du tamoxifène (durant 1 mois), traitées avec du DSS mélangé a l'eau de boisson (1 semaine) et injectées en intrapéritonéale avec des sénolytiques (D/Q) 5 fois (quelques secondes pour chaque injection, chacune espacée de 3 jours).
Impact sur les animaux
Si le traitement aux sénolytiques ne doit pas induire de douleurs chez l’animal, la colite induite par le DSS, favorisant notamment l'apparition de diarrhée, nécessitera une très bonne gestion de la douleur rendue possible par une feuille de score et un suivi adapté. De plus, notre modèle transgénique marquant les CS n’est pas dommageable, mais le modèle les déplétant peut conduire à de la fibrose hépatique chez les souris de plus de 1 an. Ce modèle sera donc considéré comme dommageable à partir de cet âge. Pour ces raisons, nous classons les 2 procédures de ce projet en "sévère". Chacune des 640 souris de ce projet sera suivie à l’aide d’une fiche de score adaptée à son traitement, génotype et âge, puis euthanasiée à la fin de la procédure expérimentale ou si l’animal atteint un point limite.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiees afin de prelever les tissus d'interets.
Remplacement
Aucune méthode alternative ou modèle in vitro n’existe pour mimer les interactions qui existent entre les différents compartiments cellulaires (immunitaire, épithélial, stroma, etc). En effet, les modèles de co-culture ne permettent pas de récapituler la complexité d’un organe que ce soit par le type de cellules et leur agencement tridimensionnel.
Réduction
Les effectifs ont été choisis afin d’obtenir des résultats significatifs avec le nombre de souris minimum. Nous obtenons 16 souris/groupe en utilisant le logiciel Gpower avec un test de student unilatéral et paramétrique (comparaison de 2 groupes indépendants sous loi normale) de puissance statistique modérée (0.7) associé à un effet taille important (0.8) pour p≤0.05. Considérant une mortalité potentielle, nous l'avons l'augmenté à 20 souris/groupe.
Raffinement
Pour limiter la douleur que notre procédure expérimentale pourrait induire, les souris seront suivies par le soin des expérimentateurs avec une fiche de score fournie (annexe 1 et 3). Notre fiche de score est basée sur 13 observations regroupées sous 3 index. Ces fiches comprennent des points limites qui correspondent à un score maximum prenant en compte les différents paramètres cités plus haut et seront remplies tout au long de l'expérimentation. Dans la procédure 1, dès que la souris rentre en expérimentation (traitement DSS) elle sera suivie quotidiennement. Nous ne donnerons pas de traitement analgésiques et antalgiques qui pourraient contrecarrer nos expériences basées sur la réponse inflammatoire. D’autres points prennent en compte le caractère potentiellement dommageable de la souche p16Cre/DTA après 1 an. Pour l’évaluer nous avons rajouté certains critères spécifiques à ce modèle dans la feuille de score, tel que la recherche de prurit ou une mesure du poids. D'autre part, nous avons prévu un suivi sanitaire journalier par les membres de l’équipe (expérimentateurs + personnels techniques) à l’aide d’une feuille de score adaptée au modèle (DSS et Annexe 3, p16-Cre/DTA + non traitées et annexe 1).
Choix des espèces
Les modèles murins sont parmi les modèles les plus répandus pour étudier l’effet des drogues sur l'inflammation, mais également fréquemment utilisés pour l'étude de la senescence. Leur cycle de reproduction court nous permet une optimisation dans la sélection des génotypes d’intérêts. Notons également que cette espèce est facilement manipulable. De plus, la plupart des modèles transgéniques que nous souhaitons utiliser ne sont disponibles que chez la souris. Dans ce projet nous utilisons des souris immunocompétentes ce qui nous permettra d’évaluer au mieux les coopérations entre les cellules immunitaires et sénescentes. Nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines et 12 mois.
Immunobiologie intégrée des lymphocytes T
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Elles subissent des irradiations aux rayons X, des prélèvements de sang et des injections répétées, une partie développant des maladies auto-immunes ou inflammatoires induites pour l'étude des lymphocytes T. Le porteur indique que des points limites doivent réduire la douleur, sans préciser lesquels, et reconnaît qu'une culture in vitro de thymus fœtaux remplace une partie des manipulations. Il affirme néanmoins que l'ensemble des signaux étudiés ne peut pas être reproduit in vitro et qu'il nécessite le recours aux souris.
Objectifs
Le projet a pour but de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires contrôlant la différenciation et les fonctions des lymphocytes T conventionnels (Tconv) et régulateurs (Treg) dans le thymus et en périphérie, en condition physiologique et pathologique.
Bénéfices attendus
Alors que les Tconv adaptent les réponses immunitaires à l'agression sublie, les Treg inhibent les réponses immunitaires. Une meilleure compréhension des ces cellules, visée dans notre projet, aidera ainsi au développement de thérapies innovantes dans le cadre de la lutte contre les maladies infectieuses, les maladies autoimmunes, le cancer, et les maladies inflammatoires chroniques. Un exemple saillant est notre description de l'utilisation des Treg afin de prévenir le rejet chronique des greffes allogéniques (Joffre et al., Nature Medicine 2008)
Procédures
irradiations rayons X (deux fois sur une journée avec une intervalle d'au moins 8 heures. Ce traitement n’est effectué qu’une seule fois dans la vie d'une souris) --- prélèvements de sang sur animaux anesthésiés (au maximum une fois par semaine et deux fois dans la vie d’une souris) --- injections sur animaux anesthésiés (i.p. : au maximum deux fois par jour sur au maximum cinq jours consécutifs dans la vie d’une souris; i.v. : au maximum une fois par semaine et deux fois dans la vie d’une souris)
Impact sur les animaux
Vu qu'une partie de notre recherche vise à mieux comprendre les défauts du système immunitaire menant aux pathologies auto-immunes et inflammatoires chroniques, nous induirons ces pathologies chez la souris.
Devenir
À l'issue de toutes les procédures utilisées dans notre projet, les souris seront euthanasiées. Ces souris ayant été manipulées, elles ne peuvent pas être utilisées dans d'autres expériences
Remplacement
Notre projet vise à caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent la différentiation (thymique et périphérique) et les fonctions des lymphocytes T conventionnels et régulateurs en conditions physiologique et pathologique. Les environnements thymiques et périphériques (tissus et organes lymphoïdes secondaires) modulent la différenciation (axe 1) et le programme épigénétique (axe 2) des lymphocytes T. Cette modulation est altérée lors d’une maladie auto-immune ou inflammatoire chronique. L’ensemble de ces signaux ne peut pas être récapitulé in vitro et nécessite l’utilisation d’animaux. Or, un modèle réductionniste du développement des lymphocytes T dans le thymus existe : Il s'agit de la culture in vitro de thymus fœtaux. Nous remplacerons le plus possible la manipulation du développement des lymphocytes T dans le thymus par ces cultures in vitro. Aussi, nous remplacerons autant que possible la manipulation de la différenciation des lymphocytes T in vivo par des expériences in vitro.
Réduction
La majorité de nos expériences est effectuée in vitro. Ceci nous permet de calibrer et bien cibler nos expériences in vivo et ainsi de réduire le plus possible le nombre de souris utilisées.
Raffinement
En cas d'intervention douloureuse (injections i.p., i.v., prélèvements de sang), les souris sont anesthésiées. Dans nos modèles de pathologie, les points limites indiqués dans chaque procédure réduisent la douleur et la souffrance au maximum. Du sopalin et du coton seront apportés aux animaux manipulés. De la nourriture et de l’eau sous forme gélifiée seront placées dans la cage pour permettre aux souris qui se déplacent plus difficilement de se nourrir.
Choix des espèces
• la différenciation des lymphocytes T dans le thymus et en périphérie est bien caractérisée chez la souris et aucun modèle in vitro ne permet actuellement de reproduire la complexité des conditions environnementales qui contrôlent ces processus. • une très large gamme de réactifs (ex. anticorps, cytokines, tétramères CMH-peptide) est disponible chez la souris. • les modèles murins que nous utilisons sont très proches des pathologies humaines. • l’étude des mécanismes qui régulent la biologie des lymphocytes T est rendue possible grâce à la disponibilité d’un grand nombre de souris génétiquement invalidées pour les acteurs moléculaires que nous voulons étudier. • facilité d’élevage. - Dès la naissance pour les lignées qui développent spontanément et rapidement une pathologie sévère (ex. IL-2 KO ou Foxp3 KO, souris NOD mutantes) - A partir de 4 semaines pour toutes les autres expériences - A partir de 4 semaines pour toutes les autres expériences, exception faite de l’analyse de la prolifération des Treg in vivo (procédure 7) qui sera effectuée à partir de trois semaines d’âge.
Etude morpho-fonctionnelle de la mise en place développementale du circuit hippocampique en condition saine et pathologique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
584 souris, dont des nouveau-nés, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Dès la naissance, elles reçoivent des injections dans le cerveau, certaines subissant à partir du cinquième jour une chirurgie avec pose d'une fenêtre optique et injection d'un virus de la rage modifié, avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur indique que les petits opérés, incapables de se nourrir et rejetés par leur mère, sont euthanasiés et leur cerveau prélevé. Il affirme que ce réseau ne peut pas s'étudier hors de l'"organisme entier" et qu'aucune méthode de substitution n'existe, concluant à la nécessité de la souris.
Objectifs
L'objectif est double. Tout d'abord il est de comprendre comment le réseau hippocampique se développe en condition saine. La seconde partie du projet est de comprendre, a partir de la base que nous aurions déjà établie, comment ce circuit dysfonctionne pour plus tard donner des pathologies tel que l’Autisme. Plus particulièrement nous étudierons, au cours du développement postnatal, les modifications de l’innervation périsomatique à la suite de la perturbation de l’activité des interneurones. Nous testerons ensuite l’état de cette inhibition a diffèrent stade du développement ainsi qu’en condition pathologique (modèles d’autisme). Par ailleurs, l’activité des neurones de l’hippocampe est significativement associée aux mouvements pendant la première semaine de vie post-natale. Nous faisons l’hypothèse qu’en inhibant les voies extra-hippocampiques, nous réduirons la corrélation entre les mouvements spontanés et l'activité synchrone de CA1 et perturberont la maturation de la dynamique hippocampique. Afin de mieux connaitre le développement du connectome des neurones GABAergiques ou glutamatergiques de CA1, nous réaliserons des traçages neuronaux rétrogrades transynaptiques grâce à l'utilisation du virus défectif de la rage.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche est important car en plus de décrypter les mécanisme anatomique et fonctionnel par lequel les neurones PV contribuent à la dynamique de CA1, il nous a permis de comprendre les règles qui régissent le développement de l'hippocampe. Cette partie fondamentales du projet est indispensable pour comprendre ce qui dysfonctionne dans des pathologie neurodéveloppementale tel que les TSA. Par nos experience de manipulations du circuit, nous esperons potentiellement contrebalancer les dysfonctionnement observé dans les modèles de TSA.
Procédures
Procédures chirurgicales tels que injections intraventriculaire, injection intra hippocampiques, pose d'une fenêtre optique pour l'imagerie à deux photons des neurones de l'hippocampes (492 animaux). Perfusion intracardiaque : Les animaux seront perfusé après une analgésie (burprenorphine 6,6ml/kg d'une solution 0.015mg/ml; 0.1mg/kg, IP) suivie 30 min plus tard d'une anesthésie profonde (Domitor à 0.9mg/kg et Zoletil 60mg/kg) (92 animaux, environs 33 mins/animale en comptant le temps d’action de l’analgésie et de l’anesthésie).
Impact sur les animaux
Comme décrit dans la procédure 1, les animaux subiront des injections stéréotaxiques a P0 puis, pour certains d’entre eux, une chirurgie à partir de P5. Dans le cas des injections stéréotaxique, l’animale est en dehors de la portée et de sa mère pendant 15 minutes. En ce qui concerne les chirurgies faites à partir de P5 les nuisances sont les suivantes : Stress préopératoire, douleurs per et postopératoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Procédure 1, 2, 4 : Ayant subie une chirurgie lourde, les animaux auront du mal à se nourrir, se déplacer, et à être accepter par leur mère. Ils ne seront donc pas remis dans leur portée, et par conséquent, euthanasié et leur cerveau prélevé pour éventuellement faire des vérifications histologiques.
Remplacement
L’étude des réseaux corticaux, de par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme. C’est dans ce contexte que se situent nos travaux dont l’objectif est d'étudier l'organisation morpho-fonctionnelle de la mise en place des activités corticales de l'échelle cellulaire à l’échelle du réseau. REMPLACEMENT: il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode de substitution in vitro ou en culture cellulaire pour étudier la mise en place au cours du développement des activités neuronales du réseau hippocampique où informations externes et internes sont impliquées.
Réduction
2) REDUIRE: Les expériences seront réalisées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux. La méthode utilisée d’imagerie calcium in vivo permet l'enregistrement d'un très grand nombre de neurones (plusieurs centaines) par animal, et donc de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Une même portée sera utilisée par plusieurs expérimentateurs. Les nouveau-nés non utilisés pour les études développementales seront utilisés plus tard dans le cadre d'études menées chez l'adulte.
Raffinement
RAFFINER: Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés au cours des chirurgies pour réduire douleur et stress (anesthésie générale et locale, tapis chauffant, suivi strict postchirurgie des nouveau-nés en particulier après leur réintroduction au sein de la portée). Les mères et leur nouveau-nés opérés ou non seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids
Choix des espèces
Les raisons de l'utilisation de modèle murin sont multiples (Martinez-Cerdeno et Noctor, Août 2018, J Comp Neurol). Concernant nos expériences, les souris présentent une organisation morpho-fonctionnelle suffisamment complexe et évoluée pour en tirer des conclusions générales sur la mise en place développementale de la dynamique des réseaux corticaux. L'existence de nombreuses et différentes lignées transgéniques permettent de cibler telle ou telle sous-population de neurones. De plus, le modèle murin est couramment utilisé en neuroscience rendant nos résultats intéressants pour une large communauté scientifique et permettant de mieux les confronter aux résultats déjà publiés. Les animaux seront injectés entre P0-P3 dans le ventricule latéral, le cortex, l'hippocampe, le thalamus ou le septum, avec des virus (AAV) permettant l'expression de sondes calciques (GCamP, GECO....), d'outils optogénétiques (channelrhodopsine, halorhodopsine....), d’outils chémogénétiques (DREADD receptors...), de marqueurs fluorescents (GFP, Td-Tomato..), de traceurs rétrogrades transynaptiques. De 3 jours à deux semaines après l’injection, les animaux seront soit : 1) opérés afin de procéder aux expériences in vivo d’imagerie calcique (pose de fenêtre optique) ou d’enregistrements électrophysiologiques (insertion intracérébrale d'électrodes; 2) injectés en sous-cutané (10µl/g d'animal), en chronique ou en aigu, avec un solution de CNO diluée à 1mg/1ml avant d'être opérés pour poser une fenêtre optique et/ou électrode pour l'enregistrement des activités neuronales in vivo ; 3) injection à P5 ou P9 du virus défectif de la rage (SADdeltaG); 4) profondément anesthésiés puis perfusés par voie intracardiaque avec une solution fixative pour l’analyse morphologique.