Procédures sévères

357 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès la naissance, elles subissent une ablation de phalange pour l'identification génétique, une injection d'un virus dans le cerveau, puis la pose d'une fenêtre optique sur le crâne avant plusieurs jours d'imagerie de l'activité neuronale. Les animaux sont ensuite tués par perfusion d'un fixateur dans le cœur sous anesthésie, et les nouveau-nés non retenus pour leur génotype sont tués au dioxyde de carbone. Le porteur qualifie cette recherche fondamentale d'"indispensable" et renvoie ses applications aux troubles du spectre autistique, présentées comme lointaines.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est de comprendre comment les motifs d'activité neuronale évoluent au cours du développement postnatal dans l'hippocampe. Pour cela, nous analyserons, grâce à l'imagerie in vivo, l'émergence des séquences et des assemblées neuronales dans la région CA1 de l'hippocampe à partir de la troisième semaine post-natale.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche est essentiel car il permet de décrypter les mécanismes fondamentaux anatomique et fonctionnel par lequel les neurones glutamatergique excitateurs et les neurones GABAergiques inhibiteurs contribuent à la mise en place de la dynamique des réseaux corticaux. Cette recherche fondamentale est indispensable pour comprendre, par exemple, ce qui dysfonctionnerait dans des pathologies neurodéveloppementales tels que les Troubles du Spectre Autistique (TSA).

Procédures

Nos expériences s'effectuant sur des nouveaux-nés issus majoritairement de lignée murine transgénique hétérozygote, il est nécessaire de pouvoir identifier les individus ET de les caractériser d’un point de vue génétique. Pour cela, nous utiliserons l’ablation de phalange comme méthode d’identification et de caractérisation génétique. Nous suivrons les recommendations émises par le Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale du 03/02/2021. Cette ablation est très rapide (moins de 10s) et se fera à P0, juste avant l'injection de virus. Les expériences d'imagerie calcique seront réalisées sur des animaux âgés entre P13-P40. La raison est de décrire les dynamiques neuronales à partir de la troisième semaine postnatale au stade adulte. Les animaux seront injectés entre P0-P1 avec des Adéno-Associé Virus (AAV) permettant l'expression de sondes calciques (GCaMP6s, jRGECO1a....) ou des marqueurs fluorescents (GFP, Td-Tomato..) dans le ventricule latéral (temps de l'intervention moins de 15 min). Une fenêtre optique sera placée sur le crâne de la souris à P13 ou P18 (temps de l'intervention moins de 90 min). Deux jours plus tard, les expériences d'imagerie in vivo débuteront et se poursuivront sur plusieurs jours. Un total de 357 animaux est prévu.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des injections stereotaxiques intraventriculaires à P0 suivies 13 ou 18 jours plus tard d'une chirurgie pour placer une fenêtre optique sur le crâne permettant d'imager l'activité neuronale in vivo. Dans les deux cas, le stress et la douleur seront contrôlés deux fois par jour ; la douleur sera minimisée, si besoin par l'administration d'analgésiques (burprenorphine, 0.1mg/kg/SC). Si les points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés.

Devenir

A la fin des les expériences d'enregistrement en imagerie calcique, la vérification histologique de la position des neurones enregistrés et de la fenêtre d’imagerie se feront après perfusion intracardiaque d'une solution fixative (4% paraformaldéhyde). Après une analgésie (burprenorphine 6,6ml/kg d'une solution 0.015mg/ml; 0.1mg/kg, SC) suivie 30 min plus tard d'une anesthésie profonde (Domitor à 0.9mg/kg et Zoletil 60mg/kg), la cage thoracique de l'animal est ouverte et une canule est insérée dans le coeur, la solution fixative est alors administrée (1 ml/g). Une fois la perfusion terminée, le cerveau sera prélevé et préparé en fonction des expériences neuroanatomiques suivantes. Les animaux de la portée, âgé de P21 et n’étant pas sélectionnés pour leur profil génétique seront euthanasiés par les zootechniciens par excès de dioxyde de carbone selon le protocole mis en place dans l’animalerie de l’institut.

Remplacement

L’étude des réseaux corticaux, de par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme. C’est dans ce contexte que se situent nos travaux dont l’objectif est d'étudier l'organisation morpho-fonctionnelle de la mise en place des activités corticales de l'échelle cellulaire à l’échelle du réseau.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec un souci permanent de réduction du nombre d’animaux. La méthode utilisée d’imagerie calcique in vivo permet l'enregistrement d'un très grand nombre de neurones (plusieurs centaines) par animal, . De plus, une même portée sera utilisée par plusieurs expérimentateurs, les nouveau-nés transgéniques non utilisés pour les études développementales seront utilisés dans le cadre d'études menées chez l'adulte et mâles et femelles seront utilisés. L'ensemble de ces points permettent donc de diminuer le nombre d'animaux générés

Raffinement

Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés au cours des chirurgies pour réduire douleur et stress (anesthésie générale et locale, tapis chauffant, suivi strict postchirurgie des nouveau-nés en particulier après leur réintroduction au sein de la portée). Les mères et leur nouveau-nés opérés ou non seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids. Les animaux plus agés seront hébergés et contrôlés dans les mêmes conditions.

Choix des espèces

Les raisons de l'utilisation de modèle murin sont multiples. Concernant nos expériences, les souris présentent une organisation morpho-fonctionnelle suffisamment complexe et évoluée pour en tirer des conclusions générales sur la mise en place développementale de la dynamique des réseaux corticaux. L'existence de nombreuses et différentes lignées transgéniques permettent de cibler telle ou telle sous-population de neurones comme par exemple les neurones générés tôt. De plus, le modèle murin est couramment utilisé en neuroscience rendant nos résultats intéressants pour une large communauté scientifique et permettant de mieux les confronter aux résultats déjà publiés. Les expériences seront réalisées sur des animaux âgés entre P13-P40. La raison est de décrire les dynamiques neuronales à partir de la troisième semaine postnatale au stade adulte. Les animaux seront injectés entre P0-P1 avec des Adéno-Associé Virus (AAV) permettant l'expression de sondes calciques (GCaMP6s, jRGECO1a....) ou des marqueurs fluorescents (GFP, Td-Tomato..) dans le ventricule latéral. Une fenêtre optique sera placée sur le crâne de la souris à P13 ou P18. Deux jours plus tard, les expériences d'imagerie in vivo débuteront et se poursuivront sur plusieurs jours.

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une péritonite leur est provoquée par injection intrapéritonéale de Staphylococcus aureus, qui peut entraîner poil hérissé, dos voûté, apathie, détresse respiratoire et la mort, pour tester deux molécules antibactériennes. Le porteur indique maintenir les animaux vigiles et limiter la souffrance par la buprénorphine, et classe la procédure en sévère du fait de la mortalité attendue. Il affirme que la corrélation in vitro-in vivo n'est pas satisfaisante et que le recours à l'animal est "indispensable".

Objectifs

Le traitement des infections à Staphylococcus aureus reste problématique et il n’existe pas de consensus à l’heure actuelle sur le choix de l’antibiothérapie la plus efficace. L’émergence de la résistance à la méticilline chez les souches de S. aureus et la production de toxines par certains d’entre eux, augmentant la virulence de la bactérie, complique la prise en charge des patients. Face à cette augmentation continue des résistances bactériennes, il apparait donc indispensable d’évaluer de nouvelles molécules thérapeutiques. Le but de notre travail est d’évaluer l’activité de deux nouvelles molécules à activité anti bactérienne dans le modèle murin expérimental de péritonite et de comparer leur activité à celle d’un antibiotique de référence.

Bénéfices attendus

Développement de nouvelles molécules qui pourraient être actives sur les souches bactériennes multi résistantes, l'antibiorésistance étant devenue un problème majeur, avec l'émergence et la diffusion croissante de souches bactériennes de plus en plus résistantes aux antibiotiques.

Procédures

Animaux de la procédure 1 Tous les animaux (n=36) recevront une injection IP de 0.6ml de la souche bactérienne. Ils recevront également une injection SC de 30µl de Buprénorphine (0.1 mg/kg) 15 min avant infection, puis 5h et 10h après. Ces injections de buprénorphine à 0.1mg/kg seront renouvelées 3 fois le lendemain. Animaux de la procédure 2 Tous les animaux (n=300) recevront une injection IP de 0.6ml de la souche bactérienne. Le premier jour du protocole, ils recevront 3 injections SC de 200µl de la molécule de traitement. Ils recevront également une injection SC de 30µl de Buprénorphine (0.1 mg/kg) 15 min avant infection, puis 5h et 10h après. Ces injections de buprénorphine à 0.1mg/kg seront renouvelées 3 fois le lendemain. Une fois cette phase sévère passée, en fonction de l’état général des souris, si nécessaire, d’autres injections SC de 30µl de buprénorphine (0.05 – 1 mg/kg) pourraient être réalisées. Tous les animaux (procédures 1 et 2) resteront vigiles tout au long de l’étude.

Impact sur les animaux

Dû à l’infection bactérienne, les animaux pourraient présenter, au cours des 48 premières heures du protocole, un ou plusieurs effets indésirables parmi les suivants : Poil hérissé, dos vouté, perte de poids, larmes, yeux collés, isolement, comportement apathique, respiration ralentie ou difficile. Malgré la mise en place des critères d’arrêt (points limites) dont la mise en œuvre sera aussi précoce que possible, cette évaluation sera susceptible d’entrainer la mort et/ ou de causer des états pathologiques graves, c’est pourquoi nous la réaliserons sur le plus petit nombre possible d’animaux par groupe (n=6) et nous classons la procédure en sévère. L’intensité de la souffrance sera réduite autant que possible, par l’injection de buprénorphine, la mise en place de biberons d’eau additionnée de buprénorphine ainsi que par une surveillance accrue.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les techniques in vitro ne permettent pas d’obtenir des données fiables sur l’activité in vivo d’un antibiotique. La corrélation in vitro - in vivo n’étant pas satisfaisante, le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable.

Réduction

Les premiers temps de l’expérimentation consistent à la validation du modèle avec les souches à étudier, ce qui permet d’utiliser le moins d’animaux possible lors de l’évaluation thérapeutique proprement dite. Pour les évaluations thérapeutiques, le nombre de souris par groupe a été réduit au minimum afin de garder une analyse statistique fiable. Le test du log-rank (Mantel-Cox), test statistique non paramétrique, sera utilisé afin de comparer les distributions des différentes séries de survie.

Raffinement

Avant l’expérimentation : - Conditions d’hébergement : Acclimatation des animaux durant une semaine avant l’expérimentation. Assurance d’une non surpopulation dans la salle d’hébergement. Les animaux sont conservés dans des cages répondant aux dernières normes. La litière est changée 1 fois par semaine avec accès libre à l’eau et à la nourriture (alimentation spécifique pour rongeur). - Détermination des points limites : cf annexe 1, figure 3 Pendant l’expérimentation : - Soins pré et post intervention : Les souris recevront 3 injections de buprénorphine (0,1mg/kg) pendant 48h (période de sévérité du protocole). De la buprénorphine (0.009mg/kg) sera ajoutée à l’eau de boisson 10h après infection et le biberon restera en place pendant 48h. - Application des points limites : cf annexe 1, figure 4 - Euthanasie : dislocation cervicale après pré-anesthésie

Choix des espèces

Le modèle murin de péritonite est un modèle bien caractérisé et parfaitement adapté pour tous les types d’analyses prévus pour cette étude. Cinq semaines de vie permettant une manipulation simple sur un animal robuste.

116 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une cachexie leur est induite par inoculation de cellules tumorales sous la peau, provoquant une fonte musculaire et une perte de poids progressives, puis elles reçoivent des injections quotidiennes pendant quinze jours avant d'être tuées pour prélèvement des muscles et des organes. Le porteur indique que l'étude est commanditée par une société cliente pour évaluer l'efficacité de ses composés, et que le modèle est limité à vingt et un jours "pour des raisons éthiques". Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier l'efficacité réelle d'un composé sur la cachexie.

Objectifs

Le projet faisant l’objet de la présente demande d’autorisation vise à étudier les effets d'une série de composés chez un modèle de cachexie induite par des cellules LLC (Lewis Lung Carcinoma). Cette étude est commanditée par une société cliente, dans le cadre de la recherche de l’efficacité de leurs composés dans ce domaine d’application.

Bénéfices attendus

Si la présente étude pemet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur la cachexie, ces deniers seront employés ultèrieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autoristion de mise sur le marché. Ils constituraient ainsi les premiers taitements autorisés pour traiter la cachexie.

Procédures

Ce projet comport 3 types d'interventions différents: Inoculation de cellules LLC : Durée de 5 minute environ. Mesures de composition corporelle : Durée de 1-2 minutes (répétée 3 fois au cours du projet). Administrations sous-cutanées : Durée 10 secondes environ; adiministrations quotidiennes pendant 15 jours.

Impact sur les animaux

Le modèle employé dans le présent projet est un modèle de cachexie résultant du développement d'une tumeur sous-cutanée induite par l'inocculation de cellules Lewis Lung Carcinoma (LLC). Le développement tumoral induit un état de cachexie progressif s'accompagnant d'une réduction de masse maigre et d'une perte de poids corporel. Pour des raisons éthiques, le modèle est limité à 21 jours post inoculation des cellules LLC après lesquels les animaux seront euthanasiés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des anayses biochimiques et histiologiques sur les muscles gastrocnémien, soleus, et plantaris, sur le tissu adipeux sous-cutané, le foie et certaines portions du tube digestif qui devrnt ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’efficacité réelle d’un composé sur l’état de cachexie. Nous avons choisi un modèle utilisant l'espèce souris qui est parfaitement caractérisé dans la littérature scientifique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe contrôle du modèle (heated-treated LLC/ Vehicule) a été réduit à 8 animaux (contre 12 pour les groupes cachexique) du fait d'une moindre variabilité des paramètres msurés, ces souris ne dévelopant pas de tumeur.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Il s'agit d'un modèle de cachexie chez la souris induit par une inoculation de cellules LLC. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout de petites maisons dôme (mouse house) et de materiel de nidification. Afin de réduire toute douleur au cours des procédures expérimentales, l'inoculation des cellules LLC sera réalisée sous anesthésie gazeuse (les animaux seront placés sur tapis chauffant) et les administrations orales seront réalisées à l'aide de canules de gavage souples pourvues d'un emboût en silicone. Enfin, compte-tenu du développement d’une tumeur et d’un état de cachexie progressif chez les animaux, un suivi journalier particulièrement étroit des animaux à l'aide d'une grille de score de souffrance permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

Le modèle souris C57BL/6 est très bien documenté dans la littérature en tant que modèle de cachexie induit par une inoculation de cellules LLC. Le choix du modèle souris C57BL/6 a été validé avec le client et le chef de projet. Les animaux utilisés seront de jeunes souris adultes (5 semaines à réception ; 8 semaines au début du traitement). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine qui sera ciblée par les composés à tester, à savoir une population adulte présentant un état cachectique lié au cancer.

3 936 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Contenues dans un appareil, elles reçoivent en intraveineuse du pentylènetétrazole qui déclenche des convulsions, puis sont tuées par dislocation cervicale dès l'apparition des trois comportements convulsifs observés. Le porteur indique que ce modèle sert au criblage de candidats médicaments pour l'industrie pharmaceutique et le décrit comme "largement utilisé". Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative pour l'épilepsie" et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

L’épilepsie est une maladie caractérisée par l’apparition de convulsions récurrentes et qui affecte plus de 6 millions de personnes à travers le monde. Les traitements actuels ne peuvent que partiellement contrôler la maladie et induisent de nombreux effets indésirables (Fatigue, somnolence, perte de poids, dépression, perte de la coordination motrice et problème délocution par exemple). La recherche pour des médicaments plus efficaces et ayant moins d’effets indésirables reste un challenge cruciale pour l’industrie pharmaceutique. Les convulsions induites par le PTZ chez la souris est un modèle in-vivo bien décrit dans la littérature et largement utilisé pour le screening des nouveaux candidats médicaments. L’objectif de ce projet est la mise en place du modèle (Convulsion induite par l’administration de PTZ) puis d’utiliser ce modèle pour tester le potentiel antiépileptique de nouveaux candidats médicaments.

Bénéfices attendus

L’épilepsie est une maladie caractérisée par l’apparition de convulsions récurrentes et qui affecte plus de 6 millions de personnes à travers le monde. Les traitements actuels ne peuvent que partiellement contrôler la maladie et induisent de nombreux effets indésirables (Fatigue, somnolence, perte de poids, dépression, perte de la coordination motrice et problème délocution par exemple). La recherche pour des médicaments plus efficaces et ayant moins d’effets indésirables reste un challenge cruciale pour l’industrie pharmaceutique. Les convulsions induites par le PTZ chez la souris est un modèle in-vivo bien décrit dans la littérature et largement utilisé pour le screening des nouveaux candidats médicaments.

Procédures

L’animal, juste avant l’administration du PTZ, est placé dans un appareil à contention pour effectuer l’injection. Une aiguille de 27G relié à une seringue de 1 ml est utilisée pour l’injection. L’aiguille est implantée dans une des deux veines latérales de la queue de l’animal. Le placement de l’aiguille dans la veine est vérifié par l’apparition de sang dans le cathéter reliant l’aiguille à la seringue. Afin d’éviter tout retrait de l’aiguille, elle est scotchée autour de la veine avec du sparadrap. L’administration de PTZ se fait de façon continue à une vitesse de 0.25 ml/min. L’administration du produit de référence ou du nouveau candidat médicament est effectuée entre 15 et 60 min avant l’administration du PTZ. Ce temps est décidé en accord avec le donneur d’ordre et/ou la littérature selon la voie d’administration et la pharmacocinétique du produit testé. Les administrations (molécule de référence, candidats médicaments...) sont réalisées une seule fois avant le test. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant (produit destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou biodisponibilité nécessitant un autre mode d’administration) les voies intrapéritonéales, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies.

Impact sur les animaux

Les administrations (molécule de référence, candidats médicaments...) sont réalisées une seule fois avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant (produit destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou biodisponibilité nécessitant un autre mode d’administration) les voies intrapéritonéales, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies L’administration de nouveaux candidats médicaments peut entraîner certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation qui peuvent apparaître après administration. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, les animaux sont suivis après injection. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Lors de l’administration du PTZ et une fois les 3 comportements observés, l’animal est tout de suite mis à mort (dislocation cervicale : rupture immédiate du tronc cérébral).

Devenir

L’administration de PTZ (100mg/kg) en intraveineuse (i.v) doit induire une convulsion. Les paramètres suivants sont enregistrés : la première secousse musculaire, la latence d’apparition de convulsions cloniques, la latence d’apparition de l’extension des pattes arrière et la latence de mort. Une fois les 3 comportements observés, l’animal est tout de suite mis à mort.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative pour l’épilepsie, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.

Réduction

Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables ; ceci afin d'éviter de multiplier les expériences. Il correspond à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées sont : la souris Swiss et la C57Bl/6 Entre 4 et 12 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par instillation de bléomycine, puis elles sont exposées une semaine à une atmosphère reproduisant la pollution de l'air de Paris, avant lavage broncho-alvéolaire et prélèvement des poumons. Le porteur indique que la fibrose peut provoquer une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité d'environ 20 %, ce qui justifie le classement en sévère. Les retombées annoncées, des mesures préventives pour les patients atteints de fibrose, restent au conditionnel, et le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet cette étude intégrée.

Objectifs

Nous émettons l’hypothèse que l’exposition à la pollution atmosphérique urbaine pourrait favoriser l’aggravation de la fibrose pulmonaire soit directement en accélérant le(les) processus physiopathologique(s) fibrosant(s), soit indirectement en potentialisant l’effet délétère d’un autre facteur déclenchant. Nous émettons également l’hypothèse que les variations saisonnières de la pollution atmosphérique urbaine ( selon le degré d’ensoleillement et/ou de l’activité industrielle) pourraient moduler ses effets sur le poumon. L’objectif général de notre projet est donc d’étudier par une approche intégrée les effets potentiellement délétères d’atmosphères polluées complexes reproduisant de façon réaliste la pollution de l’air de Paris lors de la saison hivernale et lors de la saison estivale sur la fibrose pulmonaire induite expérimentalement chez la souris par la bléomycine. Nos objectifs spécifiques sont les suivants : - Objectif 1 : évaluer si l’exposition à une atmosphère polluée complexe est suffisante pour initier par elle-même une exacerbation de la fibrose pulmonaire expérimentale, et déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. - Objectif 2 : évaluer si l’exposition préalable à une atmosphère polluée complexe potentialise l’exacerbation de la fibrose pulmonaire induite par un agent oxydant, et déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. - Objectif 3 : comparer les effets de l’atmosphère polluée complexe « Paris été » à ceux de l’atmosphère « Paris hiver » dans ces 2 modèles expérimentaux.

Bénéfices attendus

Si notre étude démontrait expérimentalement un lien de cause à effet entre atmosphère polluée complexe et survenue d’exacerbation aigue dans la fibrose pulmonaire, cela aurait des conséquences importantes tant d’un point de vue scientifique qu’en matière de santé publique. Sur le plan scientifique, ces résultats permettraient de confirmer les résultats observés dans les études épidémiologiques. Par ailleurs, si l’impact de l’exposition à la pollution atmosphérique varie selon la saison (Paris été ou Paris hiver) cela pourrait nous permettre de mieux comprendre la différence de prévalence des exacerbations aigues au cours d’une année. En matière de santé publique, des mesures préventives vis-à-vis des polluants aériens évitables chez les patients ayant une FPI pourraient être instaurés au moment de leur prise en charge ou au cours du suivi, afin de réduire le risque d’évolution vers une exacerbation et améliorer leur survie. Avec notamment la mise en place de conseils autour de la protection lors des pics de pollution, diminution des sources de pollution dans le logement et un contact précoce avec l’équipe médicale. Ces mesures préventives pourraient diminuer la morbidité et la mortalité de la FPI ainsi que les coûts en santé

Procédures

Pour répondre à nos objectifs nous utiliserons un modèle murin de fibrose pulmonaire induite à la blémoycine. Suite à cela les souris développant une fibrose pulmonaire seront exposées pendant une semaine à une atmosphère polluée complexe ou à l’air à l'aide du montage PolluRisk. Sur ces animaux la mesure des variables ventilatoires sera réalisée par plethysmographie sur animaux non anesthésié et non contraint. Ensuite, aprés anesthésie, la saturation sera mesurée. Enfin deux groupes seront réalisés. Dans le premier un lavage broncho-alvéolaire sera réalisé avant euthanasie des animaux. Dans le second, la compliance sera évaluée puis lles poumons seront prélevés pour analyses.

Impact sur les animaux

Le développement d’une fibrose pulmonaire est indolore du fait de l’absence d’innervation sensitive à la douleur dans le parenchyme pulmonaire. En revanche elle peut entraîner une insuffisance respiratoire sévère chez les souris et une mortalité d’environ 20%, justifiant sont classement en tant que procédure « sévère ».

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour prélèvement d'organe.

Remplacement

il n'existe pas à ce jour de méthode alternative à l'expérimentation in vivo pour étudier de façon intégrée l'impact de la pollution atmosphérique sur l'aggravation de la fibrose pulmonaire et l'utilisation de la souris permettra d'étudier les altérations pulmonaires causée par l'exposition à ces particules atmosphériques. D'autre part, l'étude des mécanismes sous-jacent à ces aggravations peut-être plus facilement entreprise dans cette espéce du fait de l'existance d'outils moléculaires.

Réduction

Nous veillerons à réduire le nombre d'animaux utilisés. Nous disposons de données, publiées ou non, nous permettant de réaliser des calculs statistiques permettant de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif et pour déterminer des points d'arrêt d'expérimentation.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement et les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi. Le personnel travaillant avec les animaux possède les diplômes d'expérimentation animale requis. Les conditions de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute souffrance que pourrait ressentir les animaux. Des points limites précis et des critéres d'arrét sont prévus.

Choix des espèces

Notre projet nécessite d'induire une fibrose pulmonaire , d'exposer les aniamux à des atmosphéres complexes réalistes et de prélever des tissus, Pour cela notre choix c'est porté sur la souris car: - c'est un modèle qui s'héberge et se reproduit facilement, avec une gestation courte permettant l'obtention rapide des individus nécesaires à nos séries expérimentales. - Le modéle murin de fibrose pulmonaire induite par instillation intra-trachéale de bléomycine est validé et courament utilisé dans la littérature internationale - Le protocole d'exposition à des atmosphéres complexes réalistes permet d'évaluer l'impact de la qualité de l'air sur la santé Les animaux utilisés seront des souris mâles adultes agés de 8 semaines. Pour cette étude, nous avons besoins que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. De plus la fibrose pulmonaire est une pathologie du patient âgé. En outre, les souris plus jeunes sont moins sensibles à la bléomycine que les souris agées. Cependant, il est décrit dans la littérature que les souris C57Bl6/J agées développent une fibrose pulmonaire sévére, risquant d'accroite le risque de surmortalité. Le compromis que nous avons choisit est des souris agèes de 8 semaines au moment du début de l'expérimentation. Les animaux seront identifié par un système de marquage à l'oreille

47 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une hémorragie cérébrale leur est provoquée par injection de collagénase dans le striatum lors d'une chirurgie de la tête, un cathéter jugulaire et une pompe sous-cutanée diffusent le traitement, puis elles passent des IRM avant une perfusion transcardiaque terminale pour prélever cerveau et reins. Le projet, financé par un industriel, teste une molécule censée limiter la lésion et l'inflammation d'un saignement cérébral. Le porteur affirme que ces procédures ne peuvent être remplacées, les méthodes sans animaux n'apportant pas le même niveau d'information.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de tester une nouvelle molécule dont le mécanisme d’action est susceptible d’agir sur différentes phases de l’hémorragie : la phase aigüe (24h) pour limiter la lésion et la phase inflammatoire qui s’installe les jours suivants. De plus, l’étude permettra d’apporter des éléments concernant la sécurité du médicament en s’assurant qu’il n’augmente pas le saignement.

Bénéfices attendus

Ce projet fait l'objet d'un financement industriel afin d'étudier une nouvelle molécule susceptible de limiter la lésion ainsi que l'inflammation causé par un saignement cérébral.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie d'environ 20 minutes au niveau de la tête afin de pouvoir injecter de la collagénase, provoquant ainsi une hémorragie dans le striatum. De plus, la pose d'un cathéter jugulaire et la mise en place d'une pompe en sous cutanée sera réalisée permettant ainsi l'infusion du traitement. La cathétérisation ainsi que la mise en place de la pompe durera environ 15 minutes . A J+1 et J+3, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 14 minutes à J+1 puis 60 minutes à J+3. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au coeur. Les animaux subiront une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau et des reins avant prélèvement. La durée de cet intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes minutes pour les différents prélèvements. Les procédures douloureuse (chirurgie, persfusion transcardiaque) seront réalisées sous anesthésie générale associée à une couverture analgésique.

Impact sur les animaux

Nous pouvons nous attendre à déceler sur certains animaux des signes de complications et de détresse postchirurgicales tels qu'une absence de réaction aux stimuli, une inactivité de l'animal dans sa cage ou encore une perte de poids suite à un arrêt de la prise alimentaire. Les situations précédemment citées définissent nos points limite à appliquer pour ce projet. Nous surveillerons à ce qu'ils ne soient pas dépassés.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau et des reins post fixation pour analyse.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques.

Raffinement

Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’hémorragie intra crânienne. Les animaux utilisés seront âgés de 8 semaines et auront un poids de 25 g environ. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses de deux maladies musculaires génétiques, la myopathie myotubulaire et la maladie de Charcot-Marie-Tooth, elles subissent une série de tests de force et de locomotion nommés, hanging test, grip, marche sur tapis roulant, barre crantée et électromyographie, avant une mesure des propriétés musculaires sous anesthésie suivie de la mise à mort. Le porteur décrit une faiblesse musculaire et des difficultés de déplacement dès six semaines mais affirme qu'aucune douleur n'est observée, alors que les procédures sont classées en gravité sévère. L'objectif est une preuve de concept, montrer que moduler la protéine Dynamine 2 par croisement génétique améliore le phénotype de la myopathie.

Objectifs

Nous souhaitons valider chez la souris, une preuve de concept pour les myopathies myotubulaires lié à MTM1 en modulant le niveau de la protéine Dynamine 2 par croisement génétique. En effet, Les animaux mutant Mtm1-KO montrent une sur expression de la Dynamine 2 que nous souhaitons faire diminuer par croisement avec une souris mutante (atteinte de CMT) présentant une diminution du niveau de cette même protéine.

Bénéfices attendus

Le projet vise à fournir une preuve de concept que la modulation de la protéine dynamine 2 peut améliorer le phénotype MTM1. Ceci pourrait conduitre au développement d'approches thérapeutique pour les patients atteints de myopathie myotubulaire.

Procédures

Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques à l'âge de 7 à 8 semaines. Hanging test-Mesurer la force du corps. Les souris sont suspendues sur le couvercle de la cage durant 60 secondes maximum. La force des souris sera mesurée 1 fois/semaine, 3 essais/jour/souris, avec 15 minutes de pause entre chaque essai. 2. Grip-Mesurer la force des pattes. Le test sera effectué 3 fois/souris, avec un temps de repos de 15 minutes entre les différents essais. Le Grip test sera effectué une fois par semaine, sur 2 ou 4 pattes. 3. Gait-mesurer la position des pattes pendant le déplacement. L'animal est déposé sur un tapis roulant se déplaçant à une vitesse comprise entre 8 m/s et 14 m/s pendant 1 minute maximum. Ce test sera exécuté une fois par semaine. 4. Barre cranté-Mesurer l’habilité à se déplacer sur une barre cranté de 110 cm de long. Le test sera effectué 1 fois/semaine, 3 essais/jour/souris, avec un temps de repos de 15 minutes entre les différents essais. 5. EMG (Electromyographie)-Mesurer l’activité électrique musculaire. Ce test sera réalisé une seule fois. 6. Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA). C'est une PE sans réveil.

Impact sur les animaux

Pour cette étude deux modèles murins seront utilisés, un modèle atteint de myopathie myotubulaire (MTM1) et un deuxième atteint de la maladie de CMT. La souris atteinte de CNM développe une faiblesse musculaire et peut montrer des difficultés de locomotion qui apparaissent vers 6 semaines. Ces animaux mutants ont également un poids corporel inférieur au animaux contrôles. Aucune douleur n'est observée chez ces animaux. La souris atteintes de la maladie de CMT présente une légère perte de poids par comparaison avec la souris contrôle. Aucune douleur n'est observée chez ces animaux.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante pour ce qui concerne le Hanging test, Grip, Gait, Barre cranté. En revanche, à la fin de la mesure de l'EMG, l’animal est réchauffé sur une plaque maintenue à 37°C jusqu’à son réveil. Aucun autre test comportemental ne sera effectué le jour de l’EMG. La dernièere expérimentation qui est "sans réveil" consiste à mesurer les propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA) sous anesthésie. A l'issue de cette procédure, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie. Cela concerne l'ensemble des animaux d'expérience (70).

Remplacement

Pour caractériser cette maladie (CMT) et évaluer l’efficacité de ce croisement génétique nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, nous permet d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part l’amélioration des symptômes apporté par la régulation de cette protéine par croisement génétique. D’une part, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation sur le bénéfice de la force musculaire seraient impossibles à évaluer. D’autre part une étude sur culture de cellules mutante ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et le bénéfice de la force musculaire ne peut être mesuré (REMPLACEMENT).

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Nos connaissances sur ce modèle animal mutant et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 15 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. Cependant une première étude pilote sera réalisée avec 10 animaux, afin de vérifier le phénotype et le niveau de la protéine Dynamine 2. En tenant compte des géniteurs, des animaux d’expérience, nous prévoyons 100 animaux pour cette étude (REDUCTION).

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placé dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée (RAFFINEMENT).

Choix des espèces

Afin d’évaluer et de comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène DNM2 et les effets de la modulation de cette protéine, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure du muscle est différente. De plus, la souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologie humaine. Lors d'une précédente étude nous avons constaté qu'à l’âge adulte c'est à dire à 7 et 8 semaines, le phénotype lié à la maladie était exprimé. Ainsi, nous souhaitons réaliser les test comportementaux à cet âge afin d'évaluer la maladie et le bénéfice de ce croisement sur la pathologie.