Procédures sévères

1 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rendues obèses par un régime riche en graisse, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales mammaires sous anesthésie puis des injections intrapéritonéales trois à quatre fois par semaine, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs glandes mammaires. Le porteur cherche à établir le rôle des macrophages dans le réveil de tumeurs dormantes et renvoie au conditionnel de nouvelles stratégies contre la récidive du cancer du sein. Il indique recourir déjà à des cultures organotypiques mais affirme qu'elles ne reproduisent pas la complexité de l'organe.

Objectifs

Les cancers du sein sont la première cause de décès liés au cancer dans le monde occidental chez la femme. Un challenge majeur dans le traitement des cancers du sein est leur récurrence, et cela même plusieurs années après rémission. Nous savons aujourd’hui que les cellules tumorales dormantes sont responsables de la récurrence du cancer mais les facteurs impliqués dans le réveil de ces cellules tumorales sont encore méconnus. L’obésité est un facteur de risque dans le développement et la récurrence du cancer du sein. Nos données in vitro démontrent que les macrophages induisent le réveil des cellules tumorales dormantes. Les macrophages sont connus pour s’accumuler dans le tissu adipeux, tissu présent dans la glande mammaire. Pour ces raisons, nous nous intéressons à l’implication des macrophages dans le réveil de cellules tumorales dormantes dans le tissu adipeux de la glande mammaire de souris obèses. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’impact des macrophages dans le réveil des cellules tumorales dormantes in vivo. Nous voulons confirmer nos résultats chez la souris en utilisant le modèle de tumeur primaire dormante chez la souris obèse.

Bénéfices attendus

Un challenge majeur dans le traitement des cancers du sein est leur récurrence, et cela même plusieurs années après rémission. Les facteurs impliqués dans le réveil des cellules tumorales restent donc à identifier. La réalisation de ce projet va donc permettre d’identifier ces facteurs de récurrence du cancer du sein. En effet, nous avons mis en évidence, in vitro, que les macrophages peuvent induire le réveil de cellules tumorales dormantes. Notre modèle in vivo, nous permettra alors de confirmer ou non l’implication des macrophages dans le réveil tumoral. L’identification des macrophages comme facteurs induisant le réveil des cellules tumorales dormantes dans le tissu adipeux de la glande mammaire pourra déboucher vers de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter dans la récurrence du cancer du sein.

Procédures

Procédure 1 : Pas d’injection. Pas d’anesthésie Procédure 2 - Injection dans la glande mammaire : 336 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. - Injection intrapéritonéale : ¨192¨ animaux, 4 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. Procédure 3 - Injection dans la glande mammaire : 192 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 4 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. Procédure 4 - Injection dans la glande mammaire : 336 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. - Injection intrapéritonéale : 192 animaux, 4 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1. Procédure 5 - Injection dans la glande mammaire : 96 animaux, 1 fois/animal, durée 7 minutes sous anesthésie générale - Injection intrapéritonéale : 96 animaux, 3 fois/semaine/animal (luciférine + traitement), pendant ¨X¨ semaine. Le nombre de semaine sera défini en fonction de la procédure 1.

Impact sur les animaux

L’implantation de cellules tumorales pourra générer des tumeurs au niveau de la glande mammaire. En revanche, les souris seront suivies 3 fois par semaine avec mesure de la bioluminescence, du poids et du volume tumoral. Nous pourrons donc surveiller le développement tumoral. Aussi, l’implantation des cellules tumorales sera effectuée sous anesthésie générale et une attention particulière sera portée au réveil des souris ainsi qu’à l’aspect du site d’injection des cellules. Une rotation des sites d’injection en IP des drogues et de la luciférine permettra d’éviter tout problème au niveau de ces sites. Le suivi des souris permettra également de déceler tout problème de locomotion ou de souffrance potentiellement généré par l’éventuelle tumeur.

Devenir

A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. Les glandes mammaires et des échantillons sanguins seront alors prélevés pour analyses.

Remplacement

De nombreuses publications ont décrit les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude du développement métastatique. Elles sont déjà utilisées en routine au laboratoire et sont envisagées aussi souvent que possible, comme attesté par les publications du laboratoire. Ainsi, nous avons déjà développé au laboratoire plusieurs modèles in vitro qui nous ont permis de vérifier le rôle des macrophages dans le réveil des cellules tumorales. Cependant, ces cultures ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe (matrice extracellulaire différente, et culture organotypique devenant un vrai challenge technique pour la culture de multiples types cellulaires), c’est pourquoi nous avons maintenant recours à des animaux.

Réduction

D’après la littérature, seules 45-50% des souris Balb/C sont sensibles au régime riche en graisse. Ainsi, nous prévoyons un nombre de souris plus conséquent afin d’obtenir un nombre suffisant de souris obèses. De plus, notre modèle in vitro développé au laboratoire a été réalisé sur des cellules tumorales dormantes issues de carcinome mammaire de souris Balb/c. Pour cette raison, nous devons utiliser des souris Balb/C dans notre modèle in vivo. Nos groupes expérimentaux sont composés de 24 animaux en accord avec la pénétrance du modèle d’obésité chez la souris Balb/C. De plus, seules des femelles seront utilisées étant donné le type de cancer étudié (cancer du sein).

Raffinement

Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées dans le respect de la réglementation européenne en cours afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Les animaux seront manipulés dans le plus grand calme et nous favoriserons une attitude des plus apaisantes pour leur manipulation. Les animaux sont hébergés en condition A1, en raison de 4 par cages, avec un rythme nycthéméral de 12h, l’eau et la nourriture sont données à volonté et pour le groupe à 60% de graisse, la nourriture sera remplacée trois fois par semaine. Le change des litières est hebdomadaire. Chaque cage est dotée d'un double enrichissement (standard à l'animalerie) : mouse house et carrés de coton. De plus, les cages d'expérimentation sont maintenues de manière séparée des élevages, permettant un suivi plus adapté. La période d’acclimatation avant manipulation sera de 5 jours au minimum. Le régime riche en graisse débutera donc après la période d’acclimatation. Le suivi des animaux sera évalué grâce à la grille de score. En cas de score supérieur à 9 (point limite atteint), les animaux seront alors immédiatement euthanasiés par dislocation cervicale. Les souris seront pesées 2 fois par semaine, le volume tumoral sera mesuré au moyen d’un pied à coulisse 3 fois par semaine et la bioluminescence sera également mesurée 1 fois par semaine. Aucun anti-inflammatoire ne pourra être donné aux souris puisque l’objectif de l’étude est de mieux caractériser le rôle de l’inflammation dans le réveil des cellules tumorales. Une attention toute particulière sera donc apportée à l’analyse de la douleur des souris (voir fiche de score). Aucun dérivé morphinique ne pourra être utilisé puisqu’il a été montré que leur administration à des souris diminuait la prise tumorale.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle des macrophages dans le réveil de cellules tumorales dormantes. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les procédures expérimentales seront réalisées sur des souris âgées d’au moins 8 semaines, âge à partir duquel la glande mammaire est mature/formée.

1320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un sepsis leur est induit par chirurgie de péritonite ou par injection intrapéritonéale de bouillie caecale, avec euthanasie et prélèvement d'organes entre six et quarante-huit heures après. Le porteur annonce une septicémie, une perte de poids et un retrait social, et suit des points limites fondés sur les expressions faciales et la posture. Il présente le recours à la souris comme "irremplaçable" en raison de la complexité du sepsis et de l'usage de modèles génétiquement modifiés.

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer l’impact d'une protéine d'intérêt dans la progression du sepsis

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de savoir si la protéine d'intérêt peut être considérée comme une cible thérapeutique capable de protéger l’intégrité du vaisseau dans le contexte thrombo-inflammatoire du sepsis afin d’améliorer le traitement de cette pathologie.

Procédures

Les animaux Cre/lox seront soumis pendant 10 jours (2 fois 5 jours) à 1 injection/jour en IP pour induire la délétion de la protéine d'intérêt. Une procédure chirurgicale sera réalisée pour induire un sepsis grâce au modèle de péritonite (intervention qui dure environ 10 min sous anesthésie) et une procédure induisant le sepsis par injection de bouillie caecale en intrapéritonéal (1 seule injection par souris). Une prise de sang à la veine cave inférieure sera ensuite réalisée, 6H, 12H ou 48H post-induction du sepsis (animaux anesthésiés). Suite à cette prise de sang unique, les animaux seront euthanasiés et leurs organes prélevés pour être analysés. Pour l'évaluation de la perméabilité des vaisseaux sanguin : 1 seule injection (veine de la queue) de colorant sera réalisée (animal anesthésié) suivie de l'euthanasie de la souris 30min apres l'injection et leurs organes seront ensuite prélevés pour être analysés.

Impact sur les animaux

Les modèles génétiquement modifiés de ce projet ne présentent pas de phénotype dommageables. Par contre, l’induction du sepsis va entrainer une septicémie chez les souris qui seront euthanasiées 6h, 24h, ou 48h post induction afin de suivre l’évolution du sepsis. Les effets indésirables attendus sont une perte de poids, une perte de vitalité et de sociabilité (souris qui reste isolée dans la cage).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et l'évolution du sepsis étudiée.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation des modèles génétiquement modifiées.

Réduction

Réduction du nombre d'animaux : plusieurs résultats obtenus avec un seul animal. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables en évitant la répétition d’études antérieures déjà réalisées et/ou publiées et en fonction des résultats obtenus au fur et à mesure du développement du projet. Les inhibiteurs seront testés uniquement si des résultats concluants sont obtenus avec les souris déficientes pour la protéine d’intérêt. Suite à l’induction du sepsis, nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 6 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes. Si ces différences existent, elles seront statistiquement affinées avec des groupes de 15 souris si besoin. Une approche statistique sera utilisée pour vérifier les différences obtenues entre groupes.

Raffinement

Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson. Si besoin de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage. Du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois seront rajoutés dans la cage. Une observation quotidienne (3 fois par jour) des souris sera réalisée par les zootechniciens et les expérimentateurs. Des points limites ont été mis en place et seront basés sur l’examen visuel des expressions faciales (ouverture des yeux, nez et joues « froncés », position des oreilles et des moustaches) et de la posture (prostration, absence d’interaction sociale). Expérience en manipulation des animaux et en chirurgie des expérimentateurs (formation en chirurgie validée).

Choix des espèces

Ce projet a pour but une meilleure compréhension des mécanismes impliquant une protéine d'intérêt dans la progression du sepsis. Les effets pléïotropes dans ce contexte font intervenir des fonctions cellules multiples dans l'organisme non modélisables par des approches in vitro. Le recours à l'expérimentation animale est donc l'unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans ce contexte. Par ailleurs, nous travaillons avec des souris génétiquement modifiées pour notre protéine d’intérêt (pas de phénotype dommageable). Nous utiliserons des souris de 10 à 12 semaines (âge adulte non vieillissant de l'animal).

6192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un cancer colorectal leur est induit par un carcinogène et un promoteur d'inflammation, avec une centaine d'injections intrapéritonéales en dix semaines et sans anti-inflammatoire, puisque le projet étudie précisément le rôle de l'inflammation. Le porteur reconnaît des douleurs et une perte de poids, et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever côlon et rectum. Il indique disposer de cultures in vitro qui "ne récapitulent pas" la complexité de l'organe et conclut au recours aux souris.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'étudier le rôle des cellules immunitaires appelées neutrophiles dans l'initiation et la progression tumorale du cancer colorectal. Plus précisemment nous souhaitons étudier une des fonctions des neutrophiles : la formation de « Pièges Extracellulaires», appelés "NETs", dans le developpement cancéreux. Les NETs sont composés d’ADN recouverts de protéines et sont libérés à l'exterieur des neutrophiles, afin de piéger et tuer les pathogènes lors d'une infection. Cependant des études ont montré que ces NETs ont également des propriétés pro-tumorales. Notre hypothèse est que les neutrophiles et NETs entrainent la progression du cancer colorectal via i) l’activation de cellules saines de soutien des tissus ; ii) l’inhibition de la réponse immunintaire anticancéreuse. En effet, ces évènements sont indispensables au développement des tumeurs et à la progression du cancer. Plus spécifiquement, nos résultats montrent que les NETs activent les cellules de soutien des tissus qui sont capables de modifié l'environnement des cellules permettant ainsi l'apparition et le developpement du cancer. De plus, nous avons identifié 2 protéines clés présentent dans les NETs connues inhiber la réponse immunitaire anti-tumraole. Il en résulte un environnement propice au développement des cellules cancéreuses. Nous souhaitons confirmer nos résultats chez la souris en utilisant le modèle AOM/DSS (Azoxymethane : carcinogne / Dextran Sodium Sulfate : promoteur) de cancer colorectal. En effet nous nous attendons à un retardement de l’initiation du cancer et une diminution de la progression du cancer lorsqu'on empeche l'action des neutrophiles et la formation de leur NETs. Le but est d'utiliser ce modèle pour confirmer le rôle des voies de signalisation impliquées dans l'activation des neutrophiles, la formation des NETs, et dans leur capacité à empecher la réponse immunitaire anticancéreuse et à modifier l'environnement des cellules.

Bénéfices attendus

Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux mais permettra de comprendre précisemment le(s) lien(s) entre inflammation et cancer et pourrait déboucher sur la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints d'un cancer colorectal.

Procédures

Les animaux seront manipulés par contention classique quotidiennement pour inspecter leur état général et leur administrer par injection intrapéritonéales les différents traitements (piqures en bas de l'abdomen, quotidiennement pour les inhibiteurs et 3 fois par semaine pour les anticorps) pendant 10 semaines. La contention de chaque animal durera en moyenne 20 – 25 secondes et sera réduit autant que possible dès que les conditions le permettront afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Par ailleurs, chaque animal sera pesé 3 fois par semaine, ce qui nécessitera une manipulation supplémentaire de l’animal courte (environ 5 secondes) pour le déposer sur la balance et le remettre dans sa cage. Les animaux recevrons 100 injections en 10 semaines et ces injections ne dureront que quelques secondes chacune.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus des animaux développant des tumeurs sont des signes de douleurs et une perte de poids (entre 5% et 10% du poids de l’animal après chaque cycle de DSS). Cette perte de poids est normale et elle est récupérée et généralement augmentée quelques jours après la fin d’un cycle de DSS (pendant la periode de récupération). La perte de poids ne devrait donc jamais excéder les 15% du poids initial à jour 0 des souris. Des signes de stress induits par l'injection répétée en intra-péritonéale des traitements peuvent aussi apparaitre.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience car nous aurons besoin de prélèver ensuite la le colon et le rectum des animaux pour analyser les tumeurs qui se seront développées en réponse au traitement cancérigène AOM/DSS.

Remplacement

Nos recherches ont décrit les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude de l’invasion cancéreuse. Nous avons déjà développé des modèles in vitro permettant de vérifier le rôle des NETs sur les capacités tumorales des cellules de cancer colorectal (CCR). Cependant ces cultures ne récapitulent pas en totalité les caractéristiques du carcinome colorectal (contrairement au modèle AOM/DSS de carcinome associé à la colite) et la complexité de l’organe, nous avons donc recours aux animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est choisi pour détecter toute différence significative sur le volume tumoral avec un nombre de souris minimum. Le nombre de souris se justifie par la fréquence des lésions tumorales observées après 10 semaines de traitement et l’hétérogénéité possible des différents stades cancéreux auxquels seront les tumeurs après le traitement par l'AOM/DSS. Pour l’étude des lésions cancéreuses très avancées et invasives, il nous faudra suffisamment d’animaux par groupes ayant développé spontanément ces lésions avancées pour avoir des analyses statistiques fiables. Les résultats obtenus au laboratoire in vitro permettent de réduire le nombre d’animaux. En effet, le fait que ce modèle soit largement utilisé et décrit par la communauté scientifique nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie. Ainsi nous avons générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans le respect de la réglementation européenne, les animaux seront manipulés dans le calme, 4 souris par cages, avec un cycle jour/nuit de 12h, eau/nourriture à volonté. Chaque cage est enrichie (mouse house, carrés de coton, bâtons à ronger). Les cages sont séparées des élevages pour un suivi adapté. La période d’acclimatation sera de 5 jours. Le suivi se fera 3 fois par semaine et la santé des animaux sera évalué via une liste de critères, de symptomes et de points limites. Aucun anti-inflammatoire ne sera donné puisque nous souhaitons caractériser le rôle de l’inflammation dans le développement du carcinome associé à la colite.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle des NETs dans l'inititation et le développement du carcinome associé à la colite (CAC) . Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. De plus, le modèle AOM/DSS reproduit fidèlement les caractéristiques de carcinogenése inflammatoire que nous souhaitons étudier et il a été bien caractérisé et est largement utilisé pour sa reproductibilité dans la communauté scientifique pour ce type d’étude. L’administration d’agents chimiques induisant la carcinogénèse sera réalisée sur des souris âgées de 8 à 12 semaines. Les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront à 10 semaines après initiation au AOM/DSS, ce qui correspond à la formation de carcinome colorectal.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'un modèle de sclérose latérale amyotrophique, elles subissent des injections quatre jours par semaine et une ouverture de la barrière entre le sang et la moelle épinière sous anesthésie chaque semaine pendant cinq semaines, la moitié étant suivies jusqu'au stade terminal de la paralysie. Le porteur reconnaît une perte de force musculaire, une paralysie progressive, et des risques d'hypothermie et d'arrêt cardiaque liés aux anesthésies répétées. Il affirme que ce modèle murin est le seul à reproduire la paralysie progressive de l'adulte, justifiant le recours à la souris.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative grave qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Le seul traitement utilisé en clinique, le Riluzole, ne permet de prolonger la survie que de 2 mois en moyenne. Les barrières entre le sang et le cerveau, hémato encéphalique (BHE) et entre le sang et la moelle épinière, hémato médullaire (BHM) sont des structures limitant le passage des molécules du sang vers le système nerveux central et représentent donc un challenge dans le traitement des maladies neurologiques et particulièrement de la SLA, qui ne trouve à ce jour pas de traitement satisfaisant. Il est aujourd’hui possible d’ouvrir cette barrière de manière transitoire et sans danger. Il a été montré que certaines cellules immunitaires dans des modèles murins de SLA permettaient de ralentir la progression de la maladie. L’objectif de notre étude sera de réaliser une approche combinée, avec une stimulation de ces cellules immunitaires associée à une ouverture transitoire de la barrière hématomédullaire, permettant d’augmenter leur infiltration dans le système nerveux central pour ralentir d’autant plus la progression de la maladie.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est de chercher à ralentir la progression de la maladie, en induisant une immunomodulation locale par ouverture de la barrière hématomédullaire et stimulation de certaines cellules immunitaires. A plus long terme, en cas d’efficacité, un passage en essai clinique chez l’homme est envisagé. Des méthodes existent déjà chez l’homme pour ouvrir la barrière hémato encéphalique et un dispositif d’ouverture adapté aux patients atteins de SLA pourrait voir le jour si l’étude préclinique s’avère positive.

Procédures

Les souris arriveront déjà numérotées par QR code auriculaire donc aucune procédure supplémentaire de numérotation ne sera nécessaire. Un génotypage sur prélèvement d’un petit bout de queue sera réalisé. Ce prélèvement aura lieu sous anesthésie générale, à l’occasion de la première anesthésie réalisée pour ouverture de la barrière hématomédullaire. • Injection d’un traitement immunomodulateur 4 jours par semaine pendant 5 semaines • Ouverture de la barrière hématomédullaire sous anesthésie générale durant une heure, 1 jour par semaine pendant 5 semaines. Cette procédure ne requiert aucune chirurgie et dure 5 minutes. Mesures dans chaque groupe : • 3 Prélèvements sanguins : un prélèvement toutes les 2 semaines • Pesée : une fois par semaine • Force musculaire : 1 fois par semaine pour suivre l’évolution de la maladie et l’effet du traitement. Durée du test 1 minute. Toutes les souris (N=80 souris au total, 4 groupes de 20 souris) seront euthanasiées par surdosage en anesthésiques. Dix souris/ groupe seront euthanasiées au stade symptomatique et 10 seront suivies jusqu’au stade terminal. Des prélèvements de tissus après euthanasie des animaux seront réalisés chez toutes les souris pour analyse du traitement sur la maladie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : • l’effet de la maladie sur les animaux, la perte de force musculaire et la paralysie progressive liée au modèle • le stress éventuel lié au test de force musculaire une fois par semaine sur les animaux entre l’âge de 48 et environ 162 jours, au cours de la maladie • un stress lié à la contention et la douleur de la piqure au cours des injections sous-cutanées répétées (4 jours par semaine et pendant 5 semaines consécutives) de l’immunomodulateur ou de placébo et des prélèvements sanguins • des irritations ou infections potentielles liées aux injections répétées intraveineuses des microbulles (ou placebo) pour l’ouverture de la barrière hémato médullaire une fois par semaine pendant 5 semaines consécutives • des conséquences négatives sur la maladie ainsi des hypothermies, hypoventilations et potentiellement des arrêts cardiaques liés aux anesthésies répétées (une fois par semaine pendant 5 semaines).

Devenir

Tous les animaux seront utilisés à la fin de la procédure pour des études d’histologie ou de transcriptomique et seront donc euthanasiés.

Remplacement

Ces modèles animaux sont actuellement les seuls qui permettent de reproduire la paralysie progressive chez l’adulte dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique et donc de modéliser la physiopathologie humaine, raison pour laquelle notre projet nécessite l’utilisation de ces souris.

Réduction

Pour mener à bien cette étude et obtenir un résultat interprétable il est nécessaire de former 4 groupes de N=20 souris/groupe selon le traitement administré. Groupe 1: ouverture de la barrière hématomédullaire et stimulation du système immunitaire, groupe 2 : ouverture de la barrière sans stimulation du système immunitaire, groupe 3 :stimulation du système immunitaire sans ouverture de la barrière, groupe 4, contrôle : ni stimulation, ni ouverture de la barrière. Nous utiliserons le nombre d’animaux minimal nous permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif d’après les lignes directives publiées et nos études précédentes pour déterminer le nombre de souris par groupe (calcul de puissance), afin de pouvoir obtenir une conclusion scientifique à l’ensemble de nos travaux. Nous utiliserons: N=10 souris/groupe pour les courbes de suivi de la maladie et N=10 souris/groupe pour des analyses au stade symptomatique de la maladie. Dans chacun de ces sous-groupes de N=10 souris, N=5 souris serviront à des études histologiques, N=5 souris serviront à des études de transcriptomiques. Nombre total de souris = 80 souris. Tous les effets seront analysés par des tests statistiques appropriés pour les courbes de survie, les analyses histologiques et transcriptomiques.

Raffinement

Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées et nous avons, pour chaque procédure, défini un point limite. Pour la stimulation environnementale, nous utilisons toujours des petites maisons en carton et des fibres en carton permettant de faire des nids dans chaque cage. Un programme d’enrichissement sera suivi en ajoutant dans la cage les éléments suivants : « Mouse house » ou carrés de coton pour nids. Les femelles seront hébergées ensemble à 5 souris par cage. Si la maladie des souris n’est pas synchrone d’une souris à l’autre, les souris ayant du mal à se déplacer (pour cause de paralysie engendrée par la maladie SLA) seront séparées pour éviter que les souris plus vives ne les piétinent. Elles seront dans ce cas isolées avec les autres souris paralysées (2 à 5 souris/ cage sauf cas exceptionnel et peu probable où il n’y aurait qu’une souris dans cet état). Un mélange de poudre de nourriture et d'eau (bouillie) sera proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une déshydratation et une dénutrition. Un soin particulier sera apporté aux yeux des souris partiellement paralysées qui peuvent être salis. Ils seront observés quotidiennement et nettoyés à l’eau stérile en cas de suintement ou à la vétadine en cas de rougeur (suspicion d’infection). Proche du stade terminal, les souris seront surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours de la semaine (week-ends inclus). Bien que la sonication soit parfaitement indolore, afin d’éviter le stress lié à une contention, les animaux recevront une anesthésie chimique.

Choix des espèces

Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la SLA : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bons modèles pour répondre à nos questions. Nous utilisons aussi des cultures cellulaires mais, celles-ci ne peuvent pas permettre d’évaluer un effet sur la progression de la maladie dans un modèle intégré et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central. Nous avons une grande expérience des souris et le modèle est mieux établi chez la souris que chez le rat; c’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Nous utiliserons des souris adultes, plus particulièrement au stade symptomatique aux alentours de 5 mois et au stade terminal de la maladie. Les souris SLA atteignent le stade terminal vers l’âge de 6 mois.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont isolées en cage individuelle jusqu'à la fin de l'expérience, soumises à des stress répétés, injection d'ACTH et nage forcée, puis reçoivent des substances et des prises de sang, pour créer un modèle de dépression résistante aux traitements et tester l'effet de la lumière. Le porteur justifie l'effectif de dix animaux par groupe autant par la puissance statistique que pour "éviter tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication". Il affirme que l'usage d'animaux vivants est "incontournable" pour analyser une dépression pharmaco-résistante, malgré des approches in vitro déjà menées.

Objectifs

La dépression majeure concerne environ 17 % de la population française, ce qui en fait le trouble psychiatrique le plus fréquent. La classe d’antidépresseur prescrite en première intention sont les inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, mais 50% des patients déprimés ne répondent pas correctement à ce type de traitement, d'où l'importance de chercher de nouvelles stratégies capables de potentialiser leur effet.

Bénéfices attendus

Nous prévoyons que ces deux modèles induisent des comportements pseudo-dépressifs stables et résistants à des traitements classiques mais également en développements. De même, le traitement par la lumière seule ne devrait pas avoir d’effet antidépresseur. En revanche, le traitement par la lumière permettrait de potentialiser la réponse antidépressive des antidépresseurs résistants.

Procédures

Les interventions prévues sont : 1) Les animaux seront isolés dans des cages individuelles jusqu’à la fin de l’expérimentation. Cependant, les animaux pourront voir leurs congénères et auront aussi accès à leurs odeurs et bruits. 2) Les animaux subiront des administrations de substances actives et de prélèvements sanguins sur animal vigile, 3 fois moins de 7 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) dès réception et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages munies d’un capteur infrarouge permettant de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. Cependant, les cages sont placées dans une armoire, et les animaux ont donc accès aux odeurs et bruits de leurs congénères. 2) les animaux subiront un changement de cycle pendant 14 jours pour pouvoir effectuer les tests comportementaux à l’obscurité. 3) Les animaux subiront des stress (injection ACTH, nage répétée) afin de valider le modèle de dépression pharmaco résistant. 4) Les animaux subiront des administrations de substances actives et des prélèvements sanguins.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expérimentations. Ayant subi un protocole pharmacologique et/ou de stress chronique, les animaux ne peuvent pas être réutilisés dans une autre étude pour éviter tous biais.

Remplacement

Des approches in vitro sont déjà réalisées au laboratoire (évaluation de la neurogène et de la synaptogenèse, électrophysiologie in vitro). Cependant, l'utilisation de modèles complexes, i.e. d'animaux vivants, est incontournable afin d'analyser les réponses antidépressives dans des modèles de dépression pharmaco-résistants.

Réduction

Les groupes sont formés de 10 animaux. Le nombre d'animaux utilisés est fonction de la réponse physiologique mesurée et est basé sur nos travaux précédents. Il correspond également au nombre classiquement utilisé dans la littérature pour la validation de cette réponse. Le nombre d'animaux est réduit à une valeur minimale (10 animaux par groupe) permettant d'une part d'atteindre une significativité statistique pour la validation et l'évaluation des réponses mesurées et d'autre part d'éviter tout scepticisme de la part de rapporteurs lors de la publication. Pour réduire le nombre total d'animaux, nous réalisons plusieurs tests chez le même animal et certaines mises au point techniques seront réalisées en réutilisant le même animal.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. Pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton). Pendant une dizaine de jours, ils feront l’objet d’une attention particulière afin de vérifier le bon développement du model. En cas de problème d’alimentation, les animaux auront accès à de la blédine directement dans une coupe dans la cage. L’observation des animaux sera effectuée tous les 2 jours et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Les points limites sont basés sur l'apparition de signes généraux évocateurs de souffrance : dyspnée, chute de température. En cas de signe de douleur (grille de score de la douleur >5), une injection analgésique de buprenorphine sera prodiguée. En cas de dépassement du point limite, les animaux seront mis à mort par anesthésie systémique avec de la kétamine et une injection létale d’euthasol. Les soins et les procédures seront réalisées par du personnel qualifié.

Choix des espèces

Les rongeurs sont choisis car il s'agit des plus petits mammifères ayant un cerveau encore suffisamment homologue à celui de l'homme pour mener des études expérimentales en neuropsychiatrie. Des animaux adultes seront utilisés car chez l'homme, les antidépresseurs sont majoritairement prescrits chez l'adulte.

490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa leur est provoquée par voie nasale sous anesthésie, après administration d'une bactérie censée protéger, la survie étant suivie sur sept jours. Le porteur indique que l'infection entraîne une perte de poids, une mobilité réduite puis une inactivité pouvant atteindre une intensité sévère, et prévoit un modèle de survie plutôt qu'une mise à mort anticipée. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet de conclure sur la survie d'un animal à une infection pulmonaire, justifiant le maintien du modèle souris.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Suite à des résultats prometteurs d’une bactérie à potentiel probiotique actuellement en développement au laboratoire, et ayant une action protectrice vis-à-vis de l’infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa, il est nécessaire de consolider nos résultats. L’objectif est de tester l’effet bénéfique de notre bactérie à potentiel probiotique, à savoir une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa dans les poumons des souris. Ces résultats seront validés dans un modèle de survie sur une période de 7 jours.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentielles bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines étant à l’origine d’infections pulmonaires notamment dans la mucoviscidose.

Procédures

Les animaux seront pucés sous anesthésie gazeuse d'environ 1 minute. L'implantation de la puce prendra environ aussi 1 minute. Les animaux seront anesthésiés deux fois et recevront durant 1 minute dans la narine du sérum physiologique ou un probiotique puis la seconde fois une suspension bactérienne sur une durée de 1 minute.

Impact sur les animaux

Ce projet peut induire un stress chez les animaux notamment lors de la préhension de l’animal pour les suivis, les pesées et la prise de température (2 à 3 fois par jour maximum) : intensité faible, durée environ 1 min. Les animaux auront au total soit 3 anesthésies médicamenteuses, intensité forte, durée environ 2 heures soit 3 anesthésies par isoflurane : Intensité faible, durée environ 2 min. (En fonction des résultats obtenus lors de la procédure 1) Des pertes de poids, une mobilité réduite voire, une inactivité après le début de l’infection pulmonaire peuvent être observées, elles sont d’intensité progressive avec l’évolution de l’infection pouvant aller jusqu’à une intensité sévère sur une durée de 7 jours maximum.Les pesées et prise de température des animaux sont d’intensité faible et d’une durée d’environ 1 min Les analgésies des animaux sont d’intensité faible et d’une durée d’environ 30 secondes. Selon les procédures, les suivis de températures et pesées seront de 7 jours pour la procédure 1 et 2 et de 4 jours pour la procédure 3.

Devenir

A l'issu du projet tous les animaux ayant été infectés, seront mis à mort. Et certains auront des prelevements de tissus.

Remplacement

Nous souhaitons observer dans cette demande un pourcentage de survie d’animaux à une infection pulmonaire causée par Pseudomonas aeruginosa. Les modèles cellulaires et/ou autres modèles in vitro ne permettent pas à ce jour de conclure sur la survie d’un animal à une infection pulmonaire. Pour cette raison, nous faisons le choix de conserver le modèle animal.

Réduction

Lors des procédures 1 et 2, l’analyse de la survie sera réalisée par comparaison du pourcentage de survie au 7ème jour, le nombre de souris nécessaire par groupe est de 15 souris. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous choisissons de ne pas réaliser le groupe contrôle (sérum physiologique) car nous n’attendons pas de mortalités. De plus, nous réduisons au minimum le nombre de souris dans notre groupe recevant uniquement notre probiotique car nous n’attendons aucune mortalité. Lors de la procédure 3, le nombre de souris est déterminé de façon à mettre en évidence une différence de 1 log au niveau de la quantité de P. aeruginosa entre le groupe recevant P. aeruginosa et celui recevant du Porphyromonas préalablement à l’instillation de P. aeruginosa. Nous réaliserons des analyses statistiques afin de vérifier la différence au niveau de la quantité de pathogène dans les poumons. Afin de garantir une puissance statistique, 6 souris minimum sont nécessaires dans chaque groupe lorsque ce groupe est comparé au groupe contrôle P. aeruginosa. Par ailleurs, dans nos 3 procédures, nous nous limitons à une seule souche clinique de Porphyromonas alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon

Raffinement

Avant toute inoculation d'une goutte d'un produit dans la narine de la souris, les animaux seront préalablement anesthésiés et analgésiés. Les animaux seront suivis. Un analgésique, en complément des injections en journée, sera mis à disposition dans les cages la nuit afin de prendre en charge la douleur si des critères étaient observés.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante à 24h. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats.

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une perte de substance du palais leur est infligée sous anesthésie pour créer une communication entre la bouche et les sinus, comblée par un biomatériau à base de collagène et de lysat plaquettaire, avec un suivi de trois semaines par scanner avant mise à mort au 21e jour. Le porteur reconnaît des douleurs postopératoires, des difficultés à s'alimenter, des risques d'infection, de nécrose et une mortalité pouvant atteindre 5 %. Il affirme qu'il n'est pas possible de se passer d'animaux et présente ce modèle comme un préalable à des essais chez l'humain.

Objectifs

Les communications buco-naso-sinusiennes (CBS) sont fréquentes en cancérologie, d'origine iatrogène de la tête et du cou et peuvent être causées par la chirurgie et/ou la chimiothérapie. Elles se manifestent sous forme de fistules entre la cavité orale et les sinus maxillaires ainsi que les fosses nasales.Ces communications peuvent entraîner des symptômes tels que des infections récurrentes des sinus, une obstruction nasale, des douleurs faciales et des écoulements nasaux persistants. Les traitements actuels sont souvent invasifs et présentent un risque élevé d'échec. Pour résoudre ce problème, nous proposons un nouveau biomatériau sec, poreux et bioactif fabriqué à partir de collagène de types I et de lysat plaquettaire. Ce biomatériau a pour objectif de fermer complètement les CBS tout en libérant des molécules bioactives qui favorise la réparation tissulaire (facteurs de croissance, des cytokines...) Le but se ces travaux d'évaluer l'efficacité de ce biomatériau sur des animaux dans le cadre du traitement des CBS. Il vise à offrir une solution thérapeutique supplémentaire aux CBS de petite ou moyenne taille, en particulier celles qui sont récidivantes et réfractaires au traitement par lambeaux. L'utilisation de ce biomatériau plutôt que d'un lambeau permettrait d'éviter la morbidité associée (séquelles du site donneur) et de raccourcir la durée de l'opération. Cela améliorerait la qualité de vie des patients, en particulier ceux qui doivent porter des plaques palatines obturatrices à vie en raison de CBS persistantes. Les approches utilisant des biomatériaux bioactifs d'origine naturelle, comme celle que nous proposons, représentent une alternative de choix pour combler ce vide thérapeutique.

Bénéfices attendus

- Prouver l’efficacité des biomatériaux pour la régénération tissulaire in-vivo - Perfectionner le modèle animal de CBS chez le rangeur (rats)

Procédures

L'induction de la communication bucco-sinusienne et la mise en place des biomatériaux seront réalisées sur l'ensemble des rats (60) sous anesthésie générale, avec une durée estimée de 60 minutes. Chaque rat sera placé allongé sur le dos sur un tapis chauffant, avec la bouche maintenue ouverte à l'aide d'un élastique placé sur les incisives maxillaires. La procédure consistera en la création d'une perte de substance palatine, conformément à la méthode décrite dans la littérature. Cette perte de substance sera ensuite comblée avec nos biomatériaux sélectionnés, soit l'aérogel de collagène et de lysat plaquettaire, soit l'aérogel de collagène seul, à l'exception du groupe contrôle. Lors de l'application des aérogels, une pression douce sera exercée avec une compresse jusqu'à obtention de l'hémostase. Un suivi de 3 semaines sera effectué, avec une observation hebdomadaire par scanner (micro-TDM) sous anesthésie générale, pour une durée estimée inférieure à 15 minutes. Ceci permettra d'évaluer la régénération tissulaire induite par nos biomatériaux dans les groupes traités et de la comparer à la régénération spontanée du groupe contrôle. Enfin, après une anesthésie générale, tous les rats seront euthanasiés au 21e jour ce qui prendra quelques secondes. Les cadavres des rats seront ensuite transférés au service de zootechnie expérimentale pour la dissection, et des analyses histologiques seront réalisées sur les échantillons.

Impact sur les animaux

Douleurs : Il est possible que des signes de douleur postopératoire apparaissent en raison des incisions chirurgicales, de la manipulation tissulaire et des lésions tissulaires pendant la chirurgie. Ces douleurs peuvent avoir des effets négatifs sur le bien-être général des animaux, tels que des problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité. /Difficultés alimentaires : Des difficultés à s'alimenter peuvent survenir en raison de douleurs ou d'inconfort buccal, des modifications anatomiques de la cavité buccale et des sinus qui affectent la fonction de mastication et rendent l'ingestion des aliments moins efficace./Infection : Il est possible que des infections se développent au site de la communication bucco-sinusienne ou de la réparation subséquente avec l'aérogel./ Mauvaise cicatrisation : Il est possible que la réparation avec l'aérogel ne soit pas efficace et que la communication bucco-sinusienne persiste ou se reforme. /Effets secondaires systémiques : L'utilisation de l'aérogel pour la réparation de communications bucco-sinusiennes chez les rats peut entraîner des effets secondaires systémiques, tels que des modifications du poids corporel, du métabolisme ou d'autres paramètres physiologiques. Réaction immunitaire : Il est possible que certains animaux développent une réaction allergique à l'aérogel, ce qui pourrait entraîner des symptômes tels que de l'inflammation, des rougeurs, des démangeaisons ou une nécrose tissulaire. /Mortalité : Il est possible que des animaux décèdent en raison de complications liées à la procédure de réparation avec l'aérogel, telles que des infections, des complications chirurgicales ou des réactions inattendues (risque estimé inférieur à 5%).

Devenir

Mise à mort nécessaire pour examen histologique (évaluation biointégration, biodégradation, formation osseuse, présence d'ostéoradionécrose).

Remplacement

Il n'est pas possible de se passer d'animaux pour ce projet. En effet, avant de pouvoir mettre en place les premiers essais cliniques chez l'Homme, il est nécessaire de vérifier l'efficacité du nouveau biomatériau dans une étude préalable sur modèle animal. Une seule formulation de mousse composé de collagène et de lysat plaquettaire parmi 3 formulations de départ sera évaluée, car l’évaluation in-vitro (culture cellulaire 3D) a montré son fort potentiel

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus, ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature.Le critère de jugement principal est le taux de rats présentant un succès. Un succès est défini comme une régénération de plus de 50% de la surface. En utilisant un plan de A’Hern sous les hypothèses alpha=5%, puissance=85%, p0=25% et p1=55%, il est nécessaire de randomiser 20 rats dans chaque bras expérimental. Un ratio 1:1:1 sera utilisé pour la randomisation, le bras contrôle étant uniquement présent pour valider les hypothèses. Au total 60 rats (bras contrôle : n=20 / bras expérimental 1: n=20 / bras expérimental 2 : n=20) seront randomisés dans cette étude. Le critère principal est le taux de rats présentant un succès (cf. section critère de jugement principal).Il sera présenté par bras sous la forme de nombre, pourcentage et intervalle de confiance à 95% selon une distribution binomiale exacte.

Raffinement

La totalité des procédures effectuées seront réaliser par un personnel qualifié composé de concepteur de projet et d’applicateur de procédure expérimentale ainsi de chirurgiens ORL Un entrainement sur des cadavres de rats sera effectué afin de permettre aux opérateurs de se familiariser et raffiner la procédure chirurgicale. Le bien-être animal sera raffiné par une optimisation de la gestion de la douleur (buprenorphine). Les animaux seront surveillés avec attention (comportement, prise alimentaire) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. Les difficultés à l'alimentation seront surveillées et la prise alimentaire sera facilitée par les antalgiques et un accès à l'eau et à de l'alimentation molle (croquettes ramollies). Elle sera supplémentée par des compléments hypernutritifs en cas de perte de poids. Les cages seront de taille adaptée. Le change sera effectué 2 fois par semaine. Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.

Choix des espèces

Bien que les modèles animaux ne puissent reproduire précisément la physiologie ou l'anatomie humaine, le rat se distingue en tant que modèle animal particulièrement avantageux pour notre étude. Il présente une combinaison d'atouts significatifs, tels que son coût abordable, sa robustesse et sa facilité d'entretien. Notre sélection s'est orientée vers la race Wistar Han, avec des mâles âgés d'environ 7 à 9 semaines, pesant entre 251 et 275 grammes. Toutes les expérimentations animales seront rigoureusement conduites au sein d'une installation de Zootechnie agréée. Cette décision repose sur des études préalables similaires à notre approche de recherche, qui ont été précédemment publiées.