Procédures sévères
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Hamsters dorés : 10000
60 000 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures dont la souffrance déclarée va de légère à sévère, dont 5 900 en gravité sévère. Ils reçoivent un vaccin vétérinaire puis se voient inoculer la souche pathogène correspondante, parfois par injection intracérébrale sous anesthésie, pour contrôler l'activité et l'identité de lots commerciaux de vaccins destinés aux chiens, chats, furets et animaux d'élevage. Le porteur décrit chez les témoins non vaccinés une prostration, des tremblements, une parésie, une paralysie, des convulsions et un "état proche de la mort", et attribue le nombre d'animaux et le recours à ces épreuves à la réglementation de la Pharmacopée européenne. Il affirme qu'aucun test in vitro n'existe pour remplacer ces contrôles, dont les rongeurs servent d'espèces de substitution aux espèces cibles.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de déterminer l’activité de vaccins ou de principes actifs destinés aux animaux de compagnie (chien, chat, furet) ou aux bovidés, ovidés et équidés domestiques, ainsi que l’identité de souches vaccinales. Ces objectifs doivent être respectés afin d’être en conformité avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires pour la constitution d’un dossier de mise sur le marché et pour la fabrication d’un lot commercial. Les contrôles d’activité et d’identité d’un vaccin se basent sur le développement ou non de la pathologie après injection de la souche d’épreuve (les animaux vaccinés sont protégés). Ils sont effectués in vivo sur espèce alternative. L’utilisation d’espèces alternatives est possible si les espèces utilisées (dans le cas présent des souris ou des hamsters) sont sensibles aux souches testées. Ceci permet d’éviter le recours aux espèces cibles, et de garantir une commercialisation de vaccins efficaces et sûrs qui protègent l’animal de la maladie. La Pharmacopée Européenne demande la démonstration de résultats concrets, certains obtenus sur l’animal.
Bénéfices attendus
L’avantage est que ces tests permettent la libération d’un nombre important de doses de vaccins améliorant considérablement la santé et le confort des animaux de compagnie ainsi que des propriétaires.
Procédures
Après au moins deux jours d’acclimatation, les rongeurs peuvent entrer dans la phase de test avec l’administration d’un vaccin. Pour les trois contrôles une même démarche est appliquée : Il y a en premier lieu l’administration du vaccin aux animaux. Après un certain temps pour que l’immunité s’installe, la souche d’épreuve est inoculée aux animaux. Tous les animaux sont ensuite suivis deux fois par jour jusqu’à la fin du test. Une anesthésie est réalisée avant l’injection des souches d’épreuve en intra cérébral.
Impact sur les animaux
Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent. Les animaux peuvent présenter une légère augmentation du stress due aux injections des vaccins et aux manipulations. Les témoins montrent les symptômes liés aux maladies infectieuses testées: la prostration, le dos voussé, les reins creusés, des tremblements et l’absence de réactions aux stimuli. Pour les maladies virales avec un tropisme pour le système nerveux : les poils hérissés, la réduction des déplacements, des tremblements, des mouvements saccadés, la parésie, la paralysie, des flancs creusés, les yeux enfoncés, des convulsions et/ou un état proche de la mort. Des points limites spécifiques aux pathologies sont appliqués.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés
Remplacement
La nécessité d’utilisation des animaux provient de la réglementation en vigueur sur ces tests, en conformité avec la réglementation des pays destinataires. Elle permet de démontrer l’activité et l’identité des lots de vaccins à commercialiser. Les tests in vitro sont actuellement inexistants pour remplacer le modèle in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux est imposé par la réglementation. Une réduction du nombre d’animaux est possible grâce à la mutualisation de lots témoins.
Raffinement
Des points limites spécifiques aux pathologies sont déterminés pour les témoins non vaccinés. Le personnel vérifie l’évolution de l’état général et si les points limites spécifiques sont atteints. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés du milieu ont été mis en place dans les hébergements. Pour les hamsters, un igloo ou hutte et des copeaux compressés sont disposés dans la cage lors de la période de vaccination, au passage en épreuve, des copeaux compressés sont disposés dans la cage. Et pour les souris, un igloo et des copeaux compressés sont disposés dans la cage lors de la période de vaccination, au passage en épreuve, l’enrichissement est limité à la litière et aliment afin d’éviter tout risque EHS de manipulation de l’enrichissement par l’opérateur lors des observations quotidiennes. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Ces espèces de rongeurs sont utilisées comme espèces alternatives aux espèces d’animaux de compagnie (chien, chat, furet) ou aux bovidés, ovidés et équidés domestiques. Ces espèces sont sensibles aux souches testées et permettent de réaliser les tests. Pour l’épreuve rage sur souris : Il faut des souris de 4 à 6 semaines pour la technique d'identité ou de 4 à 5 semaines pour la technique d'activité par épreuve. Pour l’activité par épreuve leptospirose sur hamster : Il faut des hamsters de 35 à 55g, c’est-à-dire de 3 à 6 semaines. Pour l’activité par épreuve rhinopneumonie équine sur hamster : Il faut des hamsters de 40 à 50g. Ces stades de développement sont ceux requis pour répondre à la Pharmacopée Européenne et aux dossiers déposés aux autorités.
Amélioration et/ou restauration de la marche et de l’équilibre sur un modèle de maladie de Parkinon chez le primate non humain.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Macaques rhésus : 5
10 macaques vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des injections quotidiennes de MPTP pendant quinze jours pour provoquer un syndrome parkinsonien, puis subissent une chirurgie d'implantation intracérébrale d'une heure et une chirurgie intraspinale de six heures pour y poser des électrodes, afin de tester une neurostimulation de la moelle épinière censée restaurer la marche. Le porteur décrit le modèle MPTP comme "très bien maîtrisé" et l'analgésie comme "très bien encadrée", et justifie le recours au macaque par l'homologie de son réseau nerveux avec l'humain et par une application humaine visée dans une autre phase du projet. Les bénéfices annoncés pour les patients parkinsoniens restent renvoyés à un développement ultérieur.
Objectifs
La trajectoire clinique d'un patient atteint de maladie de Parkinson (MP) implique souvent différentes phases avec une complexité croissante. En effet, les symptômes neurologiques sont d'abord traités avec des thérapies de remplacement de la dopamine. Lorsque les pharmacothérapies ne parviennent pas à atténuer les symptômes à un niveau satisfaisant, ou lorsqu'elles induisent des effets secondaires indésirables mais inévitables, les patients subissent souvent l'implantation chirurgicale d’électrodes dans les noyaux subthalamiques (STN) pour recevoir une stimulation cérébrale profonde (DBS). Cependant, au stade avancé de la maladie, plus de 90% des patients présentent des déficits de la marche et de l’équilibre prononcés, combinés à des épisodes de chutes, qui résistent à la fois aux traitements de substitution dopaminergique et au traitement par la DBS. Bien que la stimulation cérébrale profonde soit très efficace pour atténuer les signes moteurs tels que les tremblements, la bradykinésie et la rigidité des membres supérieurs, celle-ci échoue à atténuer, et parfois peut même aggraver les déficits locomoteurs liés à la marche et au contrôle de la posture. Ainsi, ces perturbations entraînent des risques élevés de blessures liées aux chutes et affectent gravement l'autonomie des patients. C’est pourquoi, les déficits de la marche et de l’équilibre figurent parmi les symptômes les plus invalidants de la MP.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson (MP) est l'un des troubles neurodégénératifs les plus répandus dans le monde avec plus de dix millions de personnes atteintes. Plus de 90% des malades souffrent de troubles locomoteurs impactant énormément leur qualité La maladie de Parkinson (MP) est l'un des troubles neurodégénératifs les plus répandus dans le monde avec plus de dix millions de personnes atteintes. Plus de 90% des malades souffrent de troubles locomoteurs impactant énormément leur qualité de vie et augmentant les risques de comorbidité liés par exemple aux chutes. Contrairement aux symptômes moteurs des membres supérieurs, ces déficits répondent mal aux thérapies couramment disponibles telles que les stratégies de remplacement de la dopamine ou la stimulation cérébrale profonde du fait de la différence de nature et de dynamique des circuits qui contrôlent la dextérité manuelle versus la locomotion. C’est pourquoi, nous proposons de cibler les circuits de la moelle épinière directement responsables de la locomotion. vie et augmentant les risques de comorbidité liés par exemple aux chutes. Contrairement aux symptômes moteurs des membres supérieurs, ces déficits répondent mal aux thérapies couramment disponibles telles que les stratégies de remplacement de la dopamine ou la stimulation cérébrale profonde du fait de la différence de nature et de dynamique des circuits qui contrôlent la dextérité manuelle versus la locomotion. C’est pourquoi, nous proposons de cibler les circuits de la moelle épinière directement responsables de la locomotion.
Procédures
Injections intra veineuses MPTP, quotidiennes pendant 15 jours Chirurgie implantatoire intracérébrale (1x 1h) plus intraspinale (1x6h)
Impact sur les animaux
Les nuisances ou efefts indésirables attendues sont 1/ lié au modèle de maladie de Parkinson : injection de MPTP en i.v et mise en place du procesus neurodégénératif (mais ce modèle issu de notre laboratoire est très bien maîtrisé, et les animaux suivis pour leur état général) , 2/ lié à la chirurgie implantatoire du dispositif médial et des électrodes de stimulation, là aussi cette partie est maîtrisée par des spécialistes et l'analgésie au cours de l'opératon et post-opératoire est très bien encadrée).
Devenir
A l'issue de la procédure, c'est à dire après la période de deux semaines de stimulation et d'enregistrement de la restauration de la locomotion les animaux seront euthanasiés afin de récupérer le dispositif médical et le cerveau pour la poursuite de l'étude anatomique et histologique.
Remplacement
Ce projet contenant un aspect scientifique et un technologique, vise à étudier l’impact de la neurostimulation sur un réseau nerveux complexe et à grande échelle, d'ou la nécessité d'utliser un modèle animal intégré.
Réduction
Cette technologie dispositif implantable avec des capacités de contrôle en temps réel qui coïncide avec le mouvement en cours et qui rétablit la dynamique naturelle des circuits moteurs, permettront d'étudier les stimulations et d'enregister les réponses du réseau nerveu en retour, ceci en direct et sur plusieurs sessions d'enregistrement. Chaque animal permettra d'obtenir de nombreuses données expériementales de caractérisation de la réponse nerveuse aux différentes stimulations, avant l'utilistation du dispositif chez l'humain. Chaque animal sera son propre contrôle afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés individuellement dans des cages conçues selon les directives européennes (2 m × 1,6 m × 1,26 m), dans une structure spécialement agréée pour l’hébergement et l’utilisation des primates en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (nourriture variée, jeux pour primates, fond sonore …). Toute intervention nécessaire à l’expérimentation sur l’animal sera réalisée sous anesthésie locale ou générale et complétée par l’utilisation d’analgésiques afin d’assurer le meilleur confort qui soit. Les points limites seront respectés, ce qui nous amènera à prendre les dispositions qui s’imposent de la façon la plus précoce et la plus adaptée possible. Pour cela, tous les animaux seront surveillés plusieurs fois par jour par nos techniciens animaliers et par les chercheurs formés et habitués à interagir avec ces espèces animales. Cela permettra de discuter au cas par cas des soins à apporter à l’animal en fonction des besoins.
Choix des espèces
Ce projet contient deux aspects : scientifique et technologique. Au niveau scientifique, il vise à étudier l’impact de la neurostimulation sur un réseau nerveux à grande échelle (cérébrale et spinale). Il existe une grande homologie de ce réseau entre le macaque et l’humain, mais cette homologie est nettement réduite avec d’autres espèces de vertébrés tels que les rongeurs. Au niveau technologique, ce projet vise à développer des technologies de neurostimulation qui sont dans une autre phase du projet appliquée à l’humain, ce qui explique la nécessité d’utiliser un tel modèle. L’espèce choisie ici est le macaque rhesus ou cynomolgus. En effet, le comportement moteur est déjà bien connu et analysé, le modèle de maladie de Parkinson (modèle MPTP) est très bien décrit dans la littérature et validé par la communauté scientifique. Les animaux sont utilisés à partir de 3 ans, ce qui correspond à un âge adulte pour cette espèce de primate.
Utilisation digestive et métabolique des aliments d’allaitement et des aliments solides chez les veaux
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
80 veaux vont être utilisés, renvoyés en élevage à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Ils sont maintenus dans des cages individuelles qui les empêchent de se retourner et équipés d'un harnais de collecte des fèces pendant neuf jours, placés dans des enceintes fermées pendant sept jours et soumis à un jeûne de moins de 24 heures, pour mesurer l'utilisation digestive et métabolique de différents aliments. Le porteur décrit l'isolement et la restriction de mouvement comme les principales contraintes, et indique les atténuer par des dispositifs audio et la proximité des cages. L'objet réel du projet est de mieux calibrer l'alimentation des veaux d'élevage, notamment pour réduire les rejets azotés dans l'environnement.
Objectifs
Les veaux issus des troupeaux de vaches laitières peuvent être alimentés avec des proportions variables d'aliments liquides (aussi appelés aliment d'allaitement) et d'aliments solides selon leur devenir. Ainsi, les veaux destinés à la production de viande de veau sont généralement élevés avec une forte quantité d'aliments liquides et une faible quantité d'aliments solides. A l'inverse, les autres veaux (destinés au renouvellement du troupeau de vaches laitières, ou à la production de viande sous forme de taurillons) sont élevés avec une faible quantité d'aliments liquides, mais une forte quantité d'aliments solides. Chez les ruminants, les aliments solides sont orientés vers le rumen, où se déroulent les fermentations associées à la rumination, avant de rejoindre l'estomac, puis les intestins. A l'inverse, les aliments liquides sont directement orientés vers l'estomac via le mécanisme de fermeture de la gouttière oesophagienne, sans étape de rumination. Il résulte de cette particularité des modifications dans les utilisations digestives et métaboliques des aliments selon leur nature. Les objectifs du projet sont de déterminer les utilisations digestives et métaboliques de 10 rations expérimentales (figure 1) : 1/les rations 1 à 4 sont constituées de proportions variables d'aliments d'allaitement et d'aliments solides (de 90 à 0% d'aliment d'allaitement) de façon à évaluer l'effet de la substitution entre ces deux types d'aliments. Pour ces 4 rations, les aliments solides sont constitués de fourrages (mélanges de paille et de foin) et de concentrés de céréales et de protéagineux. 2/les rations 5 à 8 contiennent 57% d'aliment d'allaitement et 43% d'aliments solides. La composition des aliments solides varie afin de contenir des proportions variables de paille et de foin en association avec un concentré de céréales et de protéagineux de façon à évaluer les conséquences induites par le type de fourrage utilisé. 3/les rations 9 et 10 contiennent sont constituées de 85% d'aliment d'allaitement et de 15% d'aliment solide. Les rations 9 et 10 se distinguent par la composition de l'aliment d'allaitement (utilisation de deux poudres de lait écrémé issues de deux procédés industriels différents). La composition de l'aliment solide est la même pour les deux rations: concentré de céréales et de protéagineux en association avec de la paille. Toutes les rations seront calculées de façon à satisfaire les besoins nutritionnels des animaux.
Bénéfices attendus
Le projet va permettre de disposer de mesure originales pour connaître les utilisations digestives et métaboliques de différents aliments chez les veaux. Aujourd'hui, la complémentarité entre les aliments d'allaitement et les aliments solides est mal maitrisée dans les élevages, ce qui aboutit à des déséquilibres nutritionnels caractérisés par un excès de certains nutriments. Par exemple, un excès de protéines dans l'alimentation est à l'origine de rejets excédentaires qui sont néfastes pour l'environnement. Le projet permettra de proposer des règles pour mieux alimenter les veaux.
Procédures
Les fèces sont collectés lors de la défécation naturelle, mais ceci néssite de placer les animaux dans des cages individuelles les empechant de se retourner et de les équiper d'un harnais de collecte des fèces. Les veaux seront équipés du harnais pendant la durée la plus courte possible (9 jours au cours des procédures 2, 4, 5 et 6). La mesure de la production de chaleur nécessite de placer les animaux dans des enceintes pendant 7 jours (procédures 4 et 5). La mesure de la production de chaleur basale nécessite de placer les animaux dans une situatuin de jeûne pendant moins de 24 h (procédure 5).
Impact sur les animaux
Les objectifs du projet nécessitent de placer les animaux dans des conditions d'hébergement particulières. D'une part, les procédures 2, 3, 4, 5 et 6 nécessitent d'héberger les animaux individuellement. Dans les procédures 2 et 6, la liberté de mouvement est également restreinte de façon à pouvoir collecter les fèces des animaux en les séparant des urines. Les procédures 4 et 5 renforcent l'isolement des animaux puisque ceux-ci sont alors hébergés individuellement dans des enceintes fermées. La procédure 5 met enfin en oeuvre un jeûne alimentaire de moins de 24 heures.
Devenir
A l'issue des procédures 3, 5 et 6, les animaux réintègrent une structure d'élevage car toutes les rations sont élaborées de façon à satisfaire les besoins nutritionnels des animaux et en n'utilisant que des matières premières autorisées en alimentation animale pour les veaux.
Remplacement
Nous souhaitons mesurer les réponses digestives et métaboliques aux apports d'aliments liquides et d'aliments solides. Pour cela, nous avons besoin de mettre en place des expérimentations sur animaux dont l'objectif est d'obtenir des valeurs de digestibilité et de productions de chaleur, qui est l'un des éléments descriptifs de la réponse animale.
Réduction
Le nombre d'animaux a été estimé sur la base d'essais antérieurs qui utilisaient entre 4 et 5 animaux par lot afin d'obtenir des valeurs nutritionnelles mesurées avec un coefficient de variation inférieur à 1 %. Le projet se déroule en 2 étapes. Au cours de la première étape, nous allons évaluer 8 rations, ce qui représente un total de 40 animaux. Cet effectif sera doublé pour certaines procédures d'adaptation alimentaire, afin de disposer de l'effectif de 40 animaux au moment des mesures. La deuxième étape mobilise 10 animaux supplémentaires, ce qui correspond à l'effectif nécessaire d'après les essais précédemment menés.
Raffinement
La première étape du projet nécessite de placer les animaux dans des enceintes qui isole fortement les animaux. Les enceintes sont équipées de dispositifs audio permettant aux animaux de s'entendre. Lors de la deuxième étape, les cages dans lesquelles sont hébergées les animaux seront placées à proximité les unes des autres, de façon à limiter l'isolement des animaux. Tous les animaux réintègrent une structure d'élevage en fin de projet.
Choix des espèces
il s'agir de l'espèce-cible de l'étude. Les animaux seront d'un poids vif d'environ 150 kg (première étape) à 250 kg (deuxième étape) et correspondant à des animaux en croissance. Il s'agit du poids vif moyen d'élevage des veaux.
Effets de l’application topique de peptides sur la réparation épithéliale intestinale après inflammation chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une inflammation du côlon leur est provoquée chimiquement, puis elles reçoivent des peptides en gel par voie intrarectale sous anesthésie, avec coloscopie sous anesthésie et prélèvements sanguins par incision de la veine de la queue, pour tester si ces peptides favorisent la cicatrisation intestinale. Le porteur cite l'article R214-104 sur la "stricte nécessité" des procédures et affirme que les modèles sans animaux ne peuvent pas encore se substituer à la colite chimio-induite, tout en indiquant travailler sur des organoïdes intestinaux. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de rectocolite hémorragique restent au stade préclinique.
Objectifs
Ce projet préclinique a pour but d’évaluer les effets de peptides synthétiques (motifs répétés d'acides aminés capables de s'auto-assembler) sur la cicatrisation colique, nécessitant un protocole d’expérimentation animale induisant une inflammation colique. Il vise également à définir les modalités d’application locale de ces peptides avant une étude clinique. Les modèles animaux sont donc irremplaçables dans le but d’améliorer la prise en charge des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI)
Bénéfices attendus
Valider la pertinence de l'administration de peptides synthétiques sur la cicatrisation colique après inflammation intestinale.
Procédures
Une application intrarectale de peptides sous forme de gel sera réalisée sous anesthésie. Cette procédure dure 5 minutes par animal en raison de l'induction de l'anesthésie et 15 secondes pour l'application. Un examen coloscopique sera réalisé sur un tiers des animaux sous anesthésie (5 minutes par animal). La perméabilité intestinale sera mesurée sur un tiers des animaux: après gavage, un prélèvement de sang par incision de la veine latérale de la queue sera réalisé 4h plus tard.
Impact sur les animaux
Absence d'effet ou aggravation de la colite avec l'administration des peptides synthétiques.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour étudier les effets des peptides sur la réparation du côlon. Du sang ainsi que le foie seront également prélevés pour évaluer l’impact de l’inflammation et de la cicatrisation coliques au niveau systémique.
Remplacement
En conformité avec l’article R214-104 du code rural et de la pêche maritime, « les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information ». Le projet s’inscrit en effet dans le cadre d’études pré-cliniques visant à favoriser la cicatrisation muqueuse chez les patients atteints de rectocolite hémorragique. Les objectifs du projet ne peuvent donc être atteints sans recours à un animal modèle de l’Homme (modèle de colite chimio-induite). Il est nécessaire de travailler in vivo pour reproduire au mieux le modèle de colite, aucun modèle in vitro n’est encore possible dans ce contexte mais nous y travaillons (modèle d’organoïdes intestinaux).
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé à partir de la variabilité des paramètres étudiés,. Il s'agit du nombre miminal d'animaux utilisables pour pouvoir comparer les paramètres étudiés à l'aide de tests statistiques adéquats (n=10-12/groupe).
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des conditions favorables à leur bien être en cage collective (enrichissement: carré de cellulose pour faire un nid) ou individuelle (enrichissement: carré de cellulose pour faire un nid et nid en plastique).
Choix des espèces
L'induction de l'inflammation colique sera réalisée chez la souris C57BL/6, souche la plus communément utilisée et la plus facilement manipulable pour ce type de projet. Ce modèle de colite chimio-induite est couramment utilisé par les équipes qui s’intéressent à l’étiologie et aux traitements pharmacologiques et nutritionnels des MICI. Nous avons développé ce modèle chez la souris (et le rat) lors d’études précédentes et récemment dans l'EU, ce qui nous a permis de bien maitriser ce modèle et de caractériser sa cinétique en cage individuelle. Age jeune adulte : 6 semaines à la réception (22g), âge de référence utilisé lors de nos précédentes investigations. A cet âge adulte, les souris présentent une physiologie digestive mâture (absorption intestinale et intégrité épithéliale) et des systèmes intégrés de détoxification, immunologiques et de stress oxydatifs optimaux. Il s’agit par ailleurs d’un âge murin communément utilisé pour l’expérimentation animale permettant d’obtenir une reproductibilité des résultats et des comparaisons avec les données scientifiques disponibles.
Intérêt de l’inhibition de l’activité phosphatase de l’époxyde hydrolase soluble pour la prise en charge des maladies cardiovasculaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 168
360 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 160 d'entre eux. Une partie subit la ligature d'une artère du cœur, une autre l'ablation d'un rein, avant des examens d'IRM, pour tester si l'inhibition d'une enzyme protège des maladies cardiovasculaires. Le porteur indique que les animaux hypertendus risquent l'accident vasculaire cérébral et l'insuffisance cardiaque ou rénale. Il présente le projet comme validé par l'Inserm et financé par l'ANR, les animaux étant tués pour analyser leurs artères et prélever leurs organes.
Objectifs
Il s’agit d’un projet s’inscrivant dans le domaine de la recherche publique préclinique. L'objectif central du projet de recherche expérimentale est de répondre pour la fois à la question : l’inhibition de la sEH phosphatase peut-elle constituer une nouvelle approche thérapeutique pour la prévention et/ou le traitement des maladies cardiovasculaires ? Ce programme de recherche a été validé scientifiquement par l'Inserm (CSS4), ainsi que par des experts internationaux sollicités. Il sera financé par l’ANR.
Bénéfices attendus
Le but ultime de cette recherche est de pouvoir démontrer pour la première fois que la sEH phosphatase constitue une cible thérapeutique d’intérêt pour prévenir et/ou traiter les maladies cardiovasculaires et nous espérons que cette recherche permettra la mise en place d’une nouvelle classe de traitements.
Procédures
le but de cette étude est un modèle d'hypertension artérielle et d'insuffisance rénale. La procédure N°1 chirurgicale , concernant le modèle de ligature coronaire comprends un nombre de 66 souris et 84 rats La procédure N°2 chirurgicale , concernant le modèle de Néphrectomie comprends également un nombre de 66 souris et 84 rats. Les animaux restant ne subissent aucune chirurgie mais un traitement, concernant le diabete. Tous l'ensemble des animaux, c'est à dire 192 souris et 168 rats auront un IRM standart.
Impact sur les animaux
Concernant le groupe de la procédure N°1 sur l'Hypertension Artérielle, ces animaux seront hypertendus; il y a donc des riques d'AVC et les animaux vont développer une insufisance cardiaque, d'ou une surveillance et un contrôle particulier quotidien, cela n'engendre pas de réponse d'un point de vue comportemenatale. Les animaux de la procédure N°2, sur le modèle d'insufisance rénale, auront egalement un facteur risque d'AVC , ils peuvent aussi développer une insufisance cardiaque. cette pathologie n'engendre pas de signe comportementaux, la surveilance quotidienne est absolument indisprensable.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour l'étude de la fonction vasculaire del'artère mésentérique par artériographie et les prélèvements sanguins, ainsi que les différents organes qui serviront aux analyses anatomiques et moléculaires, seront prélevés.
Remplacement
Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées pour la bonne réussite de ce projet. En effet, ce projet se propose d’étudier les effets cardiovasculaires de l’inhibition d’une enzyme dans des conditions de physiopathologie intégrées, autrement dit, chez des rats et des souris avec une hypertension artérielle, une insuffisance rénale ou un diabète induits expérimentalement. L’utilisation de cellules ou de modèles expérimentaux ex vivo est par conséquent inadéquate pour répondre de façon pertinente aux questions posées dans le cadre de ce travail. Ainsi, les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
réduire le nombre d'animaux par l'utilisation de méthodes non invasives (IRM, échocardiographie) permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris et de rats nécessaire afin de détecter une différence de 15% (one way ANOVA et test de Tukey).
Raffinement
raffiner les modèles afin de réduire la variabilité entres animaux permettant de limiter le nombre d'animaux par groupe : utilisation de régimes alimentaires pour potentialiser le développement de l’atteinte rénale ou des complications cardiovasculaires. De plus, les animaux seront hébergés aux normes requises et un enrichissement (plaques de cellulose vierge et des maisons en carton) est mis en place. Enfin, une anesthésie et une analgésie adéquates seront mises en place pour chaque animal en fonction de chaque type de procédure. Si les animaux arrivent aux points limites, les animaux recevront une injection d’un euthanasiant.
Choix des espèces
Le choix du rat et de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire et sur la possibilité de recourir aux animaux transgéniques (rat KI pour la sEH phosphatase) pour approfondir les résultats de la recherche. Les opérations chirurgicales et les mises sous régime seront effectuées sur les souris entre 6 et 8 semaines de vie et sur les rats entre 10 à 12 semaines de vie. Les animaux seront immédiatement traités avec l’agent thérapeutique inhibiteur de la sEH phosphatase (SWE101 administré dans l’eau de boisson : 40 mg/L pour les modèles d’hypertension artérielle et de diabète ou anticorps administré par voie intrapéritonéale pour le modèle d’insuffisance rénale, la dose d’anticorps sera ajustée en fonction des données d’inhibition obtenues in vitro sur la sEH recombinante murine) . Concernant le modèle d’hypertension artérielle et le modèle d’insuffisance rénale, le recueil des urines puis les mesures invasives de la pression artérielle seront réalisées 10 semaines après l’opération, l’imagerie fonctionnelle in vivo 10 à 12 semaines après l’opération et la mise à mort 12 semaines après l’opération. Concernant le modèle de diabète, le recueil des urines puis les mesures invasives de la pression artérielle seront réalisées 14 semaines après le début du régime riche en graisses saturées, l’imagerie fonctionnelle in vivo 14 à 16 semaines après le début du régime et la mise à mort 16 semaines après le début du régime.
Immunothérapies et traitement de carcinomes hépatiques
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 560
1 820 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui atteint le grade sévère pour 1 480 d'entre eux. On leur implante par chirurgie un ou plusieurs nodules tumoraux, sous la peau ou dans le foie, avant de tester des traitements intra-artériels et des immunothérapies, pour reproduire un cancer du foie avancé avec métastase à distance. Le porteur reconnaît que les animaux peuvent développer des métastases, une ascite et des tumeurs assez volumineuses pour gêner leurs mouvements. La plupart sont tués pour l'analyse et 200 réutilisés dans d'autres procédures, la mise à mort intervenant sous anesthésie lorsque les points limites sont atteints.
Objectifs
Aucune solution clinique robuste ne permet de traiter efficacement un nodule hépatique et un autre nodule à distance. L'existence d'un effet abscopal a déjà été démontré pour une combinaison d'immunothérapie et d'ablation par radiofréquence, mais ce n'est pas le cas du traitement par chimioembolisation des nodules hépatiques, procédure très fréquemment effectuée chez les patients porteurs d'un carcinome hépatocellulaire ou de métastases hépatiques non résécables. De plus, les tolérances des immunothérapies et des combinaisons de traitements chez les patients sont aujourd'hui peu connues. Ces informations deviennent de plus en plus nécessaires en clinique pour adapter les traitements aux patients. L’objectif du projet consiste à évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique anti-tumorale en associant un traitement local par radiologie interventionelle à une immunothérapie. Le traitement par radiologie interventionnelle utilisé sera dans un premier temps la chimioembolisation (TACE), reconnue pour son efficacité clinique. L’immunothérapie anti-tumorale retenue consistera d’une part à stimuler le système immunitaire de l’animal par un adjuvant distribué en local, et d'autre part à améliorer l'efficacité anti-tumorale du système immunitaire par l'usage de Checkpoint inhibiteurs en systémique.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les bénéfices immunologiques apportés par un traitement par TACE, et comment ils peuvent être combinés de façon efficace avec des immunothérapies à base de Checkpoint Inhibiteurs et/ou d'adjuvants. De plus, le projet permettra d'apporter des éléments de réponse concernant les chronologies otpimales des traitements combinés, les doses, les éventuelles répétitions des traitements, qui sont des questions clés en clinique aujourd'hui dans toutes les combinaisons thérapeutiques. Enfin, le projet pourrait apporter une solution préclinique optimale pour le traitement d'un nodule principal et d'un nodule non ciblé, qui servirait de base à des potentiels essais chez l'Homme.
Procédures
Les animaux seront implantés d'un ou de plusieurs nodules tumoraux pouvant être sous-cutané ou intra-hépatique par chirurgie, pour mimer un nodule hépatique et une métastase à distance comme en clinique chez des patients avec des cancers avancés. Les traitements pourront se faire par voir intra-artérielle par chirurgie, comme le traitement par TACE administré chez l’Homme, ou par voie intra-tumorale, très utilisée pour les tumeurs cutanées notamment (mélanomes) chez l’Homme. Ces traitements pourront être combinés avec des immunothérapies par voie systémique (voie utilisée pour délivrer des immunothérapies aux patients porteurs d’un cancer avancé). Les tumeurs seront suivies régulièrement par imagerie ou par mesure au pied à coulisse. Des prélèvements de sang de petits volumes réguliers (décrits dans les recommandatations) peuvent être réalisés pour suivre certains marqueurs d’intérêt immunologiques notamment. Les procédures seront effectuées sous anesthésie, également sous analgésie pour les chirurgies.
Impact sur les animaux
Les animaux porteurs de tumeurs pourraient présenter des métastases, comme ce qui est observé en clinique. Le suivi par imagerie permet notamment de contrôler l’apparition de nouvelles tumeurs. Une production d’ascite, comme ce qui est observé en clinique dans certains cancers, peut aussi être observée. Les tumeurs sous-cutanées peuvent, lorsque leur volume devient important, gêner les mouvements, mais de façon très légère. Enfin, des effets secondaires après l’injection intra-tumorale ou à l’injection intra-artérielle peuvent survenir, de la même façon qu’en clinique (réaction inflammatoire locale). Ces procédures de traitement pourraient entrainer un ralentissement de la pousse des tumeurs, voire la diminution ou la disparition des tumeurs, effet souhaité par ces traitements combinés avec un traitement systémique par immunothérapie.
Devenir
En dehors des phases de mises au point, les animaux sont réveillés à l'issue de toutes les procédures. Les animaux seront suivis à leur réveil, plusieurs fois par semaine, pour évaluer leur état. En cas d'atteinte des points limites, une dernière procédure d'imagerie peut être effectuée sous anesthésie, sans réveil de l'animal par la suite.
Remplacement
Il s'agit ici d'améliorer des éléments de la pratique clinique, d'évaluer l'efficacité et la tolérance de nouvelles combinaisons de traitements anti-tumoraux. L’expérimentation animale n’est pas substituable pour la détermination des effets thérapeutiques de la réaction immune car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Ces études d’immunologie et d’immunothérapie anti tumorale sont uniquement réalisables chez l’animal immunocompétent.
Réduction
Les animaux qui ne présenteront pas de pousse tumorale pourront être réutilisé une seule fois à la mise au point de nouvelle techniques au sein du même projet. De plus, sous certaines conditions précises, les rats ne présentant pas de pousse tumorale intra-hépatique pourront faire l'objet d'une nouvelle tentative d'induction pour réduire le nombre d'animaux utilisés. Par ailleurs, les animaux donneurs de fragments tumoraux via des tumeurs sous-cutanées pourront, sous certaines conditions précises, être opérés pour une résection de leur tumeur sous-cutanée et être réutilisé au sein du même projet (pour des mises au point ou comme donneur à nouveau). Les animaux donneurs pourront être implantés sur les deux flancs pour optimiser le nombre d'animaux inductibles par donneur, et une tissuthèque sera mise en place pour tenter d'implanter des fragments conservés par congélation et réduire ainsi le nombre d'animaux donneurs.
Raffinement
Les animaux en étude seront suivis quotidiennement, avec une mesure fréquente à minima hebdomadaire de leurs tumeurs, voire plus si cela semble nécessaire, pour évaluer leur état clinique, les volumes tumoraux, surveiller d'éventuels signes de souffrance et pouvoir éventuellement traiter lorsque cela est possible. Le scoring sera fait selon une grille des points limites décidée dans le protocole expérimental avant le début des expériences. Les procédures d'implantation des tumeurs, d'imagerie et de traitement se feront sous anesthésie gazeuse avec,dès que cela est nécessaire, un traitement analgésique (pré-per-et post opératoire). Les animaux sont hébergés en groupes, dans des cages avec des enrichissements et sont habitués à la prise en main par l'expérimentateur.
Choix des espèces
La littérature renseigne l'utilisation du Rat et de la Souris pour l'induction de carcinomes hépatiques ou de métastases hépatiques de carcinomes colorectal. De plus, ce sont des modèles déjà testés pour le traitement des cancers par immunothérapies de carcinomes, et le traitement de tumeurs par radiologie interventionnelle. Le modèle Souris est particulièrement utilisé dans des études impliquant le système immunitaire. Ce sont des modèles qui permettent un screening rapide et suffisant pour tester des combinaisons de traitements. Ces espèces animales sont autorisées pour l'utilisation en laboratoire à des fins scientifiques. Les animaux seront des jeunes adultes sevrés, entre 5 et 16 semaines.
Rôle de la télomérase et de la maintenance des télomères dans le mélanome chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 380 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. La plupart développent un mélanome avant trois mois, d'autres reçoivent une injection intramusculaire de cellules tumorales, avec des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que ces tumeurs peuvent altérer durablement la mobilité, la forme du corps et la respiration des poissons. Il affirme que le vieillissement et le cancer sont des processus de "l'organisme entier" et retient le poisson zèbre pour la ressemblance de ses télomères avec ceux de l'humain.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre le rôle de la télomérase dans l'initiation et la progression du mélanome. La télomérase est réactivée dans 80 à 90 % des cellules cancéreuses, ce qui permet l'immortalisation des cellules et, par conséquent, l'échappement à la sénescence réplicative. En accord avec cette idée, des thérapies anti-télomérase font actuellement l'objet d'essais cliniques dans le traitement du cancer. La plupart des études in vivo ont été réalisées à l'aide de modèles murins, dans lesquels les télomères sont beaucoup plus longs que chez l'homme. Nous avons donc l'intention d'étudier l'effet de l'absence de télomérase dans le mélanome en utilisant un modèle de télomères semblable à celui de l'homme, le poisson zèbre. Objectifs spécifiques : 1- Évaluer l'impact de l'absence de télomérase sur l'incidence du mélanome. Notre objectif est de démontrer si l'absence de télomérase influence l'initiation du mélanome, la taille de la tumeur ou entraîne une régression de la tumeur à un stade ultérieur. Nous évaluerons également la taille des télomères, l'expression des gènes et la stabilité génomique. Enfin, nous évaluerons si l'activité de la télomérase est modulée par l'activation de son promoteur. 2- Chercher à savoir si la télomérase limite la malignité des mélanomes. Nous cherchons à évaluer si l'absence de télomérase limite le potentiel de malignité du mélanome. 3- Évaluer l'efficacité de la thérapie anti-télomérase dans le mélanome et les avantages des thérapies combinatoires qui agissent en synergie avec l'inhibition de la télomérase. Ici, notre objectif est d'évaluer l'efficacité de la thérapie anti-télomérase à différents stades de développement du mélanome (progression précoce et tardive). Nous voulons également évaluer l'effet des thérapies combinatoires qui agissent en synergie avec l'inhibition de la télomérase.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle de la télomérase et du maintien des télomères dans l'initiation et la progression du mélanome. Nous espérons découvrir si le manque de télomérase a un impact sur l'initiation du mélanome, la malignité, la taille de la tumeur ou même la régression de la tumeur à un stade ultérieur. De plus, nous espérons réaliser si la thérapie anti-télomérase est efficace dans le traitement du mélanome. La réactivation de la télomérase se produit dans 85 à 90 % des cancers, et elle a été décrite comme une étape fondamentale de la progression du cancer. C'est pourquoi des thérapies anti-télomérase font actuellement l'objet d'essais cliniques dans le traitement du cancer. Étant donné que la longueur des télomères du poisson zèbre est plus proche de celle de l'homme que d'autres modèles animaux, ce projet a le potentiel d'être directement traduit en essais cliniques chez l'homme. Il est important de noter que nous évaluerons l'efficacité de la thérapie anti-télomérase dans les tumeurs précoces et tardives. Ce dernier point est crucial pour comprendre si les thérapies anti-télomérase sont appropriées à tous les stades du mélanome. Nous combinerons également les thérapies anti-télomérase avec un médicament endommageant l'ADN et évaluerons leur effet synergique. En résumé, ce projet contribuera à une meilleure compréhension du rôle de la télomérase dans le mélanome, mais surtout, il apportera une contribution importante pour évaluer l'efficacité de la thérapie anti-télomérase dans le cancer.
Procédures
Les poissons de 2 procédures seront imagés en direct à différents moments. Dans la procédure 2, les poissons porteurs de mélanome seront imagés à l'âge de 4, 7 et 9 mois, tandis que dans la procédure 4, les poissons immunodéprimés seront imagés 1 et 2 mois après l'injection. Les individus seront anesthésiés avant d'être transférés dans une boîte de Pétri recouverte d'agarose à 1%. L'anesthésie est obtenue en immergeant le poisson dans une dose de Tricaine. Cette immersion sera effectuée pendant au moins 10 min et jusqu'à ce qu'aucun signe de réflexe ne soit détecté (toucher et pincement léger de la nageoire caudale). Les poissons seront ensuite imagés par une caméra et sous un stéréoscope à fluorescence. L'imagerie durera au maximum 5 minutes. Les poissons récupéreront ensuite dans des bassins séparés pendant 30 minutes avant d'être transférés dans les aquariums précédents. Nous ferons l'image de 102 poissons dans la procédure 2 et de 60 poissons dans la procédure 6. Dans la procédure 4, des poissons immunodéprimés seront injectés avec des cellules de mélanome pour évaluer la malignité des tumeurs. Les poissons seront anesthésiés avant d'être transférés sur une éponge humide. L'anesthésie est obtenue en immergeant les poissons dans une dose de Tricaine. Environ 500 000 cellules de mélanome seront injectées par voie intramusculaire avec une seringue Hamilton. Les poissons seront ensuite placés dans un réservoir séparé pendant 30 minutes avant d'être transférés dans les aquariums précédents. Nous injecterons 20 poissons immunodéprimés /groupe, au total nous utiliserons 960 poissons. Dans la procédure 5, les larves deux jours après la fécondation seront anesthésiées et ensuite micro-injectées avec environ 500 cellules de mélanome. Quatre groupes de traitement différents seront testés : un groupe témoin (juste le milieu embryonnaire) ; le groupe du médicament A, le groupe du médicament B et le groupe du médicament A + B. Le traitement durera 4 jours et l'expérience se terminera à 7 jours après la fécondation, où toutes les larves seront euthanasiées. Nous utiliserons 40 larves par groupe pour permettre de réaliser 2 analyses moléculaires différentes, au total nous utiliserons 2560 larves.
Impact sur les animaux
Nous utilisons un modèle de poisson zèbre atteint de mélanome. 90 % des poissons développent un mélanome avant l'âge de 3 mois. L'évaluation histopathologique a révélé une propagation maligne de mélanocytes atypiques sous le derme ainsi que dans le tissu conjonctif lâche entourant les fascicules musculaires du tronc et, occasionnellement, dans l'épiderme. On a également constaté que les cellules tumorales exprimant HRAS(V12G) se dispersaient dans les os, les muscles et la moelle épinière, mais qu'elles n'avaient pas envahi le péritoine ni formé de métastases viscérales. Ces tumeurs ont le potentiel d'affecter la mobilité, la forme du corps, le comportement respiratoire du poisson, ainsi que son appétit. Certains de ces effets sont permanents, comme la mobilité et la forme du corps, et d'autres peuvent être temporaires (moins de 24 heures), comme l'appétit. En ce qui concerne les greffes de tumeurs sur des poissons immunodéficients, le poisson hôte peut avoir quelques effets temporaires après l'injection. L'effet le plus courant est un saignement au niveau du site d'injection, qui ne dure généralement pas plus de 1 ou 2 minutes. En ce qui concerne les traitements médicamenteux que nous prévoyons d'effectuer sur des embryons de poisson zèbre, nous devrons évaluer la dose maximale tolérée du médicament, car les doses les plus élevées pourraient entraîner la mort des embryons. Les poissons sont surveillés trois fois par jour par le personnel de la pisciculture lors de l'alimentation, en plus des chercheurs responsables de la procédure. Si un phénotype anormal est observé chez l'un des poissons, une fiche d'évaluation du bien-être animal, spécifique à chaque procédure, est utilisée pour évaluer les signes de détresse et définir l'action à entreprendre au vu du score total.
Devenir
Les poissons de la procédure 1 doivent maintenir la ligne, nous sacrifierons les poissons à 6 mois ou avant s'ils atteignent une limite de points. Les poissons de la procédure 2 seront sacrifiés à la fin de l'expérience (9 mois) et utilisés dans la procédure 3 pour l'analyse post-mortem. Les poissons des procédures 3 à 6 seront sacrifiés à des points spécifiques pour des analyses post-mortem (par exemple histologie et analyse transcriptionnelle).
Remplacement
Les études in vitro ont apportés de nombreuses avancées sur la compréhension du vieillissement de la cellule et le rôle des raccourcissements des télomères dans ce phénomène. Cependant, les modèles in vitro ne permettent pas d’appréhender les questions du niveux de l'organisme. De plus, nous nous intéressons à l’étude du développement des pathologies associées à l'âge, qui est un processus au niveau de l'organisme entier, et nécessite donc l'utilisation d'animaux vivants. Nous devons utiliser un organisme modèle multicellulaire qui vieillit de la même manière que les humains, c’est à dire de manière dépendante de la taille des télomères. C’est pourquoi nous utilisons le modèle poisson.
Réduction
Nous générerons nos lignées expérimentales afin de pouvoir obtenir des animaux expérimentaux et des animaux témoins à partir du même croisement (procédures 2 et 3). Cette méthode permet non seulement de garantir une identité génétique maximale entre les animaux (en limitant le nombre de copies du transgène à une seule), mais aussi d'éviter d'avoir recours à des animaux supplémentaires comme témoins, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les expériences de xénogreffe (procédures 4 et 5), nous utiliserons des échantillons de tumeurs dérivés d'autres procédures comme source de mélanome, éliminant ainsi le besoin d'animaux supplémentaires porteurs de mélanome. Notre estimation du nombre d'individus est basée sur des expériences précédentes réalisées dans notre laboratoire et elle est étayée par une analyse statistique. Par exemple, nous nous attendons à ce que 30% des poissons présentant une régression du mélanome à 9 mois dans la procédure 2. Dans ce cas, nous avons effectué un test de Chi-deux, avec une puissance de 80% pour déterminer le minimum d'animaux requis.
Raffinement
Toutes les expériences susceptibles d'infliger de la douleur aux animaux seront réalisées sous anesthésie générale et pendant une courte durée (5 min maximum). Après la procédure, les poissons seront placés dans un bassin individuel et seront surveillés jusqu'à leur rétablissement complet. En outre, un contrôle de suivi sera effectué tous les trois jours par le personnel de l'animalerie et par les chercheurs. Une carte de pointage du bien-être animal adaptée à chaque procédure sera utilisée pour évaluer les signes de détresse. Certaines procédures qui nécessitent un suivi plus fréquent des individus et, en cas d'atteinte des seuils, ces poissons seront euthanasiés. Les cartes de pointage comprennent, en fonction de la procédure, l'évaluation des modes de nage, de la forme du corps, du comportement nutritionnel, du comportement respiratoire et des saignements/ulcères.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle de la télomérase et du raccourcissement des télomères dans le cancer. Par conséquent, nous devons utiliser un modèle multicellulaire qui, d'une part, récapitule l'hétérogénéité du cancer en termes de types de cellules et, d'autre part, présente des télomères similaires à ceux des humains. Le poisson zèbre pour le mélanome est largement étudié et il a été démontré qu'il comprend tous les principaux types cellulaires tels que les cellules de mélanome, les fibroblastes, les neutrophiles, les macrophages et les cellules immunitaires. De plus, le poisson zèbre possède des télomères similaires à ceux de l'homme, tant au niveau du complexe shelterin que de la taille des télomères. Nous considérons donc que le poisson zèbre est le modèle le plus approprié pour ce projet. Toutes nos expériences reposent sur l'initiation et la progression du mélanome dans notre modèle de poisson zèbre. Dans ce modèle, les poissons commencent à développer un mélanome dès la sixième semaine et pratiquement tous les individus auront un mélanome à la seizième semaine (4 mois). Dans la procédure 2, nous suivrons visuellement (par microscopie à lumière et à fluorescence) la progression du mélanome de 4 mois (progression précoce) à 9 mois (progression tardive) chez des animaux par ailleurs non perturbés. Pour comprendre l'effet de l'absence de télomérase dans le mélanome, les procédures 3 et 6 nécessiteront l'euthanasie des poissons à différents points dans le temps (4, 7 et 9 mois) dans une étude longitudinale. Afin d'étudier la capacité des cellules de mélanome mutantes de la télomérase à former de nouvelles tumeurs, dans les procédures 4 et 5, nous utiliserons les échantillons de tumeurs dérivés de la procédure 3 et transplanterons les cellules de mélanome dans des poissons adultes immunodéprimés (procédure 4). Dans la procédure 5, les cellules de mélanome seront allogreffées dans des larves de poisson zèbre 2 jours après la fécondation et nous suivrons l'impact des agents de chimiothérapie sur la progression de la tumeur.
Évaluation d’une immunothérapie peptidique ciblant CD38 chez le rat R-DMDdel52, modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteurs d'une dystrophie musculaire de Duchenne, ils reçoivent jusqu'à 510 injections sous-cutanées et des prélèvements de sang au sinus rétro-orbitaire, pour tester une immunothérapie peptidique. Le porteur décrit une maladie évolutive, avec perte de masse musculaire, faiblesse et défaillance cardiorespiratoire conduisant à une "euthanasie compassionnelle" entre six et treize mois. Il annonce, en cas de succès, un passage aux chiens dystrophiques puis aux enfants, et présente le rat comme un modèle "plus fidèle" que la souris.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie rare, rapidement invalidante, causée par des mutations dans le gène de la dystrophine (porté par le chromosome X). La dystrophine est une proteine clé dans le fonctionement et la survie des cellules musculaires. Le déficit en dystrophine induit donc une perte progressive de force dans les muscles, menant à la perte de la marche à un âge médian de 10 ans. L'atteinte des muscles de la ventilation et du muscle cardiaque produit une insuffisance cardiorespiratoire irrémédiablement fatale à l'âge médian de 20 ans. Il n'existe à ce jour aucune solution de guérison. Cependant, le traitement par les glucocorticoïdes, anti-inflammatoires puissants, largement répandu chez les enfants, permet de retarder significativement la perte de la marche et le décès d'environ 2 à 8 ans, mais avec le désavantage de provoquer parfois des effets indésirables qui dégradent la qualité de vie des patients. Depuis 5 ans, on assiste à une accélération de propositions de solutions therapeutiques (thérapies géniques ou molecules pharmacologiques) et on dénombre une cinquantaine d'essais cliniques en cours. Les mutations aboutissent à l'absence de dystrophine dans les cellules musculaires (en particulier cardiaque). Cette absence aboutit à une fragilité de ces cellules, ce qui se traduit tôt ou tard par une rupture de leur membranes, soumises aux forces latérales lors des cycles de contraction/relâchement. Il s'ensuit une mort des fibres musculaires à l'origine de la perte de force musculaire et une série de mécanismes secondaires délétères tels que l'inflammation chronique et la fibrose. Cette combinaison empêche les cellules souches musculaires de réparer durablement le muscle qui entre alors en sénescence (arrêt des cycles cellulaires qui aboutit à la mort). Dans ce contexte, notre objectif scientifique est de proposer une alternative aux traitements existants en apportant la preuve de principe préclinique de l'efficacité d'une immunothérapie innovante. Nous posons l'hypothèse que notre immunothérapie ciblant une protéine clé de l'inflammation est capable de ralentir la progression de la DMD, en luttant pour la première fois contre l'ensemble des mécanismes néfastes induits de sorte que les cellules souches du muscle échapperont à la sénescence précoce et poursuivront ainsi plus durablement leur contribution réparatrice.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet vise à obtenir des données robustes démontrant le bénéfice de l'immunothérapie innovante ciblant une proteine clé de l'inflammation sur le modèle original et pertinent du rat DMD développé au laboratoire qui reproduit plus fidèlement la maladie que les modeles classiques de souris. Le traitement testé permet de bénéficier simultanément de propriétés anti-sénescentes et anti-inflammatoires, sans les effets indésirables des corticoïdes actuellement utilisés dans le traitement de la DMD pour contrer l’inflammation. Le traitement testé devrait de surcroît améliorer la contribution des cellules souches à la réparation musculaire. À moyen terme et en cas de succès de cette immunotherapie sur le rat DMD, un essai sera ultérieurement programmé sur un nombre restreint de chiens DMD. Notre équipe dispose d'une expertise, d'une compétence et d'une base précieuse de données sur ces chiens, acquises antérieurement lors de l'évaluation d'autres stratégies thérapeutiques. Nous pourrons alors établir le potentiel de l'immunothérapie sur ce second modèle translationnel, hautement prédictif du succès d'un essai clinique chez l'humain. En cas de bénéfice évident chez les rats et les chiens, nous aurons contribué à produire des données précliniques robustes qui seront un argument fort pour accélérer le financement des essais cliniques chez les enfants atteints de DMD. À long terme, le bénéfice attendu est une amélioration de la qualité et de l'espérance de vie des enfants atteints de DMD. Notre immunothérapie est conçue en particulier pour remplacer les glucocorticoïdes en récapitulant voire en augmentant leurs effets bénéfiques, tout en annulant leurs effets secondaires.
Procédures
Les animaux reçoivent le candidat médicament par une injection quotidienne sous cutanée. Cela correspond à un nombre d'injections compris entre 21 (procédures 1, 2 et 3) et 510 (procédures 4 et 5). Les animaux seront prélevés au sinus rétro-orbitaire, 4 fois en un mois ou 7 fois en 17 mois selon les procédures. Chaque prélèvement dure moins de 2 minutes, réalisé par une personne très expérimentée. Avant ce prélèvement, l'animal est anesthésié par voie générale et locale et reçoit en plus une analgésie. L'évaluaton fonctionnelle privilégie les méthodes non invasives. Seule la mesure de force nécessite une anesthésie injectable, réalisée 1 fois pour les animaux des procédures 1 à 3 et 3 fois en 6 mois pour les procédures 4 et 5. Il n'y a pas de chirurgie prévue.
Impact sur les animaux
Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur à la suite de l'injection du peptide NC-P7, y compris pour les doses élevées. L'immunothérapie par peptide présente l'intérêt majeur de ne pas produire de toxicité. En revanche, les rats R-DMDdel52 développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle à partir de l'âge de 4 semaines. La perte de masse musculaire cause une faiblesse musculaire et une difficulté croissante à se mouvoir. Le fonctionnement du cœur et du diaphragme, principal acteur de la ventilation de repos, est également progressivement altéré, ce qui conduit à une déficience cardiorespiratoire progressive. Combinées, ces défaillances conduisent à la nécessité d'une euthanasie compassionnelle entre 6 et 13 mois d'âge. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. Les procédures 1, 2 et 3 de ce projet incluent des animaux jeunes chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont faibles et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables. Les procédures 4 et 5 de ce projet incluent des animaux au-delà de 6 mois. Nous porterons une attention particulière à ces animaux.
Devenir
À l'issue des cinq procédures, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer à l'échelle microscopique l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés (muscles des membres, diaphragme, cœur). Il est également essentiel de prélever les organes sentinelles d'une éventuelle toxicité (reins, foie, rate, poumons) et de les soumettre à une expertise anatomopathologique. La méthode précise de mise à mort des animaux est décrite dans le chapitre 3.3.3. Il est attendu que l'immunothérapie testée améliorera grandement l'état de santé des animaux et retardera la survenue des signes cliniques les plus sévères. Mais administrée seule dans un premier temps, l'immunothérapie n'empêchera pas totalement la nécrose des fibres musculaires. Les animaux vieillissants nécessiteront donc toujours une surveillance rapprochée et des compétences médicales pour décider du niveau de l'atteinte générale de l'animal et du recours à une euthanasie compassionnelle, par exemple en cas de décompensation cardiorespiratoire. Dans ce cas, l'euthanasie interviendra en anticipation de la mise à mort programmée des rats de l'étude. Les organes seront néanmoins récupérés sur les animaux euthanasiés, de sorte que tous les animaux, même morts précocement au cours de la procédure, pourront être inclus dans les analyses histologiques et anatomopathologiques.
Remplacement
L'expression de la cible CD38 dans le système immunitaire (monocytes, macrophages, lymphocytes T et B), le muscle, le système nerveux central, le tissu conjonctif a déjà été confirmée par de nombreuses expériences réalisées sur cellules, in vitro. Le ciblage de CD38 dans les maladies inflammatoires, cardiovasculaires, neurodégénératives, immunitaires ainsi que dans la lutte contre les effets indésirables du vieillissement a également été largement documenté. Les effets bénéfiques de la modulation spécifique de CD38 par l'immunothérapie brevetée par ENCEFA via le NAD, le cADPR et le NAADP boosting sur la réduction de l'inflammation (NAD), l'accroissement de la contractilité du cœur et des muscles et de leur métabolisme (cADPR) et la stimulation du flux autophagique (NAADP) ont également été mis en évidence sur de nombreux modèles cellulaires, puis sur des modèles de souris. Sur ces bases mécanistiques très robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à deux questions qui ne peuvent être obtenues que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : quelle dose de NC-P7 faut-il injecter pour obtenir un engagement optimal de la cible CD38 dans le muscle (PK-PD) et quels effets bénéfiques sur l'éventail de mécanismes pathogènes ouvert par le processus dystrophique peut-on attendre d'un traitement précoce ou tardif, court ou long sur un modèle animal de dystrophie musculaire de Duchenne.
Réduction
Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats R-DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 5 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Le problème majeur auquel nous avons été confrontés est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Malgré nos soins, nous avons déploré l'absence de réveil chez quelques animaux. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique (essentiellement), on puisse traiter les données de 5 animaux arrivés au terme de la procédure. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et R-DMD traités avec l'excipient, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux et en cas de mort de l'un d'eux, de ne pas le remplacer. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux. Nous avons pu réduire ce nombre à 4 pour la procédure 1 car l’intensité de la variation d'un biomarqueur tel que la créatine kinase qui présage de l’efficacité du traitement (et qui sera privilégié dans le cas de la procédure 1) est beaucoup plus forte.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Depuis janvier 2021, la température dans nos nouveaux locaux a été très bien maintenue dans la fenêtre 22 ± 2 °C, sauf lors de périodes courtes de réglages ou de pannes corrigées dans un délai court. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se lever. Les cages XL ont une surface de 2080 cm2 et une hauteur de 23 cm sur une moitié de la surface, soit 5 cm de plus que la réglementation. Nous sommes le premier laboratoire académique à utiliser ces cages. L'observation des animaux nous conforte dans la pertinence de ce choix : les animaux profitent pleinement de la hauteur pour se lever fréquemment sur leurs pattes arrière. Sur le plan fonctionnel, cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12 h par jour (5 h-17 h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début (3-4 semaines, animaux de 100 g ; nous préférons rester sous le seuil réglementaire de 10 pour des raisons de confort des animaux). Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g (animaux WT au-delà de 5 mois, les R-DMD non traités n'atteignent jamais cette masse corporelle). L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. À tour de rôle, les groupes font également des séjours de quelques heures dans une grande cage de type "cage à furet" (Savic suite royale 95 double®). Cette cage de 6000 cm2 (le triple de leur cage habituelle) mesure 159 cm de hauteur. Elle est organisée en 3 niveaux, les deux plus haut accessibles via des échelles. Nous avons constaté que les rats s'y plaisent beaucoup et pratiquent une intense exploration du volume selon leurs capacités. Nous les filmons et mettons actuellement au point une méthode de quantification de ces mouvements spontanés, réduisant ainsi à terme la nécessité de les contraindre à des exercices imposés. Une fois validée, cette méthode permettra de réduire le nombre de tests fonctionnels, réservés aux mesures de force ou d'endurance par exemple.
Choix des espèces
Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat R-DMDdel52 mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris Mdx, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle canin GRMD. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Comme indiqué ci-dessus nous utiliserons : 1) des jeunes animaux sevrés reçus dans notre EU à l'âge de 3 semaines et après la semaine d'acclimatation, inclus dans nos cohortes d'étude à partir de 4 semaines pour les Procédures 1, 2 et 4 et à partir de 5 mois d'âge pour les Procédures 3 et 5. Les animaux âgés de 4 semaines sont choisis parce qu'ils correspondent au stade post-sevrage le plus précoce pour initier un traitement précoce dans la phase asymptomatique de la maladie. Les animaux âgés de 5 mois expriment déjà les signes cliniques de la maladie et sans traitement, devront être euthanasiés dans les 2 à 8 mois suivants. En cas d'efficacité du traitement durable chez ces animaux, il est attendu qu'ils récupèrent en partie de la maladie et le cas échéant, qu'ils survivent au-delà de l'âge de l'euthanasie habituel pour le groupe des rats DMD non traités (6 à 13 mois). Une réussite de ce traitement durable augurera d'une possibilité de proposer des essais cliniques avec cette immunothérapie.
Effet du stress prénatal sur la sensibilité viscérale et la tumorigenèse intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des femelles gestantes sont soumises à une contention répétée sous lumière vive, et leur descendance subit une distension colorectale et une colite chimique provoquant perte de poids, diarrhée et sang dans les fèces. Le porteur indique que le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée, mais que la colite chronique entraîne ces signes. Il affirme que la douleur et la tumorigenèse induites par le stress sont des réactions de "l'organisme entier" impossibles à reproduire in vitro, rendant l'animal "incontournable".
Objectifs
Etudier l'effet du stress prénatal sur la sensibilité viscérale ainsi que sur la tomorigénèse au niveau intestinal
Bénéfices attendus
Les méthodes alternatives permettant une évaluation de la sensibilité viscérale de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. De plus, l'implication du stress entrainant une augmentation de la douleur ainsi que la tumorigenèse intestinale sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossibles à reproduire in vitro dans leur intégralité. Ce projet permettra de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales et de mieux comprendre la tumorigénèse intestinale.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à 4 procédures: Les femelles gestantes seront soumises à un stress (du 13ème au 18ème jour de gestation, les souris sont placées dans un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour). Les souris issues de cette gestation ainsi que des souris contrôles (ayant subi directement le stress) seront soumises à la distension colorectale à 8 semaines. Les souris issues de la gestation seront soumises à un modèle d'inflammation de l'intestion (colite au DSS) et auront un suivi endoscopique mensuel. La perméabilité intestinale sera évaluée après gavage au FITC dextran et prélèvement de sang.
Impact sur les animaux
Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée. En revanche le protocole de colite chronique entraine une perte de poids, ainsi que l'apparition de diarhée et de sang dans les fécès caractéristiques de ce modèle.
Devenir
A l'issue de la procédure 1 tous les animaux de génération F1 seront gardés en vie et utilisés pour les procédures suivantes. Les procédures 4 et 5 seront réalisées au cours des procédures 2 et 3. Le fait d'utiliser un même animal pour différentes procédures permet de réduire le nombre d'animaux. Les animaux de la procédure 2 seront mis à mort à l'issue de la procédure. Les animaux de la procédure 3 seront mis à mort à l'issue de la procédure. En effet, à l'issue de ces procédures nous réaliserons des prélèvements de tissus post mortem (sang et organes).
Remplacement
Les méthodes alternatives permettant une évaluation du statut douloureux de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales. De plus, la douleur et la tumorigénèse induites par le stress sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossibles à reproduire in vitro dans leur intégralité.
Réduction
Tout au long du projet, les animaux seront suivis régulièrement au cours du temps (au minimum 1 fois par semaine) par des techniques non invasives comme le suivi du poids, la consistance des fèces et présence de sang dans les fèces évaluée par le test HémoccultbII® et de de façon plus spécifique par l'observation grâce à un endoscope pour la tumorogénèse. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude, permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.
Raffinement
De plus, afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, dans un premier temps, des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Selon la durée de l’étude, un deuxième enrichissement pourra être introduit dans l’environnement, tel que des aspen Brick, des tunnels en polycarbonate ou des igloos. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Pour toutes les procédures nécessitant de la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et surveillés jusqu'à leur réveil, un suivi et une observation post-opératoire sera mise en place.
Choix des espèces
La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons également de souris déficientes pour l'expression de certains gènes cibles que nous utiliserons dans ce projet. Les méres seront stressées du 13 au 18 éme jour de gestation. C'est la période décrite dans la littérature pour ce modèle. Ensuite les souris F1 utilisées seront âgées d’au moins 6 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures. De plus, c'est l'âge utilisé classiquement dans la litterature pour ces modèles.
Recherche de la dose thérapeutique minimale et maximale des nanoparticules siRNA PMP22-SQ capable d’induire une rémission chez la souris atteinte de la maladie de Charcot-Marie-Tooth 1A chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de nanoparticules siRNA pour la maladie de Charcot-Marie-Tooth, passent des tests locomoteurs et une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie, avant une mise à mort pour prélèvement de sang et d'organes. Le porteur indique que les études de toxicité aiguë et chronique conduiront à des doses plus élevées, les souris développant alors des effets secondaires étant euthanasiées. Il décrit ce recours à la souris comme une "obligation", seuls les rongeurs pouvant selon lui servir à mettre au point le traitement, avant un passage annoncé aux primates non-humains.
Objectifs
A l’heure actuelle, la neuropathie périphérique héréditaire sensitivomotrice Charcot Marie Tooth 1A (CMT1A) ne bénéficie d’aucun traitement curatif. Le but de notre projet est d’introduire une nouvelle nanomédecine pour la CMT-1A. Nous avons développé une thérapie ciblée. Cependant, avant de passer aux études précliniques réglementaires, il faudra établir la dose minimale efficace et la dose maximale tolérée capable d'induire une réponse à long terme de notre traitement au niveau comportemental, tissulaire et cellulaire spécifiquement dans les cellules de Schwann. Cette étude sera effectuée sur deux modèles murins.
Bénéfices attendus
Ce projet est d'une importance primordiale pour les patients atteints de la pathologie CMT-1A. Cette neuropathie invalidante atteint 1/5000 personnes ce qui la classe à la limite des pathologies rares. Depuis la découverte de la CMT au 19ème siècle aucun médicament n'a été mis sur le marché pour soulager ou guérir les patients. Les résultats que nous avons déjà obtenus sont brevetés et représentent un espoir pour les patients. Dans le cas de succès des études énoncées, nous pourrons passer aux primates non humains pour valider les résultats.
Procédures
L'Injection se fera une seule fois, elle dure quelques secondes et sera réalisée sous anesthésie brève à l’isofurane. Pour tester l'efficacité du traitement, les animaux seront soumis avant tout traitement et à la fin du traitement à trois tests locomoteurs. Chaque test dure moins d'une minute et n’engendre aucun désagrément pour l’animal. La vitesse de conduction neuronale sera réalisée avant et après traitement sous anesthésie gazeuse. L'enregistement dure moins de 30 secondes.
Impact sur les animaux
A l'heure actuelle et en se basant sur nos expériences précédentes aucun effet indésirable a été souligné sur les animaux. Cependant, les études de toxicité aigues et chroniques nous amènerons à utiliser des doses supérieures. En cas d'observation d'effets secondaires (perte de poids, douleurs, stress, comportement anormal) les souris concernées seront euthanasiées et nous procéderons à une analyse histologique des organes pour comprendre la cause des effets secondaires observés.
Devenir
Toutes les souris (1080 souris) seront mise à mort pour les prélèvements de sang et d'organes.
Remplacement
Nous avons préalablement effectué des études sur des cellules de Schwann immortalisées. De plus, Les modèles de culture cellulaire ne peuvent reproduire avec fidélité et précision la complexité du système nerveux périphérique qui représentent les bases de nos études. Cependant, pour une étude à visée thérapeutique, seuls les modèles de rongeurs peuvent nous aider à mettre au point un traitement. De ce fait, nous sommes sous l'obligation d'avoir recours à un modèle murin transgénique pour pouvoir mener à terme nos travaux de recherche.
Réduction
Le nombre minimal d’animaux par lot a été prévu de façon à éviter tout double emploi injustifié. Un minimum de 5 animaux par temps et par groupe est nécessaire pour atteindre la puissance statistique nécessaire.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale et des points-limites sont établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. De plus, les animaux seront hébergés dans des conditions standards avec des enrichissement à leur disposition. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bienêtre des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites adaptés) et des soins adaptés. Du gel d'hydratation et des croquettes seront mis à disposition des souris au fond de la cage pour assurer un accès à volonté à la nourriture et à la boisson dès l’apparition des troubles locomoteurs.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères au système métabolique et physiologique suffisamment proche de l’Homme pour servir à l’évaluation de l’activité physiologique d’un médicament. Les expériences seront uniquement effectuées chez des souris adultes âgées de 2 mois. A cet âge, la forte myélinisation juvénile est terminée. De plus, les techniques d’analyse mis à notre disposition pour évaluer l’efficacité du traitement ciblé est très bien adapté chez la souris.
Essais d’efficacité anti-tumorale chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 1337
1 679 rongeurs, 1 337 rats et 342 souris, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, 835 relevant de la gravité la plus élevée. Une tumeur leur est greffée puis un médicament candidat leur est administré, avant des prélèvements de sang et d'organes et la mise à mort. Le porteur présente ces essais comme un moyen d'accélérer le développement de traitements anticancéreux plus efficaces chez l'humain. Il affirme que la toxicité et l'efficacité antitumorale ne peuvent être évaluées que sur un mammifère, malgré des tests cellulaires préalables.
Objectifs
Evaluer la dose tolérée maximale, la pharmacocinétique et l’efficacité tumorale de traitements anticancéreux dans différents modèles animaux.
Bénéfices attendus
Notre projet s’inscrit dans la continué de différents projets de recherche dans notre laboratoire et permettra d’accélérer le développement des médicaments candidats contre le cancer plus efficace chez l’homme.
Procédures
Procédures : Les animaux vont être d’abord subi une période d’acclimatation. L’induction de cancers est réalisée par l’inoculation des cellules tumorales. Lorsque la taille des tumeurs est visible par l’œil nu (environ 70-100 mm3), les souris vont être traités par le médicaments candidats. L’efficacité est évalué en comparant la taille des tumeurs chez la souris traitée versus la souris contrôle. Également, nous allons prélever les échantillons sanguins afin d’étudier les biomarqueur et les organes pour les analyses histologiques. En moyenne, une expérience comprend quatre groupes expérimentaux (1 contrôle et 3 doses), avec 8-12 animaux par groupe. La durée d’une expérience est généralement de 5-6 semaines.
Impact sur les animaux
Suite aux protocoles expérimentaux et aux anesthésies, une perte de poids peut être observée.
Devenir
A l'issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de procéder à des prélèvements de sang et d'organe.
Remplacement
Les produits anti-tumoraux ont fait l’objet d’évaluations d’efficacité sur des lignées cellulaires tumorales avant les essais sur animaux décrits dans ce projet. Toutefois, l’évaluation du rapport entre la dose toxique et la dose efficace sur des tumeurs nécessite le recours à des organismes modèles de l’Homme. En effet l’efficacité antitumorale est liée à la disponibilité de la molécule dans la tumeur solide, d’une part et, d’autre part, la toxicité systématiquement élevée des produits anticancéreux peut affecter des types cellulaires variés et ne peut valablement être étudiée que sur un mammifère.
Réduction
Tout au long de nos expériences in vivo, nous allons strictement respecter les règles de 3R (Réduire, Raffiner et remplacer). Dans certain cas, l’utilisation des modèles cellulaires in vitro (par exemple, le test de prolifération) va permettre de réduire le nombre d’animaux en amont. D’autre part, nous allons utiliser les logiciels de calcule de puissance (power.t.test) pour déterminer exactement le nombre d’animaux nécessaire dans chaque groupe expérimental afin de respecter à la fois les règles de 3R et de respecter l’exigence statistique
Raffinement
Afin de raffiner nos procédures et limiter le stress et la souffrance chez les animaux, nous utiliserons des protocoles précis d'anesthésie et de prise en charge de la douleur par l'injection d'analgésie. Nous respecterons les points limites établis par la surveillance quotidienne des animaux et le suivi de leur état via une fiche de scoring. Leur environnement et leur condition d'hébergement sont aussi quotidiennement contrôlés, l'enrichissement est présent et adéquat au vue de l'espéce (batonnet de coton, sizzle ball, demi dôme de cellulose). DU diet gel pourra aussi être quotidiennement mis dans les cages si une perte de poids était observée.
Choix des espèces
Le choix des espèces animales est déterminé (i) par la disponibilité de lignées cellulaires tumorales d’intérêt dans l’espèce considérée, (ii) par l’existence de lignées d’animaux immunodéficients pouvant être maintenues dans les conditions du laboratoire et tolérantes vis à vis de la greffe de lignées cellulaires tumorales humaines susceptibles d’induire la formation de tumeurs et (iii) par la possibilité de pratiquer dans cette espèce les interventions chirurgicales nécessaires à la greffe tumorale et les prélèvements sanguins en volume suffisant pour le dosage des principes actifs administrés. Nous allons utiliser les animaux de 5 - 6 semaines dont la maturité sexuelle a été atteinte. Ces animaux « adultes » permettent d’éviter les perturbations physiologiques lors de la montée hormonale pendant la puberté.
Dérégulations Précoces pour Expliquer la Prédisposition aux Cancers dans le Syndrome de Li-Fraumeni
- Recherche fondamentale
- Oncologie
15 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Porteuses de mutations du gène TP53 qui prédisposent aux cancers, elles ne subissent pas d'intervention mais sont suivies puis tuées avant six mois pour analyse post-mortem de leurs organes, toute suspicion de tumeur entraînant une mise à mort anticipée. Le porteur étudie le syndrome de Li-Fraumeni et vise des biomarqueurs ou des cibles thérapeutiques transposables en clinique. Il affirme avoir d'abord travaillé sur des modèles cellulaires mais juge le modèle murin "irremplaçable" pour analyser plusieurs organes.
Objectifs
Le syndrome de Li-Fraumeni (LFS) est une maladie autosomale dominante de prédisposition aux cancers multiples dès le plus jeune âge, portée par des mutations germinales du gène tumeur suppresseur TP53. La prévalence des mutations de TP53 dans la population générale est estimée à 1/5000. Nos recherches utilisant des lignées de fibroblastes (non cancéreuses) de patients atteint de LFS, ont déterminé que les mutations de TP53 engendrent des défauts transcriptionnels et métaboliques, qui pourraient être à l'origine de la prédisposition aux cancers. Nous souhaitons maintenant aller plus loin et transposer nos résultats dans des contextes physiologiques, afin de cartographier les dérégulations transcriptionnelles et métaboliques qui ont lieu dans de nombreux organes murins, dont ceux qui sont susceptibles au développement de cancers.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra, grâce aux modèles murins, de mieux caractériser les perturbations moléculaires qui prédisposent à l'apparition de cancers dans le syndrome de Li-Fraumeni. Les perspectives de ce travail sont de transposer nos découvertes en clinique pour une utilisation de type biomarqueur ou cible thérapeutique.
Procédures
Nous ne prévoyons pas d'interventions sur nos animaux pour ce projet.
Impact sur les animaux
Les lignées murines du LFS (R270H et R172H) présentent une médiane de survie de 16 mois, et peuvent développer différents cancers au cours de leur vie. L’âge auquel peuvent apparaître les cancers n'est pas bien documenté. Notre projet vise à étudier des souris de la colonie à un âge inférieur à 6 mois, afin de limiter au maximum l'apparition de cancers et des douleurs associées. Un suivi strict des souris sera mis en place (voir points limites) et toute suspicion de développement rapide de tumeurs entraînera l'euthanasie de l'animal. Une analyse rétrospective de ces 2 modèles murins sera menée afin de raffiner le modèle et d'étendre les connaissances concernant l'âge auquel les cancers se développent dans différents organes.
Devenir
Tous les animaux sont sacrifiés à la fin de la procédure pour analyse post-mortem (récolte d'organe, histologie et analyses moléculaires).
Remplacement
REMPLACEMENT : nous avons réalisé en amont les expériences sur des modèles cellulaires pour éviter d'utiliser l'animal, mais à ce stade de nos recherches nous ne pouvons pas nous en passer car aucun moyen ne nous permet de remplacer ce modèle murin pour analyser les différents organes et la physiologie des individus porteurs du LFS.
Réduction
REDUCTION : Nous avons réalisé un design d'élevage et d'expérimentation qui utilise juste le bon nombre de souris, et nous plafonnons le nombre d'animaux grâce à la multiplication des tests/analyses sur un seul animal.
Raffinement
RAFFINEMENT : Nous tenons compte des meilleures conditions d'hébergement pour nos modèles murins et nous veillerons au bien-être animal de nos souris. Pour se faire, nous utilisons des points limites spécifiques et des critères d'arrêt de souffrance.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’homme, notamment dans le cadre d’études visant à comprendre le développement de cancers, avant d’entreprendre des études cliniques chez l’humain. De plus, la majeure partie des études expérimentales sur l'étude du LFS utilisent les modèles murins, ce qui permettra une comparaison et confrontation des résultats obtenus avec la littérature. Les modèles d'études murins de LFS R270H et R172H sont admis par la communauté scientifique et sont disponibles chez Jax. Leur phénotype a été initialement décrit dans Mutant p53 Gain of Function in Two Mouse Models of Li-Fraumeni Syndrome (Olive et al, Cell, 2004). Ces modèles de souris ont une faible mortalité dans les 10 premiers mois de la vie, ainsi qu'une faible pénétrance de cancers. Le but de notre étude étant d'étudier les tissus sains, avant qu'ils ne développent de cancers, nous n'excéderons pas un âge de 6 mois pour l'étude de ces souris. Les animaux seront sacrifiés à 1 mois, 3 mois et 6 mois. En effet, nous souhaitons étudier différents organes sains, chez des animaux qui n'ont pas encore développés de tumeurs, afin de mesurer les effets délétères de la mutation germinale de TP53, qui pourraient prédisposer au développement de cancers au cours de la vie.