Procédures sévères

496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après la pose d'une sonde thermique, un choc septique leur est provoqué par injection de contenu caecal ou par ligature et perforation du caecum, puis elles subissent des prélèvements sanguins quotidiens et des échographies avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur décrit une forte perte de poids, des diarrhées et une prostration, et pose l'hypothèse que la fièvre serait bénéfique. Il affirme que le remplacement total par la culture cellulaire "n'est pas possible à ce jour".

Objectifs

Le choc septique est le dysfonctionnement des organes à la suited'une infection, impliquant une atteinte des vaisseaux sanguins et un changement de la température corporelle. Malgré les recherches et les travaux publiés ces dernières années, le rôle de la température sur ce dysfonctionnement est encore mal connu. Notre hypothèse est que la fièvre est bénéfique chez des souris atteintes d'infections. Dans ce projet, nous souhaitons contrôler la température pour étudier finement la dysfonction des organes lors d'un choc septique chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous permettre de mieux comprendre le rôle que joue la température dans l'évolution du choc septique, et pourrait aider les cliniciens à mieux prendre en charge la température chez les patients en choc septique.

Procédures

Les souris seront implantées avec des sondes thermiques en sous-cutanée sous anesthésie (2 minutes par souris). Un modèle de septicémie sera induit chez ces souris au niveau du péritoine, soit par injection de contenu caecal dans le péritoine (simple injection péritonéale), soit par ligature et perforation du caecum par chirurgie (3 minutes par souris). Puis les souirs seront placées sous surveillance. Un prélèvement sanguin quotidien sera réalisé durant les 48 premières heures après une courte anesthésie gazeuse, afin de suivre les paramètres sanguins au cours du temps. Les souris subiront une échographie cardiaque (5 minutes par souris et temps de transport par cage de 10 minutes) avant la chirurgie et 7 et 28 jours post chirurgie. Les souris subiront une échographie cardiaque avant la chirurgie et 7 et 28 jours post chirurgie. Les souris seront euthanasiées par excès d'anesthésie gazeuse lors de la fin de l'expérience, et les organes seront prélevés.

Impact sur les animaux

Les deux modèles sont associés à un un changement important de la température corporelle des souris, à une perte de poids, à des diarrhées possibles, à une prostration et à une activité sociale fortement alterée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés « afin de prélever les organes et le sang nécessaires pour l'étude que nous menons

Remplacement

Afin de tester les mécanismes moléculaires, des expériences in vitro seront menées indépendamment. Néanmoins, le remplacement total par la culture cellulaire n'est pas possible à ce jour car les expériences in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des intéractions moléculaires et physiologiques qui ont lieu dans un organisme comme l'homme ou la souris. Nous utilisons les modèles de péritonite afin de nous rapprocher au plus près des causes du choc septique chez l'homme, qui représentent la 1ere cause de mortalité dans le monde. A cet égard, aucune étude expérimentale chez l'animal n'a permis de contrôler finement la température corporelle dans un modèle de sepsis.

Réduction

Pour minimiser le nombre d'animaux, nous nous sommes basés sur des études préalablement publiées dans la littérature ainsi que sur des tests statistiques. Des résultats antérieurs fournissent des informations importantes concernant la mortalité, les modalités de modèles de sepsis, les temps d'étude etc. Ainsi, nous proposons d'utiliser 496 animaux au total. Cet effectif permettra d'approfondir les mécanismes de la septicémie en réponse à la température, tout en limitant l'étude.

Raffinement

Afin de minimiser le stress animal, les souris seront placées en groupe avec des éléments d’enrichissements comme des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson. Les animaux seront surveillés quotidiennement. La mise en place de nourriture humidifiée dans la cage sera faite une semaine avant le début du protocole pour éviter le stress. Nous mettrons en place une grille d'évaluation de la souffrance des souris pour suivre l'évolution de la maladie. Le poids, l'apparence, la conscience, l'activité physique, la réponse aux stimuli, les yeux, la respiration seront évalués pour suivre l’évolution de la maladie et intervenir par euthanasie lorsque les points limites seront atteints.

Choix des espèces

Pour notre étude, nous avons choisi la souris car les modèles de choc septique que nous utilisons sont largement décrits dans la littérature scientifique chez la souris. De plus, de nombreux souris génétiquement modifiées permettant l'étude des mécanismes pathologiques sont largement développés. Age adulte (2 à 3 mois). Nous utiliserons des souris adultes car les données de la littérature scientifique montrent que l'incidence de la péritonite est beaucoup plus importante chez l'adulte que chez l'enfant.

648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sévèrement immunodéprimées, elles reçoivent un conditionnement par chimiothérapie ou irradiation puis une greffe de cellules de lymphome humain dans le sang, la rate ou la moelle, et sont suivies jusqu'à l'atteinte de points limites liés au développement tumoral. Le porteur veut vérifier qu'un inhibiteur déjà utilisé dans la sclérose en plaques ralentit la progression du lymphome. Il affirme que seul un modèle "à l'échelle d'un organisme vivant" peut reproduire la complexité des interactions tumorales.

Objectifs

Nous menons des travaux de recherche focalisés sur la physiopathologie des lymphomes B, un groupe pathologique hétérogène de cancers, dont la fréquence est en augmentation constante dans les pays développés (incidence actuelle d'environ 8 pour 100 000 habitants). Notre projet vise à mettre en place différents modèles murins pertinents de lymphomes B humains. Après caractérisation, ils nous permettront d’évaluer au mieux l’effet bénéfique de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider notre hypothèse que les vésicules extracellulaires produites par les cellules tumorales ont un rôle accélérateur de la prise de greffe tumorale et que l'utilisation d'un inhibiteur pourrait donc avoir un rôle protecteur. Cet inhibiteur que nous souhaitons évalué est déjà utilisée largement dans la sclérose en plaque et pourrait trouver sa place dans la prise en charge des lymphomes sans métastase dans la moelle osseuse au diagnostic pour limiter leur évolution à une forme disséminée.

Procédures

Pour obtenir des modèles murins fiables et robustes reproduisant au mieux les lymphomes humains, les souris devront recevoir un conditionnement (traitement chimique par injection ou irradiation) puis une greffe de cellules tumorales humaines dans un site reproduisant au mieux la pathologie humaine (dans le sang, la rate ou la moelle). Les traitements évalués seront ensuite administrés par voie intraveineuse ou intrapéritonéale. Enfin dans le cadre du suivi de ces animaux greffés, des prélèvements de sang ainsi que de l'imagerie non invasive pourront être réalisés.

Impact sur les animaux

Le développement tumoral peut engendrer un affaiblissement de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter l'apparition de signes de lymphome (perte de poids, léthargie, dos courbé...).

Devenir

Les souris ne développant pas de tumeur seront euthanasiées. Les souris développant une tumeur seront soit euthanasiées à un temps prédéfini dans le cadre de la caractérisation du modèle soit seront traitées puis euthanasiées dès l'atteinte des points limites énoncés ou en parallèle des souris contrôles.

Remplacement

Ce projet vient après des analyses in vitro nous permettant de justifier l'intérêt de la molécule thérapeutique (anticorps monoclonal) que nous souhaitons évaluer maintenant in vivo, étape indispensable pour valider son intérêt. Cette évaluation passe par la mise en place et la caractérisation de modèles murins robustes et pertinents pour reproduire la pathologie humaine (utilisation de cellules tumorales humaines, implantation orthotopique...).

Réduction

Nos choix de stratégies (lignées cellulaires, pré-conditionnement, voies d'injection et doses utilisés) se basent sur les données de la littérature et sur notre propre expérience dans le développement de modèles murins autour du lymphome. Tout cela nous a permis de réduire au minimum les conditions testées et va également nous guider dans notre stratégie : les combinaisons de conditions vont être testées successivement (en commençant par les plus relevantes au regard de notre expérience) et si une s'avère pertinente et validée, nous ne testerons pas les autres. Le nombre de souris par lot sera également adapté à chaque étape afin de garantir la fiabilité des résultats obtenus sans réaliser des lots trop importants lorsque cela n'est pas nécessaire.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux sera mis en place afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Pour cela des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats seront réalisés. Les interventions de chirurgie seront réalisées sous anesthésie générale et des traitements analgésiques seront systématiquement utilisés pour prévenir toute douleur. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. La technique de suivi non-invasif par imagerie bioluminescente nous permettra de réaliser une caractérisation en cinétique de nos modèles de façon non douloureuse tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaire à une caractérisation en cinétique.

Choix des espèces

Seul un modèle à l'échelle d'un organisme vivant peut reproduire la complexité des interactions entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement et permet d'être au plus près de l'effet potentiellement obtenu chez l'homme lors du test de nouvelles thérapeutiques. Les souris sont de bons modèles d'étude, notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilitées d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leur similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de souris sévèrement immunodéprimées pour permettre la prise tumorale. Ces animaux seront utilisé à l'âge de 7 à 10 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines, donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

20 chiens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque chien subit l'ablation de la rate sous anesthésie pour le rendre sensible au parasite, reçoit une injection intraveineuse de ce parasite, puis est tué pour prélever son sang parasité qui servira à fabriquer un principe actif de vaccin commercial. Le porteur applique des points limites en cas de symptômes et prévoit l'euthanasie dès la parasitémie minimale attendue. Il affirme que le développement du parasite n'est possible que sur l'espèce cible et qu'il n'existe "pas de modèle in vitro alternatif".

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’être en adéquation aux exigences réglementaires du dossier d’autorisation de mise sur le marché (AMM) dans la fabrication d’un vaccin commercial. Les tests ont pour but d’effectuer une première amplification in vivo des parasites nécessaires à la constitution du principe actif du vaccin. Ils sont effectués sur espèce cible. Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro alternatif.

Bénéfices attendus

L’avantage est que ces tests permettent la libération d’un nombre important de doses de vaccins améliorant considérablement la santé et le confort des animaux de compagnie ainsi que des propriétaires.

Procédures

La première étape est la splénectomie, c’est-à-dire une ablation de la rate. Elle permet de rendre le chien sensible aux parasites. Cette étape se déroule sous anesthésie avec du personnel compétent en chirurgie et un suivi pré et post-opératoire rapproché. Une période de trois semaines minimum est requise entre la splénectomie et l’inoculation du parasite pour fournir le sang parasité nécessaire à la campagne de fabrication des lots de principe actif. Le parasite est injecté par voie intraveineuse au chien. Ensuite, l’animal est suivi quotidiennement. Lors de la phase d’amplification in vivo des parasites, certains animaux peuvent déclencher des symptômes. Dans ce cas, des points limites spécifiques à la pathologie sont appliqués. Dans tous les cas, l’animal est euthanasié dès l’apparition de la parasitémie minimale attendue, associée ou non à la présence de signes cliniques moyens. A la fin de la période, l’animal peut être suivi jusqu’à toutes les quatre heures. En phase terminale, l’euthanasie est pratiquée et le sang parasité est prélevé pour démarrer la phase de multiplication in vitro.

Impact sur les animaux

Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent. Les animaux peuvent présenter une légère augmentation stress due à l’anesthésie, à l’opération (ablation de la rate) ainsi qu’aux injections et aux manipulations. Lors de l’amplification in vivo des parasites, certains animaux peuvent développer des symptômes qui peuvent induire une douleur. Dans ce cas, des points limites spécifiques à la pathologie sont appliqués.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés pour récupérer le sang parasité

Remplacement

La production du principe actif de ce vaccin nécessite des parasites. Le développement est possible uniquement sur un modèle in vivo. Toutes les autres étapes de production du vaccin sont effectuées in vitro.

Réduction

La première phase est une amplification in vivo sur 1 chien. Une fois qu’une parasitémie satisfaisante obtenue, une amplification du nombre est possible grâce à une mise en culture in vitro de ces derniers sur plateaux de culture en présence de globules rouges non infectés.

Raffinement

L’ablation de la rate se déroule sous anesthésie, avec du personnel compétent en chirurgie et un suivi pré et post-opératoire rapproché. Lors de la phase d’amplification in vivo des parasites, certains animaux peuvent déclencher des symptômes. Dans ce cas, des points limites spécifiques à la pathologie sont appliqués. Dans tous les cas, l’animal est euthanasié dès l’apparition de la parasitémie minimale attendue, associée ou non à la présence de signes cliniques moyens. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Des enrichissements du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

Ce choix résulte du fait que c’est l’espèce cible. Le développement des parasites n’est possible que sur l’espèce chien. Les chiens utilisés seront âgés d’au moins 6 mois. Un âge avancé permet de récolter plus de sang et ainsi diminuer le nombre d’animaux nécessaires.

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit sous anesthésie une occlusion de l'artère cérébrale moyenne puis une ischémie de 90 minutes, suivie d'examens IRM, pour tester un traitement de l'AVC consistant à incliner le corps tête en bas. Le porteur indique que la lésion induit des déficits sensorimoteurs, dont une hémiplégie partielle et des difficultés à se nourrir, sans récupération attendue puisque le suivi s'arrête à 24 heures. Il présente le projet comme une réplication d'un effet neuroprotecteur déjà observé, avancée comme condition d'une future évaluation "chez l'homme".

Objectifs

L’objectif est d’évaluer un nouveau traitement pour l’accident vasculaire cérébral (AVC), ayant l’avantage d’être non pharmacologique et facile à mettre en place dès le transport du patient vers l’hôpital. Il s’agit d’une inclinaison prolongée du corps (tête en bas, angle de 15°), effectuée pendant l’AVC, avant l'arrivée à l'hôpital. Un effet protecteur a déjà été mis en évidence sur un modèle d’ischémie/reperfusion chez le rat. Dans ce projet réalisé sur le même modèle animal, un suivi par IRM permettra de montrer que des changements de perfusion cérébrale sont induits pendant l’inclinaison, et qu’ils sont associés à l’effet neuroprotecteur observé. Par rapport aux données existantes, le projet a donc une double valeur, réplicative d’une part, et mécanistique d’autre part.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de répliquer de manière indépendante l’observation d’un effet neuroprotecteur : c’est une condition pour qu’il soit ensuite évalué chez l’homme. De plus, il apportera des données d’imagerie éclairant le mécanisme d’action et guidant la future évaluation clinique de ce traitement potentiel.

Procédures

Pour induire l'accident vasculaire cérébral, une chirurgie de 30 à 45 minutes est réalisée sous anesthésie générale. L’anesthésie est prolongée pendant la durée de l’ischémie (90 min), soit une durée totale entre 2h et 2h15. Un examen IRM est réalisé pendant l'ischémie. Un autre examen IRM (20 minutes) est réalisé le lendemain.

Impact sur les animaux

La lésion cérébrale (striatum et cortex sensori-moteur) induit des déficits sensorimoteurs (hémiplégie partielle, locomotion altérée, possible difficulté à se nourrir) dont la gravité est mesurée grâce à diverses échelles ou neuroscores. Il n’y a pas de récupération sensorimotrice notable attendue dans ce projet car le suivi post-AVC est volontairement limité à 24h.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue de la procédure, après mesure du déficit neurofonctionnel et de la taille finale d’infarct final. Les cerveaux sont prélèvés post-mortem pour analyses immunohistochimiques.

Remplacement

L’inclinaison du corps comme stratégie de protection cérébrovasculaire nécessite une expérimentation animale. L’utilisation du modèle animal adéquat (permettant une ischémie et une reperfusion) conditionne la validité de l’évaluation des traitements et la possibilité de transfert en clinique. L’utilisation d’animaux est également justifiée par le rôle central de l’imagerie in vivo dans ces procédures. Le projet utilisera des rongeurs, plutôt que des animaux de plus grande taille (chats, primate) grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie dédiés aux petits animaux.

Réduction

L’imagerie in vivo permet un suivi longitudinal sans avoir à sacrifier les animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans ce projet, l’imagerie permet également de sélectionner des animaux avec une occlusion artérielle correcte, et une lésion cérébrale significative. La variabilité du modèle est ainsi limitée. La chirurgie est réalisée sous traitement anti-douleur adapté (buprénorphine), avec thermorégulation continue, et hydratation intra-péritonéale. D’autre part, le suivi est volontairement limité à 24h post-AVC, car l’infarct est alors constitué, et la mesure d’un éventuel effet neuroprotecteur peut être réalisée. Une grille de score dédiée permet de juger objectivement les déficits sensori-moteurs, et le codage des expressions faciales permet de quantifier la souffrance post-opératoire afin de la traiter.

Choix des espèces

Le rat (souches Sprague-Dawley ou Wistar) est utilisé en première intention car c’est sur cette espèce qu’ont été décrites les techniques d’occlusion endoluminale (via un filament carotidien), ne nécessitant pas de craniotomie et permettant un excellent contrôle de la recanalisation et de la reperfuion par simple rétraction manuelle du filament. Le modèle a ensuite été adapté à la souris, mais les déficits sensori-moteurs sont plus difficilement mis en évidence et la taille du cerveau est plus petite, ce qui est pénalisant pour les techniques avancées d’imagerie (mesure de la perfusion notamment). Rats : jeunes adultes (poids de 250-300g). L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est réalisée via un filament dont le diamètre est calibré en fonction du poids de l’animal. Il est donc capital pour la réussite du modèle et l’inclusion des animaux que le poids soit strictement contrôlé. Les animaux jeunes sont préférés car la variabilité du modèle est moindre.

15 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent deux chirurgies, l'implantation d'électrodes dans le thalamus puis une neurectomie vestibulaire unilatérale qui détruit un côté de l'oreille interne et provoque un syndrome vestibulaire, avec enregistrement de l'activité neuronale pendant deux mois, pour étudier l'effet de cette perte sur les cellules directionnelles de l'orientation spatiale. Le porteur maintient les rats à leur poids initial par contrôle alimentaire et les héberge individuellement, et intègre à ses effectifs un risque de mortalité chirurgicale d'environ 20 %. Les bénéfices annoncés se limitent à mieux caractériser les déficits fonctionnels de la perte vestibulaire.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet dans le domaine des Neurosciences Intégratives et Cognitives est de comprendre comment une perte vestibulaire unilatérale affecte l'activité des neurones nécessaires à l'orientation spatiale, et plus particulièrement des cellules directionnelles du thalamus antérodorsal. Le système vestibulaire est un système sensorimoteur dont les fonctions sont assurées grâce à la présence de récepteurs vestibulaires (canaux semi-circulaires et organes otolithiques) dans l’oreille interne, sensibles aux accélérations angulaires et linéaires. Ces informations sont véhiculées jusqu’aux noyaux vestibulaires du tronc cérébral avant de transiter par des relais thalamiques et d’être projetées dans un ensemble très varié d’aires corticales. Les signaux vestibulaires sont impliqués dans de nombreuses fonctions, en particulier dans le contrôle de la posture et de la locomotion, dans la stabilisation du regard, mais également dans des fonctions cognitives comme l’orientation spatiale. Alors qu’un grand nombre de travaux ont été conduits sur les modèles de perte totale des signaux vestibulaires, peu d’études se sont intéressées à la perte unilatérale de l’information vestibulaire. Dans ce cas, on observe l’apparition d’un syndrome vestibulaire caractéristique, composé d’une multitude de symptômes différentes affectant l’ensemble des fonctions vestibulaires. Au cours du temps, il est cependant possible d’observer la disparition progressive et spontanée des troubles fonctionnels grâce au phénomène de compensation vestibulaire. Nos premiers résultats indiquent que, bien que les déficits posturo-locomoteurs disparaissent progressivement, les déficits mnésiques ne semblent pas s’atténuer lors de la phase de compensation. En parallèle, nous avons montré que plusieurs marqueurs de plasticité post-lésionnelle réactionnelle sont exprimés dans différents structures cérébrales du réseau spatial. Toutefois, il est impossible de comprendre si et comment cette lésion affecte les propriétés fonctionnelles des neurones qui appartiennent au réseau cérébral dévolu au traitement de l’espace. Ce projet vise donc à apporter des réponses aux déficits observés précédemment au niveau comportemental après perte vestibulaire unilatérale, en s'intéressant aux cellules directionnelles qui sont un corrélat neuronal de la mémoire spatiale.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux caracteriser les effets induits par une perte vestibulaire unilatérale affecte l'activité cérebrale, et de mieux comprendre les propriétes fonctionelles des neurones directionels, impliqués dans la navigation spatiale.

Procédures

Les animaux (N=15) seront d'abord soumis à une procédure chirurgicale d'implants d'électrodes. Ils seront ensuite soumis à une procédure comportementale et d'enregistrement de l'activité neuronale pendant 1 mois, le temps de recueillir un nombre minimum de cellules directionnelles de n=30. Une fois ce nombre atteint, ils subiront une neurectomie vestibulaire unilatérale. Après une semaine de récupération, ils repasseront dans la procédure comportementale et d'enregistrement de l'activité neuronale pendant 2 mois. Enfin au bout de ces 2 mois post NVU, ils seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront deux chirurgies : une première chirurgie pour implanter des électrodes au sein de la structure visée (le thalamus antérodorsal), et l'autre pour induire une perte vestibulaire unilatérale. Ces points seront discutés davantage dans les sections des procédures expérimentales. Lleur alimentation sera contrôlée pendant la tâche comportementale et d’enregistrement puisqu’ils seront maintenus à leur poids initial et ne disposeront pas de nourriture illimitée. Enfin, les animaux seront hébergés individuellement pour des raisons de sécurité.

Devenir

A l'issue de la procédure n°1 qui consiste à implanter des électrodes dans le thalamus antérodorsal, les rats subiront la procédure n°3 qui consiste en une tâche comportementale durant laquelle l'activité neuronale est enregistrée. Après 1 mois, les animaux subiront la procédure n°2 qui consiste à réaliser une neurectomie vestibulaire unilatérale. Après 1 semaine de récupération post-opératoire ils retourneront dans la procédure n°3 pendant 2 mois. Enfin, ils seront mis à mort.

Remplacement

La nature même des expériences ne permets pas d'envisager de remplacement. En effet, elles reposent sur une tâche comportementale que les animaux effectuent et ne peuvent pas être réalisées à partir de modèles in vitro ou in silico. Du fait du caractère invasif des procédures (implantation d'électrodes intra-cérebrales) elles ne peuvent pas non plus être conduites chez l'humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été réduit au maximum (n=10) en se basant sur les études précédentes de l’équipe et sur un test de puissance statistique permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux tout en ayant suffisamment de données pour une inférence statistique valide. A ce nombre minimum s’ajoute 5 animaux afin de prendre en compte les risques de mortalité liés aux deux chirurgies (risque d’échec de la neurectomie de l’ordre de 20% et risque de perte de l’implant d’électrodes de 10%). De plus, l'utilisation de microdescendeurs à haute densité d'enregistrement permet de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet. Enfin, la possibilité de comparer l'activité neuronale avant et après perte vestibulaire chez les mêmes animaux permet de réduire le nombre d'animaux tout en augmentant la robustesse des résultats.

Raffinement

La souffrance des animaux est limitée au maximum. Les animaux sont habitués à la manipulation et à la salle d’expérimentation pendant 10 jours avant le début du protocole expérimental afin de diminuer leur stress puis pendant l’ensemble du projet expérimental. Pendant la chirurgie, l’utilisation de buprénorphine permettra de diminuer la douleur de l’animal (Buprécare, 0.03mg/kg SC). Pendant la période post-opératoire à la première chirurgie d’implantation, une grille de score adaptée sera utilisée pour évaluer le bien-être de l’animal et une analgésie sera utilisée en cas de soupçon de douleur (score sur la grille d’évaluation de la SEBA situé entre 10 et 14). Pendant la période post-opératoire à la suite de NVU, une analgésie appropriée sera assurée durant la phase aigüe de 3 jours (Buprénorphine, Buprécare® 0.05mg/kg, SC). L’hébergement des animaux sera adapté durant les 3 premiers jours après la NVU afin de garantir la sécurité et le bien-être animal. Les co-porteurs du projet sont formés en expérimentation animale (niveau concepteur de projet), en chirurgie sur rongeurs et sensibilisés au bien-être animal

Choix des espèces

Le projet porte sur l’enregistrement de l’activité de neurones in vivo lors d’une tâche comportementale. La nature même de ce projet ne permet pas d’envisager de remplacement in vitro ou in silico. De plus, au regard du caractère invasif des procédures, elles ne peuvent pas être conduites chez l’humain. L’utilisation du modèle rat présente de nombreux avantages, notamment dans l’étude des déficits engendrés par une perte vestibulaire unilatérale. En effet, ce modèle permet une bonne reproduction du syndrome vestibulaire rencontré chez différentes espèces tout en présentant la particularité de présenter une courte phase de déficits fonctionnels post-lésionnels. Ce gain temporel est avantageux pour la compréhension des mécanismes qui sous-tendent les déficits fonctionnels. De plus, le modèle rat est classiquement utilisé dans l’étude des cellules directionnelles. Nous pourrons donc comparer nos résultats aux résultats préexistants dans la littérature mais également aux résultats antérieurs de l’équipe, réalisés également sur modèle rat. La présente étude s’intéresse aux signaux directionnels chez l'adulte, après neurectomie vestibulaire unilatérale. L’étude de ces mécanismes sera donc réalisée sur des rats adultes afin de s'assurer d’être sorti de la période développementale. Par ailleurs, pour un rat, la maturation des neurotransmetteurs et la densité synaptique est atteinte à + de 8 semaines (Semple et al., 2013). Il est donc nécessaire de travailler sur des rats adultes d'au moins 10 semaines pour qu'une maturation complète du système nerveux central soit présente. Nous avons fait le choix de travailler sur des rats adultes, âgés de 3 mois au début du protocole expérimental pour ces raisons.

85 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une contusion de la moelle épinière suivie d'une greffe de tissu graisseux, provoquant des déficits sensorimoteurs, des troubles de la miction et des douleurs pouvant durer environ deux semaines, avec vidange manuelle de la vessie deux fois par jour, pour tester une stratégie de réparation médullaire. Le porteur mobilise une grille de douleur (le "Rat grimace scale") et une analgésie à la buprénorphine, et réserve la mise à mort finale à une électrophysiologie sans réveil. Le bénéfice annoncé, une application chez des blessés médullaires, reste renvoyé à un hypothétique cas de succès.

Objectifs

Si la prise en charge immédiate des sujets ayant subi un traumatisme médullaire n’est pas capable de réduire les dégâts occasionnés par la blessure primaire imprévisible, la décompression médullaire et la mise en œuvre de mesures médicales visant à limiter les modifications vasculaires, biochimiques ou électrolytiques permettent aujourd’hui de limiter l’extension longitudinale et radiale de la lésion secondaire. Toutefois, ces interventions immédiates ne permettent pas aux patients de recouvrer l’intégralité de leurs fonctions sensori-motrices et végétatives après le traumatisme et des déficits fonctionnels persistent avec des conséquences humaines et sociales désastreuses. Face à ce constat, il est impératif d’orienter la recherche fondamentale et clinique sur la mise au point de stratégies visant à limiter les déficits post-lésionnels et à réparer le tissu nerveux endommagé, d’où l’objet de ce projet scientifique.

Bénéfices attendus

En cas de succès, une application clinique pourra être envisagée chez des blessés médullaires.

Procédures

2 procédures : - Procédure 1 (avec réveil) : Prélèvement de la graisse + lésion de la moelle épinière + greffe (durée : 45 min à 1h) et suivi des animaux (3 mois) . - Procédure 2 (sans réveil) : Electrophysiologie (1 h).

Impact sur les animaux

La contusion spinale thoracique entraîne des déficits sensorimoteurs sous-lésionnels, ainsi que des troubles neurovégétatifs, notamment en ce qui concerne la miction. Des douleurs peuvent également être présentes, ainsi qu’une perte de poids, une déshydratation ou une dénutrition. La littérature indique que les troubles végétatifs et les douleurs peuvent persister environ pendant 2 semaines.

Devenir

A l'issue de la procédure 2, les animaux seront sacrifiés afin de prélever les moelles épinières pour des analyses immuno-histologiques. Aucun animal sera maintenu en vie à la fin du projet.

Remplacement

Il s’agit d’une étude pré-clinique non-humaine qui ne peut être substituée (R de Remplacer). Le modèle de contusion spinale chez le mammifère reste à l'heure actuelle une des seules solutions non-humaines pour mettre en évidence le potentiel thérapeutique d’une stratégie de protection/réparation de la moelle épinière post-lésionnelle. Les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre après une lésion spinale et les récupérations sensori-motrices ne peuvent pas être étudiés sur des cultures cellulaires ou avec des modèles numériques.

Réduction

Le nombre d’animaux requis (R de Réduire) a été estimé à la suite d’expérimentations préliminaires réalisées sur 3 animaux et à l’aide d’un test statistique approprié. Une analyse de puissance basée sur les résultats obtenus lors des tests comportementaux a permis d’estimer pour un risque α = 0,05, une puissance de 90%, un écart-type commun de 1,768 et une correction réalisée à l’aide du test Kruskal-Wallis que le nombre d’animaux minimum nécessaires dans chaque groupe était de 17.

Raffinement

Une attention sera particulièrement portée au bien-être et au soin des animaux (R de Raffinement) afin d’éliminer toute potentielle souffrance, stress et effets indésirables. Après la lésion médullaire, l’animal sera traité toutes les 12h pendant 5 jours avec de la buprénorphine (S.C., 0.05 mg/kg, 0,3 mg/ml) associé à un antibiotique (P.O., ciprofloxacine, 10 mg/kg). L’administration de ces deux substances pourra être prolongée en cas de nécessité. La vidange de la vessie sera réalisée 2 fois par jour jusqu’au retour de la fonction. Un suivi attentif sera mis en place afin de s’assurer que l’animal se nourrit et s’hydrate normalement et qu’il ne souffre pas. Le « Rat grimace scale » (NC3Rs) sera réalisé quotidiennement. Les comportements anormaux (tremblements, convulsion, agité ou très immobile, prostration, automutilation) seront considérés comme rédhibitoires ainsi que les signes de déshydratation (persistance du pli de peau et enophtalmie), malnutrition et infections. Une attention sera également portée sur la couleur des muqueuses (ictère, anémie, cyanose, congestion) ainsi que sur la présence de plaie (cf. grille de score). Le rôle des expérimentateurs et du responsable du bien-être des animaux sera de s’assurer que les animaux ne souffrent pas et qu’ils aient accès à de la nourriture et à de l’eau ad libitum.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère dont les mécanismes neurobiologiques mis en œuvre après une lésion médullaire sont proches de celui de l’humain. Ces mécanismes ne peuvent être étudiés sur des cultures cellulaires, in silico ou sur des espèces non-mammifères, chez ces derniers les mécanismes mis en œuvre après une lésion du système nerveux sont sensiblement différents de l’Homme. L’étude pourrait être réalisée chez des primates non-humains comme le reportent de nombreuses publications ou des plus gros mammifères (cochons, chats…) mais compte tenu du coût et de la logistique à mettre en œuvre pour héberger ces animaux (notre animalerie n’étant pas habilitée pour accueillir de telles espèces) nous préférons avoir recours à des petits rongeurs dont notre équipe à l’expérience et est équipée de tous les dispositifs expérimentaux (plateforme d’analyse du mouvement, d’enregistrement électrophysiologique...) permettant de les étudier. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 250-350 g environ au début de l’expérience. Afin d’étudier les récupérations post-traumatiques chez le mammifère adulte, il est nécessaire de s’assurer que les animaux ont terminé leur croissance et leur développement.

183 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie de ligature et ponction du cæcum leur provoque un choc septique, avec mobilité fortement réduite, absence de réaction aux stimuli et baisse de la prise alimentaire, pour tester une molécule stimulant l'O-GlcNAcylation comme piste thérapeutique. Le porteur décrit un modèle dont la mortalité propre avoisine 30 % et intègre cette perte au calcul des effectifs, en transposant à la souris des résultats déjà obtenus chez le rat. Les retombées cliniques annoncées restent renvoyées au long terme, l'objectif immédiat étant de valider l'innocuité et la dose du composé.

Objectifs

Le choc septique (défaillance multi-viscérale survenant au cours d’une infection grave associée à un syndrome de réponse inflammatoire systémique ou SIRS) est un problème de santé publique majeur dont l’incidence augmente avec le vieillissement de la population et dont la mortalité est comprise entre 30 et 50%. Malheureusement il n’existe pas de traitement adapté au choc septique ou au SIRS, conduisant à la mort de plus de 45 000 personnes par an en France. Il devient donc urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le SIRS caractérise par une libération, une expression anormalement élevée d’une multitude de composés de l'inflammation. La manifestation du SIRS chez l’adulte inclut au moins 2 des critères suivants : une altération de la respiration, une dérégulation de la température, une tachycardie et un état hyper ou hypo-inflammatoire. De façon générale, un patient est considéré en état de SIRS lorsqu’il présente deux critères ou plus. Nous avons développé en collaboration avec une équipe américaine une approche visant à stimuler l’O-GlcNAcylation dans le choc septique. L’O-GlcNAcylation est une modification post traductionnelle responsable de la survie cellulaire qui joue un rôle majeur dans la réponse au stress. Les approches développées par nos deux équipes visent à augmenter de manière très précoce les niveaux de O-GlcNAc, et sont associées à une réduction importante des marqueurs de stress, à une amélioration de la fonction cardiovasculaire et une forte réduction de la mortalité dans le choc septique. Nous démontrons que la stimulation de l’O- GlcNAcylation présente un potentiel thérapeutique important pour la survie des patients. Le but du projet est de 1) valider l’innocuité des molécules chez un modèle murin, 2) valider une cinétique et une dose d’administration et enfin 3) confirmer les résultats obtenus chez le rat chez une autre espèce.

Bénéfices attendus

Avec les différents résultats précédemment obtenus par l’équipe dans un modèle de ligature et ponction caecale chez le rat, les résultats attendus sont une amélioration de la réponse inflammatoire, une amélioration de la fonction cardiovasculaire et des différents marqueurs de stress des animaux traités et ceux à différents temps d’administration. Ces résultats seront objectivés par une étude in vivo de la fonction et du stress cardiovasculaire (pression artérielle, fréquence cardiaque), rénale (créatinine) et hépatique mais également par des tests biochimiques (RT-qPCR et Western Blot) validant l’effet de la molécule testée. Lors de cette étude, les paramètres précédemment cités seront comparés entre les différents groupes (Contrôle, malades, malades + traitement). Les retombées à plus long terme peuvent être majeures avec la mise en place d’une nouvelle stratégie thérapeutique en clinique.

Procédures

L’ensemble des animaux sera soumis à 4 interventions. La première intervention consiste en la chirurgie afin de développer le choc septique (uniquement la chirurgie pour le groupe contrôle). Cette intervention dure environ 20 à 30 minutes (sur la base des expériences précédemment menées sur le rat). La deuxième intervention consiste à une injection de buprénorphine 6h après la chirurgie (à 14h le jour de la chirurgie) sur un animal vigile. Cette intervention dure quelques secondes. La troisième intervention consiste à une injection de buprénorphine 12h après la chirurgie (à 20h le jour de la chirurgie) sur un animal vigile. Cette intervention dure quelques secondes. Enfin la quatrième et dernière intervention consiste à une chirurgie afin d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques des animaux. L’intervention dure environ 5 à 10 minutes (sur la base des expériences précédemment menées sur le rat).

Impact sur les animaux

Le modèle de ligature et ponction caecale est un modèle représentant la symptomatologie du choc et de fait un modèle sévère. Au cours de ce protocole, l’état de santé des animaux va s’aggraver du fait du développement du choc septique avec une mobilité fortement réduite, une absence de réaction aux stimuli sonores et toucher mais également une diminution de la prise alimentaire, sans toutefois de réel impact sur le poids, le protocole n’ayant une durée que de 24h. Enfin, une douleur peut être associée à la chirurgie réalisée sur l’animal (laparotomie). L’apparition de ces effets indésirables est environ 2 à 3h après l’induction du choc et jusqu’au sacrifice.

Devenir

A la fin de la procédure 1 (procédure sévère), tous les animaux ne présentant pas de signes de souffrance trop important seront gardés en vie pour la procédure 2. Seuls les animaux démontrant des signes de souffrances trop importants seront euthanasiés en fin de procédure 1. A la fin de la procédure 2 (procédure sans réveil), tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Le choc septique est une pathologie complexe faisant intervenir de nombreux mécanismes complexes et intégrés, nécessitant impérativement l’utilisation de modèles animaux. L’usage des animaux est justifié uniquement car ce modèle n’est pas remplaçable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit de façon à obtenir des données statistiques suffisamment puissantes (dans la mesure du possible, les tests seront réalisés en aveugle afin d’augmenter la puissance de l’étude). Les animaux seront utilisés à un âge adulte. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux pour les groupes en choc septique est calculé de la façon suivante : un nombre d’animaux statistiquement viable est sélectionné (n=15). A cela s’ajoute la mortalité associée au modèle (environ 30%) mais également l’exclusion de certains animaux (entre 20% et 40% avec les résultats précédemment obtenus) soit entre 15/0.7*0.8 = 26,7 soit 27 animaux et 15/0,7*0,6= 35,7 soit 36 animaux. Les tests statistiques utilisés seront des tests Kruskall-Wallis avec post test de Dunn’s non corrigé.

Raffinement

Les différentes procédures expérimentales de la première étape (mise au point) seront réalisées sur des effectifs réduits afin de déterminer les conditions (i) de transposition du modèle du rat à la souris et (ii) d’utilisation optimales. Dans un second temps, lorsque la transposition à la souris et les conditions d'utilisation optimales auront été déterminées, les procédures seront réalisées sur un plus grand nombre d’animaux avec seulement les conditions sélectionnées dans la première étape. Afin de raffiner le modèle, des mesures seront mises en place afin de maximiser le confort des animaux par exemple avec la mise en place de scores et de points limites comprenant des critères morphologiques (aspect, comportement) et physiologiques (température, fréquence respiratoire), l’administration d‘un antidouleur en début de procédure et toutes les 6 heures post-chirurgie est prévue et la réinjection d’une dose supplémentaire peut être considérée en cas de signe de douleur. De plus, nous associerons une infiltration d’un anesthésiant local (lidocaïne 0,5%, maximum de 0,03mL) au niveau de la zone incisée. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés par 3 dans des cages avec enrichissement, sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Un respect strict des cycles jour/nuit sera observé. Après chirurgie, afin d’éviter au maximum le stress, les animaux seront replacés avec leurs congénères opérés le même jour. Tout au long des procédures, les animaux seront sous une couverture anesthésique (mélange O2/sévoflurane – induction : 8% à 1L/min ; maintien : 3% à 0,5L/min). Nous proscrirons l’usage d’anti-inflammatoires non stéroïdiens du fait de leur impact sur l’inflammation, voit majeure dans la physiopathologie du choc septique. La liste des points limites est présentée en annexe. Ces points seront adaptés avec la phase de mise au point. Un score sera établi et des décisions seront prises en fonction de ce score afin de limiter la douleur de l’animal. Si nous observons que notre score n’est pas totalement adapté lors des premières expériences, nous modulerons la rigidité de ce dernier toujours dans le but de réduire au maximum la souffrance animale. Les gestes réalisés au cours de ce projet sont des gestes simples et maîtrisés par l’équipe chez le rat (cathétérisation artérielle, ligatures du caecum).

Choix des espèces

Ce modèle est, historiquement et actuellement, l’un des plus utilisé et des mieux décrit. Sa proximité avec la symptomatologie du choc septique chez l’Homme, sa facilité de mise en place en fait un modèle efficace pour cribler et valider l’efficacité des traitements. Les souris utilisées sont des souris C57BL/6J de 10-12 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. 10-12 semaines. C’est un âge standard pour ce genre de manipulations. De plus la taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés.