Procédures sévères

36 cochons miniatures femelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, puis gardés en vie et transférés vers un second établissement pour la suite de l'étude. Chaque animal subit une irradiation destinée à détruire sa moelle osseuse, reproduisant un syndrome aigu d'irradiation, avant l'injection de cellules souches sanguines d'origine humaine. Le porteur présente ce modèle comme une étape vers des essais cliniques, pour traiter des militaires ou des populations victimes d'un accident nucléaire. Il justifie le choix du miniporc par une physiopathologie proche de l'humain et par la quantité limitée de cellules disponibles.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de proposer un nouveau traitement (cellule souche hématopoïétique humaine) en cas de syndrome aigu d’irradiation (SAI), pour le militaire en opération ou la population victime lors d’une urgence radiologique, d’un accident nucléaire ou un acte de malveillance. Il est basé sur une technologie de rupture permettant de produire des cellules souches hématopoïétiques (CSH) obtenue à partir de cellules souches reprogrammées issues de cellules humaines. Ces cellules d’origine humaine sont nommées hiPSC (human induced Pluripotent Stem Cells) et ont commencé à révolutionner les pratiques médicales. Le traitement en urgence de population nécessite de disposer de produits cellulaires pouvant être congelés, décongelés et injectés rapidement et permettant de traiter un groupe important d’individu. Ces banques de cellules souches dites « médicament » permettront de produire des cellules souches de différents types pour traiter les victimes. Des hiPSC issues de donneurs « universels » sont déjà disponibles. Le projet a pour ambition de démontrer que cette stratégie d’utilisation des hiPSC est la réponse thérapeutique au traitement en masse du syndrome aigu d’irradiation. Ce projet est en synergie avec les nouvelles stratégies internationales en termes de santé et de médecine régénérative, à savoir la constitution de banques d’hiPSC de grade clinique (à savoir excellente viabilité et absence d’anomalie chromosomique) et la dérivation de produits cellulaires de qualité. L’objectif est la validation après la destruction des cellules de la moelle osseuse par l’irradiation de la reprise de l’hématopoïèse chez le cochon par une injection de cellules souches humaines hématopoïétiques issues d’hiPSC. Ce projet permettra de démontrer l’efficacité d’un greffon provenant iPSC sans induire de toxicité aigüe et chronique.

Bénéfices attendus

La preuve de concept de la possibilité de générer un tissu hématopoïétique fonctionnel (l’ensemble des cellules du sang) à long terme à partir d’un tout nouveau type cellulaire appelé ; « hiPSC » (human induced Pluripotent Stem Cells) a été établie chez le petit animal. Cette nouvelle technologie permet de produire les cellules à l’origine de la production du sang. L’objectif de ce projet est de progresser vers les essais cliniques par la reconstitution hématopoïétique lors d’un syndrome hématopoïétique. Pour le passage en clinique, nous sommes dans l’obligation d’utiliser des modèles in vivo, plus particulièrement des animaux de grande taille et dont la physio-pathologie du SAI est proche de l’homme. La validation de la reprise d’hématopoïèse humaine xénogénique chez le cochon par une greffe de cellules souches hématopoïétique issues hiPSC et également de la sous population de cellules triée à partir de ces hiPSC (la sous population à capacité de reconstituer l’hématopoïèse) permettra de démontrer l’efficacité d’un greffon provenant hiPSC sans induire de toxicité aigüe et chronique. Le bénéfice de ce projet est de progresser vers les essais cliniques par la reprise hématopoïétique lors d’un syndrome hématopoïétique chez l’homme.

Procédures

Les procédures d’irradiation sont réalisées en une seule fois pour une durée de 5 min sous masque et isoflurane après une anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation, les taux de cellules sanguines varient avec une diminution puis une reprise aux niveaux de base à des temps différents selon les cellules. La survenu transitoire de quelques pétéchies est observée chez quelques animaux. Afin de palier à tout risque d’infection lié aux prises de sang et moelle osseuse les cochons reçoivent un antibiotique à chaque intervention sur l'animal (à l'occasion de prises de sang notamment).

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie et retournent dans le second établissement pour l’hébergement et la poursuite de l’étude (prélèvements et administrations).

Remplacement

Le passage à la clinique nécessite des animaux de grande taille. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome hématopoïétique sur le porc de taille réduite (de type miniporc) est similaire à celle observée chez l’homme. De plus étant donné que la production de cellules hiPSC en quantité importante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc qui est un porc de taille réduite permettant l’injection de cellules en concentration compatible avec leur production.

Réduction

Pour obtenir des valeurs statistiques, les groupes des miniporcs irradiés et traités par les cellules souches sont classiquement constitués de 8 individus pour pallier les variabilités inter-individus des animaux et également du greffon injecté et pour éviter ainsi d’avoir à renouveler plusieurs fois l’expérimentation. Le nombre d’animaux choisi pour ce protocole est nécessaire et suffisant pour exploiter d’un point de vue statistique les résultats obtenus.

Raffinement

Le transport des animaux au site d’irradiation sera effectué par le véhicule climatisé dédié à ce transport. Pour la procédure d’irradiation les animaux sont anesthésiés et surveillés pendant la durée de l’irradiation, ainsi que pendant la phase de réveil. Si au cours de l’expérience un animal montre des signes caractéristiques de souffrance, il sera retiré de l’expérimentation et une mise à mort compassionnelle sera effectuée selon les méthodes approuvées en limitant le plus possible la douleur, la souffrance et l'angoisse des cochons, par une personne compétente de l'établissement hébergeur.

Choix des espèces

Le passage à l’étape clinique nécessite des animaux de grande taille. Il a été montré que la physiopathologie du syndrome hématopoïétique sur le porc de taille réduite (de type miniporc) est similaire à celle observée chez l’homme. De plus étant donné que la production de cellules hiPSC en quantité importante est un paramètre limitant, le choix s’est porté sur le miniporc qui est un porc de taille réduite permettant l’administration de cellules en concentration compatible avec leur production limitée à l’heure actuelle. Les animaux seront des animaux âgés de 2 mois minimum). Etant donné que le nombre de cellules à administrer est fonction du poids de l’animal, il faut donc des animaux le plus jeune possible avec un poids le plus proche de 5 kg environ. D’autre part, la prise de greffe est plus efficace plus l’animal est jeune. Les porcs seront des femelles afin d’éviter des conflits et donc risques de blessure, qui sont plus fréquents chez les mâles. Le risque de blessure doit être absolument évité chez ces animaux qui auront un système immunitaire et de coagulation affaibli après irradiation et par conséquent un risque de mortalité augmenté.

1 640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de tumeur mammaire humaine leur sont greffées sous anesthésie, puis elles reçoivent des injections répétées d'anticorps ou de candidats médicaments, jusqu'à une ou deux fois par jour pendant trente jours, ainsi que des prélèvements sanguins. Le porteur signale une perte de poids, une baisse de locomotion et des complications post-chirurgicales liées au développement de la tumeur. Toutes sont tuées pour prélever tumeurs et organes, le porteur jugeant "indispensable" le recours à la souris faute de modèle reproduisant l'environnement tumoral humain.

Objectifs

Le projet faisant l’objet de la présente demande correspond à l’études précliniques dans un modèle tumoral mammaire chez la souris. Ce projet a pour objectif scientifique et technique de mettre en place et d’utiliser des modèles tumoraux mammaires chez la souris afin de tester l’efficacité d’anticorps ou de candidats médicaments et ainsi permettre d’accélérer le passage des résultats de la recherche fondamentale vers la clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet va donc consister à la mise en place et l’utilisation au sein de notre animalerie de modèles orthotopiques mammaires en transplantant des cellules tumorales humaines, modifiées ou non génétiquement, permettant ainsi de mesurer l’efficacité des anticorps candidats médicaments. Il permettra ainsi de valider ou non l’intérêt d’un transfert vers la clinique pour ces anticorps/candidats médicaments.

Procédures

Durant les expériences les animaux peuvent être soumis: - à des transplantations de cellules tumorales sur animaux anesthésiés réalisées en 30min par animal (1640animaux max), - à des injections d’anticorps/candidats médicaments sur des animaux vigiles ou sous anesthésie gazeuse. Ces injections sont réalisées 1-3x/semaine sur1 à 8 semaines en 2-5 min/animal ou 1-2x/jour pendant 30 jours max en 2 min/animal selon la voie d'injection choisie sur 1640 animaux, - à des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou anesthésiés et à des fréquences variables (de 1-3x/semaine pendant 4 semaines) d'une durée de 5 min/animal. Nous envisageons de réaliser ces prélèvements sur 1640 animaux.

Impact sur les animaux

Suite à la procédure que nous réalisons dans ce projet, les animaux peuvent subir: - du stress lié à la manipulation des animaux lors des différentes injections, à l’anesthésie chimique, aux mesures de tumeurs au pied à coulisse ou par imagerie, - une perte de poids et de locomotion suite au développement de tumeur ou à un effet toxique des anticorps/candidats médicaments testés, -une déshydration suite à une anesthésie gazeuse, -des douleurs et complications post-chirurgicales suite à un acte chirurgical.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure et dès que cela est possible des prélèvements de tumeurs, d’organes et de sang peuvent être réalisés pour être analysés immédiatement ou pour être stockés. Ce stockage pourra permettre d’obtenir une collection d’échantillons exploitables ultérieurement et ainsi éviter la réalisation de nouvelles procédures expérimentales.

Remplacement

L’utilisation des animaux (souris) lors de ces dernières phases des études précliniques pour tester l’efficacité de candidats médicaments est indispensable car aucun modèle de substitution ne permet à l’heure actuelle de recréer un environnement assez proche de celui retrouvé chez l’homme pour le développement tumoral. En effet, le développement tumoral implique des mécanismes et une complexité tissulaire impossible à reproduire à ce jour dans un autre modèle de substitution. Ainsi, seuls des modèles animaux adaptés permettent de reproduire un environnement proche de celui de l’homme qui est un élément crucial dans la réponse thérapeutique.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par expérience sera calculé en se basant à la fois sur les données de la littérature, des expériences « pilotes » et un test statistique de puissance. Ne seront injectés aux souris que les anticorps pour lesquels un effet thérapeutique des anticorps aura été observé au préalable. Le suivi de l’effet des anticorps testés sera évalué au cours du temps par des méthodes peu invasives. Toutes les procédures expérimentales effectuées seront recensées numériquement sur le serveur permettant d’avoir une traçabilité et un suivi des expériences menées, incluant les souris utilisées, les anticorps testés, les résultats obtenus et leurs interprétations ainsi que toute observation ou information pouvant être utile par la suite.

Raffinement

Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (Twist et coton plat), maintien des animaux en groupes de 4 à 5 afin d’éviter l’isolement et une période d’acclimatation de 7 jours est respectée systématiquement avant les manipulations. Afin d'atténuer la douleur chez l'animal, nous avons recours aux analgésiques ainsi qu'à l'anesthésie gazeuse et chimique lors de certains gestes techniques. Durant toute la durée d'une expérience, l’ensemble des animaux est observé quotidiennement pour s’assurer : des conditions adéquates de stabulation (paramètres environnementaux, litière, alimentation, boisson) et de l’état de santé des animaux (comportement, aspect physique), pesé 2 fois par semaine en temps normal et quotidiennement en cas d’apparition des premiers signes de détresse chez l’une des souris de l'expérience.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce animale de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. Sur cette base, et en adéquation avec nos objectifs le modèle souris apparaît le plus pertinent. L’utilisation d'animaux (souris) permettra d’avoir un environnement permissif au développement tumoral et d’effectuer des greffes de cellules tumorales mammaires humaine chez un individu d’une espèce différente (souris) afin de tester l’efficacité des anticorps ou composés candidats médicaments. Enfin, la maîtrise zootechnique (élevage/confinement), les connaissances actuelles et la diffusion d’information dans le domaine scientifique font que le modèle murin est le plus adapté à la réalisation des objectifs de ce projet. Afin d’avoir un tissu épithélial mammaire bien développé et limiter les biais dans l’expérimentation dus à des animaux à des stades de développement différents, les animaux utilisés seront des souris femelles âgées de 6 à 10 semaines.

730 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur déclenche pharmacologiquement, sur animal vigile, soit une crise convulsive généralisée suivie pendant trente minutes puis interrompue par la mise à mort, soit un état de mal épileptique arrêté au bout de trente minutes. Tous les rats sont tués pour prélever leur cerveau et mener des analyses ex vivo. Le porteur revendique un "besoin fort" de nouveaux antiépileptiques et affirme que ni les modèles in vitro ni in silico ne peuvent reproduire les crises et les comportements associés.

Objectifs

Les épilepsies regroupent un ensemble de syndromes neurologiques se caractérisant par des crises pouvant se manifester sous des formes diverses, allant des absences aux convulsions. Leur origine peut être génétique mais le plus souvent elle est associée à une agression cérébrale sévère initiale, telle qu'un traumatisme crânien, une infection, ou un état de mal épileptique (EME). Bien qu’une épilepsie puisse se manifester à tout moment de la vie, les pics d’occurrence sont observés avant l’âge de 20 ans et après 60 ans. Plus de 20 médicaments sont disponibles pour contrôler les crises. Toutefois, un patient sur trois continue d’en faire malgré la prise de médicaments, et un grand nombre de ceux dont les crises sont contrôlées par ces médicaments se plaint de comorbidités affectant gravement leur qualité de vie. Il existe donc un besoin fort et urgent de développer de nouveaux candidats médicaments permettant non seulement de contrôler les crises pour ceux qui ne répondent pas aux médicaments, mais aussi de réduire le degré d’inconfort qui compromet une bonne observance thérapeutique. Le candidat médicament CM1 a été récemment développé pour répondre aux besoins non satisfaits des patients. Il s’agit d’un candidat-médicament de nature lipidique, dont le mode d’action diffère totalement des anti-épileptiques classiques. Il possède des effets anti-crises d’épilepsie (occurrence d’une seule crise) et des effets anti-épileptiques (occurrence de plusieurs crises spontanées), tout en protégeant certaines fonctions cognitives. Ces observations ont été réalisées dans le cadre d'un projet précédent. Des études in vitro et ex vivo ont montré : 1) que les effets anti-crises pouvaient passer par une augmentation des processus réduisant l’activité cérébrale ; 2) que l’activation d’un récepteur particulier, appelé ici CM1-R1, pouvait potentiellement être responsable des effets bénéfiques du CM1 ; et 3) que le CM1 pouvait modifier le profil lipidique cérébral. Les objectifs de ce projet sont d'apporter des réponses: 1) quant aux mécanismes par lesquels le CM1 augmente la réduction de l’activité neuronale ; 2) sur l’implication du récepteur CM1-R1 et d’un homologue R2 sur les mécanismes décrits en (1) ; 3) quant aux effets du CM1 sur les mécanismes de neurotransmission GABAergique et Glutamatergique, et l’implication de 2 récepteurs dans ces effets ; et enfin 4) sur les modifications de la composition lipidique cérébrale induites par le CM1.

Bénéfices attendus

Les épilepsies constitutent la seconde maladie neurologique après la migraine, et affectent près de 70 millions de personnes dans le monde. De nombreux traitements existent, mais malgré cela, près d’un tiers de patients continuent de faire de crises malgré la prise de ces traitements. En outre, parmi les personnes qui répondent aux traitements existants, le ralentissement de l’activité cérébrale qu’ils entrainent constitue un effet secondaire fortement handicapant pour une grande part d’entre elles, réduisant de ce fait l’observance du traitement. II est donc impératif de poursuivre le développement de nouveaux traitements, capables non seulement de réduire le nombre de crises ou leur sévérité, mais aussi de maintenir, voire même d’améliorer les capacités cognitives (mémoire). Le projet s’appuie sur le développement d’un potentiel candidat médicament, CM1, dont il a été montré qu’il exerce une activité anti-crise, anti-épileptique et cela sans altérer, voire même en améliorant, les capacités cognitives. L’objectif de ce projet est d’apporter des premiers mécanismes d’action in vivo de cette molécule, étape indispensable à la poursuite du développement de ce potentiel candidat médicament.

Procédures

Dans la procédure n°1, les animaux utilisés seront des rats soumis à un processus de déclenchement unique d’une crise convulsivante généralisée aiguë, induite pharmacologiquement. Les rats sont obligatoirement vigiles, car dans le cas contraire, aucune crise ne pourrait être induite. Dans les procédures 2 à 4, les animaux utilisés seront des jeunes rats soumis à un état de mal épileptique induit pharmacologiquement. Cette induction pharmacologique se fait sur animal vigile. L’état de mal est stoppé au bout de 30 min. Dans les procédures 2 et 4, il est important de chasser le sang des capillaires sanguins de tout l’organisme, en particulier le cerveau.

Impact sur les animaux

Le projet repose sur 4 procédures, réalisées sur le rat. Pour la procédure n°1, les crises d’épilepsies généralisées, de classe sévère, seront suivies sur une période n’excédant pas 30 minutes, au-delà desquelles les rats seront euthanasiés. Les rats développent en général les premières crises tonico-cloniques généralisées (GTCS) dans les 10-20 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Si le traitement testé a un effet pro-convulsivant, les rats développeront en moyenne les GTCS avant les 10 premières minutes. Au contraire, si le traitement a un effet anti-crise, les GTCS apparaitront après 20 minutes. Ce modèle, très bien standardisé au niveau international, n’excède pas 30 minutes ; en effet, on considère que l’effet protecteur est total quand aucune GTCS n'est observée dans les 30 minutes qui suivent l’administration de l'agent convulsivant. Les procédures 2 à 4 seront réalisées chez le rat après un état de mal épileptique (EME, série de crises convulsivantes en continu sur 30 minutes) induit pharmacologiquement à l’âge de 21 jours. A l’issue des 30 min d’EME, il sera stoppé pharmacologiquement. L’EME induit une douleur de type sévère pendant 3 à 5 jours, pendant laquelle aucun analgésique ne peut être administré en raison du blocage provoqué sur le processus même de développement d’une épilepsie. Sur ces 3 à 5 jours, durant lesquels le poids est contrôlé quotidiennement, les ratons ont une activité réduite, avec dos voussé.

Devenir

Pour la procédure n°1, les rats auront tous été soumis à un protocole d’induction d’une crise convulsivante généralisée. Ils seront tous mis à mort pour éviter de prolonger un état épileptique. Pour les procédures n°2 à 4, les cerveaux de tous les animaux seront prélevés, soit pour des études histologiques, biochimiques ou électrophysiologiques ex vivo.

Remplacement

Compte tenu du fait que les épilepsies regroupent une diversité de syndromes, il existe à ce jour très peu d’alternatives permettant d’évaluer les différents aspects de la pathologie sur des modèles in vitro ou ex vivo. De plus, l’analyse de comportements complexes, comme ceux de l’anxiété et de l’apprentissage spatial, et de surcroît la manifestation de crises épileptiques ne peuvent être appréhendées au niveau préclinique autrement qu’in vivo chez des vertébrés, et ne peut aujourd’hui être remplacée par des méthodes alternatives in vitro ou in silico.

Réduction

Ce projet impliquera l’utilisation d’un total de 730 rats sur une durée de 5 ans. Ce nombre d’animaux a été réduit au minimum tout en ne compromettant pas l’atteinte des objectifs de l’étude. Il a été déterminé à l’aide d’outils statistiques, en tenant compte des résultats d’études antérieures (notamment de la variabilité observée) dans le laboratoire sur ces mêmes modèles. Pour les procédures 1 et 2, des étapes GO/NOGO ont été mises en place. En effet, elles ont pour objectifs d’évaluer l’implication de 2 récepteurs potentiels du candidat médicament testé dans les effets observés. Nous commencerons par tester l’effet du récepteur R1. Si tout l’effet du candidat médicament passe par ce récepteur R1, alors les expérimentations visant à étudier l’implications de R2 ne seront pas réalisées.

Raffinement

Les animaux mâles arriveront suffisamment tôt pour permettre une semaine d'acclimatation avant le début des procédures. Leur poids sera suivi hebdomadairement, et les animaux seront soumis à une surveillance attentive à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être, pour limiter au maximum stress et douleur, et apporter des soins adaptés, le cas échéant. Plus spécifiquement, pour la procédure n°1, qui dure au maximum 30 minutes, la mise à mort de l’animal sera réalisée dès qu’il a atteint la première crise convulsivante généralisée. Pour les procédures n°2 à 4, l’état de mal épileptique induit par la pilocarpine (Pilo-EME) entraîne une souffrance sévère sur les 3 à 5 premiers jours, avec perte de poids pouvant atteindre 25%. Afin de favoriser le recouvrement, nous maintenons les ratons avec la femelle nourricière jusqu’au terme de ces 5 jours (26 jours d’âge). En outre, nous massons quotidiennement l’abdomen des ratons pour stimuler à nouveau le transit intestinal, temporairement interrompu par l’administration de scopolamine (antagoniste des récepteurs muscariniques centraux et périphériques). Depuis que nous avons introduit ces deux améliorations, le taux de survie des ratons est passé de 75% à 95%.

Choix des espèces

L’ensemble des données antérieures de l’équipe a été obtenu sur des rats Sprague-Dawley. L’utilisation de la même souche de rat nous permettra de comparer les données de ce projet avec celles des études antérieures de l’équipe. Enfin, chaque fois que cela est possible, le rat est choisi à la souris du fait qu’il est physiologiquement, génétiquement et morphologiquement plus proche de l’humain. En outre, son répertoire comportemental, notamment au regard de certaines compétences cognitives, le rend plus pertinent que la souris. Nous travaillons sur des ratons jeunes (3 semaines), car la grande majorité des cas d’épilepsie acquise (non génétique) chez l’humain se déclare chez le jeune de moins de 20 ans.

797 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par instillation de bléomycine dans la trachée, puis elles reçoivent des injections répétées d'un mimétique de l'héparane sulfate ou un anti-fibrosant par gavage, avant une exploration respiratoire. Le porteur décrit la fibrose comme indolore mais reconnaît qu'elle peut provoquer une insuffisance respiratoire sévère et tuer 20 à 30 % des animaux avant l'euthanasie prévue pour prélever les organes. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace l'induction d'une fibrose in vivo et juge la souris plus adaptée à l'approche mécanistique.

Objectifs

Ce projet vise à développer une thérapie régénérative pour le traitement des lésions pulmonaires tels que celles observées dans le syndrome de détresse respiratoire aiguë, les exacerbations aiguës de maladies pulmonaires interstitielles fibrotiques ou dans les pneumopathies sévères. Nous envisageons l'utilisation de mimétiques des héparanes sulfates (HSM) afin d’améliorer la réparation du tissu pulmonaire et de permettre une récupération fonctionnelle après une agression pulmonaire aiguë. Les effets bénéfiques des HSM seraient principalement liés à la régénération du tissu lésé en restructurant la matrice détruite, en protégeant les peptides cellulaires communicants (facteurs de croissance, cytokines, chimiokines), et en limitant la fibrose. Le projet explorera la capacité d'un agent mimétique de l'héparane sulfate à réduire l'inflammation, les altérations des mécanismes de l'angiogenèse et la fibrose. Cette thérapie a pour objectif d’améliorer les séquelles de lésions pulmonaires aiguës caractéristiques des dommages alvéolaires diffus. En cas de succès, ce projet proposerait une nouvelle approche pour la prévention et le traitement de la fibrose pulmonaire.

Bénéfices attendus

L’hypothèse de recherche de ce projet est que l'agent mimétique de l’héparane sulfate présenterait un potentiel thérapeutique pour lutter contre les lésions pulmonaires aiguës en fournissant une thérapie régénérative du tissu lésé. Ainsi cet agent (1) remplacera la matrice extracellulaire remodelée consécutive à l’induction des lésions en ciblant les héparanes sulfates (2) améliorera l'angiogenèse et la récupération alvéolaire, et (3) diminuera significativement le processus inflammatoire, et par conséquent la fibrose pulmonaire.

Procédures

La réalisation de ce projet nécessite l'induction d'une fibrose pulmonaire (durée 21jours). Dans un premier temps nous déterminerons la dose optimale d'agent mimétique de l'héparane sulfate. Pour cela les animaux recevront 6 injections intraveineuses (durée quelques secondes) de cet agent mimétique ou de serum physiologique. Le groupe contrôle recevra une molécule anti-fibrosante quotidiennement par gavage. Après une exploration fonctionnelle respiratoire (durée 1h) les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes. A partir de la dose optimale identifiée, nous déterminerons les mécanismes d'action de cet agent mimétique de l'héparane sulfate dans les stades précoce (jour 8) et tardif (jour 11) de l'inflammation. Pour cela les animaux recevront respectivement 2 (jour 5 et 7) et 3 (jour 5, 8 et 10) injections intraveineuses d'agent mimétique de l'héparane sulfate ou de serum physiologique. Le groupe contrôle positif recevra une molécule anti-fibrosante par gavage (durée quelques secondes) pendant 4 ou 7 jours respectivement. Suite à cela les animaux seront euthanasiés aux jours 8 ou 11 pour prélèvement des organes (durée 10 minutes). Enfin une étude de la pharmacocinétique et de la pharmacodistribution sera réalisée. Pour cela les organes seront prélevés à 5 min, 30 min, 3h, 6h, 12h 24h après injection intra veineuse d'agent mimétique de l'héparane sulfate.

Impact sur les animaux

Le modèle murin de fibrose pulmonaire induite par instillation intra-trachéale de bléomycine est validé et couramment utilisé dans la littérature internationale. Ce modèle est caractérisé par un pic inflammatoire (D8) précédent l'apparition de la fibrose pulmonaire (D14-D21). L'instillation intra-trachéale de BLM n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Le développement d'une fibrose pulmonaire est également indolore du fait de l'absence d'innervation sensitive à la douleur dans le parenchyme pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité de 20 à 30%. La technique de plethysmographie corps entier est une technique largement utilisée pour l’étude de la respiration. Elle permet de mesurer les variables ventilatoires sur un animal non anesthésié et non contraint. Afin de diminuer le stress de l’animal, une séance d’acclimatation sera systématiquement réalisée. Concernant les prélèvements, tous les animaux seront anesthésiés au préalable.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d'organes, du sang et du liquide de lavage broncho-alvéolaire.

Remplacement

La réalisation de ce projet nécessite l'induction d'une fibrose pulmonaire in vivo. De fait, il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale in vivo à ce jour. D'autre part, l'étude des mécanismes d'action d'un mimétique de l'héparane sulfate dans le cadre d'une thérapie matricielle peut-être plus facilement entreprise chez la souris du fait de l'existence d'outils permettant une approche mécanistique plus poussée.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqué est de 797. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi sur la base de données, publiées ou non, et des calculs statistiques afin de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif. Cela permet également de déterminer les points d'arrêt d'expérimentation les plus précoces et compatibles avec les objectifs du projet. Pour cela nous nous sommes basé sur la littérature existante ainsi que des tests de puissance et des statistiques issues de séries expérimentales précédentes prenant en compte les effets du traitement à la bléomycine (BLM) et la potentielle variabilité de nos paramètres physiologiques entre les différents individus.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi par groupes sociaux de 4 animaux par cage. La température de l’animalerie et l’humidité́ relative sont contrôlés en permanence. La nourriture sera fournie ad libitum et la photopériode sera de 12h/12h. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d'abri en cellulose. Concernant l'insitllation intra-trachéale de bléomycine, celle-ci sera réalisée sous anesthésie. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'a leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale de bléomycine et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé au animaux afin de faciliter l’alimentation et la récupération des animaux dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédent l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiées via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe palpébral, une respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Les points limites seront basés sur l'examen visuel des signes suivant: immobilité́, difficultés respiratoires (râle, respiration rapide..), position anormale (dos vouté, couché sur le coté..), réduction de la mobilité́ (faiblesse musculaire, ataxie, tremblements, paralysie..), perte de poids rapide ou progressive, mauvais état du pelage (poil ébouriffé́, mal entretenu..), vocalisation, pâleur des yeux ou des extrémités, automutilation. Pour cela, une échelle d'évaluation avec score est utilisée.

Choix des espèces

Ce projet nécessite d'induire une fibrose pulmonaire, de réaliser des explorations fonctionnelles respiratoires et de prélever des tissus. Il n'existe donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques dans notre contexte. Notre choix c'est porté sur la souris car c'est un modèle qui s'héberge et se reproduit facilement. D'autre part, le modéle murin de fibrose pulmonaire induite par instilation intra-trachéale de bélomycine est un modéle validé dans la littérature et courament utilisé. Il est parfaitement décrit et Il a permis la description de multiples phénomènes moléculaires et cellulaires impliqués dans la fibrogénèse pulmonaire et a été utilisé pour tester de nombreuses stratégies thérapeutiques. Pour réaliser notre étude, nous avons besoin que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. Cependant, les souris jeunes semblent moins sensibles à la bléomycine comparées aux souris âgées. Cependant, Il est bien décrit dans la littérature que les souris C57Bl6/J plus âgées, développent une fibrose pulmonaire plus sévère, ce qui risquerait d’induire une surmortalité. Le compromis qui a été choisis est un âge de 8 semaines.

286 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À 12 jours de vie, les ratons sont séparés de leur mère, subissent une incision au cou pour isoler la carotide puis 90 minutes d'hypoxie qui provoque une hyperactivité proche de crises d'épilepsie, avant une injection de vésicules extracellulaires, le porteur signalant 10 % de mortalité. Tous sont ensuite tués pour prélever leur cerveau. L'effet neuroprotecteur espéré chez le nouveau-né humain reste une hypothèse à démontrer, et le porteur affirme qu'un organoïde cérébral in vitro, mené en parallèle, ne peut pas remplacer l'animal in vivo.

Objectifs

Deux nouveau-nés pour mille présentent des lésions cérébrales d’origine vasculaires induites lors de leur naissance difficile. Ces affections sont à l’origine de troubles neurologiques moteurs et cognitifs complexes à traiter. Des prises en charge sont connues, comme l’abaissement de la température cérébrale du nouveau-né. Ce procédé n’est que partiellement efficace, 50% des nourrissons traités développent encore des troubles neurologiques. Il y a aussi l’utilisation de cellules souches fœtales. Mais cette prise en charge présente certains obstacles : variabilité des cellules lors de leur préparation au laboratoire, rejet de greffe possible, problèmes de sécurité et d’éthiques liés à l’injection de cellules souches fœtales vivantes provenant de prélèvement en fin de grossesse. Il existe des cellules souches générées au laboratoire, qui lèvent ces obstacles. Elles sont dotées de qualités similaires aux cellules souches embryonnaires, elles peuvent être produites en grande quantité et sont immortelles. En plus, il est possible de récolter les vésicules extracellulaires des cellules souches. Ces vésicules extracellulaires sont de très petits sacs contenant des molécules thérapeutiques intéressantes pour soigner les lésions cérébrales, elles servent à communiquer avec des cellules cibles présentes dans leur microenvironnement pour en moduler le fonctionnement, de plus, leur contenu peut être modifié en incorporant des protéines connues pour leur effet bénéfiques. Les vésicules extracellulaires sont connues pour favoriser la récupération fonctionnelle notamment dans un modèle d’hémorragie intra-cellulaire chez le rat, ou lors de la protection des fonctions cérébrales dans un modèle chez le mouton. L’objectif de ce projet est de tester la neuro-protection des vésicules extracellulaires grâce à un modèle de lésion cérébrale chez le raton à 12 jours de vie (correspondant à un nouveau-né humain). Le contenu des vésicules extracellulaires sera modifié par l’enrichissement ou l’appauvrissement de la protéine d’intérêt connue pour contrôler l’inflammation et atténuer les lésions cérébrales. Nous montrerons que la protéine d’intérêt est plus efficace lorsqu’elle est administrée avec les vésicules extracellulaires. Nous procéderons à un ensemble de technique permettant d’évaluer les lésions cérébrales ainsi que les différentes populations de cellules du cerveau.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons montrer dans ce projet que l’injection de vésicules extracellulaires naïves (c’est à dire naturelle, sans ajout de molécules) peuvent diminuer les lésions cérébrales, et donc avoir un effet neuro-protecteur. Les vésicules extracellulaires représentent une alternative sûre à l’injection de cellules souches vivantes et permettent d’éliminer les risques liés à la transplantation de cellules vivantes, tels que les rejets immunitaires, les problèmes éthiques, la transformation des cellules souches en diverses cellules non cérébrales. Par ailleurs, nous allons montrer, qu’en modifiant le contenu des vésicules extracellulaires en leur ajoutant la protéine d’intérêt, que l’effet neuro-protecteur des vésicules extracellulaires naïves peut être augmenté. Comme le suggèrent des données pilotes, il est peu probable que la protéine d’intérêt soit le seul facteur naturel responsable des effets bénéfiques des vésicules extracellulaires. Cependant, les effets de l'injection de la protéine d’intérêt seule détermineront si la protéine d’intérêt doit être dans des vésicules pour être active. Les résultats obtenus vont permettre de valider l’effet neuro-protecteur des vésicules extracellulaires enrichies en protéine d’intérêt dans un modèle de lésion cérébrale chez le rongeur avant d’être validé dans un modèle plus gros (cochon), en tant que données préliminaires pour une étude clinique chez l’humain.

Procédures

La chirurgie des ratons se fera à 12 jours de vie sous anesthésie générale. Cette intervention dure 10 minutes. Puis l’hypoxie se fera pendant 90min. Vingt-quatre heures après la chirurgie, les ratons recevront une injection de vésicules extracellulaires, cette administration dure quelques secondes. L’ensemble du projet se fera donc sur 4 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : - Le jour de la chirurgie : du stress, de la faim et de l’hypothermie sont causés par l’isolement d’avec la mère. Une douleur au niveau de l’incision du cou pour isoler la carotide. Au moment de l’hypoxie on observe une hyperactivité ressemblant à des crises d’épilepsie. - Nous observons une stagnation de la prise de poids pendant 24h après la chirurgie - Les ratons peuvent avoir une douleur locale lors des injections intra-péritonéal ou sous-cutanées - La mortalité observée dans ce modèle est de 10% - Les ratons des groupes hypoxie ischémie prennent moins de poids que ceux des groupes contrôle (SHAM).

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à la fin du projet pour prélever leurs cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques, ce qui correspond à l’analyse du tissu cérébral.

Remplacement

En parallèle de ce projet, une méthode alternative sera menée avec un modèle validé de cevreau humain fabriqué in vitro (appelé organoïde cérébral). Le but est de réaliser les mêmes traitements que sur les ratons pour ainsi comparer les résultats et d’élucider avec précision les mécanismes d’action des vésicules dans un contexte cellulaire humain. Toutefois, ce modèle récent a ses limites et ne peut remplacer totalement le modèle animal. Il n’y a pas d’alternative parfaite à un modèle in vivo pour étudier les effets de la réduction du flux sanguin/oxygène cérébral sur le cerveau et les anomalies du développement qui en découlent. La relation poumon/cerveau/circulation sanguine ne peut être modélisable in vitro. L’effet potentiellement neuro-protecteur des vésicules ne peut se faire que sur un organisme entier car il est difficile de reproduire in vitro la diminution du flux sanguin et une diminution de l’oxygène circulant.

Réduction

Nous utiliserons des données publiées dans les revues scientifiques afin de ne pas reproduire des expériences non utiles. Nous savons que la mortalité du modèle est de 10% nous compenserons en conséquence. Par ailleurs, compte tenu de l’hétérogénéité du modèle (réaction différentes selon les ratons), les groupes seront de 20 individus (10 mâles et 10 femelles pour mettre en évidence un éventuel effet sexe) pour obtenir des données analysables pour chaque point d’analyse (à quatorze et quinze jours de vie). Vingt animaux sont prévus pour transmettre le modèle à 2 nouvelles personnes. Si l’apprentissage se fait bien, nous en utiliserons moins. Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés.Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d’animaux utilisés. En conséquence, le nombre d’animaux dans notre étude sera maintenu au minimum nécessaire (286 ratons) afin d’obtenir des résultats analysables par les tests statistiques.

Raffinement

Afin de limiter le stress d’un nouvel environnement, nous procéderons à l’apprivoisement de la rate avant la mise bas. Nous l’habituerons à nous et aux bruits de déplacement dans la salle de chirurgie. Nous procéderons à l’enrichissement de l’hébergement avec du papier doux absorbant pour la fabrication du nid. Au moment de la naissance, si le comportement de la rate est anormal, c’est à dire qu’elle n’a pas fabriqué de nid et qu’elle ne s’occupe pas des petits, nous procéderons à une adoption par une autre rate. L’adoption se fera avec une rate qui pourra recevoir un nombre de ratons de manière raisonnable. L’adoption se fera en frottant doucement le raton avec la sciure de la nouvelle cage. Trente minutes avant la chirurgie, les ratons recevront une dose d’antidouleur, puis les ratons seront séparés de leur mère par groupe de 5 afin d’éviter un isolement trop long de toute la portée. Cinq ratons seront hébergés dans un environnement enrichi (sciure de la cage d’hébergement, papier doux absorbant et température contrôlée) pendant 1h. La chirurgie se fera sous anesthésie générale ainsi qu’une anesthésie locale sur un coussin chauffant. Dès que les ratons seront réveillés ils seront remis à leur mère pour recevoir ses soins et se nourrir. Pour finir, les ratons seront mis dans la couveuse reliée à la bouteille de mélange gazeux à 8% d’oxygène. On surveillera l’état général des ratons dans le nid à l’aide d’un document appelé « arbre décisionnel ». Il permet d’observer les ratons dans la portée sans les déranger à nouveau car le jour de la chirurgie les soins apportés par la mère sont importants. Dès qu’un animal ne va pas bien il est vite repéré car il est blanchâtre et/ou immobile. Une surveillance sera effectuée à +24h après la chirurgie afin de s’assurer de la bonne cicatrisation de la plaie et de la prise de poids. On surveillera la mobilité, la présence de lait dans l’estomac du raton. Les injections intra-péritonéales et sous cutanées seront réalisées avec une aiguille adaptée au raton (courte et fine) et par du personnel formé. Elles seront réalisées en même temps que la surveillance des points limites à 13 jours de vie afin de ne pas déranger plusieurs fois la portée.

Choix des espèces

Les revues scientifiques indiquent que les rats fournissent des informations pertinentes et qu’ils se remettent bien de la chirurgie. Le raton de 12 jours correspond à un nouveau-né à terme, au développement du cerveau et la maturation des cellules du système nerveux.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une arthrite est déclenchée par injection de collagène, puis les souris reçoivent un gavage quotidien pouvant provoquer une fausse route ou une perforation de l'œsophage, l'arthrite limitant leur mobilité et des plaies de grattage apparaissant au point d'injection. Le projet teste si un acide aminé alimentaire, l'ergothionéine, améliore l'arthrite ou renforce un médicament de référence. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne reproduit cette maladie systémique.

Objectifs

Une étude réalisée chez des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde a identifié un acide aminé issu de l’alimentation comme étant un marqueur permettant de discriminer les sujets atteints des sujets sains. Ce métabolite semble également être prédictif de la réponse au traitement des patients atteints de polyarthrite rhumatoÏde. L’objectif de ce projet est donc de vérifier si cet acide aminé possède un potentiel thérapeutique dans l’arthrite. Pour cela, nous voulons tester si son administration améliore l’arthrite expérimentale au collagène de la souris ou la réponse au méthotrexate dans ce même modèle.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour objectif de montrer un effet bénéfique d'un acide aminé provenant de l'alimentation dans l’arthrite expérimentale au collagène chez la souris, ainsi que son effet de potentialisation du méthotrexate utilisé dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Ainsi, ce projet pourrait avoir un impact important en rhumatologie. Il permettrait en effet de mieux comprendre le lien entre alimentation et développement de la polyarthrite rhumatoïde mais aussi de prédire la réponse au traitement des malades et donc d’ajuster leur traitement. Par ailleurs, cela pourrait mener à des études permettant de déterminer l’intérêt d’une supplémentation de cet acide aminé chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde pour améliorer l’efficacité de leur traitement.

Procédures

2 injections sous cutanées sur animaux vigiles, d'une durée de moins d'une minute par injection. Un prélèvement de sang sous anesthésie générale (1 à 2 minutes pour le prélèvement, environ 1h d'anesthésie) une semaine avant le début des injections et un prélèvement de sang (1 à 2 minutes de prélèvement) sous anesthésie générale terminale en fin d'expérimentation. Les traitements seront réalisés quotidiennement par voie orale (moins de 2 minutes) ou 3 fois par semaine par voie intra-péritonéale (moins de 1 minute) dans un volume maximum de 0,2 ml.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises à un gavage quotidien, qui comporte des risques de fausse route ou de perforation de l'oesophage. L'injection de l'émulsion de collagène à la base de la queue peut générer une irritation conduisant la souris à se gratter au point d'injection et à former des plaies. Le développement de l'arthrite chez les souris peut être responsable d'une limitation de leur mobilité.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. Ceci permettra d'effectuer des prélèvements d'organes (rate, ganglions et sang) et de réaliser de nombreuses analyses in vitro complémentaires aux résultats cliniques obtenus.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’un métabolite présent dans l’alimentation sur le système immunitaire et articulaire, en prenant en compte son accumulation dans les globules rouges. A l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire la complexité d’un système impliquant des interactions entre globules rouges, cellules et organes du système immunitaire et des articulations. Par ailleurs, les expériences in vitro permettront de démontrer le mécanisme d’action de ce métabolite sur les différents types cellulaires impliqués mais ne permettront pas de démontrer de façon irréfutable l’effet clinique de cette molécule sur une pathologie systémique telle que la polyarthrite rhumatoïde. Les approches in vitro et in vivo sont donc complémentaires et toutes les deux nécessaires.

Réduction

Cette étude utilisera un total de 160 animaux. Le nombre de souris nécessaire pour cette étude est défini grâce à un calcul de puissance et sur la base des études réalisées historiquement dans le laboratoire sur le modèle d’arthrite au collagène. Sur les animaux seront prélevés sur chaque animal le sang, la rate, les ganglions et les pattes afin d’obtenir un maximum d’information sur l’homéostasie immunologique dans les différents tissus et limiter ainsi la répétition d'expériences.

Raffinement

Les souris sont maintenues en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Elles sont hébergées dans des cages en plastique munies d’une grille enrichies avec du coton et des igloos pour améliorer leur bien-être. Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur des animaux, notamment avec la mise en place d'une anesthésie. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs, Le score clinique précis des souris et évalué 3 fois par semaine par les expérimentateurs. Dès les premiers signes cliniques (gonflement de la patte injectée), des aliments sous forme de granulés seront placés directement dans la cage pour faciliter la prise de nourriture des souris. L’euthanasie se fera sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Nous avons décidé d’utiliser l’arthrite expérimentale au collagène de la souris qui est le modèle animal le plus utilisé pour établir un effet thérapeutique dans la polyarthrite rhumatoÏde. L’induction des arthrites se fera sur des animaux de 8-12 semaines. Les scores cliniques d'arthrite seront évalués pendant 3 à 8 semaines après l'induction. Le stade de développement des animaux est déterminé par la maturation du système immunitaire. Avant 8 semaines, le système immunitaire n'est pas assez mature pour répondre correctement à l'immunisation. A partir de 12 semaines, la capacité des souris à développer des arthrites décroit avec l'âge.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ouverture de la cavité abdominale avec injection de cellules tumorales dans la rate puis ablation de la rate, suivie d'un traitement par voie intrapéritonéale, avant une mise à mort entre seize et vingt-deux jours après l'opération pour prélever leur foie. Le projet teste une bithérapie contre le cancer colorectal métastasé au foie, dont l'intérêt pour l'humain reste renvoyé au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que les méthodes in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d'un organisme et décrit la souris comme la seule espèce disponible.

Objectifs

Ces dernières années, l’immunothérapie a suscité un engouement dans le monde de la cancérologie. Cette dernière consiste à mobiliser le système immunitaire des patients pour cibler et éliminer les cellules tumorales. Les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI) ont montré des effets puissants et durables mais seulement sur un faible pourcentage de patients. L’une des raisons pouvant expliquer ces résultats pourrait être un manque d’infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs. De manière à rétablir un infiltrat lymphocytaire dans la tumeur, il est possible de cibler l’angiogenèse. L’angiogenèse correspond à la formation de nouveau vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants et est nécessaire pour assurer le transport des nutriments et de l’oxygène dans la tumeur. Au sein des tumeurs, l’angiogenèse induit un environnement immunosuppresseur et perturbe également la migration des cellules immunitaires car les vaisseaux sanguins sont anormaux. De ce fait, il est intéressant de cibler l’angiogenèse afin de normaliser les vaisseaux sanguins et de favoriser la réponse immunitaire antitumorale en réduisant l’environnement immunosuppresseur. La combinaison thérapeutique des ICI et des anti-angiogéniques a fait l’objet de nombreux essais cliniques et son efficacité est approuvée dans le traitement de plusieurs cancers solides. En dépit d’une réelle avancée ces dernières années, une compréhension plus approfondie des mécanismes d’action de cette bithérapie est nécessaire pour permettre de mieux cibler les patients répondeurs et apporter des réponses quant à son efficacité. Au laboratoire, nous avons montré que cette bithérapie améliore, in vivo, les réponses anti-tumorales dans différents modèles de cancer chez la souris. Cependant ces observations ne nous permettent pas de confirmer totalement l’intérêt de la bithérapie chez l’homme. En effet, les métastases sont la principale cause de décès du cancer chez l’homme et environ 50 % des cancers du côlon entraînent des métastases dans le foie ou encore les poumons. De plus, les cancers du côlon métastatiques sont plus difficiles à soigner. Dans ce contexte, afin de confirmer l’intérêt de la bithérapie chez l’homme nous souhaitons développer une approche d’induction de cancer colorectal métastasé dans le foie.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est d’explorer l’effet de la combinaison αPD-1 et αVEGR-2 dans un modèle de cancer colorectal en métastase hépatique pour confirmer son intérêt chez l’Homme. Les métastases sont la principale cause de décès du cancer chez l’Homme et environ 50% des cancer du côlon entrainent des métastases. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients et de confirmer que ce traitement pourrait être utilisé chez des patients présentant des métastases. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale : ouverture de la cavité abdominale, injection de cellules tumorales dans la rate, splénectomie, fermeture de la cavité abdominale. Par la suite, les souris seront traitées en intrapéritonéale. 16 et 22 jours après l’intervention chirurgicale, les souris seront mise à mort.

Impact sur les animaux

L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris et de réaliser une splénectomie. Cette intervention chirurgicale pourrait entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par l’intervention chirurgicale. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les foies.

Remplacement

1. Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. 2. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Tous le long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydration (pli de peau : si le pli persiste plusieurs seconde, l’animal est fortement déshydraté) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisées tous le long de l’expérimentation : du soins pré au post-opératoire. Des antalgiques seront utilisés pour limiter la souffrance de l’animal. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. De la nourriture sera également mise dans la cage. Pour remédier aux infections qui peuvent être causées par l’intervention chirurgicale, un travail en condition aseptique sera réalisé. Pour cela, des espaces propres et sales seront utilisés. L’espace non-stérile sera utilisé pour les soins pré-opératoires, l’anesthésie, la tonte, les soins post-opératoires. L’espace stérile sera utilisé pour la préparation des consommables utilisés lors de l’acte chirurgical et l’acte chirurgical en lui-même. De plus, les deux premiers jours suivant l’intervention, une désinfection de la cicatrice sera réalisée. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. .

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation. De plus, diverses souches de souris immunocompétentes sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, telles que les souris C57Bl/6 (MC38) et les BALB/c (CT26). Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.