Procédures sévères

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles expriment une protéine mutée qui provoque une neuroinflammation avec douleurs, fièvre, baisse de mobilité et perte de poids, et reçoivent des injections quotidiennes pendant plus de deux semaines ainsi que des prélèvements de sang par incision de la queue. L'objectif est de vérifier si le blocage d'un canal potassique réduit la neuroinflammation d'un syndrome auto-inflammatoire rare, le CAPS. Le porteur affirme que l'effet ne peut être validé que sur un modèle vivant et administre des antalgiques toutes les huit heures aux animaux les plus atteints.

Objectifs

L’inflammation est un phénomène normal de défense lorsqu’elle est bien régulée. La mutation d'une protéine peut entrainer une réaction inflammatoire exacerbée qui n'a pas lieu d'être. Ce mécanisme est à l'origine de maladies autoinflammatoires appelées Syndrôme Périodique Associé au Froid (CAPS) dont certains symptômes sont un grave déficit intellectuel et un retard de croissance dû à une réaction inflammatoire provoquée par les cellules immunitaires du cerveau (neuroinflammation). Dans notre laboratoire, au cours d'études in vitro, nous avons découvert de nouvelles protéines impliquées dans le déclenchement de l'inflammation. Dans un modèle de souris dans lesquelles on peut induire le CAPS, nous voulons confirmer que le ciblage de ces protéines par des molécules peut réduire la neuroinflammation. Les molécules que nous allons tester font déjà l'objet d'études cliniques dans le cadre d'autres maladies comme l'anémie et la sclérose en plaque.

Bénéfices attendus

L'industrie pharmaceutique réalise beaucoup d'effort pour soigner les maladies autoinflammatoires. A l’heure actuelle, aucun traitement n’existe pour traiter la neuroinflammation des patients atteints de CAPS. La neuroinflammation due au CAPS est responsable de graves déficits intellectuels et de retards de croissance importants. Si nous validons in vivo un effet des molécules testées sur la neuroinflammation, alors de nouvelles perspectives thérapeutiques s'ouvriraient non seulement pour le traitement de la neuroinflammation dans le CAPS, mais également dans les maladies neurodégénératives liées au vieillissement, y compris la maladie d'Alzheimer.

Procédures

1) 360 souris test subiront 1 injection intrapéritonéales quotidienne pendant 4j, puis une injection intrapéritonéale et 3 injections sous cutanées par jour pendant 14 j.Sur ces 360 animaux, 216 subiront en plus 1 prélèvement de 100 µl de sang tous les 6j. 2) 90 souris contrôles subiront 1 injection intrapéritonéales quotidienne pendant 4j, puis une injection intrapéritonéale par jour pendant 14 j. Sur ces 90 animaux, 54 subiront en plus 1 prélèvement de 100 µl de sang tous les 6j Chaque injection prend environ 10 secondes. Les prélèvements sanguins durent environ 1 minute: une légère incision est pratiquée sur la queue en moins d'1 seconde puis le sang qui perle est prélevé à l'aide d'un tube capillaire. Il faut environ 1 minute pour récupérer les 100 µl de sang nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

Les souris que nous testerons vont exprimer une protéine mutée dans les cellules immunitaires du cerveau. En conséquence, ces souris présenteront une neuroinflammation qui va altérer leur état général en impactant plusieurs organes et provoquer des douleurs, de la fièvre, une réduction de la mobilité et une perte de poids. Les souris pourront ressentir une légère douleur de piqure lors des injections. Les souris pourront également ressentir une légère douleur lors des prélèvements sanguins réalisés en pratiquant une incision superficielle sur la queue.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas être réutilisés, ils seront tous mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Nous avons observé sur des cellules immunitaires en culture qu'en inhibant des protéines particulières nous pouvons affecter l'activation de l'inflammasome qui constitue la première étape de la réaction inflammatoire. Cette observation a été réalisée dans un système simple (cellules en culture) dont le paramètre quantifiable est la production de molécules pro inflammatoires. Dans un contexte physiologique, ces molécules pro inflammatoires constituent en fait un relais car elles vont à leur tour activer d'autres effecteurs de l'inflammation et de la réponse immunitaire innée. Afin de vérifier le potentiel thérapeutique de cette observation, nous devons maintenant la valider dans un modèle in vivo en montrant que le blocage d'une des premières étapes de l'inflammation suffit à exercer un effet sur la réaction inflammatoire exacerbée mimant celle présentée par les patients atteints de maladies autoinflammatoires et qui met en jeu des interactions entre différents organes et différents types cellulaires.

Réduction

Ce projet nécessitera 450 souris. Ce nombre est nécessaire et suffisant pour une comparaison statistique fiable de la mortalité et des niveaux sanguins des différents marqueurs de l'inflammation. Des groupes de 18 animaux seront nécessaires pour comparer les niveaux sanguins des marqueurs de l'inflammation. Pour les mesures de survie après induction de la mutation, les groupes seront comparés statistiquement sur des échantillons de 18 souris par groupe. Nous allons aussi étudier les dommages tissulaires par histologie au jours 8 et 14 après l'induction de la neuroinflammation. Le paramètre mesuré sera le nombre de cellules immuntaires infiltrés dans les tissus qui sera comparé statistiquement entre les groupes sur des échantillons de 18 souris.

Raffinement

Dans ce projet, les animaux développeront une inflammation induite par l’expression d'une protéine mutée. Cette inflammation est sévère. Afin de limiter autant que possible leur souffrance, des traitements antalgiques puissants seront administrés toutes les 8h aux animaux testés. Après l'induction de la neuroinflammation les animaux seront surveillés 3 fois par jour et leur état état général sera scoré. Nous avons défini un point limite qui est un score au dela duquel l'état de l'animal est considéré irréversible et entrainera sa mise à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal déjà validé dans le domaine de l’inflammation. Par ailleurs, une lignée génétiquement modifiée, porteuses d’une mutation conditionnelle d'un gène, analogue à celle retrouvée chez les patients atteints de CAPS est disponible. Pour ce modèle d’inflammation induite par les souris seront utilisées au stade adulte (à partir de 8 semaines). À ce stade, le système immunitaire est complètement développé. Si les souris sont trop jeunes, le système immunitaire ne sera pas mature. Si les souris sont trop âgées, le système immunitaire ne sera plus assez efficace.

2 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Certaines reçoivent une injection à un jour de vie, puis les animaux passent sept tests comportementaux, dont un test de peur conditionnée avec choc électrique et des tests de mémoire spatiale, avant d'être tués pour prélever leurs structures cérébrales. L'objectif est de comprendre comment une carence en oméga-3 pendant le développement modifie les réseaux de neurones, à l'aide de souris transgéniques convertissant les oméga-6 en oméga-3. Le porteur qualifie le recours à l'animal de "nécessité" expérimentale et affirme n'avoir trouvé aucune méthode de substitution dans les bases de données.

Objectifs

Le but général de ce projet est de comprendre l'impact de manipulations des lipides oméga-3 et oméga-6 sur le développement de réseaux de neurones et l'activité d'autres cellules du cerveau. Pour ce faire, nous utiliserons deux modèles de souris transgéniques permettant la conversion des oméga-6 en oméga-3 dans toutes les cellules pour le premier modèle ou spécifiquement dans les neurones ou les microglies du cerveau pour le deuxième modèle.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment le statut cérébral en omégas influence le développement de sous-réseaux neuronaux et les fonctions cognitives associées.

Procédures

Certains animaux subiront 1 injection unique en sous-cutané d'une molécule à 1 jour post partum. L'injection ne dure que de 3 à 5 secondes. A la fin des expériences, les animaux seront mis à mort, préalablement injectés avec une solution analgésique puis une solution anesthésique. Les injections d'analgésique et anesthésique ne dure que de 3 à 5 secondes. Les animaux seront soumis à sept tests comportementaux, d'une durée de 5 à 15 min, à la fréquence d'un test tous les deux jours, visant à mesurer les comportements émotionnels et la mémoire spatiale.

Impact sur les animaux

L’injection de la molécule à 1 jour post partum peut induire un ralentissement du développement de la descendance avec pour conséquence un poids diminué par rapport aux animaux non traités à cette molécule, poids qui est retrouvé à l'âge adulte. Le temps d’injecter toute la portée, les petits sont séparés de leur mère pendant un cours moment et sont manipulés par l’Homme, ce qui peut créer un léger stress. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux. Le test de peur conditionnée n'induit pas de généralisation de comportement de peur chez l'animal, indiquant seulement un niveau d'inconfort lié au choc modéré. Aucun signe de perte de poids ou d'altération général de la santé de l'animal n'est induit avec ce choc.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence nutritionnelle en omega-3 sur le fonctionnement du neurone et de la microglie chez la souris pendant le développement. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également à récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les analyses biochimiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

L’objectif général du projet vise à étudier les conséquences d’une carence en oméga 3 pendant le développement sur la mise en place du système nerveux central. Pour ce faire, nous utilisons des modèles souris. Une partie de nos hypothèses ont été formulées sur la base de données obtenues in vitro. Cependant dans la cadre d’une étude faisant le lien entre la nutrition et le cerveau, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Enfin, les modèles génétiques que nous voulons utiliser pour nos études ont été construits chez la souris. Les animaux reçoivent un régime alimentaire (carencé ou équilibré en omega 3) durant toute la durée de leur développement périnatal (gestation et allaitement). Nous nous intéressons à l'effet d'une approche transgénique permettant de convertir les oméga 6 en oméga 3 sur cette altération nutritionnelle durant le développement sur l'inflammation microgliale et la mise en place de l'architecture neuronale à la fin du développement post natal à 3 semaines (au sevrage) mais également l'impact de cette carence durant la période périnatale et la période de l'adolescence sur le jeune adulte (10 semaines).

3 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Génétiquement modifiées, elles développent une colite provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson, subissent un jeûne puis un gavage et une injection de toxine bactérienne, avant la mort pour analyse du foie. Le porteur indique des diarrhées parfois sanglantes et une déshydratation, et précise qu'aucun antidouleur n'est donné pour ne pas modifier la maladie observée. Il étudie les atteintes du foie liées à la colite et juge la souris "nécessaire" comme modèle intégré.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICIs) sont des pathologies touchant plus de 2 millions de personnes en Europe, et elles sont caractérisées par une inflammation chronique du tractus gastro-intestinal. Bien que l’étiologie de ces pathologies soit encore mal caractérisée, il semblerait qu’elles soient multi factorielles (implication de facteurs génétiques, environnementaux et du microbiote). Les MICIs s’accompagnent de manifestations extra-intestinales touchant notamment le foie. Ce projet a pour but de mieux comprendre les altérations hépatiques qui se développent lors de la colite et plus particulièrement de tester le rôle des différents types cellulaires présents dans le foie dans la survenue de ces altérations. Les résultats obtenus pourront contribuer à identifier de nouveaux gènes candidats ainsi qu'à définir de nouvelles approches thérapeutiques afin de limiter les conséquences extra-intestinales de la colite. En utilisant des souris génétiquement modifiées, nous étudierons particulièrement le rôle de l’inflammation médiée par les hépatocytes, les cellules endothéliales et les cellules de Kupffer dans la survenue des conséquences extra-intestinales de la colite.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’identifier quels sont les acteurs cellulaires responsables des manifestations hépatiques lors de la colite dans un modèle murin. La colite induite par le dextran sulphate de sodium (DSS) dans notre modèle murin étant similaire à la pathologie humaine, les résultats de cette étude apporteront à plus long terme de nouvelles opportunités pour le développement de stratégies thérapeutiques pour l'Homme visant à limiter les effets de la colite sur le foie ainsi que les diverses complications associées à cette pathologie.

Procédures

Les animaux seront soumis à un traitement dans l'eau de boisson en continu pendant 7 jours au maximum induisant une colite expérimentale. Les animaux seront également soumis à un test de perméabilité intestinale 5 jours après le début du traitement. Pour cela, les animaux seront mis à jeun pendant 5h, puis gavés (1 fois, sur animal vigile) avec une solution détectable par spectrophotométrie puis un faible volume de sang sera prélevé prélevés 4 heures après gavage à la veine caudale (entaille sur la queue) à l'aide d'un capilaire hépariné (1 fois sur animal vigile, 1 min). Enfin, les animaux seront injectés par voie intrapéritonéale avec des toxines bactériennes (une seule injection par animal de 100ng sur animal vigile). L'ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

La colite expérimentale induite chez les animaux entraîne une perte de poids modérée en fonction de la durée du traitement. De plus, la colite expérimentale induit une perte de consistance des selles, ainsi que diarrhées, parfois sanglantes pour les formes les plus graves. Les diarrhées causées par le traitement peuvent également induire une déshydratation chez l'animal. Pour notre étude, le traitement n'excèdera pas 7 jours et entraîne une perte de poids inférieure à 20% du poids initial. Le suivi de poids effectué pour chaque animal peut occasionner un stress physique dû au contact entre animal et expérimentateur, notamment lors de la contention. Les souris seront mises à jeun lors du test de perméabilité intestinale afin de ne pas interférer avec la solution de gavage possédant une molécule qui se dégrade facilement. La mise à jeun ainsi que le gavage peut entrainer respectivement la faim de l'animal et un certain stress. La dose de toxine bactérienne injectée est très inférieure aux doses léthales pour la durée de la procédure (16 heures) et n'induit qu'une réaction inflammatoire. Les injections de toxine bactérienne peuvent engendrer des douleurs abdominales au niveau du site d'injection.

Devenir

L'analyse des phénomènes inflammatoires et métaboliques impliquant divers types cellulaires hépatiques lors de la colite nécessite l'euthanasie de l'ensemble des animaux à l'issue des procédures permettant une analyse approfondie.

Remplacement

Comme nous étudions des phénomènes inflammatoires et métaboliques affectant plusieurs organes, nous avons besoin d’utiliser un modèle intégré, tel que la souris. Cette étape est essentielle pour la compréhension du processus biologique étudié. L’évaluation de gènes candidats nécessite l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés.

Réduction

Au total, 3620 animaux sont impliqués dans ce projet. Pour chaque condition expérimentale des calculs de puissance seront effectués afin de déterminer la taille minimale des effectifs (mâles et femelles) nécessaires pour obtenir des résultats interprêtables et significatifs. Pour l'analyse statistique, divers tests seront employés afin de comparer les différents groupes entre eux. Dans la mesure du possible, les groupes expérimentaux partageant un même groupe contrôle seront analysés en parallèle afin de limiter le nombre d’animaux requis pour l'étude, permettant une réduction importante du nombre d'animaux requis pour l'étude. D’autre part, comme nous analysons plusieurs organes, nous récolterons un maximum d’organes au moment de la dissection afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés à l’animalerie pendant deux semaines et sont habitués à être manipulés afin de réduire leur stress. De plus, les animaux issus des mêmes portées sont regroupés par 5 maximum. Au sein de leur habitacle, les souris disposent d'enrichissement fabriqué en papier, développé pour ressembler à des fines tiges d'herbes, favorisant la nidification et diminuant ainsi leur stress. Cet enrichissement est accompagné de petites maisonnettes cartonées pour les souris mâles diminuant les risques de conflits au sein de l'habitacle. Un suivi journalier est réalisé dès le premier jour du traitement au dextran sulphate de sodium (DSS) et permettra de surveiller l’évolution de l’induction de la maladie ainsi qu'une éventuelle atteinte des points limites. Comme nous étudions les effets de l’inflammation de l’intestin sur le foie, nous ne pouvons pas utiliser de traitements analgésiques qui sont susceptibles de modifier le phénotype observé.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés sont pertinents car la souris est la seule espèce de mammifère dans laquelle des invalidations géniques ciblées et spécifiques de certains tissus et cellules peuvent être réalisées dans l’état actuel des connaissances techniques et scientifiques. D’autre part, la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme et elles sont faciles à manipuler. Pour notre étude, nous aurons recours a des lignées génétiquement modifiées et qui permet notamment l'exploration fonctionnelle approfondie de processus biologiques complexes. L'utilisation de lignées transgéniques pour ce projet est nécessaire car elles permettent d'étudier spécifiquement l'implication de divers partenaires protéiques, moléculaires et cellulaires impliqués dans la colite. L'étude d'un systéme immunitaire mature nécessite d'avoir recours à des souris adultes (entre 12 et 15 semaines) pour l'ensemble des expérimentations.

1 320 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Rendus progressivement aveugles par une dégénérescence de la rétine, ils reçoivent un implant sous la rétine et, pour une partie, une ouverture du crâne afin de mesurer l'activité visuelle du cerveau, parfois sur des études suivies jusqu'à un an. Le porteur signale un risque de déchirure de la rétine, de cataracte et une hémorragie cérébrale dans un cas sur quatre lors du retrait de l'os du crâne. Il teste des prototypes d'implants rétiniens et juge l'animal "indispensable" pour évaluer la vision restaurée.

Objectifs

Les implants sous-rétiniens sont une source d’espoir pour les patients atteints de déficiences visuelles évolutives, telles les rétinites pigmentaires ou les formes sèches de la dégénérescence maculaire liée à l’âge, pour lesquelles il n'existe pas actuellement de traitements efficaces. Ce projet a pour but d’évaluer les performances de prototypes d’implants rétiniens sur des rongeurs.

Bénéfices attendus

La restauration visuelle par rétine artificielle est un espoir de traitement pour les patients atteints de cécité due à des maladies dégénératives des photorécepteurs de la rétine. L’implant sous rétinien, dont le but est de remplacer la fonction de ces cellules perdues, permettra d'activer les voies et les aires visuelles supérieures et in fine redonner la vue. Dans ce projet, l’efficacité des implants photoacoustiques sera mise en évidence par des mesures de l’activité des aires visuelles cérébrales. La finalité de ce projet est de montrer, lors de stimulations lumineuses, des variations de l’activité neuronale provoquées par l’implant et d’évaluer ainsi l’acuité visuelle retrouvée.

Procédures

CHIRURGIE : Pose d’un implant rétinien, sous anesthésie générale et analgésie. Durée de l’intervention : 10 minutes. Sur certains rats implantés, une craniotomie ou la création d’une fenêtre crâniale chronique sera réalisée afin de pouvoir mesurer l’activité électrique du cerveau. Craniotomie, 1 fois par animal, sous anesthésie générale et analgésie. Durée de l’intervention : 40 mn. Création d’une fenêtre crâniale chronique (pour des études longitudinales), sous anesthésie générale, 1 fois par animal. Durée de l’intervention : 1h30. ETUDES/OBSERVATIONS : Observation du fond de l’œil et de la structure de la rétine par des techniques optiques d’observation, sous anesthésie générale et analgésie. Durée : moins de 5 minutes par observation. Deux à quatre fois par animal. Mesure de l’activité électrique du cerveau (transmission de l’information visuelle) par enregistrement des potentiels évoqués visuels, sous anesthésie générale et analgésie. Durée 1h30, 1 fois par animal, expérimentation terminale. Mesure de l’activité cérébrale (transmission de l’information visuelle) par imagerie ultrasonore, sous anesthésie générale et analgésie. Durée 1h30. En cas de craniotomie préalable : 1 fois par animal, expérimentation terminale. En cas d’étude longitudinale : jusqu’à 12 fois par animal sur une période de 12 mois.

Impact sur les animaux

Risque faible d’une mauvaise réaction à l’anesthésie Lors de la pose de l’implant rétinien, il existe un petit risque de déchirement du tissu rétinien et d’une petite hémorragie localisée. Dans les jours qui suivent la pose, une cataracte ou une inflammation localisée du tissu rétinien peut apparaître. Cette dernière se résorbe généralement sous 15 jours. Ces complications restent cependant assez rares (moins de 5 pourcents) Pour la création de fenêtre crâniale (chirurgie), le risque principal est l’hémorragie cérébrale lors du retrait de l’os crânien (25 pourcent des cas). Lors de la pose d’une fenêtre chronique, il peut y avoir perte de cette dernière dans les mois post-chirurgie. Pour les rats avec une fenêtre chronique, risque de blessures entre congénères s’ils ne sont pas isolés.

Devenir

Des prélèvements et analyses des yeux et des implants sont nécessaires post-mortem. L’ensemble des animaux sera euthanasié en fin de période de maintien (21 jours pour les études aigües, 3 mois ou 1 an pour les études chroniques).

Remplacement

Dans ce projet, l’évaluation des réactions inflammatoires (biocompatibilité des matériaux à moyen terme) et la restauration de la vision au niveau de la rétine ainsi que la transmission de l’information visuelle au cerveau ne peuvent pas être réalisées par des expérimentations ex vivo. Les mécanismes physiologiques (dépolarisations corticales) et variations de flux sanguin au niveau du cortex visuel, ne peuvent être observés que sur un cerveau en fonctionnement. Ainsi l’acuité visuelle restaurée ne peut être évaluée que par des tests chez l’animal in vivo. L’utilisation de l’animal est donc indispensable.

Réduction

Basé sur l’expertise du laboratoire et sur des projets proches, le nombre total d’animaux, 1220 rats, a été estimé pour obtenir un nombre minimum de résultats significatifs tenant compte des éventuelles pertes dues à des complications chirurgicales, à une mauvaise réaction à l’anesthésie durant les procédures expérimentales. La rédaction d’un protocole précis ainsi que la bonne maîtrise des outils de chirurgie et d’imagerie par les expérimentateurs correspondants permet de minimiser les pertes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir ventilé dans des cages de stabulation avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Nous utilisons de la litière de peuplier dépoussiérée de 2 mm. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des étiquettes de suivi post-opératoire seront visibles sur les cages afin d’avoir une surveillance accrue. Ces étiquettes indiquent que les animaux ont eu une chirurgie ainsi que toutes les procédures effectuées. Les points limites adaptés à chaque procédure ont été établis. Lors des procédures, les animaux bénéficieront si nécessaire d’une anesthésie. Les chirurgies seront dans le respect de l’asepsie. Les paramètres physiologiques du rat opéré seront visibles à l’aide d’un système montrant l’oxygénation du sang, la température rectale et la fréquence cardiaque. Des analgésiques adaptés seront utilisés en préopératoire et post-opératoire. Après toute intervention chirurgicale, une dose de glucose sera injectée en intra-péritonéal et une gelée post-opératoire sera mise dans la cage. Les animaux ayant une fenêtre crâniale chronique seront isolés pour éviter toute dégradation du dispositif entre congénères. Un enrichissement supplémentaire sera placé dans la cage.

Choix des espèces

Nous utilisons un modèle de rat ayant une dégénérescence des cellules rétiniennes qui le rend progressivement aveugle. Cette dégénérescence est comparable aux rétinites pigmentaires constatées chez l’Homme. Nous utiliserons des rats âgés de 9 à 11 mois au début des procédures, âge à laquelle leur rétinite pigmentaire sera suffisamment avancée pour notre étude de restauration visuelle avec des implants rétiniens. Au-delà de 12 mois, la rétine dégénérée des rats est très fine et fragile, ce qui augmente le risque de complications chirurgicales suite à l’implantation de l’implant. Les rats sains (à la vue normale) utilisés seront quant à eux âgés d’au moins 8 semaines, âge auquel la rétine de l’animal est mature et peut donc servir de contrôle pertinent par rapport à une rétine dégénérée.

286 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 225 d'entre elles et modéré pour 61. Elles appartiennent à une lignée transgénique qui développe spontanément une arthrite : les articulations, surtout aux pattes arrière, gonflent jusqu'à rendre la marche douloureuse, et une partie des souris reçoit des antibiotiques dès la naissance, par une voie que le résumé ne précise pas. Chaque semaine, des recueils d'urine et de selles et une prise de sang à la joue sont pratiqués, y compris sur les mères gestantes puis allaitantes, dont le lait peut aussi être extrait par massage des mamelles, et les nouveau-nés peuvent subir une biopsie dès la naissance pour vérifier leur génotype. Les souris d'élevage sont tuées à partir de 160 jours, quand l'arthrite est installée, et les souris traitées aux antibiotiques à 12 semaines au plus tard. Le porteur attend des résultats qui "pourraient influencer l'utilisation des antibiotiques chez les enfants", et affirme que "le modèle animal ne peut pas être remplacé".

Objectifs

Les rhumatismes inflammatoires correspondent à une inflammation articulaire, appelée arthrite, dans le cadre de maladies générales de l'organisme avec un risque de handicap et une baisse de la qualité de vie. Les mécanismes aboutissant aux rhumatismes inflammatoires restent mal connus. Le corps humain est l'hôte d'une communauté microbienne, dont la plus importante est le microbiote qui réside dans les intestins. Les micro-organismes présents sont capables d’interagir avec différentes cellules immunitaires, qui agissent comme des sentinelles. Des études antérieures ont montré que les traitements antibiotiques étaient associés au développement de l'arthrite chez les enfants. Néanmoins, la méthodologie de ces études ne permet pas d’établir un lien causal, et les mécanismes par lesquels ces médicaments influencent la physiopathologie de l'arthrite restent inexplorés. D'autres études ont observé que la translocation de fragments de bactéries, présentes dans l'intestin, vers le système sanguin de l'organisme était augmentée chez les souris arthritiques. Un plus grand nombre de fragments de bactéries ont également été retrouvés dans le sang de patients atteints d'arthrite. Sachant que l'un des mécanismes d'action des traitements antibiotiques est la destruction des bactéries de l’intestin, cela provoque une augmentation de fragments bactériens dans l’intestin. Nous formulons alors l'hypothèse que le traitement antibiotique peut être responsable d'une augmentation significative de fragments bactériens libres capables de pénétrer dans l’organisme et d'augmenter la sévérité de l'arthrite. Ainsi, dans cette étude, nous étudierons le rôle des antibiotiques dans la physiopathologie de l'arthrite. L'exploration complexe du lien entre le tube digestif et l'arthrite inflammatoire nécessite d’être réalisée sur des animaux puisqu’à ce jour aucun système cellulaire in vitro ne permet de reproduire ces interactions complexes. Nous utiliserons un modèle murin transgénique qui développe spontanément une arthrite ressemblant à l'arthrite humaine. Seront étudiés les effets de différents types d'antibiotiques sur la translocation de fragments de bactéries, l'activation immunitaire et le développement de l'arthrite.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir un lien mécanistique entre le traitement antibiotique à un jeune âge et le développement ultérieur d'une arthrite inflammatoire. Les résultats pourraient influencer l'utilisation des antibiotiques chez les enfants, et éventuellement guider le choix des molécules à utiliser dans les populations à risque de développer une arthrite.

Procédures

L'urine sera collectée une fois par semaine chez les mères (enceintes et allaitantes) et les nouveau-nés après le sevrage, soit après contention avec la main du manipulateur et placement d'un tube collecteur au niveau de l'urètre ; soit en isolant la souris quelques instants dans une cage séparée pour une courte durée si nécessaire (moins de 30 minutes), l'urine présente dans la cage sera alors aspirée à l'aide d'une pipette. Une fois par semaine, les selles sont recueillies en isolant les souris quelques instants dans une cage séparée (moins de 30 minutes). Des échantillons de sang sont prélevés sur la mandibule (sous-maxillaire) une fois par semaine. Il s'agit de piquer, à l'aide d'une aiguille fine, une zone de la joue de la souris connue pour avoir une veine facilement accessible. Cela permet de récupérer facilement 2 à 3 gouttes de sang, avec une cicatrisation rapide et un traumatisme limité pour la souris. La souris pourra être endormie à l'aide d'un anesthésique gazeux, afin de réduire le stress et l'inconfort de la procédure pour la souris. Conformément aux recommandations actuelles, le volume prélevé sera inférieur à 7,5 % du volume sanguin total de l'animal. Le lait maternel peut être prélevé pour l'analyse post-traitement, conformément aux procédures existantes dans la littérature. Les souris seront endormies comme décrit ci-dessus et placées sur le dos afin d'avoir accès à leur estomac et à leurs mamelles. Les souris peuvent être endormies à l'isoflurane (anesthésie gazeuse) si la procédure est inconfortable pour elles. Les mamelles seront massées pour stimuler la sortie du lait, qui sera récupéré à l’aide d’une pipette. Seule la moitié des mamelles sont utilisées, afin de laisser suffisamment de lait à la mère pour nourrir ses petits. Une biopsie peut être prélevée sur les nouveau-nés dès leur naissance, afin d'effectuer une étude génétique de la souris, pour s'assurer que la mutation génétique est toujours présente.

Impact sur les animaux

Ce projet de recherche a comme effet indésirable attendu l’augmentation de la sévérité de l’arthrite provoquant la douleur chez les souris selon les traitements reçus et leurs durées. L’arthrite évoluera par une augmentation du gonflement des articulations (principalement des pattes arrières) plus ou moins rapide et forte, pouvant devenir douloureuse lors de la marche. Les souris seront alors surveillées quotidiennement par les animaliers ou les expérimentateurs. Pour cela, une grille de score de bien-être est mise en place afin de juger l’état douloureux de l’articulation ainsi que la souffrance animale. Les souris seront euthanasiées si leur état se dégrade soudainement ou si le score déterminé à partir de la grille est supérieur à la limite établie.

Devenir

Pour les souris en élevage, après 160 jours de vie, l’arthrite sera bien installée. Ainsi, prolonger leur durée de vie ou leur donner de nouvelles portées, risque de les rendre plus douloureuses. Pour éviter ce risque de diminution du bien-être, les souris seront euthanasiées à partir de 160 jours de vie. Concernant les souris nées sous différents traitements antibiotiques, les souris seront euthanasiées à 12 semaines de vie maximum. Les mères ayant mi-bas pourront être réintroduit dans la procédure d’élevage pour avoir une nouvelle portée, à partir de 160 jours de vie, elles seront euthanasiées.

Remplacement

Aujourd’hui, il n’existe pas de système permettant d’évaluer l’arthrite en dehors du modèle animal. En effet l’arthrite apparait selon des facteurs génétiques, environnementaux et hormonaux qui ne sont pas clairement connus et difficiles à reproduire en dehors du modèle animal. De plus, l’arthrite du modèle animal est très proche de celle retrouvée chez l’homme. Il n’existe pas non plus de modèle permettant de comprendre l’effet systémique des antibiotiques sur la sévérité. Notre modèle cherche à comprendre l’implication et l’interaction entre le système digestif et l’apparition ou le développement de l’arthrite. Il n’existe pas de méthode alternative pour comprendre l’interaction entre plusieurs organes différents. Pour cela, le modèle animal ne peut pas être remplacé.

Réduction

Le nombre d'animaux que nous estimons nécessaire repose sur notre expérience de la conception d’études de ce type et sur notre volonté à utiliser le moins d’animaux possible tout en nous permettant d’avoir assez de résultats pour réaliser une interprétation fiable des données. Ainsi, le nombre de souris est réduit au strict minimum pour obtenir des résultats pertinents statistiquement. Ce nombre tient compte du nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi éviter des erreurs d’interprétation.

Raffinement

Chaque souris aura à sa disposition du coton et/ou un abri dans sa cage pour se former un nid. Des morceaux de bois pourront être donnés à des souris isolées ou en faible effectif afin de permettre le jeu et l’exploration d’objet. Les souris seront hébergées en groupe de 6 individus maximum dans des cages sur des portoirs ventilés. Une exception existe, où les souris pourront être isolées durant leur gestation et selon les traitements. Dans ce cas, une surveillance accrue et davantage de coton et bois seront donnés à la souris isolée. En cas de souffrance d’un animal, une grille de score a été établie pour juger de l’intensité de la douleur. Ainsi, en fonction du score, des dispositions seront prises pour améliorer le bien-être. Cela peut aller de l’augmentation de l’enrichissement (coton, tunnel, buchettes), au dépôt de nourriture et d’eau dans la cage, à l’augmentation de la surveillance, arrêt de la procédure ou euthanasie de l’animal si le score de douleur est jugé trop important.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont la physiologie et le système immunitaire sont très proches de ceux de l'homme, et il existe des lignées avec des modifications conduisant à une inactivation des gènes, ce qui permet de reproduire des maladies et étudier les mécanismes sous-jacents. Les résultats expérimentaux obtenus chez la souris ont donc de fortes chances d'être transposés à l'homme. Le modèle murin d'arthrite inflammatoire chronique spontanée utilisé dans ce projet est très proche de l'arthrite observée chez l'homme. Il s'agit d'une souris chez laquelle est invalidé un gène qui empêche l'activation d'un récepteur impliqué dans l'inflammation, appelé récepteur de l'interleukine 1 (IL1). Par conséquent, ce récepteur est constamment stimulé, ce qui entraîne une suractivation de l'inflammation et la sécrétion de substances inflammatoires, tel que le l'interleukin-1. Dans le cas de ces souris, l'inflammation est présente dans les articulations, ce qui provoque leur inflammation. Dans la précédente demande d’autorisation de projets, nous avons remarqué que plus les souris recevaient des antibiotiques à un âge jeune, plus l’arthrite devenait précoce et sévère avec le temps. C’est pourquoi dans ce projet, nous donnerons des antibiotiques à des souris dès la naissance pour étudier le phénomène d’apparition de l’arthrite et les mécanismes biologiques impliqués chez l’enfant et au cours du temps. Ce projet permettra de mieux comprendre l’arthrite juvénile idiopathique (AJI) observée chez l’homme.

3 000 rongeurs, 2 500 souris et 500 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur injecte des anticorps puis une toxine bactérienne pour déclencher une arthrite, avec gavages, injections répétées et prises de sang par voie rétro-orbitaire, afin de tester des composés à potentiel thérapeutique répartis sur cinquante études. Le porteur décrit une maladie qui provoque des œdèmes des pattes, des ankyloses et des douleurs spontanées, une ankylose ou une nécrose sévère entraînant une mise à mort immédiate. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit la complexité des maladies inflammatoires des articulations.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de solutions thérapeutiques innovantes pour l’arthrite rhumatoïde qui est une maladie chronique auto-immune systémique qui touche principalement les articulations. Elle induit des lésions causées par des cytokines, des chimiokines et des métalloprotéases. Les articulations périphériques sont symétriquement enflammées, provoquant une destruction progressive des structures articulaires et des désordres généraux entrainant douleurs et handicaps qui empêchent d'effectuer les gestes quotidiens et activités professionnelles. Les traitements médicamenteux disponibles ont pour objectif de réduire l'inflammation pour prévenir les érosions articulaires mais les effets sont en général insuffisants. Par ailleurs leurs utilisations sont limitées à cause d’effets indésirables. Ces traitements incluent les antirhumatismaux modificateurs de la maladie, des agents biologiques (anti-TNF, anti-IL-1, anti-IL-6), des dépléteurs des lymphocytes B, des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et des corticostéroïdes. Tous les traitements biologiques présentent des risques d’infections sérieux (tuberculose, septicémie), et peuvent induire la production d’anticorps neutralisants. Les AINS induisent des effets cardiovasculaires et gastrointestinaux qui peuvent être très sévères. Par conséquent l’arthrite rhumatoïde est une maladie dont les besoins médicaux ne sont toujours pas satisfaits. Il est donc urgent de développer de nouvelles solutions thérapeutiques pour les patients souffrant de cette maladie, qui soient plus efficaces et mieux tolérées. La recherche visant à la mise au point de nouveau traitement contre la polyarthrite rhumatoïde est très active grâce à l’identification de nombreuses cibles potentielles en partie grâce au développement des technologies de séquençage génétique : molécules d’activation des macrophages, des polynucléaires, cytokines de l’inflammation ou de l’angiogenèse, cibles intracellulaires et autres molécules de signalisation. Des anomalies du microbiote intestinal associées à la maladie ont aussi été mises en évidence. Des thérapies cellulaires sont elles aussi en développement. Le projet permettra d’évaluer l’efficacité de nouvelles substances à potentiel thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les traitements médicamenteux pour l’arthrite rhumatoïde, souvent prescrits en association, ont pour objectif de réduire l'inflammation pour prévenir les érosions mais les effets sont en général insuffisants et leurs utilisations sont limitées par des effets indésirables. Ces traitements incluent les antirhumatismaux modificateurs de la maladie, des agents biologiques (antagonistes du TNF-alpha, inhibiteurs des récepteurs de l'interleukine-1 (IL-1), inhibiteurs de l'interleukine-6 (IL-6), des dépléteurs des lymphocytes B, des molécules modulatrices des lymphocytes T, des inhibiteurs de la Janus kinase, des AINS contre la douleur, des corticostéroïdes par voie systémique ou en intra-articulaire. Tous les traitements biologiques présentent des risques d’infections sérieux (tuberculose, septicémie), et peuvent induire la production d’anticorps neutralisants. Les AINS induisent des effets cardiovasculaires et gastrointestinaux qui peuvent être très sévères. L’arthrite rhumatoïde est une maladie dont les besoins médicaux ne sont toujours pas satisfaits. Il est donc urgent de développer de nouvelles solutions thérapeutiques pour les patients souffrant de cette maladie, qui soient plus efficaces et mieux tolérées. A long terme, ce projet pourrait satisfaire ce besoin. A court terme les données générées permettront de faire avancer les programmes de recherche : Par exemple, un composé peu efficace sur l’une des deux procédures peut indiquer le besoin de développer des dérivés structuraux plus actifs, ou bien invalider la cible d’intérêt ce qui conduit à l’arrêt du programme. Un composé efficace peut faire progresser le projet vers la phase de développement clinique.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux. • Pesées : Durée de 30 secondes, sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Mesure de la température corporelle : Durée de 1min, sur animal vigile ou sous anesthésie générale via une sonde rectale pour rongeur. • Prise de photographies des pattes en les posant sur une plateforme en verre (animal vigile) Durée de 15 secondes • Prélèvement de sang par voie retro orbitale au cours des procédures : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. • Prélèvements de sang via la veine caudale ou à la submandibulaire : Durée 30 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 20 à 50 μl chez la souris et de 20 à 200 μl chez le rat. Le volume total prélevé n’excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l’animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place pouvant aller jusqu’à une semaine. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques par voir orale (gavage à l’aide d’une sonde gastrique), intrapéritonéale, sous-cutanée ou via la veine caudale : Sur animaux vigiles, durée de 30 secondes. • Administrations intraveineuses par voie retro orbitale : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. • Immunisation par voie intradermique ou sous-cutanée, au niveau de la queue : Durée 30 secondes, une seule injection, sur animal vigile • Induction de l’arthrite par injection intrapéritonéal d’anticorps : Durée de 30 secondes, sur animal vigile, une seule injection • Boost de LPS par voie intrapéritonéale : Durée de 30 secondes sur animal vigile, une seule injection.

Impact sur les animaux

Ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal. L’induction de l’arthrite peut engendrer une hypothermie et un état de fatigue passagere (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car l’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différent tissues dont les articulations et les tissus lymphatiques.

Remplacement

A notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui reproduisent l’extrême complexité des maladies inflammatoires articulaires. Celle-ci intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’intéraction du composé avec la cible d’intéret (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux. 50 études seront réalisées dans le cadre de ce projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux exigences règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront hébergés en groupe dans des cages contenant de l’enrichissement afin de satisfaire la manifestation de leurs comportements naturels (nidification, instinct grégaire, recherche de nourriture, etc.). Les procédures potentiellement douloureuses ou source d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale gazeuse. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique journalière sur la durée des procédures. Les locaux d'hébergement et les systèmes d’hébergement suivront un programme d’hygiène et sanitaires (programme sanitaires) afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adapté sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet tels que l’ajout d’eau gélifiée ou de nourriture au sein de la cage pour faciliter la prise alimentaire des animaux ainsi que l’utilisation de litière adéquate si nécessaire, par ou sous l'autorité du vétérinaire ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Le stress lié à la manipulation peut avoir un impact sur la réponse inflammatoire et immunitaire, c’est pourquoi une habituation sera réalisée avant l’induction de l’arthrite. Des critères d'arrêt anticipés seront mis en place, suivant la grille de score établie, pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris qui sont communément utilisées en pharmacologie. De nombreuses données sur les modèles d’inflammation chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de l’agent arthritogène, effets de molécules de références etc.). Adulte: Les données de la littérature indique clairement que les rats et les souris adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine de l’arthrite car ils doivent disposer d'une système immunitaire mature.