Procédures sévères

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rendues obèses ou déficientes pour un récepteur des lipides, elles subissent une chirurgie de l'estomac et de l'intestin d'environ une heure puis des prises de sang répétées, avant d'être tuées deux mois plus tard pour prélever l'aorte. Le porteur annonce une mortalité pouvant atteindre 20 % après l'opération, des douleurs pendant cinq jours, un risque de lâchage de la cicatrice et une dénutrition. Il compare deux techniques de chirurgie de l'obésité pour leur effet sur la plaque d'athérome et affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace l'animal dans ce domaine.

Objectifs

La chirurgie bariatrique, inclue plusieurs techniques comme la sleeve gastrectomie (SG), le bypass gastrique de Roux en Y (RYGB). Malgré le statut de référence qu’occupe le RYGB dans le traitement de l’obésité morbide, des échecs avoisinant les 20% sont observés, en particulier chez les patients super obèses dont la prise en charge pose problème. Dans ce contexte, le SADI-S (single-anastomosis duodeno-ileal bypass with sleeve gastrectomy), a été récemment développé. Cette intervention consiste en un bypass duodéno-iléal avec anastomose unique associée à une SG. L’anastomose digestive unique rend le SADI-S moins complexe que le RYGB (qui nécessite 2 sutures digestives). Nous avons récemment mis au point au laboratoire un modèle murin de SADI-S, dont les premiers résultats en comparaison du RYGB montrent, chez la souris Ob/Ob (naturellement obèse) une amélioration importante de l’homéostasie glucido-lipidique, associée à une perte de poids qui avoisine les 40%. Ces résultats, comparables à ceux observés chez l’homme, laissent entrevoir une réduction importante du risque cardiovasculaire, qui n’a pas à ce jour été évaluée chez l’homme après SADI-S. Les études menées chez l’homme suggèrent un effet bénéfique du RYGB sur la plaque d’athérome par mesure échographique de l’épaisseur intima-média carotidienne et par coronarographie , mais les mécanismes mis en jeu restent encore peu connus, et aucune étude n’a évalué les effets du SADI-S sur l’athérosclérose. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact du SADI-S, en comparaison du RYGB, sur le développement et/ou la régression de la plaque d’athérosclérose chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus d’un tel projet s’inscrivent dans la réflexion, d’actualité, autour des chirurgies métaboliques et de leur indication chez des patients obèses présentant des comorbidités variées. Si le SADI-S, intervention émergente dont la réalisation en pratique clinique est en plein essor, semble s’accompagner d’effets métaboliques marqués, les mécanismes mis en jeu et les conséquences sur le long terme restent peu connus. Une étude clinique nationale française est actuellement en cours pour comparer ses effets avec ceux du RYGB (NCT03610256). Notre étude sur modèle animal, en améliorant la connaissance des effets du SADI-S et du RYGB en particulier sur la plaque d’athérome, pourrait en particulier permettre de mieux cibler les indications opératoires de ces types de chirurgies selon le profile métabolique du patient.

Procédures

Chaque souris de chaque groupe sera opérée d’une chirurgie (soit une chirurgie de type RYGB, soit une chirurgie de type SADI-S ou une chirurgie de type Sham) d’une durée moyenne d’environ 65 minutes. Pour ces deux groupes expérimentaux, un prélèvement de sang par une coupure minime à l’extrémité de la queue sera réalisé à différents temps (30 microlitres) : avant la mise sous régime, à une semaine et à deux semaines après la mise sous régime puis tous les mois jusqu’à la chirurgie et tous les mois après la chirurgie, afin de déterminer la cholestérolémie et la glycémie. Les souris seront randomisées dans 2 groupes expérimentaux (groupe "sham" ou laparotomie; ou groupe type chirurgie bariatrique) en fonction de leur poids et de leur cholestérolémie. Après une semaine de récupération, les animaux seront mis en condition pour la chirurgie bariatrique.

Impact sur les animaux

En tant que protocole sévère, les effets indésirables attendus sont : - Une mortalité entre 0 et 20% après chirurgie; - Des douleurs pendant les 5 premiers jours qui nécessitent une antalgie appropriée; - Un risque de désunion cicatricielle post-opératoire qui nécessite une surveillance biquotidienne initiale - Une dénutrition qui nécessite une supplémentation ferrique et vitaminique quotidienne

Devenir

A l'issue de la chirurgie (procédure 1) toutes souris seront gardées 2 mois en vie et seront euthanasiées pour le prélèvement de l'aorte afin de mesurer la plaque d’athérome.

Remplacement

Les conséquences physiologiques du SADI-S et du Gastrique Bypass en Y impliquent un système biologique intégré et régulé par de nombreux paramètres (nerveux, hormonal, nutritionnel) et ne peut donc pas être substitué par des approches ex vivo ou in vitro. Il n’existe pas à l’heure de méthodes ex vivo / in vitro de remplacement à l’expérimentation animale dans le domaine de la chirurgie bariatrique.

Réduction

Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

La procédure 1 est classée sévère. Un protocole péri-opératoire a été mis en place afin de limiter la douleur et la souffrance de l’animal. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale par Isoflurane. Les animaux reçoivent avant la chirurgie puis pendant une durée de 3 jours de la buprénorphine et de l’amoxicilline. Des injections de metoclopramide seront réalisées avant la chirurgie et jusqu’à J5. Les souris seront nourries avec une nourriture sous forme de gel riche en graisse (Geldiet highfat, 10% Saindoux, 10% sucre liquide, 57% eau, Safe) de J1 à J5, puis le régime riche en graisse sous forme solide sera réintroduit à partir de J3. Les souris seront supplémentées en fer et en vitamines ad libitum dans l’eau de boisson jusqu’à la fin du protocole afin de prévenir l’anémie et les carences nutritionnelles. Les souris seront placées en couveuse à 30°C pendant 5 jours post-chirurgie et leur cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les différentes voies et les transporteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines. Outre l’existence de nombreux modèles de souris génétiquement modifiés, ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie (anticorps, test ELISA, dosage colorimétrique) et/ou de biologie moléculaire (Primers, Sh-RNA,...) qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Nous avons au laboratoire une lignée de souris déficientes en LDLr et nous commanderons des souris Ob/Ob. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 2 et 5 mois). A ce stade, les paramètres cardiovasculaires sont stables. Ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.

1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent pendant seize semaines un régime carencé destiné à induire une maladie du foie gras (stéatohépatite), puis des injections et des prises de sang sous anesthésie, pour évaluer des composés du laboratoire déjà engagés en essais cliniques. Le porteur indique que l'induction de la maladie provoque une perte de poids progressive, un ictère et des œdèmes, et que les prélèvements peuvent rarement entraîner une cécité. Il juge le modèle animal "indispensable" et affirme que la maladie et son traitement ne peuvent s'étudier que sur un "organisme entier".

Objectifs

La NASH, aussi appelée « maladie du foie gras » est une stéatose hépatique non alcoolique constituant un problème de santé publique dans la société occidentale. Cette maladie se caractérise par une accumulation excessive de graisse dans le foie associée à une inflammation localisée. Cette dérégulation physiologique provoque la formation de lésion et une hyperactivation du système immunitaire. La NASH est une maladie silencieuse et évolutive pouvant atteindre des stades sévères tels que la cirrhose ou le carcinome hépatocellulaire (cancer). Cette maladie touche entre 1.5 et 6.45 % de la population mondiale. Actuellement, aucun médicament n’a été approuvé par la Food and Drug Administration et par l’Agence Européenne des médicaments. La seule alternative thérapeutique efficace pour les patients est la transplantation hépatique. L’alternative médicamenteuse est primordiale pour les patients. C’est pour cette raison qu’il est urgent de développer un traitement efficace et sûr pour les patients atteints de NASH. L’efficacité thérapeutique et l’innocuité de nos composés ont été démontrées avec succès sur des modèles souris de diverses pathologies auto-inflammatoires ou auto-immunes. Grâce à ces études précliniques le laboratoire a pu engager des essais réglementaires chez l’homme. Des études cliniques ont montré que nos composés sont sûrs et bien tolérés chez l’homme. De plus, l’utilisation de thérapie cellulaire a été proposée comme alternative à la transplantation hépatique. En effet, il a été démontré que les thérapies cellulaires ont la capacité de restaurer la fonction de certains organes. Cependant, une des limitations de cette stratégie est le manque de résistance de ces cellules dans l’organisme. Les molécules sécrétées par ces cellules ont également des propriétés thérapeutiques sans les contraintes liées aux thérapies à base de cellules souches. L’objet de nos études est d’évaluer et de valider le potentiel thérapeutique de nos composés pour le traitement de cette maladie du foie.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur les patients atteints de NASH. Nos travaux permettront de mieux comprendre le rôle et l’influence du système immunitaire dans le développement de cette pathologie. Nos résultats pourraient contribuer à fournir de nouvelles preuves concernant le ciblage et la régulation de l'inflammation dans la NASH, en tant qu'approche thérapeutique prometteuse. La découverte de nouveaux médicaments pour le traitement de la NASH améliorerait considérablement la qualité et l’espérance de vie des patients.

Procédures

Interventions sur les animaux : - Tous les animaux subiront un régime alimentaire modifié qui ne réponds pas à tous les besoins nutritionnels de l’animal pour induire la maladie (16 semaines maximum). - Tous les animaux subiront trois à huit injections sous anesthésie générale (1 minute/animal). - Tous les animaux subiront deux prélèvement sanguin sous anesthésie générale (3 minutes/animal).

Impact sur les animaux

L’induction de la NASH se manifeste par une perte de poids progressive. La NASH peut conduire à la manifestation d’ictère, d’œdème. De manière extrêmement rare, l'injection et les prélèvements sanguins peuvent conduire à la manifestation d’évènements tels qu’une hypothermie, une inflammation et une cécité. Aucun effet secondaire n’est attendu suite à l’administration des composés d’intérêts.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérience sous anesthésie générale pour le prélèvement d’organes. Nous devons collecter les organes pour réaliser des analyses. Ces analyses vont nous permettre de confirmer que la maladie qui a été induite est similaire à la maladie humaine mais également de voir si nos traitements ont un effet résolutif sur cette maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux dans ce projet est indispensable car l’apparition et la progression de la maladie impliquent le foie mais également le système immunitaire qui joue un rôle majeur dans le développement et la progression de la maladie. De plus, notre stratégie thérapeutique repose sur une modulation du système immunitaire pour réduire la progression et améliorer la résolution de la NASH. Cette étude ne peut être simplifiée en utilisant des systèmes non-animaux. Afin de comprendre le rôle joué par les différents organes et tissus de l’organisme et les mécanismes qui impliquent leur communication lors de la détermination et de la progression de la maladie, il est nécessaire d’étudier un organisme entier. Actuellement, il n’y a pas d’alternative disponible à un modèle non-animal qui puisse nous permettre de répondre à nos questions. Le modèle de souris représente la meilleure stratégie pour générer des données qui peuvent avoir un impact translationnel futur chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux dans le projet est estimé en considérant la nécessité de réduire l’utilisation d’animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes répondant aux objectifs de cette étude.

Raffinement

Pour garantir le bien-être de l’animal, nous avons défini des seuils de tolérance basés sur le poids corporel, la température corporelle. L’induction de la maladie chez l’animal est longue car nous avons choisi d’induire la maladie à l’aide d’un régime alimentaire modifié et non à l’aide de molécule hépatotoxique. Tous les animaux seront maintenus dans un groupe social et dans des cages enrichies (matériaux de nidification et tubes). Nous avons établi des points limites nous permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Toutes les injections et tous les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale pour réduire le stress ressenti par l’animal. En complément d’une anesthésie générale, un analgésique local pourra être utiliser pour limiter la douleur à l’endroit de l’injection et du prélèvement.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux de NASH disponibles, nous avons choisi d’utiliser un modèle induit par une alimentation modifiée. Ce modèle est privilégié en raison de l’apparition rapide de la maladie et de ses multiples manifestations voisines de celles déclarées chez les patients. Ce modèle murin est considéré aujourd’hui comme un modèle préclinique pertinent pour établir la preuve de concept de l'efficacité de nouvelles thérapies. Le stade de développement des animaux est de 9 semaines (souris adulte) au commencement de l’étude. De plus, il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour évaluer le potentiel thérapeutique de nos composés.

11 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Âgés de trois à quatre mois, ils subissent l'ouverture de la cage thoracique et une résection partielle du poumon agrafée avec un renfort de suture à base d'alginate, puis un suivi par scanner sous anesthésie pendant six à neuf mois avant d'être tués pour analyse de l'organe. L'objectif n'est pas thérapeutique mais commercial, il s'agit d'une preuve de concept en vue du marquage CE d'un dispositif hémostatique présenté comme un produit fabriqué en France. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de tester le dispositif dans un environnement avec organes et fluides corporels qu'aucun essai in vitro ne reproduit.

Objectifs

Le pansement idéal n’existe pas. Cependant, il doit présenter quelques caractéristiques, parmi lesquelles : 1/maintenir la plaie en milieu humide et chaud, 2/être modifié selon les stades de cicatrisation, 3/ être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, 4/absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, 5/ ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, 6/ ne pas être toxique et être hypoallergénique, 7/ protéger des chocs, 8/ être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, 9/ être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanées mais très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies par rupture de petits vaisseaux dits « capillaires » qui induit un saignement continu et étendu, le chirurgien utilise des hémostatiques chirurgicaux résorbables comme traitement. Ces dispositifs médicaux sont des produits de synthèse ayant des temps de résorption longs. Nous souhaitons testé est un produit naturel dont le temps de résorption devrait être plus court que ses concurrents. Son enrichissement (calcium, zinc et magnésium) permet des échanges ioniques avec la plaie et favorise l'activation des réactions en cascade de la coagulation. Le dispositif médical est un renfort de la suture dans l’utilisation d’un système d’agrafage de type GIA® et dont la résorption sera suivie à différents temps par imagerie scanner. L’objectif de cette procédure est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale, de suivre sa résorption et son impact au niveau du tissu lésé ainsi que des zones proches à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de dispositif médical hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements liés au renfort de suture par agrafage en cours de chirurgie. De plus, nous disposerions d’un produit fabriqué en France, ce qui n’est pas le cas des autres dispositifs (Etats-Unis, Japon). La biocompatibilité de ce dispositif médical a été testée en in vitro.

Bénéfices attendus

Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit (sous format de pansement) pour le renfort d’un système d’agrafage sur la résection d’un tissu (lobectomie pulmonaire partielle) mais aussi de suivre la résorption du produit et les adhérences possibles dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) en tant que renfort de suture.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie pour permettre l’accès au poumon tout en préservant les autres organes dans les cavités respectives. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès à l’organe, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutané). L’animal n’aura qu’une seule intervention chirurgicale. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Quelques minutes au total Retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie après entrainement médical: 5 minutes. A différents temps post-opératoires, l’animal aura une imagerie pour évaluer le taux de résorption: transport anesthésie acquisition environs 2h à chaque fois. Pour l’hébergement à long terme, les animaux seront hébergés dans des conditions proches des élevages, sans contraintes particulières. Les animaux seront pesés régulièrement. Cet acte ne dure que quelques minutes.

Impact sur les animaux

Lors de l’ouverture de la cage thoracique, il y aura une rupture du vide pleural qui se situe entre le poumon et la plèvre recouvrant la cage thoracique. Ce vide est essentiel pour permettre au poumon de se gonfler et dégonfler. Si le vide est rompu, le poumon ne peut pas se gonfler correctement lors de l’inspiration et place l’individu en détresse respiratoire. Pour éviter cette complication, l’incision sera refermée plan par plan et hermétiquement. Ensuite, à l’aide d’un cathéter et d’une seringue, l’excédent d’air sera aspiré de la cage thoracique en même temps que la remise progressive du poumon sous ventilation. La procédure sera potentiellement douloureuse pour l’animal en post-opératoire, et la procédure analgésique systématique sera adaptée à chaque animal selon le suivi de l'état clinique. Au bout de 3 semaines, les animaux déclarés aptes au transport partiront pour une autre structure qui assurera l’hébergement de longue durée. A différents temps post-opératoire, l’animal sera transféré vers un centre d’imagerie pour passer au scanner. Le transport entre les différentes structures va générer du stress dû à l’arrivée dans un nouvel environnement. De plus, les différentes contention pour réaliser les pesées et les gestes techniques pour faire l’anesthésie de la chirurgie et de l’imagerie ainsi que la mise à mort peuvent générer un stress.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort soit parce qu’ils auront atteint un point limite ou qu’ils ont atteint le temps d’observation (J+6 mois, J+7,5 mois, J+9 mois). Une étude histologique de l’intégration du pansement hémostatique dans l’organe sera réalisée donc cela nécessite le prélèvement de l’organe.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance sur le tissu lésé et de suivre sa résorption à différents temps post-opératoires. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements lors de résection de tissu en cours de chirurgie. Il est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduits in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

Nous utiliserons 11 animaux au total dont 9 animaux répartis en 3 groupes. Il y a 2 animaux supplémentaires prévus pour compléter un groupe si nécessaire. Ce nombre a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. Étant donné que c’est une preuve de concept, nous n’avons pas besoin de plus 3 animaux par lot pour obtenir la réponse à notre questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et nécessite une intervention chirurgicale pour l’arrêter, nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé et raffiné la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur des animaux mise à mort, issus de procédures antérieures.

Raffinement

Initialement l’intervention était prévue en thoracoscopie c’est-à-dire sous coelioscopie, ce qui ne nécessite que 3 incisions (une pour la caméra et 2 pour les instruments). La forme de la cage thoracique est trop étroite pour travailler avec les pinces et le système d’agrafage sans provoquer d’autres lésions sur les tissus environnants. C’est pourquoi, il a été opté pour une chirurgie ouverte avec une voie d’abord au niveau du 9ème espace intercostal, dont l’incision suivra la forme des côtes. L’animal sera injecté avec un analgésique d'action longue (anti-douleur) pour anticiper la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un hypnotique couplé à un analgésique. L’animal est placé sous masque avec un anesthésique gazeux et sur une table chauffante pour maintenir la température corporelle. L’extrémité du lobe pulmonaire sera saisie à l’aide d’une pince atraumatique. Les mors du système d’agrafage équipés du renfort seront placés de part et d’autre du lobe, puis le dispositif sera mis en place. Cette résection n’empêche pas le poumon de fonctionner correctement par la suite. La plaie sera protégée à l’aide d’un pansement. L’animal sera placé dans des couvertures polaires et sous-surveillance jusqu’à son réveil complet. L’animal avec les couvertures polaires sera remis dans l’enclos et recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans l’enclos des légumes frais, plus appétents, pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. L’état général de l’animal et de la cicatrice seront suivis quotidiennement pendant 1 semaine, puis toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. Les animaux seront hébergés collectivement mais s’il est seul, il aura un contact visuel et/ou olfactif avec d’autres congénères et bénéficiera d’un renforcement de l’enrichissement. Les animaux seront suivis quotidiennement pour détecter rapidement toutes complications. Ces dernières seront reportées auprès du vétérinaire de la structure qui mettra en place le traitement adapté. La surveillance sera renforcée le temps nécessaire. Pour obtenir la complète collaboration des animaux sur un hébergement à long terme, des techniques de renforcement positif seront mises en place.

Choix des espèces

Toute étude en vue du marquage CE d’un dispositif médical existant sous plusieurs formats doit être réalisée sur le format de taille maximale, correspondant ici à un dispositif de 8 cm. Il n’existe que 2 espèces animales sur lesquelles nous pouvons trouver un poumon capable d’accepter un dispositif de cette taille, le porc et le mouton. Les études initiales pour le dispositif actuellement commercialisé ayant été réalisées sur le porc, nous avons donc retenu cette espèce pour ce projet. Le modèle lapin utilisé dans le cadre d’autres projets semblables ne peut être utilisé pour ce projet car la taille du poumon ne permet pas de faire la résection nécessaire, sous peine d'handicaper gravement l'animal en post-opératoire. Les animaux seront réceptionnés à 29 kg environ pour atteindre 35-37 kg (jour de chirurgie). L’utilisation d’animaux de 35 kg environ permet de bénéficier d’une taille d’organe représentative de ce que nous avons en chirurgie humaine. Il s'agit de jeunes animaux de trois à quatre mois.

714 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'étude de leur dure-mère et de leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Selon les groupes, elles subissent une ligature des deux veines jugulaires, une injection de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien ou la pose d'un cathéter intracrânien laissé 12 à 14 jours, avec un isolement pendant toute cette durée. Le protocole prévoit aussi un régime gras pour rendre les souris obèses, 31 jours d'isolement en cage d'activité et des tests comportementaux étalés sur deux jours et demi, que le porteur ne nomme pas. Le but est de reproduire chez la souris l'hypertension intracrânienne idiopathique, une maladie qui touche spécifiquement les femmes jeunes en surpoids. Le porteur juge le recours à ces souris "indispensable", alors que le même projet prévoit une IRM du réseau veino-lymphatique chez des patients et des témoins humains.

Objectifs

Les vaisseaux lymphatiques récemment mis en évidence dans les méninges du système nerveux central semblent impliqués dans un grand nombre de pathologies neurologiques. Ces vaisseaux lymphatiques sont absents du tissu cérébral et uniquement présents dans l’enveloppe la plus externe au cerveau : la dure mère. Au sein même de cette enveloppe, ils sont plus spécifiquement localisés le long des sinus veineux duraux. Des travaux récents ont montré que cette proximité anatomique veino-lymphatique jouait un rôle clé dans l’immunité du système nerveux central. Nos hypothèses sont les suivantes : 1) Une altération du réseau veineux cérébral influera le réseau lymphatique, et inversement, 2) La dérégulation du complexe veino-lymphatique chez l’Homme pourrait être impliquée dans une pathologie rare dont les mécanismes sont encore inconnus : l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I). Cette pathologie touche spécifiquement la femme jeune en surpoids et associe une rétention de fluide dans le système nerveux central à des sténoses, c’est-à-dire des rétrécissements, des sinus veineux duraux. Nos objectifs sont de caractériser les mécanismes de cette pathologie, et d’explorer la neuro-inflammation qui pourrait être impliquée dans l’altération des fonctions cognitives observées chez ces patientes. Dans cette étude, nous allons combiner une analyse par imagerie par résonnance magnétique (IRM) du réseau veino-lymphatique dural chez l’Homme (patients avec HTIC-I et contrôles), et une étude expérimentale sur des modèles animaux d’HTIC-I. Notre programme d’étude chez la souris est le suivant : 1) Modéliser chez la souris l’HTIC-I 2) Étudier comment une altération du flux veineux pourrait affecter le réseau lymphatique 3) Étudier comment une manipulation du réseau lymphatique (amplification et altération) pourrait induire, amplifier ou diminuer les caractéristiques de l’HTIC-I 4) Analyser les conséquences sur le comportement et la cognition de l’altération des réseaux lymphatique et veineux 5) Analyser les conséquences sur l’inflammation du cerveau et des méninges d’une altération des réseaux lymphatique et veineux 6) Étudier comment le genre féminin et l’obésité participent à la physiopathologie de la maladie. Nous utiliserons sur 5 ans un total de *714* souris non transgéniques.

Bénéfices attendus

D'un point de vue médical, l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I) est une maladie mystérieuse aux frontières de la neurologie, de l'ophtalmologie et de la neurochirurgie. Cette maladie affecte les femmes jeunes en âge de procréer et peut conduire à une altération majeure du champ visuel ou à la cécité. Les traitements existants soulagent les symptômes, mais ne ciblent pas la cause de la maladie, ils sont invasifs, ont une efficacité limitée et sont associés à des risques et effets secondaires non négligeables. Des thérapies alternatives, plus efficaces et moins invasives, ciblant directement la cause biologique de la maladie semblent nécessaires. Cependant, un prérequis nécessaire de ce développement est de comprendre la physiopathologie et les mécanismes biologiques impliqués. A long terme, l'objectif de cette étude est d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles avec un potentiel réaliste pour améliorer le pronostic de cette maladie. D'un point de vue scientifique, l'HTIC-I est un modèle de maladie cérébrale paradigmatique qui semble parfaitement illustrer une dysfonction primitive du complexe veno- duro-lymphatique. Tandis que le rôle et l'anatomie des lymphatiques ont été bien étudiés chez l'animal, leur caractérisation chez l'humain et leur rôle dans les pathologies neurologiques est très méconnu. L'exploration du complexe veno-lymphatique et de sa plasticité pourrait conduire à des avancées significatives en neurosciences.

Procédures

Les procédures suivantes seront réalisées après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, et hydratation. Les souris sont ensuite anesthésiées par anesthésie gazeuse. Les interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Un protocole de prise en charge de la douleur sera suivi en post opératoire. On identifie les procédures suivantes qui seront réalisés selon le plan expérimental en fonction des groupes d’animaux : 1. Chirurgie de ligature bilatérale des veines jugulaires (Durée : 1 heure, préparation 30 min). 2. Mesure de pression intracrânienne : La mesure de la pression intracrânienne est une procédure sans réveil (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 3. Manipulation du réseau lymphatique par injection de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 4. Mise en place d'un cathéter intracrânien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 5. Mise en place du cathéter intracrânien et injection de traceurs de fluorescence différente à 30 minutes d’intervalle (préparation : 30 min, durée : 1h30), procédure sans réveil. **6. IRM cérébrale avant et après chirurgie de ligature jugulaire (préparation : 30 minutes, durée de la procédure : 40 minutes)**. Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consiste en : 1. Des tests comportementaux répartis sur deux jours et demi. 2. Un régime riche en graisse pour rendre l’animal obèse pendant toute la durée de l’experimentation soit entre 4 et 10 semaines. 3. Isolement pour cathéter intracrânien laissé en place pendant 12 à 14 jours. 4. Injection par le cathéter intracrânine une fois par jour pendant 6 jours. **5. Étude d’activité dans des cages d’activité locomotrice nécessitant l’isolement de l’animal pendant 31 jours. 6. Étude d’activité dans des cages comportant une roue d’activité nécessitant l’isolement de l’animal sur 4 périodes de 3 jours**

Impact sur les animaux

Dans cette expérimentation, les nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être divisés en effets indésirables liés aux chirurgies réalisés sous anesthésie générale et incluent les accidents survenant lors de l’anesthésie (accident opératoire, hémorragie, mauvaise tolérance de l’anesthésie pouvant conduire au décès de l’animal ou à l’interruption de la chirurgie), les effets indésirables post opératoires (douleur, infection de la cicatrice ou du site opératoire, stress, inactivité mobilité réduite, comportement anormal). Les procédures réalisées sans anesthésie sont de sévérité moindre mais peuvent entrainer un inconfort, ou un stress de l’animal qu’il conviendra de détecter et de prendre en compte. Le phénotype obèse peut engendrer des difficultés pour l’animal à se déplacer. L’isolement de l’animal porteur d’un cathéter intracrânien peut occasionner une souffrance de l’animal et des troubles du comportement qu’il conviendra de détecter et de prendre en charge précocement et préventivement par un enrichissement du milieu.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études histologiques et biochimiques de la dure mère et du cerveau des animaux.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet, l’étude des mécanismes physiopathologiques ne peut être modélisée autrement que par des modèles vivants. Le recours à ces animaux est indispensable afin de pouvoir analyser les réactions physiologiques à l’atteinte d’une fonction.

Réduction

Trois lots d’animaux seront nécessaires en raison de traitements différents des échantillons en post mortem (n= 660). A ceci s’ajoutent les animaux des procédures 9 et 10 *et 11 (n=54)* dont l’analyse est clinique par IRM ou tests comportementaux. Afin de réduire les contraintes pour les animaux, les études histologiques seront couplées aux études cliniques (comportement et mesure de PIC). Un calcul de puissance a été réalisé pour évaluer le nombre d’animaux par groupe, ainsi un nombre de 10 animaux pour chaque condition expérimentale pour analyse histologique a été calculé afin d’obtenir des données reproductibles et solides nécessaires pour réaliser des analyses robustes. Tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 15 animaux par groupe a été estimé pour un groupe avec analyse post mortem en immuno histochimie. Pour le groupe avec analyse en cytométrie de flux, un nombre minimal de 18 souris par groupe est nécessaire sur le plan technique en raison de la faible cellularité de la dure mère. Tenant compte du risque de perte d’animaux pendant la chirurgie, le nombre de 20 animaux par groupe a été estimé pour ce groupe. Ce nombre de 18 souris par groupe a été validé également par le calcul de puissance réalisé pour évaluer la taille de l’échantillon. Un nombre minimal de 3 animaux est nécessaire pour les analyses en imagerie post mortem 3D, les données étant qualitatives et ne nécessitant pas d’analyse statistique. Par conséquent, tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 5 animaux par groupe nous semble pertinent. Pour la procédure 9 (IRM), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 6 animaux par lot a été validé. Pour la procédure 10 (tests comportementaux en cage individuelle), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 12 animaux par lot a été validé. Pour analyser les résultats de l’étude, nous utiliserons les tests diagnostiques dédiés aux échantillons et à leur distribution. Ainsi, un total de *714* souris sera nécessaire en tout pour répondre à l’ensemble des objectifs.

Raffinement

A réception des animaux une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification de type « Nestlet ». Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau . Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie, pH de l’eau) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement. Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine après une chirurgie. Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, à J1-J2 et J8 post chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgique. Une grille de surveillance sera remplie tous les jours les premières 48 heures puis tous les deux jours après une chirurgie, et utilisée pour la surveillance de la douleur et la détections de points limites. La grille sera cotée de 0 (aucune souffrance) à 15 (Souffrance maximale) et guidera l’administration d’antalgique et le rythme de surveillance des animaux. Les critères de surveillance seront : l’apparence de l’animal, le comportement naturel, la perte de poids, le comportement provoqué, le site de la chirurgie. Ce suivi permettra de vérifier l’état général des animauxet de détecter un état de stress ou de douleur nécessitant un traitement, ou la mise en place d’une procédure d’euthanasie. Un protocole d’antalgie adapté sera mis au point, pour traiter ou prévenir une douleur induite par une procédure. L’animal bénéficiera avant tout geste chirurgical d’une association d’antalgique par opiacés et d’anti-inflammatoire. Le protocole d’antalgie sera adapté à la grille de surveillance. L’indication d’antalgiques, le rythme de surveillance, et l’identification des points limites conduisant à l’euthanasie de l’animal seront définis en fonction du score.Une anesthésie sera réalisée pour tout geste susceptible d’entrainer une souffrance physique ou morale de l’animal. Les animaux isolés seront surveillés spécifiquement et auront accès à un enrichissement supplémentaire.

Choix des espèces

Notre objectif est d'identifier les mécanismes du remodelage veino-lymphatique et de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués. Le modèle animal est donc indispensable à notre recherche. Concernant l’espèce, les modèles de chirurgie et de manipulation du réseau lymphatique ont été préalablement développées chez la souris avec de bons résultats. L’expérience de notre équipe et les données existantes dans la littérature sont majoritairement basées sur la souris. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal adulte après développement du réseau lymphatique chez la souris c’est-à-dire après 8 semaines post-natal. Les injections intracrâniennes et la mesure de pression intracrânienne devront être effectuées sur des animaux jeunes adultes (âgés de 2 mois à un an), un âge auquel la boite crânienne est mature et stable, autorisant une chirurgie stéréotaxique précise.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des gavages, des prélèvements de sang par voie mandibulaire puis une ponction cardiaque, pour étudier l'effet des immunoglobulines A sur le microbiote intestinal lors d'une infection bactérienne. Le porteur indique qu'une forte charge bactérienne peut provoquer une inflammation digestive avec diarrhées, et qu'une bactériémie peut entraîner fièvre et déshydratation, ce qui justifie le classement en sévère. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier finement les interactions entre l'hôte et son microbiote et conclut qu'il n'y a "aucune possibilité" de mener le projet sans animaux.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d'étudier l'effet des immunoglobulines A sur la composition du microbiote intestinal de souris et d’évaluer son effet protecteur lors d’une infection bactérienne.

Bénéfices attendus

La possibilité de limiter la mise en place d'un déséquilibre de la flore intestinale par un transfert passif d'immunoglobuline A par voie orale a un intérêt clinique majeur. Si cette solution se révèle efficace, elle pourra en effet être testée chez des patients déficients en immunoglobuline A ou sous immunosuppresseurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à des gavages par voie orale pendant 4 jours au début de l’expérimentation puis encore une fois à J18. La manipulation par animal dure entre 20 secondes et 1 minute. 2 prélèvements sanguin seront réalisés par prélèvement mandibulaire (environ 15 secondes par prélèvement) et un prélèvement sanguin sera réalisé par ponction cardiaque.

Impact sur les animaux

L'induction d'une forte charge bactérienne peut provoquer une inflammation du système digestif avec une apparition de diarrhées. La survenue d'une bactériémie peut provoquer un état infectieux général incluant de la fièvre et de la déshydratation. Les points limites ont été définis, classe sévère.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement de sang et de tissus. Ces prélèvements permettront de mesurer différents marqueurs inflammatoires et de déterminer la composition du microbiote intestinal.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier finement les interactions entre un hôte et son microbiote intestinal. Ce dernier est composé d'une grande quantité de taxons différents, qui peuvent être aérobie ou anaérobie, et qui varient le long du tube digestif. Leur implantation dépend de nombreux facteurs parmi lesquels l'alimentation de l'hôte, la réponse immunitaire, la sécrétion de mucus, la compétition inter-espèces etc. Ces facteurs ne peuvent pas être contrôlés in vitro. Il n'y aucune possibilité de réaliser ce projet sans l'utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux/groupe (6 souris) a été réduit au maximum sans mettre en péril l’interprétation statistique des résultats.

Raffinement

Toutes les expérimentations sont réalisées dans une animalerie certifiée. Les souris seront manipulées une fois par jour pour être habituées à la présence et à l'odeur de l'expérimentateur avant le début des gavages. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien être optimal tout au long de l’étude. Leur douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés si besoin (myorelaxant, anesthésie, analgésie). Les animaux sont hébergés en groupes harmonieux (minimum de 2) et dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). L'eau et la nourriture sont mis à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée pour couvrir les bruits parasites.

Choix des espèces

La souris présente plusieurs avantages pour ce projet. Premièrement, elles produisent des immunoglobulines A à la structure proche de celles retrouvées chez l’humain. De plus, la grande majorité des travaux effectués sur ces immunoglobulines est conduite chez la souris, et notre travail pourra être analysé plus finement grâce à la vaste littérature qui existe sur ce sujet et avec ce modèle. Enfin, les modèles de souris déficients en immunoglobulines A sont déjà présents dans notre animalerie, et permettront d'observer l'effet de la supplémentation en immunoglobuline A administrées oralement. Souris entre 5 semaines et 6 mois car avant 5 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complet et après 6 mois la réponse immunitaire risque d’être altérée.

5 600 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Du stade œuf jusqu'à trente jours après l'éclosion, ils sont exposés dans l'eau à plusieurs concentrations d'une substance chimique, avec pour effets déclarés possibles malformations, immobilité, hyperventilation et mortalité. À la fin de l'essai, tous les survivants sont tués par surdose d'anesthésique, mesurés et pesés. Le porteur inscrit ces essais dans le cadre réglementaire REACH pour évaluer le danger environnemental de substances, et présente le recours aux poissons comme un "dernier recours" après examen des méthodes sans animaux.

Objectifs

Cette demande d’autorisation concerne la réalisation d’essais de toxicité chez le poisson zèbre aux premiers stades de la vie (ligne directrice OCDE 210) pour répondre à des exigences réglementaires notamment l’enregistrement à l’Annexe 9 du règlement REACH (Enregistrement, Evaluation, Autorisation et Restriction des Produits Chimiques). Les données générées, à partir de ces essais, sont essentiellement utilisées pour évaluer le danger pour l’environnement des substances chimiques et éventuellement contribuer à l’établissement du classement correspondant. Les valeurs obtenues peuvent également servir de données complémentaires pour la démarche d’évaluation des risques liés à l’utilisation de ces substances chimiques. La mise en oeuvre de ces essais dépend à la fois des informations mises à disposition de l’établissement utilisateur par le donneur d’ordre et également de l’objectif spécifique de réalisation. Dans le cadre de l’enregistrement de substances chimiques selon le règlement REACH, la stratégie expérimentale qui est proposée est conforme aux recommandations de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Économiques), reprises par l’ECHA (Agence Européenne des Produits Chimiques).

Bénéfices attendus

Ces études sont conduites dans le cadre strict de demandes règlementaires et contribuent à améliorer les connaissances des effets sur l’environnement des proquits testés.

Procédures

Les poissons aux premiers stades de leur vie sont exposés à une série de concentrations du produit chimique testé dissout dans l’eau du stade oeuf jusqu'à 30 jour après éclosion.

Impact sur les animaux

Des effets chroniques seront mesurés pour une partie importante du cycle de vie des poissons. L'accent n'est pas mis sur la mortalité des poissons (bien qu'elle soit également enregistrée), mais sur des paramètres chroniques tels que le temps d'éclosion, les malformations, la longueur et le poids du corps. D'autres effets peuvent également survenir dans ce type d’études selon les stades de développement considérés : mortalité, immobilité, hyperventilation ou absence de mouvement respiratoire, anomalie comportementale et/ou corporelle et/ou de croissance.

Devenir

A la fin du test, tous les poissons survivants sont mis à mort par une surdose d'anesthésique, la longueur de chaque poisson est mesurée et ils sont ensuite pesés (poids humide, poids sec).

Remplacement

Le donneur d’ordre doit d'abord évaluer l'ensemble des données disponibles sur les propriétés intrinsèques d'une substance. Des essais supplémentaires ne peuvent être nécessaires que lorsque ces données ne répondent pas aux exigences règlementaires. Il est cependant nécessaire d'envisager l'utilisation de méthodes alternatives et toutes autres options avant de procéder à des essais sur des animaux vertébrés. Il existe des lignes directrices utilisant des embryons ou des larves de poissons mais ces essais ne permettent pas d’évaluer la toxicité sur l’ensemble des premiers stades de la vie et notamment la croissance et le développement. La vérification de la disponibilité de données bibliographiques acceptables dans un cadre réglementaire sur la substance soumise à essai sera effectuée, au préalable, afin de ne réaliser que les essais strictement nécessaires. Si de nouvelles données doivent être produites, les essais sur les animaux ne peuvent être utilisés qu’en dernier recours. Les méthodes alternatives seront évaluées en amont être utilisées au lieu d’essais directs pour tirer des conclusions aux fins de plusieurs exigences d’information. Les méthodes alternatives présentées dans REACH sont les suivantes: l’approche des éléments de preuve, les méthodes in vitro, les modèles de la relation quantitative structure-activité (RQSA) et les références croisées/catégories. Toutefois, les exigences réglementaires varient en fonction des effets spécifiques. Le niveau d’information doit être équivalent à celui atteint avec des essais standard.

Réduction

Pour répondre aux critères statistiques de la ligne directrice 210 de l’OCDE, un essai complet doit être effectué en utilisant un minimum de 80 oeufs fécondés pour chacune des cinq concentrations de la substance d'essai, aussi bien que dans le groupe témoin (et le groupe témoin-solvant si nécessaire). Un essai complet utilise entre 480 et 560 œufs fécondés. Dans certains cas un essai limite, ou un essai limite prolongé, impliquant moins de cinq concentrations comme l’essai complet, peut être acceptable si l’on cherche à établir une Concentration Sans Effet Observé (CSEO) de façon empirique uniquement. L'effectif sera réduit en conséquence entre 160 et 240 œufs fécondés. Si une donnée de CL50 (Concentration Létale pour 50% des organismes) après 96 heures est disponible, il n’est pas nécessaire de tester les concentrations au-delà de cette valeur ou de 10 mg/L si la CL50 est supérieure à cette concentration.

Raffinement

En amont du lancement de l’essai, les données disponibles sur la toxicité aiguë, obtenues de préférence à partir d’essais sur les mêmes espèces et/ou d’un essai de détermination de l’ordre de grandeur, devront être prises en considération pour délimiter la gamme des concentrations d’essai. Cependant, toutes les sources d’informations devraient être prises en compte lors de la sélection des concentrations d’essai, y compris des données de substitution, des données issues d’essais de toxicité aiguës sur des embryons de poissons, etc. Les observations quotidiennes du comportement et des effets seront réalisées sur les oeufs et les larves après éclosion. En cas de malformations et donc d’apparence anormale telles que l’organisme est en état de souffrance considérable et irréversible, l’organisme sera retiré de l’essai. Les animaux concernés seront mis à mort de façon anticipée et comptabilisés comme morts aux fins de l’analyse statistique ultérieure. Durant la phase d'exposition les volumes d'hébergement seront adaptés pour évoluer avec la taille et l'age des poissons du jour 1 jusqu'à la fin de l'essai pour permettre une croissance correcte des animaux. Le nourrissage en conditions d'exposition correspondra à celui distribué en élevage avec des quantités ajustées pour maintenir une bonne qualité d'eau pendant toute la durée de l’essai.

Choix des espèces

Le poisson zèbre fait partie des espèces recommandées dans les différents textes normatifs de référence. Il est recommandé de choisir l’espèce de poissons en fonction de certains critères pratiques importants, tels que leur disponibilité tout au long de l’année, leur facilité d’élevage, leur commodité pour l’essai, ainsi que tous facteurs économiques, biologiques ou écologiques susceptibles d’être pris en considération. Les poissons doivent être en bonne santé et exempts de toute malformation visible. Le poisson zèbre peut être facilement produit et élevé en laboratoire, avec un contrôle des maladies ou des parasites, ce qui permet d’obtenir des sujets sains et d’ascendance connue. Les stades de développement utilisés sont des oeufs fertilisés de poisson au lancement de l’essai jusqu’à des juvéniles de 30 jours après éclosion à la fin de l’essai.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales, se voit implanter une fenêtre dorsale par chirurgie, puis subit une injection d'ADN plasmidique dans la tumeur, une électroporation et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur classe la procédure en sévère du fait de l'isolement de ces animaux sociaux pendant huit jours au maximum, et prévoit la mise à mort à cause de la croissance tumorale et de la fenêtre dorsale qui ne tient pas au-delà de trois semaines. L'objectif reste de suivre la distribution d'un plasmide fluorescent, le porteur affirmant qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit ce contexte où le système immunitaire est impliqué.

Objectifs

L’immunothérapie est aujourd’hui une modalité de traitement efficace pour certains cancers agressifs. Des approches de thérapie génique ont été proposées pour influencer le système immunitaire. Cependant, la thérapie génique doit reposer sur un système d’administration d’ADN aux tissus ou aux cellules qui soit efficace, sûr et spécifique. L’électroporation d’ADN in vivo s’avère une méthode sûre et efficace, cependant, le taux d’expression du transgène est encore faible par rapport aux méthodes virales. Un des verrous identifiés pour améliorer l’efficacité de la transfection, est l’absence de connaissances de la distribution des plasmides porteurs du gène thérapeutique dans les tumeurs lors de leur injection avant électroporation. Grâce à des molécules fluorescentes, il est possible de suivre un ADN plasmidique tout en conservant ses fonctions d’expression du gène. De plus, l’utilisation de gènes rapporteurs fluorescents permet de quantifier les taux d’expression dans les cellules de l’organisme. Dans le cas du gène rapporteur EGFP (protéine fluorescente verte), son expression est détectable dans les 4 heures suivant la transfection, et l’expression maximale est atteinte deux jours après la transfection. L’objectif de notre étude est 1- de déterminer la distribution spatiale et temporelle d’un plasmide marqué par fluorescence et portant le gène rapporteur EGFP dans la tumeur et son microenvironnement tumoral sans et avec électroporation par microscopie intravitale et 2- d’évaluer la corrélation entre la distribution du plasmide et l’expression de la protéine reportrice EGFP dans la tumeur et son environnement avec électroporation. L’imagerie intravitale des tumeurs à l’aide de l’implantation d’une chambre (fenêtre) dorsale permettra une observation dynamique de la distribution plasmidique dans le microenvironnement tumoral et de l’expression génique dans les tumeurs en temps réel. Après le transfert de gènes, l’expression de la protéine fluorescente (EGFP) pourra être observée dans le même animal. Pour ce projet, nous réaliserons une procédure de degré « sévère » avec 32 animaux au total. »

Bénéfices attendus

De nombreuses études précliniques et cliniques ont démontré la faisabilité de la thérapie génique assistée par électroporation avec un certain nombre de gènes thérapeutiques pour le traitement de divers types de tumeurs. Cependant, l’efficacité de transfection lors du transfert d’ADN assisté par électroporation est encore faible par rapport aux méthodes virales. La connaissance de la distribution des plasmides porteurs du gène thérapeutique dans les tumeurs en fonction du traitement nous permettra d’envisager des stratégies utilisant l’électroporation pour améliorer l’efficacité de la transfection et donc l’efficacité antitumorale.

Procédures

L'ensemble des 32 animaux sera soumis à une chirurgie de moins d'une heure sous anesthésie générale et à l'injection de cellules tumorales d'une durée de 10 secondes. Les animaux auront également trois injections d'analgésiques d'une durée de 10 secondes, maximum. Après croissance tumorale (4-5 jours) l'ensemble des 32 animaux aura une injection d'un plasmide fluorescent directement dans la tumeur (

Impact sur les animaux

Le protocole de chambre dorsale est susceptible d’induire des nuisances ou effets indésirables. L’estimation de la souffrance induite par ce protocole est sévère du fait de l’isolement de ces animaux sociaux le temps de la procédure (max 8 jours). La pose de la chambre peut induire une douleur modérée du fait de la chirurgie. L’injection du plasmide peut induire une douleur légère le temps de l’injection (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure d’imagerie du fait de la croissance tumorale non traitée et de la présence de la chambre dorsale qui ne peut pas être maintenue plus de 3 semaines sans altération de l'état de la souris.

Remplacement

La procédure expérimentale ne peut pas être remplacée par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, nous voulons suivre la distribution du plasmide et l’expression de la protéine fluorescente après électro transfert dans la tumeur et son microenvironement dans un contexte où le système immunitaire est impliqué, comme c’est le cas dans les protocoles cliniques chez le patient. Les modèles 3D in vitro ne permettent pas cette injection intratumorale, ni de prendre en compte l’environnement tumoral.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum pour obtenir dans chaque groupe étudié un nombre d’individus suffisants pour établir un modèle de distribution du plasmide et quantifier le niveau d’expression de la protéine fluorescente au cours du temps. La distribution du plasmide sera observationnelle. Le niveau d’expression de la protéine sera comparé entre les deux groupes traités à chaque temps et sera comparé dans chaque groupe au cours du temps par des tests statistiques . Du fait de l’utilisation de chambres dorsales, le suivi de la distribution du plasmide et de l’expression de la EGFP pourra se faire dans le même animal au cours du temps, réduisant ainsi drastiquement le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées visent à réduire toute angoisse. La pose de chambre dorsale et l’injection des cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie. L’injection du plasmide, l’électroporation et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie. Pour les chambres dorsales, un analgésique sera administré avant et après la chirurgie. Pour évaluer la douleur, nous nous basons sur une grille de scoring. Le suivi des animaux après la pose de chambre dorsale se fera tous les jours par observation et remplissage de la grille de scoring. L’expérience sera arrêtée si l’animal présente une inflammation de la chambre, une prostration, ou un score supérieur au seuil établi dans la grille, sinon, les souris seront mises à mort au plus tard 8 jours après le début de l’expérience. Les animaux seront hébergés individuellement (cage conventionnelle) tout le temps de la procédure (8 jours max) pour éviter qu’ils ne se blessent entre eux. L’hébergement individuel est compensé par un enrichissement spécifique et une durée limitée. La quantité de litière est légèrement réduite pour éviter que la chambre ne s’accroche à la mangeoire métallique. Les animaux sont placés dans une armoire ventilée avec les autres animaux visibles et à proximité dans les autres cages (même étage dans l’armoire). Pour l’enrichissement, deux cylindres de cotons et une bûchette sont placés par cage à la place de l’enrichissement habituel. La confection ou non du nid avec les cotons sert de critère quant au bien-être de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle tumoral murin que nous voulons étudier se développe dans des souris. Cette espèce est largement utilisée par les équipes de Recherche dans le domaine de l’oncologie. Elle permet de reproduire le développement tumoral et le développement d’un microenvironnement tumoral similiaire à celle de l’espèce humaine. Des souris adultes de 6-8 semaines seront utilisées. Ceci correspond à l’âge de maturation du système immunitaire.