Procédures sévères

770 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque chirurgicalement un infarctus du myocarde, avec un taux de décès d'environ 30 % lié à l'opération, avant un suivi par échographie, des injections de vésicules extracellulaires et une mise à mort pour analyser le cœur. Les retombées annoncées, de nouvelles thérapies pour la médecine humaine et vétérinaire, passent d'abord par un test chez le "gros animal". Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne répond à l'objectif et que la souris "mime la clinique humaine".

Objectifs

Les vésicules extracellulaires (VEs) sont des entités subcellulaires produites par les cellules de manières spontanée ou en réponse à un stimulus. Considérées comme des « nanoparticules biologiques », elles sont depuis peu utilisées par de nombreuses équipes à travers le monde pour régénérer les tissus endommagés dans des pathologies comme l’arthrose, l’AVC, la fistule ou encore l’infarctus du myocarde. Le projet a pour but de tester l’hypothèse de l’intérêt des vésicules extracellulaires produites par diverses méthodes de production à partir de cellules souches mésenchymateuses humaines, dans un modèle d’infarctus du myocarde chez la souris et pour un potentiel développement thérapeutique chez l’homme. Diverses méthodes de production, purification et modification des vésicules extracellulaires seront testées et validées sur ce modèle murin. La méthode optimale retenue sera ensuite évaluée chez le gros animal pour un futur développement clinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’obtention de données permettant de développer de nouvelles thérapies pour la médecine humaine et vétérinaire. Les bénéfices attendus de ce projet sont de déterminer les facteurs influençant l’efficacité des vésicules extracellulaires (tels que la méthode de production, la purification ou encore l’amélioration des vésicules) et de déterminer la meilleure combinaison pour un futur développement clinique. Les animaux utilisés seront pris en charge de manière à limiter au maximum l’effet délétère des procédures expérimentales, en particulier au niveau antalgique.

Procédures

Nous induirons un infarctus du myocarde par technique chirurgicale avec anesthésie, suivi avec échographie cardiaque (non invasif) sous anesthésie puis antalgie post opératoire. La procédure d’euthanasie sous anesthésie permettra la récupération du coeur entrainant la mort de l'animal. - Procédure d’induction d'un infarctus du myocarde par technique chirurgicale avec anesthésie gazeuse (environ 30 minutes) et traitement des douleurs post-opératoires (2 injections par jour pendant 3 jours, environ 30s par injection) - suivi avec échographie cardiaque (non invasif) sous anesthésie (environ 10 minutes 2 fois) - Surveillance du poids (2 fois par semaine pendant 1 mois) - Injection des traitements en intra-veineux ou intra - péritonéal (1 à 3 fois, environ 30 secondes) - injection d’anesthésiques en sous cutané (7 fois, environ 30 secondes) - La procédure d’euthanasie (1 injection intrapéritonéale, moins de 30s, d'un produit induisant le décès) chez un animal auparavant anesthésié par anesthésie gazeuse, permettant la récupération du coeur pour des analyse biologiques (1 fois, environ 10 minutes).

Impact sur les animaux

Il y a un risque de décès pendant l’opération (faible), en post opératoire immédiat (faible) ou à distance (modéré). Les souris auront potentiellement des douleurs post opératoires. L'anesthésie est liée à un risque d'hypothermie, de détresse respiratoire ou d'arret cardiorepiratoire. Les injections des traitements et antalgiques nécessitent la contention des souris et induit des douleur liée à l'introduction de l'aiguille sous la peau - injection d’anesthésiques en sous cutané.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour permettre l'analyse biologique des organes de la souris afin d'évaluer l'effet des traitements sur les tissus.

Remplacement

A ce jour, il n'existe aucun modèle de infarctus du myocarde menant à une insuffisance cardiaque in vitro ou de modélisations informatiques ou autres modèles alternatifs susceptibles de répondre à notre objectif de travail. C'est pourquoi, nous utiliserons, comme modèle animal, la souris C57BL6/Rj qui mime la clinique humaine.

Réduction

Le modèle choisi, et d'autant plus dans les mains expérimentées de la personne réalisant les chirurgies, a une variabilité relativement faible par rapport aux autres modèles existants. Cela permet de limiter le nombre d'animaux par groupe à un maximum de 15 (variabilité beaucoup plus importante chez le gros animal et l'humain). Le calcul du nombre de sujets nécessaire avec un écart type de 30% permettant de détecter un effet de 33% entre deux groupes est de 15 sujets par groupe. La procédure chirurgicale est liée à un taux de décès avant analyse de l'ordre de 30%, ce qui nécessite pour obtenir un groupe de 15 souris par groupe au final un total de 22 souris en moyenne. Les expériences seront accomplies dans un ordre et regroupées pour permettre de limiter la nécessité de réaliser des groupes contrôles pour chaque question scientifique. La nécessité de répliquer l'expérience ne sera qu'optionnelle en cas de puissance insuffisante. Tous les animaux seront utilisés à la fois pour une analyse des paramètres clinique et radiologiques, mais aussi pour les analyses biologiques/histologiques, permettant de ne pas avoir à reproduire les expériences pour le simple fait de récupérer des résultats biologiques/histologiques. Au total, 770 animaux seront utilisés pour les expériences.

Raffinement

Toute modification du comportement des animaux sera surveillée et l'animal euthanasié si nécessaire. Afin de palier au stress et à l'anxiété, les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs frères (6 souris par cage maximum) et l’isolement est à éviter au maximum. Le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois, maison et tunnel en carton. Les animaux sont surveillés quotidiennement en post opératoire pendant 3 jours puis quotidiennenment par l'équipe zootechnique et 3 fois par semaine par les expérimentateurs. Les points limites comme l'incapacité à se déplacer, ou la forte perte de poids nous fera mettre à mort l'animal avec la procédure adaptée (euthanasie par injection en IP). Prise en charge per-opératoire : Les souris sont anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois anesthésiées et endormies, elles reçoivent une injection en sous-cutanée d'anticouleur. La profondeur de l’anesthésie et donc l’absence de sensibilité à la douleur sera évaluée en testant la disparition de certains réflexes. Pendant l’ischémie, un analgésique post-opératoire, sera injectée en sous cutanée à la souris avant la fin de l’intervention. On réalisera une injection d'antalgique local, en intercostal au niveau de la paroi au moment de la fermeture du thorax. Les souris seront réhydratées avec du sérum physiologique. Elles seront sous observation jusqu’à leur réveil complet. Dès leur réveil, les souris seront isolées individuellement dans une cage pendant plusieurs heures, dans un environnement calme et chaud. Le protocole d’analgésie est renouvelé toutes les 12h pendant 3 jours post-opératoires.

Choix des espèces

A ce jour, il n'existe aucun modèle de infarctus du myocarde menant à une insuffisance cardiaque in vitro ou de modélisations informatiques ou autres modèles alternatifs susceptibles de répondre à notre objectif de travail. C'est pourquoi, nous utiliserons, comme modèle animal, la souris C57BL6/Rj qui mime la clinique humaine. En effet, ce rongeur a un système cardiovasculaire proche de celui de l'homme. Actuellement, l'expérimentation animale est la seule et unique approche possible pour rendre cette étude relevante et exploitable pour développer d'éventuelles approches thérapeutiques dans le futur. Les tests chez le rongeur font partie des tests précliniques classiques pour évaluer l’effet thérapeutique d’un produit. Nous utiliserons des souris adultes de plus de 8 semaines ou plus afin de mimer une pathologie qui touche plutôt l’adulte chez l’homme. Nous utiliserons des souris C57BL/6Rj âgées de 8 semaines : à ce stade de développement, tous les organes sont arrivés à maturité. Cela permet de mieux mimer une pathologie qui touche généralement l’adulte.

70 bars européens juvéniles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Capturés dans leur milieu naturel, ils sont poursuivis à l'épuisette jusqu'à épuisement, exposés à l'air une minute, puis maintenus vingt-quatre heures dans une chambre de mesure avant d'être tués pour prélever leurs organes. Le porteur qualifie lui-même d'intense le stress de la phase d'émersion et de la sortie de l'appareil. Il affirme que "seule l'expérimentation animale" permet d'étudier les réponses physiologiques de l'organisme entier, ici la consommation d'oxygène de poissons sauvages.

Objectifs

Ce projet vise à étudier les réponses physiologiques des juvéniles de bars européen aux changements environnementaux dans les zones côtières et estuariennes dans lesquelles le bar vit ses premières années de vie. Ces zones sont des zones naturellement très variables auxquelles les bars sont adaptés. Cependant les changements environnementaux dus aux activités humaines (réchauffement climatique, nuisances sonores, polluants, etc.) imposent des contraintes supplémentaires qui peuvent affecter de multiples processus physiologiques des poissons, dont le métabolisme qui sera l’objet de ce projet. Le métabolisme englobe les réactions chimiques permettant la synthèse de l’énergie nécessaire à la vie des organismes. Cette énergie régit la capacité des individus à survivre, se reproduire, grandir et leur permet de faire face aux variations de leur environnement. Les bars juvéniles vivant dans des habitats altérés risquent de dépenser beaucoup d’énergie pour faire face aux contraintes environnementales imprévisibles et stressantes et donc s’affaiblir. La respirométrie est une des mesures du métabolisme les plus répandues qui permet de mesurer la consommation d’oxygène à l’échelle d’un organisme. Les mesures de respirométrie nécessitent de placer un poisson dans un environnement clos dans lequel on mesure la consommation d'oxygène à partir de laquelle il est possible de mesurer les taux métaboliques maximaux et standards. Les approches classiques d'étude du métabolisme des poissons se basent sur des mesures de consommation en oxygène dans des environnements contrôlés. Ce projet a donc pour objectif de mettre en place et valider la technique de la respirométrie sur des juvéniles de bar européen sauvages pour mesurer les taux métaboliques maximaux et standards en limitant les biais liés à l'acclimatation des poissons à la vie en captivité.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de mesurer le métabolisme énergétique des poissons en minimisant le temps de transfert des animaux entre capture et mesure. Habituellement, les animaux sont ramenés en laboratoire et connaissent de nombreuse étapes particulièrement stressantes (pêche, transfert et transport dans un véhicule, acclimatation aux conditions de laboratoire) qui peuvent affecter à long terme leur métabolisme. Ce projet nous permettra donc de montrer comment il est possible de mesurer la consommation en oxygène du poisson dans son environnement naturel. A moyen terme, les résultats de ce projet nous permettront de comprendre plus précisément l’impact des variables environnementales sur le métabolisme des juvéniles de bar, donc de mieux décrire les contraintes écologiques qui s’exercent sur les juvéniles et impactent leur métabolisme et donc leur investissement énergétique dans la survie, la croissance ou la reproduction. A long terme, la réalisation de ce projet permettra l’application de l’outil « respirométrie de terrain » à d’autres modèles animaux. De plus, ce projet se veut d’apporter de nouvelles connaissances sur le métabolisme à l’échelle cellulaire, en lien avec les taux métaboliques mesurés à l’échelle de l’individu (respiromètre) sur le terrain.

Procédures

Les poissons seront soumis à une capture dans leur milieu naturel avec un engin de pêche, puis soumis individuellement à un exercice physique intense pendant quelques minutes. Cet exercice consiste en une poursuite avec une épuisette dans un espace confiné (dans un seau de 10L) pendant 10 minutes maximum, suivi d'une phase de récupération, puis maintenu dans une chambre de mesure à oxygène pendant 24h, et enfin transférés dans une cuve de transport jusqu'à un laboratoire pour être mis à mort. Cette manipulation entraine donc les interventions suivantes sur les poissons : - capture avec engins de pêche (moins de 10 min pour la senne et maximum 2 heures pour le verveux) ; - 2 transferts à l’épuisette (du piège au bac de transport, du bac de transport à la chambre respirométrique, chacun ≤ 1 min) ; - transport du lieu de capture au lieu d’installation des respiromètres (< 15 min) ; - protocole de chasse du poisson avec une épuisette (exercice physique intense induit manuellement en chassant le poisson avec l’épuisette jusqu’à épuisement du poisson ; procédure qui dure < 10 min) ; - émersion de 1 min ; - maintien du poisson dans le respiromètre et mesure de l’activité métabolique (isolement pendant 24h avec un courant continu léger lui permettant de maintenir une nage passive ou de routine) ; - sortie du poisson du respiromètre après la mesure et mise à mort de l’individu.

Impact sur les animaux

- Un stress léger pendant la pêche dans les zones de capture. Le temps passé dans l’engin de pêche. Si les poissons sont capturés avec la senne de plage, ce stress ne durera que quelques minutes (la senne de plage est un filet mis en œuvre à la main). Si les poissons sont capturés avec le verveux (nasse capturant les poissons au moment de la montée ou de la descente de la marée) ce stress durera 3 heures maximum. - Les 2 transferts à l’épuisette (du piège au bac de transport, du bac de transport à la chambre respirométrique, chacun ≤ 1 min) et le déplacement du bac de transport du lieu de capture au lieu d’installation des respiromètres (< 15 min) seront des stress légers. - Un stress modéré pendant la chasse du poisson (exercice physique intense induit manuellement en chassant le poisson avec l’épuisette jusqu’à épuisement du poisson ; procédure qui dure < 10 min) - Un stress intense durant la phase d’émersion de 1 min. - Un stress modéré pendant le maintien du poisson dans le respiromètre (isolement pendant 24h avec un courant continu léger lui permettant de maintenir une nage passive ou de routine). - Un stress intense pendant la sortie du poisson du respiromètre après la mesure et jusqu’à la mise à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour réaliser des prélèvements d'organes.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation animale permet de réaliser une étude qui englobe l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques. Cela permet notamment de caractériser le résultat d’interactions complexes entre différents tissus et fonctions cellulaires, offrant ainsi la possibilité d’avoir un suivi complet des réponses mitochondriales face à l’environnement de l’animal.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte tenu de l’étendue de la variabilité attendue entre nourriceries des processus étudiés dans cette étude. Cette étude peut se dérouler selon différent scénarii, selon la validation des méthodes à différentes étapes. Le nombre total de poissons mis à mort demeure le même quel que soit le scénario : 60 juvéniles. Pour ces poissons nous réaliserons les mesures de respirométrie puis ils seront mis à mort pour réaliser des mesures d’activité mitochondriale en laboratoire (à partir du cœur) ainsi que d’autres analyses en laboratoire. L’analyse des données de respirométrie nécessite l’extraction des données de consommation d’oxygène (mesurées en continue sur 24h au maximum ; 2h si seul le taux métabolique maximal est mesuré). Mesurer le taux métabolique standard et maximal nécessite de nettoyer les données brutes (enlever les outsiders et points aberrants). Nous comparerons les poissons de différents groupes (âge ou site) par des analyses de variance avec les mesures de métabolisme en variable réponse et le site de capture ou l’âge en variable explicative. En laboratoire, la taille habituelle des groupes comparés est d’environ 10-15 individus. Etant donné que la variabilité inter-individuelle en milieu naturel sera plus élevée, nous prévoyons la mesure de 20 individus par site ou par âge pour avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

La pêche des poissons sera réalisée à la senne de plage ou verveux permettant de réduire au maximum le stress généré par la capture des poissons. Le verveux est mis en place à la main dans le courant d’eau. Les poissons qui redescendent les cours d’eau avec la marée sont amenés progressivement vers le cul du chalut. Il est possible d’inspecter le cul du chalut et d’arrêter le travail du verveux dès que les poissons ciblés sont capturés. La senne de plage comporte une partie fixe (maintenue par un poteau) et une partie mouvante, mise en œuvre à la main. En faisant un arc de cercle il est possible de capturer des poissons sur les rivages en limitant leur stress (temps de manœuvre : 10 minutes). Ces méthodes de capture dites « passives » assurent un meilleur bien-être animal par rapport au chalutage qui peut être particulièrement stressante (poisson capturé longtemps et forcé à nager rapidement dans le chalut). Les transferts des poissons seront réalisés avec des épuisettes permettant de préserver les écailles et le mucus des poissons. Le bac de transport sera opaque, avec un couvercle pour limiter le stress. Le bac (environ 10L, diamètre 30 cm, avec des poignées) sera équipé d’un bulleur pour maintenir dans l'eau un niveau d'oxygénation proche de la saturation. Les poissons pourront se retourner dans le bac de transport. Les prélèvements d'eau se feront au point de capture permettant de maintenir les poissons dans une eau de qualité similaire à celle de son leur environnement. Les équipements pour la « chasse » (épuisette, bac de transport) et la respirométrie (respiromètres) seront installés à proximité de chaque lieu de capture et permettra de limiter les temps de déplacement entre capture-phase d’épuisement-mesures en respiromètre. L'eau du bac sera prélevée sur les lieux de captures; l'eau du respiromètre est régulièrement renouvelée à 100% (au plus toutes les 10 minutes). Afin de limiter les transferts, les poissons capturés seront immédiatement placés dans un bac de transport individuel (le même bac qu'à la phase d'épuisement puis de transfert dans le respiromètre). La chambre de respiration, immergée, sera transparente pour que le poisson voit la lumière naturelle. La zone d’immersion de la chambre sera hors vue des expérimentateurs. Les poissons seront donc soumis aux variations naturelles de leur environnement (température, salinité, marée, luminosité).

Choix des espèces

D’importantes pêcheries commerciales et récréatives dépendent du bar européen qui est également une des espèces de poisson les plus étudiées en laboratoire ou en aquaculture. Pourtant l'écologie de cette espèce dans son milieu est globalement mal connue en dehors des grandes étapes de son cycle de vie. Suite à une série de mauvais taux de recrutements et d’une forte pression de pêche, la biomasse du stock reproducteur de bar dans l'Atlantique Nord est devenue préoccupante. Comme les caractéristiques biotiques et abiotiques (paramètres physico-chimiques et biologiques) évoluent rapidement en raison des changements climatiques et des perturbations anthropogéniques, il est important de comprendre la réponse des bars européens aux changements environnementaux dans leur milieu naturel, d’où notre étude sur le métabolisme.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur ouvre l'abdomen pour injecter des cellules tumorales dans le caecum, avant un traitement par voie intrapéritonéale, l'intervention pouvant provoquer douleurs, perte de poids et infection. Les retombées annoncées, confirmer chez l'humain l'intérêt d'une bithérapie déjà employée en clinique, restent à démontrer. Le porteur affirme que le cancer implique des interactions "possibles seulement dans un organisme vivant" et que les expériences in vitro "ne suffisent pas".

Objectifs

Ces dernières années, l’immunothérapie a suscité un engouement dans le monde de la cancérologie. Cette dernière consiste à mobiliser le système immunitaire des patients pour cibler et éliminer les cellules tumorales. Cette approche a montré des effets puissants et durables mais seulement sur un faible pourcentage de patients. L’une des raisons pouvant expliquer ces résultats pourrait être un manque d’infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs. De manière à rétablir un infiltrat lymphocytaire dans la tumeur, il est possible de cibler l’angiogenèse. L’angiogenèse correspond à la formation de nouveau vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants et est nécessaire pour assurer le transport des nutriments et de l’oxygène dans la tumeur. Au sein des tumeurs, l’angiogenèse induit un environnement immunosuppresseur et perturbe également la migration des cellules immunitaires car les vaisseaux sanguins sont anormaux. De ce fait, il est intéressant de cibler l’angiogenèse afin de normaliser les vaisseaux sanguins et de favoriser la réponse immunitaire antitumorale en réduisant l’environnement immunosuppresseur. La combinaison thérapeutique des inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (ICI) et des anti-angiogéniques a fait l’objet de nombreux essais cliniques et son efficacité est approuvée dans le traitement de plusieurs cancers solides. En dépit d’une réelle avancée ces dernières années, une compréhension plus approfondie des mécanismes d’action de cette bithérapie est nécessaire pour permettre de mieux cibler les patients répondeurs et apporter des réponses quant à son efficacité. Au laboratoire, nous avons montré que cette bithérapie améliore, in vivo, les réponses anti-tumorales dans différents modèles de cancer hétérotopique chez la souris. Cependant ces observations ont été réalisé sur des modèles de cancer colorectaux injectés en sous cutané et ne nous permettent pas de confirmer totalement l’intérêt de la bithérapie chez l’Homme. En effet, les modèles hétérotopiques ne permettent pas d’analyser les interactions entre la tumeur et l’environnement spécifique du côlon. Dans ce contexte, afin de confirmer l’intérêt de la bithérapie chez l’Homme nous souhaitons développer une approche d’induction de cancer colorectal orthotopique : les cellules tumorales seront injectées directement dans le caecum.

Bénéfices attendus

Le but de ce travail est d’explorer l’effet de la combinaison αPD-1 et αVEGR-2 dans un modèle de cancer colorectal orthotopique pour confirmer son intérêt chez l’Homme. En effet, les modèles hétérotopiques ne permettent pas d’analyser les interactions entre la tumeur et l’environnement spécifique du côlon. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients et confirmer que ce traitement pourrait être utilisé chez des patients. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale : ouverture de la cavité abdominale, injection de cellules tumorales dans le caecum, fermeture de la cavité abdominale. Par la suite, les souris seront traitées en intrapéritonéale. 14 jours après les traitements, les souris seront mises à mort.

Impact sur les animaux

L’acte chirurgical nécessite d’ouvrir la cavité abdominale des souris et d’injecter des cellules tumorales dans le caecum. Cette intervention chirurgicale pourrait entrainer de la souffrance chez les animaux, une perte de poids, ou encore une infection causée par l’intervention chirurgicale. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences car ils sont porteurs de tumeurs et ne pourront pas être ré-utilisés.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur des modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes.

Raffinement

Tout au long de l’opération, un contrôle de la profondeur d’anesthésie (pincement de la patte, contrôle de la respiration), la déshydratation (pli de peau : si le pli persiste plusieurs secondes, l’animal est fortement déshydraté) et l’hypoxie (couleur des muqueuses) seront contrôlées. Étant donné que la température ne peut pas être contrôlée et que le risque d’hypothermie est sévère lors d’une anesthésie, des tapis chauffants seront utilisés tout le long de l’expérimentation : du soin pré aux post-opératoires. Des antalgiques seront utilisés pour limiter la souffrance de l’animal. Des enrichissements de milieu seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leur nid. De la nourriture sera également mise dans la cage. Pour remédier aux infections qui peuvent être causées par l’intervention chirurgicale, un travail en condition aseptique sera réalisé. Pour cela, des espaces propres et sales seront utilisés. L’espace non-stérile sera utilisé pour les soins pré-opératoires, l’anesthésie, la tonte, les soins post-opératoires. L’espace stérile sera utilisé pour la préparation des consommables utilisés lors de l’acte chirurgical et l’acte chirurgical en lui-même. De plus, les deux premiers jours suivant l’intervention, une désinfection de la cicatrice sera réalisée. A la suite de l’opération, chaque animal sera examiné et pesé. Si des signes anormaux sont observés, la fréquence de surveillance sera augmentée. De plus, de la nourriture sera mise dans la cage. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance. Les injections intrapéritonéales (traitements) seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations.

Choix des espèces

Diverses souches de souris immunocompétentes sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, telles que les souris C57Bl/6 (MC38) et les BALB/c (CT26). Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’Homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

174 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur greffe par chirurgie abdominale une tumeur pancréatique humaine, avec suivi hebdomadaire par IRM et échographie sous anesthésie, injections du traitement et prélèvements sanguins, la tumeur pouvant provoquer douleurs abdominales et perte de poids. Les retombées annoncées pour les patients, un traitement plus efficace du cancer du pancréas, restent au conditionnel. Le porteur affirme que les modèles alternatifs ne reproduisent pas fidèlement la progression tumorale et invoque la "nécessité" de travailler sur un "organisme entier et vivant" avant tout passage chez l'humain.

Objectifs

Nous avons développé un traitement qui cible spécifiquement les cellules tumorales et qui a montré des résultats prometteurs contre les leucémies, cancer du sang. L’objectif est donc d’étendre son utilisation à d’autres cancers, tel que celui du pancréas. Le but de ce projet est de développer un modèle de souris qui récapitule au mieux le développement du cancer de pancréas humain afin d’évaluer dans un premier temps l’efficacité de notre traitement. Dans un deuxième temps, puisque notre traitement uttilise le mécanisme d’absorption du fer pour délivrer sa drogue toxique dans la cellule cancéreuse, ce projet nous aidera à comprendre les mécanismes physiologiques qui participent à la croissance tumorale, qui est fortement dépendante du fer.

Bénéfices attendus

L’incidence du cancer pancréatique est en constante hausse dans le monde, avec une survie sur 5 ans de seulement 8%. La lutte contre celui-ci est aujourd’hui une urgence de la santé publique. Nos résultats pré-cliniques sur le cancer du pancréas sont très prometteurs et nous poussent à étudier ce cancer dans un environnement proche de l’homme. Celui-ci nous permettra d’évaluer l'efficacité du traitement et de récapituler fidèlement la progression tumorale observée chez le patient. Ce projet nous permettra également d'approfondir les connaissances des tumeurs pancréatiques, aujourd’hui peu compris. Enfin, ce projet permettra d’améliorer la prise en charge des patients et de leur offrir un traitement plus efficace.

Procédures

Les animaux serons soumis à une procédure chirurgicale d’une durée de 30 minutes au cours de laquelle une incision abdominale sera pratiquée, le pancréas sera exposé et du tissu cancéreux humain sera placé dans le pancréas de la souris. Avant l’intervention, une dose d’anti-douleur sera administrée pour éviter toute souffrance. La chirurgie se déroule sous anesthésie profonde, et sous une grande surveillance de l’animal (respiration normale, absence de saignement). Les responsables du projet surveilleront quotidiennement les animaux pendant les 3 jours suivant la chirurgie, afin de s’assurer du bien-être de l’animal et que les points de suture sont stables. Pour suivre la croissance tumorale dans le site pancréatique, la souris sera imagée par IRM et échographie une fois par semaine. La procédure d'IRM et d'échographie (bien que non invasive ou douloureuse), se fera également sous anesthésie pour éviter de stresser l'animal et pour le maintenir immobile le temps de la procédure qui dure environ 20 minutes par animal. La moitié des animaux sera ensuite traitée avec le traitement et l'autre moitié sera traitée avec une solution saline et représentera le groupe dit “contrôle”, dans lequel la tumeur suivra son développement normal. Le traitement est administré par voie sanguine, toujours en anesthésiant l'animal pour éviter toute souffrance, et le protocole d'injection est d’une injection tous les quatre jours, sur 12 jours. La technique d'injection est bien maîtrisée par l'opérateur et prend moins d'une minute à réaliser. Pour évaluer l'impact du traitement sur les constantes sanguines, des échantillons de sang seront prélevés à au moins une semaine d'intervalle entre chaque prélèvement. Au moins 3 fois par semaine, les animaux seront contrôlés par les responsables du projet pour détecter tout signe et symptôme de souffrance. En cas de besoin, des anti-douleurs seront administrés, ou en cas de douleur/souffrance intense, les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Le projet consiste à greffer une tumeur de pancréas humaine dans le pancréas d’une souris, pour étudier la réponse à notre traitement anti-cancéreux. Nous sommes conscients des nuisances que cela peut entrainer chez l’animal, particulièrement au niveau de l’acte chirurgical mais aussi au niveau du développement de la tumeur. Ce dernier peut occasionner une gêne, une perte de poids et des douleurs abdominales. Les techniques d’imageries que nous utiliserons (IRM et échographie) et les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui peut également induire un stress chez l’animal au moment de l’induction et au réveil. L’acte chirurgical peut éventuellement entrainer une inflammation au niveau du site opératoire.

Devenir

Les animaux encore vivants à la fin du projet seront euthanasiés pour évaluer d'éventuels effets toxiques du traitement dans le pancréas, et les autres organes, ou pour évaluer d'éventuelles modifications des valeurs sanguines résultant de l'administration du traitement. Les organes seront collectés et examinés avec des techniques colorimétriques de laboratoire ce qui permettra d'obtenir des résultats utiles pour de futures expériences sur des souris, mais aussi pour prédire d'éventuels effets secondaires chez l'homme une fois que le traitement passera en phase clinique.

Remplacement

Nous avons commencé par tester l’efficacité et la toxicité de notre traitement sur des cellules de cancer de pancréas au sein du laboratoire. Cependant, il devient nécessaire d’étudier l’ensemble du processus tumoral et métastatique, dans un organisme entier et vivant récapitulant au mieux ce qu’il se passe chez l’homme. Malheureusement, les modèles alternatifs aux animaux ne permettent pas aujourd’hui de reproduire fidèlement la progression tumorale observée chez l’homme. Enfin, notre projet offre une alternative thérapeutique pour les patients atteints de cancer du pancréas, ce qui justifie la nécessité de travailler sur un modèle animal avant son application chez l’homme. Nous continuions à explorer de nouvelles méthodes alternatives pour réduire l’utilisation des modèles animaux autant que possible, mais la souris reste aujourd’hui le modèle le plus pertinent pour répondre à nos objectifs scientifiques.

Réduction

Dans le respect de la règle des 3R (remplacement, réduction, raffinement), nous nous sommes engagés à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en optimisant la qualité des résultats. D’une part, avant de commencer nos expériences sur les souris, nous avons évaluer l’efficacité de notre traitement sur des cellules de pancréas en laboratoire. Nos précédents projets portaient sur l’évaluation du même traitement sur des modèles de souris atteints de leucémies. Ainsi nous avons pu optimiser le nombre de souris par groupe suffisant pour obtenir des résultats de qualités et exploitables scientifiquement. A la fin de la procédure expérimentale, nous utiliserons les souris après euthanasie pour des analyses de biologie moléculaire et d’histologie dans le but d'étudier l’impact du traitement sur les tissus et l’expression de notre cible. Ainsi, l'utilisation du modèle animal sera optimisée au maximum pour récupérer toutes les données nécessaires à l’étude, sans avoir à utiliser plus d’animaux pour reproduire l’expérimentation. Enfin, nous utiliserons des techniques non invasives (IRM, échographie) pour observer en temps réel l’évolution tumorale. Ces techniques nous permettent de réduire le nombre d’animaux en évitant une fin de protocole prématurée et par conséquent une reproduction de l’expérimentation.

Raffinement

Pour respecter le bien-être animal, les conditions d'élevage, d'hébergement et de soins seront les plus adaptés possible pour réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable chez les animaux. Puisque les souris utilisées ont un système immunitaire affaibli, elles seront hébergées dans des conditions stériles. Le personnel a été récemment formé pour effectuer la pratique chirurgicale requise et suit régulièrement des cours de mise à jour à cet égard. Avant la procédure chirurgicacle, des anti-douleurs à action prolongée seront administrés et seront anesthésiées le temps de la procédure. Les instruments seront tous stérilisés pour éviter toutes infections. Au réveil, les animaux seront surveillés attentivement pour s’assurer qu’ils ne souffrent pas. Si un animal présente des signes de souffrances, il sera rapidement euthanasié dans le but d'assouvir toutes douleurs. Les sessions d’IRM et d’échographies seront également réalisées sous anesthésie pour minimiser le stress et l’angoisse des animaux, et seront maintenus sur une plaque chauffante à 37°C pour stabiliser leur température corporelle. Les responsables de projet surveilleront les souris 3 fois par semaine pour s’assurer de leur bien-être et qu’ils soient traités avec le plus grand respect et le moins de douleurs possible. Ils seront également suivis par les personnels qualifiés de l’animalerie 1 fois par jour.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie est une souris d’un système immunitaire affaibli, permettant de développer le cancer du pancréas humain. Ainsi, l’effet du traitement sur le cancer sera relevant par rapport à ce qu’on pourrait observer chez l’homme. Pour ce projet, il a été choisi d’utiliser des souris adultes donc bien développés (6 à 7 semaines) qui ont la capacité de cicatriser et de se rétablir rapidement après un acte chirurgical. Ce choix est également justifié par le fait que le cancer du pancréas touche plutôt des sujets adultes de plus de 55 ans.

24 cochons de 60 kg vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent la pose chirurgicale de deux cathéters dans les veines jugulaires, sont maintenus en cages individuelles pendant quatre semaines dont une isolés en chambre respiratoire, et la moitié est exposée à une chaleur de 32°C, avant la mise à mort pour prélever intestin, foie, muscle et tissus adipeux. L'objectif est de comparer, selon la race et la température, l'utilisation de l'énergie de l'alimentation pour la production porcine face aux vagues de chaleur. Le porteur affirme que les modèles mathématiques ne prennent pas en compte les différences entre races et justifie ainsi le recours aux animaux.

Objectifs

L'alimentation des porcs doit permettre de satisfaire les besoins nutritionnels des animaux, tout en limitant les excès préjudiciables à l'équilibre nutritionnel et contribuant de manière importante aux impacts de la production porcine sur l'environnement. L'énergie, bien que n'étant pas un nutriment, est fournie à l'animal sous forme de protéines, de lipides et de glucides, nutriments ayant des efficacités spécifiques pour fournir de l'énergie. Ainsi, les lipides ont une efficacité supérieure aux glucides de type amidon, ces derniers ayant eux-mêmes une efficacité énergétique supérieure aux protéines. La composition de l'aliment est donc susceptible de modifier l'efficacité énergétique du porc ce qui se traduit par une plus grande production de chaleur lorsque l'efficacité est la plus faible. Chez les porcs d'un poids vif de 60 kg, l'aliment contient 45% d'amidon, 16% de protéines, 15% de fibres et 2% de lipides. Les conditions d'ambiance et notamment le stress thermique sont susceptibles d'intéragir avec le métabolisme des animaux, car elles modulent la capacité des animaux à exporter la chaleur produite par le métabolisme. Au-delà de la caractérisation globale de l'efficacité énergétique d'utilisation de l'aliment, la compréhension des voies métaboliques impliquées dans l'utilisation des nutriments est également importante car elle permet d'identifier les leviers permettant de moduler l'efficacité énergétique des animaux et ainsi d'aider les animaux à faire face à des conditions difficiles d'ambiance. Ces voies métaboliques peuvent varier selon la susceptibilité des animaux, qui peut dépendre des contextes dans lesquels ils ont été élevés ou des contextes de sélection de la race. Les objectifs du projet sont de 1/ mesurer à l'échelle individuelle le bilan d'utilisation de l'énergie (par calcul de différence entre l'entrée sous forme d'aliment et les sorties dans les fèces, les urines, les gaz issus des fermentations digestives et la production de chaleur) selon les conditions d'ambiance et la race, et 2/ caractériser les voies métaboliques impliquées dans l'utilisation des nutriments selon les conditions d'ambiance et la race. L'identification des voies métaboliques différentes entre les conditions d'ambiance et les races va aider à identifier des leviers permettant d'aider les animaux à supporter les vagues de chaleur, plus fréquentes du fait du changement climatique.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre de disposer de connaissances concernant la capacité des porcs à faire face à des conditions d'ambiance de stress thermique et selon le contexte dans lequel la race a été sélectionnée. Nous attendons ainsi la mise en évidence de voies métaboliques plus efficaces chez les animaux les mieux adaptés à la chaleur, celles-ci générant ainsi une charge thermique plus faible pour les animaux. Des mécanismes différents de perte de chaleur pourront également être identifiés.

Procédures

Il y aura une procédure chirurgicale d'une durée d'une heure pour la pose de 2 cathéters dans les veines jugulaires. La moitié des animaux sera soumis à un stress thermique correspondant à une température ambiante de 32°C.

Impact sur les animaux

Les animaux sont placés en cages individuelles pendant toute la durée du projet (4 semaines). Au cours des trois premières semaines, les cages sont contigues. Au cours de la dernière semaine, les cages sont placées en chambre respiratoire induisant un isolement supplémentaire des animaux. La moitié des animaux sera placée dans des conditions d'ambiance de stress thermique correspond à une température ambiante de 32°C, ce qui pourra induire une gêne pour les animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de procéder à des prélèvements de tissus (intestin, foie, muscle et tissus adipeux) en vue de la caractérisation de voies métaboliques. Ces prélèvements complèteront les résultats obtenus à partir des prises de sang et des mesures de production de chaleur en chambre respiratoire.

Remplacement

L'adaptation des porcs à la chaleur est la résultante de modifications de l'activité physique, du comportement alimentaire, d'une répartition différente de la circulation sanguine et de modifications métaboliques et hormonales entraînant une utilisation différente de l'énergie. Peu de modèles mathématiques prennent en compte ces différentes composantes afin de prédire l'adaptation des porcs. Surtout, les modèles mathématiques ne prennent pas en compte les différences de réponse entre les animaux, liées à des sélections de race différentes. Pour cela, le projet est basé sur l'utilisation d'animaux issus de 2 races différentes en vue de mesurer leur réponse aux vagues de chaleur.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans le projet est déterminé sur la base d'essais antérieurs dans lesquels nous avons observé qu'un effectif minimal de 6 animaux par lot était nécessaire pour déterminer avec une puissance statistique suffisante la différence de production de chaleur entre les deux conditions d'ambiance. Nous avons 4 conditions expérimentales correspondant à 4 lots et nous allons donc utiliser 24 animaux dans le projet.

Raffinement

Les mesures du projet nécessitent de placer les animaux individuellement en chambre respiratoire. Les chambres sont équipées d'un dispositif audio permettant aux animaux de maintenir un contact avec leurs congénères. La mise en place de la condition de stress thermique se fera sur 5 jours, afin de laisser suffisamment de temps aux animaux pour s'adater à ces nouvelles conditions. Toutes les cages sont équipées de dispositifs d'enrichissement qui sont renouvelés régulièrement et au gré des comportements individuels. Ils s'agit de matériels manipulables (chaînes métalliques, balles en plastique dur, jouets en plastique mou). Les animaux seront équipés de cathéters, afin de pouvoir prélever du sang avec un minimum de douleur pour l'animal. Un protocole spécifique pour la prise en charge de la douleur est mis en place au moment de l'intervention chirurgicale. La prise en charge de la douleur est réalisée conformément aux recommandations pour un acte pouvant entraîner une douleur faible. Les animaux sont suivis a minima quotidiennement par du personnel expérimenté afin de détecter l'atteinte d'un point limite.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce-cible de l'étude. Les porcs seront des animaux en croissance, d'un poids vif d'environ 60 kg.

3 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par voie intraveineuse une protéine qui déclenche une hépatite aiguë, avec dégradation de la fonction du foie et signes cliniques attendus, puis des traitements par gavage une à deux fois par jour, avant la mise à mort pour prélever le sang et les organes. L'objectif est de tester des inhibiteurs d'enzymes développés par la société porteuse en vue d'une future application clinique. Le porteur affirme que ce type d'interaction inflammatoire ne peut pas encore être reproduit in vitro et que ce modèle est "nécessaire".

Objectifs

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des espèces chimiques oxygénées, telles que des radicaux libres, et jouent un rôle important dans la communication entre les cellules. Leur concentration peut cependant croître significativement en période de stress, sous l'effet de la chaleur ou de l'exposition aux ultraviolets par exemples, et alors endommager les structures cellulaires, ce qu'on appelle le stress oxydant. L'augmentation nocive d'espèces réactives de l’oxygène dans les cellules est principalement due à l'activation d'enzymes spécifiques appelées NADPH oxydases (NOX) menant à l’apparition de processus pathologiques telles que la fibrose ou l’inflammation. Le but de ce projet est de tester l’efficacité d’inhibiteurs des NADPH oxydases (NOX) développés par notre société en vue d’une future application clinique hépatique. Nous souhaitons ainsi tester nos molécules dans un modèle d’hépatite induite par une protéine (la Concanavaline A) chez la souris et y tester nos inhibiteurs d'enzymes NOX. Ce modèle d’hépatite induit une inflammation et le recrutement de cellules immunitaires dans le foie, imitant l’hépatite auto-immune chez l'homme.

Bénéfices attendus

Dans ces circonstances, un bénéfice thérapeutique peut être obtenu par l’inhibition des enzymes NOX afin de limiter la production d'espèces réactives de l’oxygène. Moins d'espèces réactives de l’oxygène doit conduire à limiter leurs effets néfastes sur les cellules et limiter le développement de maladies inflammatoires. Un bénéfice thérapeutique dans ce projet car nos inhibiteurs des enzymes NOX devraient réduire l'inflammation dans le foie.

Procédures

induction 1 intraveineuse par une veine de la queue, sous contention - 1 minute / pesées et traitements par sonde de gavage (1 en général, 2 maximum par jour, donc par étude) - 10 secondes chacun

Impact sur les animaux

La conA sera administrée par voie intraveineuse. Après le stress physique engendré par la contention et une douleur liée à la piqûre, cela a pour effet une dégradation de la fonction hépatique. Des signes cliniques liés à cette dégradation induite, donc attendue dans ce modèle, sont généralement visibles (piloerection, manque de toilettage). Afin de s’assurer qu’ils ne présentent pas de modification du comportement lié à un sepsis et/ou à la présence de souffrance et douleur, ces derniers seront surveillés à chaque manipulation, et plus étroitement dans les premières heures après l’induction. Un traitement par voie orale sera aussi administré aux animaux 1 ou 2 fois par jour selon la molécule testée et sa pharmacologie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, permettant le prélèvement de sang et d'organes. Ceci permettra de mesurer des marqueurs biologiques pour évaluer l'efficacité de nos composés.

Remplacement

Les progrès technologiques permettent de plus en plus le remplacement des animaux par des méthodes alternatives. Ces changements sont une bonne chose et dès que cela est possible nous réalisons des expériences in vitro dans le but d’identifier les composés les plus prometteurs, pour les tester par la suite in vivo. Dans le cadre de nos recherches, nous étudions l’effet des molécules sur l’inflammation au niveau du foie afin de traiter in fine des maladies hépatiques humaines. Le système inflammatoire va interagir avec plusieurs éléments du rein mais aussi d’autres organes. Malheureusement, ce genre d’interaction ne peut pas encore être reproduite in vitro c’est pour cela que la recherche in vivo, et ce modèle en particulier, est nécessaire.

Réduction

Ce modèle a déjà été utilisé pour tester des inhibiteurs d'enzymes NADPH oxydase au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. De plus, des tests in vitro sont réalisés au préalable afin de tester nos composés. Les données pharmacologiques des différents composés ainsi que leur profil pharmacocinétique seront obtenus avant le début des procédures. Nous ne testerons donc que les composés les plus puissants en pharmacologie primaire et ceux présentant les caractéristiques d’un potentiel futur médicament. Des tests statistiques seront choisis pour comparer l’efficacité de notre composé par rapport à un contrôle ou comparer plusieurs molécules entre-elles. Ces différents tests nous permettrons de démontrer l’efficacité de nos molécules par rapport à un contrôle ou un potentiel effet-dose.

Raffinement

Afin de limiter le stress causé aux animaux, les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique est bien tolérée par les animaux, un volume maximal de 10mL/kg leur sera administré. Après réception des animaux, ils seront placés dans des cages où des carrés de ouate seront mis à leur disposition pour la construction de leur nid. Un dôme rouge au minimum sera aussi présent afin que les animaux puissent se cacher. Leur comportement de rongeur sera encouragé par la présence d’un bâton de bois rigide par animal. La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière obscurité (12h - 12h), d’une température (20 - 24°C) et d’une hygrométrie (45 - 65%) contrôlés en permanence. Les animaux seront monitorés à chaque traitement pour la surveillance de signes cliniques et vérifier l'absence de souffrance.

Choix des espèces

Ce modèle est très bien décrit pour les rongeurs, particulièrement chez les souris Balb/c. Ces animaux sont réceptifs à l’induction par la conA, à des doses peu élevées et développent une pathologie fortement similaire à l’hépatite auto-immune humaine. Nous utiliserons des souris Balb/c mâles de 7 semaines à l’induction de la pathologie, le modèle et les doses étant bien connus et validés pour ces animaux, aussi bien dans la littérature que dans notre animalerie.