Procédures sévères
Mise en place d’un modèle porcin (miniporc) de contusion médullaire, et évaluation d’un nouveau dispositif innovant visant à améliorer la récupération sensori-motrice après lésion médullaire traumatique.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles musculosquelettiques
Une laminectomie, un ou trois impacts contrôlés sur la moelle épinière, puis une réouverture de la plaie pour injecter le dispositif testé ou une solution témoin : le protocole prévoit ce parcours pour au moins 18 des 23 miniporcs adultes du projet, chaque chirurgie se déroulant sous anesthésie générale. La déclaration classe 22 porcs dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et un seul sans réveil. Les porcs opérés passent jusqu'à six IRM de 45 minutes sous anesthésie et des prises de sang une à deux fois par semaine, et peuvent présenter les suites que le porteur décrit lui-même : troubles de la marche, incontinence ou impossibilité d'uriner et de déféquer, escarres, fonte musculaire. Tous sont tués à l'issue de chaque procédure, pour prélever la moelle épinière et comparer ses lésions aux dernières images IRM.
Objectifs
La lésion de la moelle épinière représente une cause majeure d’invalidité (paralysie), le plus souvent suite à un choc / impact sur le dos. Ce sont des lésions graves, qui peuvent entrainer la mort ou une paralysie plus ou moins importante (selon l'endroit de la blessure). Le but de cette étude est d’évaluer l’efficacité d’un nouveau traitement à implanter dans la moelle épinière, améliorant la récupération après une lésion médullaire traumatique. Ce dispositif est conçu pour aider le tissu nerveux à se régénérer. Notre objectif est de prouver le bénéfice médical du produit sur la récupération sensorielle et motrice de patients paralysés pour lesquels il existe peu ou pas d’espoir. Une partie de ce projet consistera provoquer un meutrissure de la moelle épinière par un choc contrôlé sur la moelle de miniporcs (sous anesthésie générale). Ce modèle de blessure est celui qui ressemble le plus à ce qui se passe chez l’Homme, ce qui rend les observations et traitements facilement transposables. Le suivi de la sévérité des lésions sera réalisé par IRM (imagerie), et via l'évaluation des capacités des animaux à bouger, marcher... Une guérison est espérée, ce qui à l'heure actuelle n'est pas possible.
Bénéfices attendus
La lésion de la moelle épinière représente une cause majeure d’invalidité. L’objectif de ce projet est de développer un dispositif de cicatrisation médullaire. Cela sera à terme bénéfique à l’homme victime de lésion médulaire traumatique, lui permettant une solution à une invalidité jusqu’ici irreversible. Cela pourrait également être une solution de traitement pour les animaux de compagnie victimes de lésions médullaires (exemple : suite à hernie discale chez le chien)
Procédures
- Examens IRM et scanner (sous anesthésie générale, durée 45min par examen IRM, 10min par scanner) : 1 IRM+scanner pour 1 animal lors de la phase 1 ; 2 IRM et 1 scanner pour 2 animaux lors de la phase 2 ; 4 IRM pour 4 animaux lors de la phase 3 ; 6 IRM pour 12 animaux lors de la phase 4. - Laminectomie et impacts (sous anesthésie générale) : 1 laminectomie et 3 impacts pour 2 animaux lors de la phase 2 ; 1 laminectomie et 1 impact pour 4 animaux lors de la phase 3 ; 1 laminectomie et 1 impact pour 12 animaux lors de la phase 4. - Réouverture de la plaie chirurgicale pour injection du DM/ de la solution SHAM (sous anesthésie générale) : 1 chirurgie et injection pour 2 animaux lors de la phase 2, 1 chirurgie et injection pour 4 animaux lors de la phase 3, 1 chirurgie et injection pour 12 animaux lors de la phase 4. - Prises de sang, sur animal vigile (si coopératif) ou anesthésié: env. 2 minutes, 1 à 2x par semaine au maximum
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles pour les animaux des phases 2, 3 et 4 sont : - Effets indésirables liés à l’anesthésie: température trop basse, arrêt du coeur et/ou de la respiration - Complications chirurgicales: mauvaise cicatrisation de plaie, infection - Douleur post-opératoire liée à la plaie chirurgicale (la moelle epinière est dépourvue de récepteurs à la douleurs) : lorsque la chirurgie a été réalisée correctement, la douleur s’estompe assez rapidement (de 6 à 9 jours chez l’Homme lors d'une opération sur la moelle épinière). Ensemble de troubles liés à la lésion de moelle: - Troubles de la locomotion: - Troubles pour uriner ou déféquer (incontinence ou au contraire impossibilité) - Complications liées à l'absence de mouvements: irritation et souillure par l’urine, ulcères (escarres) au niveau des zones de pression, perte de masse musculaire. Aucun effet indésirable lié au traitement n’est attendu
Devenir
Les animaux devront être euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de prélever la moelle épinière et effectuer des analyses complémentaires des lésions (histologie, biochimie) en fin d’étude et les comparer avec les dernières images IRM effectuées.
Remplacement
Les méthodes alternatives de culture cellulaire avec une simple couche de cellules ou un organoïde aboutissent a des résultats limités et ne rendent pas compte de la complexite du système nerveux, encore moins lorsqu’il est endommagé . Une prédiction précise sur un tableau clinique consécutif à la lésion, et son évolution, n’est pas non plus réalisable. L’évaluation de la sévérité et de la réparation des lésions dans le temps ne peut être réalisée que sur animaux vivants. En effet, l’objectif est de suivre la guérison de lésions dans le temps grâce à l’application d’un nouveau traitement. Cela ne peut être réaliser que par un suivi des animaux par imagerie (IRM), et par récupération fonctionnelle (suivi clinique) dans le temps.
Réduction
Au total 19 animaux seront utilisés pour la caractérisation d’un dispositif médical (toutes les phases comprises). Des animaux supplémentaires pourront être utilisés au besoin comme décrit précédemment (maximum 4 en tout). Une évaluation approfondie des résultats sera effectuée avant le début de chaque nouvelle phase, afin de ne pas utiliser d’animaux supplémentaires inutilement. Un nombre minimum d’animaux est utilisé pour chaque phase. Un gros avantage de l’IRM est de pouvoir faire le suivi d’un même animal tout au long de l’étude, évitant ainsi des groupes d’animaux supplémentaires prévus pour des euthanasies intermédiaires.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être des animaux, nous utiliserons principalement l’IRM, qui est une modalité d’imagerie non-invasive et non-ionisante. Les animaux auront une période d’acclimatation à l’animalerie d'au minimum 7 jours avant le début des procédures expérimentales et feront l'objet d'un conditionnement positif, basé sur des intéractions amicales avec les personnels en charge des soins, et l'administrations de récompenses, afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Tous les animaux recevront un enrichissement du milieu adapté à leur espèce, régulièrement renouvelé (rotation des jouets par exemple). Des points limites suffisamment prédictifs sont mis en place. Tous les actes douloureux ou nécessitant une immobilité longue (chirurgie, imagerie, éventuelles prises de sang) seront réalisées sous anesthésie générale. Les éventuelles douleurs liées à la réalisation des lésions médullaires seront prises en charge dès la période pré-chirurgicale, par administration d'analgésiques et antalgiques: morphiniques et anti-inflammatoires non stéroïdiens. L'efficacité des traitements anti-douleur sera vérifiée au moins 2 fois par jour par observation des animaux. Les procédures réalisées nécessiteront très probablement un isolement des animaux, mais un contact visuel et auditif sera maintenu entre les individus. Les prise en charge clinique des animaux sera basée sur ce qui se fait en pratique vétérinaire et hospitalière, avec un suivi rapproché des animaux, prévention des escarres et mise en place d'un programme de physiothérapie / rééducation.
Choix des espèces
Le miniporc offre divers avantages pour le développement de thérapies des lésions médullaires et leur transposition clinique. C'est une espèce pour laquelle de nombreuses données sont disponibles dans la littérature. Contrairement aux rongeurs, le miniporc a une anatomie, une physiologie et une pathophysiologie similaires à celles de l'Homme. Les instruments chirurgicaux et analytiques pour les interventions, ainsi que les dispositifs thérapeutiques sont similaires, voire égaux, à ceux utilisés chez l'Homme. Les miniporcs ont une bonne tolérance aux déficits neurologiques, même graves, avec l'avantage de présenter un tempérament docile, facilitant la prise en charge post-opératoire et la rééducation. Les animaux devont avoir leur taille adulte (19-20 mois environ). En effet, il est essentiel que les animaux ne soient pas en période de croissance pour ce projet pour ne pas biaiser les résultats liés aux mesures de la moelle, des lésions, et donc de l’efficacité du traitement.
Impact de l’activation immunitaire maternelle sur les infections congénitales par le cytomégalovirus
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
996 rats vont être utilisés, tous mis à mort à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Des rates gestantes reçoivent une injection destinée à activer leur système immunitaire et deux prises de sang, puis sont opérées sous anesthésie pour l'injection d'un cytomégalovirus dans le cerveau de leurs embryons, avec des avortements partiels possibles. Tatoués aux pattes dès le premier jour, leurs ratons passent un test de retournement sur le dos et un test d'éloignement du vide sur une plateforme de 8 cm, puis, selon les groupes, l'implantation d'électrodes sous anesthésie, des tests cognitifs et comportementaux non nommés portant sur l'anxiété, la mémoire spatiale et la sociabilité, et 72 heures d'EEG par télémétrie. Ces ratons infectés peuvent présenter dès leurs deux premières semaines des crises d'épilepsie déclenchées par la manipulation, associées à des morts subites, et le porteur attend du projet "des informations importantes" et la "possibilité" de prévenir un jour ces conséquences.
Objectifs
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du neurodéveloppement (e.g. microcéphalie, polymicrogyrie, surdité, paralysie cérébrale, épilepsie, déficience intellectuelle...). Une influence neuropathologique à plus long terme a été évoquée, notamment sur la survenue d'autisme ou de schizophrénie. En dépit de leur fréquence et de leurs conséquences médicales et socio-économiques, la physiopathologie des infections congénitales au CMV reste peu étudiée et mal connue. Ainsi, les options préventives et thérapeutiques restent limitées. L’étude de modèles animaux pertinents, notamment chez la souris et le rat, utilisant les CMVs spécifiques de ces espèces, représente une approche de choix pour appréhender les mécanismes sous-jacents complexes et évolutifs, le développement du système immunitaire cérébral et des réseaux neuronaux, et leurs interactions réciproques. L'objectif principal de ce projet est d'explorer chez le rat l'impact de la réaction immunitaire au CMV et les conséquences de l'infection du cerveau en développement par le cytomégalovirus (CMV), à différents niveaux d’analyse : au niveaux moléculaire et cellulaire, au niveau des conséquences proximales pendant la période postnatale précoce et à plus long terme sur la cognition, le comportement et la survenue d'activités épileptiques spontanées.
Bénéfices attendus
Les infections congénitales par le cytomégalovirus sont fréquentes (0.7 à 1% des naissances) et représentent une cause majeure de pathologie neuro-développementale, avec des conséquences médicales sévères et un impact socio-économique important. Cependant, les mécanismes restent mal compris et peu abordés, et l'impact à long terme notamment reste mal connu. De ce point de vue, notre projet doit apporter des informations importantes pour apprécier ces conséquences, tout en ouvrant la possibilité de les prévenir en ciblant des altérations précoces du cerveau en développement.
Procédures
Une injection périphérique est pratiquée chez des femelles gestantes puis un prélèvement sanguin est réalisé 3h et 24h après l’injection. Après au moins 2 jours de récupération, les mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale, afin d’accéder aux embryons et d’injecter le CMV dans les cerveaux embryonnaires. Dépendant du nombre d’embryons, la chirurgie dure de 30 à 45 minutes ; le muscle et la peau sont suturés. Au premier jour postnatal, les ratons d’une même portée sont tatoués au niveau des pattes avant et/ou arrière, et suivis quotidiennement pendant les deux premières semaines de vie postnatale (mesures de masse corporelle, réalisation de tests sensorimoteurs (test du réflexe de retournement lorsque l’animal est placé sur le dos, test du réflexe d’éloignement du vide lorsque la tête de l’animal est dans le vide, l’animal étant posé sur une plateforme élevée d’environ 8 cm), observation de la survenue de crises généralisées d’épilepsie) ; chaque session de tests dure environ 2-3 minutes. Aux stades P18 et P30, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter une électrode permettant d’enregistrer les activités corticales précoces. Ces enregistrements sont réalisés chez l’animal éveillé pendant environ 30 minutes, puis sous anethésie générale légère pendant au maximum 2 heures. Après P60, d’autres animaux sont évalués au cours de test cognitifs et comportementaux non-invasifs, sans restriction d'eau ni de nourriture (anxiété, reconnaissance et mémoire spatiales, sociabilité). Des sessions d’entrainement sont réalisées afin de minimiser le stress. Une fois ces tests terminés, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter un système permettant d’enregistrer les activités corticales sans fil. Ces explorations fonctionnelles (vidéo-EEG télémétrique ; durée 72h) sont réalisées une semaine après la chirurgie chez l’animal vigile en activité dans sa cage.
Impact sur les animaux
Le composé injecté aux femelles gestantes peut déclencher une réaction transitoire (hyperthermie, hypoactivité, et hypophagie) qui se normalise après 24h. Un prélèvement sanguin est réalisé à 3h et 24h post-injection. Après au moins 2 jours de récupération, ces mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale pour accéder aux embryons et réaliser des injections dans les cerveaux embryonnaires. L'anesthésie des femelles gestantes peut engendrer des dépressions respiratoires, une hypothermie, une déshydratation. La chirurgie elle-même peut engendrer en post-opératoire sur des temps courts (1 à 3 jours maximum) de rares et faibles hémorragies vaginales, des avortements partiels, des douleurs abdominales, une diminution de la mobilité / inactivité, une perte de poids, une inflammation des sutures. Les femelles gestantes sont isolées lors de la période post-opératoire jusqu’à la mise bas. Leur bien-être après chirurgie est évalué quotidiennement par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques. La majorité des femelles gestantes (>97%) récupèrent très bien après la chirurgie et la gestation se poursuit jusqu’à la mise bas. Chez les ratons nés après l’infection cérébrale au CMV in utero, un ensemble de phénotypes est attendu. Leur suivi quotidien au cours des deux premières semaines de vie postnatale a mis en évidence la survenue : d'hyperextension des membres inférieurs ; de crises d'épilepsie généralisées tonico-cloniques déclenchées par la manipulation, et correlée à la survenue de mort subite (sudden unexpected death in epilepsy, SUDEP) ; d’un défaut de développement de réflexes sensorimoteurs évalués par le test d'éloignement du vide (cliff aversion test) et le test de retournement (rigthing reflex). A plus long terme, nous anticipons des altérations fonctionnelles et comportementales chez les rats infectés par le CMV in utero, e.g. des activités épileptiques spontanées, des troubles du cycle veille/sommeil, des troubles cognitifs (mémoire spatiale) et des troubles de la sociabilité, mais cela doit être exploré et validé.
Devenir
Les femelles sont euthanasiés car elles ne peuvent pas être réutilisées. La descendance est mise à mort pour analyses post mortem.
Remplacement
Les mécanismes neurophysiopathologiques des infections congénitales par le CMV reposent de manière inhérente sur des interactions développementales multiples, entre la dynamique de l'infection virale elle-même, celle des réseaux neuronaux, et celle du système immunitaire cérébral. Il est évident que certains de ces évènements, ainsi que leur complexité, et leurs relations réciproques, ainsi que leurs conséquences à long terme comme envisagé dans le projet, ne peuvent être modélisés in vitro y compris en utilisant des cérébroïdes, et encore moins in silico. Cette constatation est évidente pour les études cognitives et comportementales. Une partie de nos expériences d'enregistrements des activités épileptiques sera réalisée in vitro (tranches aigues de cerveau), afin de réduire l’expérimentation sur l’animal vivant.
Réduction
Nous avons basé le nombre minimal d'animaux nécessaires sur la base de nos résultats antérieurs, et sur des calculs classiques de puissance statistique pour les tests les plus usuels. Nous optimisons la réduction des animaux utilisés de plusieurs manières : - chaque gestation et tous les embryons injectés in utero sont utilisés. - par ailleurs, le principe de réduction sera appliqué, car un animal jeune adulte passera à la fois les tests cognitifs et comportementaux, puis les enregistrements EEG ; les tissus cérébraux étant prélevés à l'issue de ces analyses. Ceci aura de plus l'avantage de permettre d'établir d'éventuelles corrélations entre plusieurs anomalies chez les mêmes animaux ayant passé l'ensemble des tests.
Raffinement
Le bien-être des animaux est évalué par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques adaptés, y compris les weekends et jours fériés, consignés dans un registre (avec une fiche de suivi post-opératoire pour les femelles gestantes, qui permet d'établir un score, et une fiche de suivi des cohortes de ratons injectés au CMV). Chaque rate et sa portée est hébergée dans une cage avec nourriture et eau à volonté. L’environnement est enrichi avec des matériaux souples (papier foisonnant, litière en carrés de cellulose vierge) et un tunnel en carton permettant la confection d’un nid. Les femelles gestantes subissent une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale, sur un tapis chauffant. Le rythme respiratoire des animaux est surveillé en permanence, et une injection intra-péritonéale de sérum physiologique est réalisée en fin d’intervention. Après leur réveil, les femelles sont placées sur un tapis chauffant pendant au moins 30 minutes. Un suivi post-chirurgical est réalisé : surveillance de la cicatrisation (nettoyage de la plaie et nouvelles sutures si détérioration), d’absence d'hémorragie vaginale, de la mise bas (euthanasie si retard de la mise bas supérieur à 24h), de la perte de poids (euthanasie si > à 20%), de l'hypothermie (froid au touché), des signes de douleur (prostration, agressivité, absence de réaction aux stimuli). En fonction du score obtenu, une injection d'analgésique ou d’anti-inflammatoire peut être pratiquée. Les ratons sont également suivis avec notamment une surveillance de leur état général et de leur prise de poids, et de l’apparition des phénotypes caractéristiques de notre modèle. Ces mesures seront quotidiennes de P1 à P14. Après P14, seul le poids sera mesuré, d’abord quotidiennement jusqu’à P20, puis 1 fois par semaine jusqu’à P30. Après sevrage (à P30), les animaux seront regroupés par sexe à 2-3 par cage dans un environnement enrichi (rouleaux de papier foisonnant et tunnel en carton). Le poids sera suivi une fois par semaine après P30. Autour de P60, les tests comportementaux seront précédés de plusieurs sessions d’habituation pour minimiser les effets du stress.
Choix des espèces
Les animaux que nous utilisons, en l'occurrence les rats, sont des rongeurs de petite taille et d’élevage facile, avec une gestation d'une durée adaptée aux exigences des travaux de recherche. Ils possèdent un système nerveux central dont le développement présente de nombreuses similitudes avec celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est cependant suffisamment complexe pour être représentative. D'une manière générale, ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes pathologiques du développement cérébral. Le rat est particulièrement adapté à des études électrophysiologiques, cognitives et comportementales. Dans le projet présenté ici, le choix de l'espèce est aussi orienté par l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus de rat recombinante, car les cytomégalovirus, y compris ceux de rat, sont spécifiques d'espèce. Les rates gestantes seront âgées d'environ 10 semaines à 6 mois. Les infections in utero seront réalisées à E15, donc au début du dernier tiers de gestation, ce stade d'infection tenant compte de l'état de développement cérébral, d'impératifs méthodologiques, et conduisant à reproduire les conséquences neurologiques postnatales rappelant la pathologie humaine modélisée ici. L’étude des activités épileptiformes in vitro seras réalisée entre P14 et P17, période classique où le cerveau immature, correspondant à la période néonatale chez l'homme, présente une plus forte susceptibilité aux activités épileptiques. Les enregistrements des activités corticales précoces seront réalisés à P18 et à P30, qui sont des périodes classiquement utilisées pour ce type d’enregistrements. La recherche d'effets à plus long terme du CMV sera réalisée chez des jeunes rats adultes (P60 et au delà), permettant la réalisation efficace de tests cognitifs et comportementaux, ainsi que des enregistrements EEG télémétriques sur plusieurs jours consécutifs.
Évaluation du potentiel thérapeutique d’antagonistes du récepteur NOP de la nociceptine dans des modèles de stress chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Elles subissent un conditionnement de peur par chocs électriques, un confinement avec sons intenses, un jeûne de vingt-quatre heures et jusqu'à quatre injections, développant une anxiété et une hypervigilance pendant les quatre semaines suivantes. L'objectif est de tester si des antagonistes de la nociceptine préviennent les symptômes de stress post-traumatique, une partie des souris étant tuée pour prélever des tissus cérébraux. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de travailler sur un modèle animal pour étudier ces comportements complexes.
Objectifs
Les troubles du stress post-traumatique se développent chez les individus exposés à un événement traumatisant et altèrent de façon significative la vie personnelle, sociale et/ou professionnelle. A l’heure actuelle le traitement de ces troubles est très insuffisant. Ainsi il est primordial d’identifier de nouvelles cibles pour permettre notamment de prévenir l’apparition de la pathologie dans les populations à risque ou d’empêcher son développement de façon précoce après le trauma. La nociceptine est un neuromédiateur impliqué dans la réponse au stress. Des études antérieures nous ont permis de montrer que le blocage des effets de la nociceptine améliorait les symptomes cognitifs et émotionnels dans des modèles de stress chronique. Des données suggèrent également que cette stratégie pourraient aussi empêcher le développement des symptomes de stress post-traumatique. C'est cette hypothèse que nous souhaitons tester dans ce projet. Les deux objectifs principaux sont donc: 1) Déterminer si le blocage du système nociceptine par des molécules antagonistes empêche le développement des symptômes de type stress post-traumatique dans un modèle souris; 2) Identifier les circuits cérébraux modulés par le système nociceptine lors du stress qui pourraient expliquer ces effets bénéfiques.
Bénéfices attendus
Les études comportementales permettront de valider le potentiel des antagonistes nociceptine pour prévenir le développement ou traiter les symptômes du TSPT dans un modèle préclinique. L'étude des circuits cérébraux associés fournira des données fondamentales sur le mécanisme d’action de cette nouvelle classe de régulateurs de la réponse au stress. Des antagonistes nociceptine sont déjà en développement clinique, notamment pour le traitement de la dépression. S'ils sont positifs, nos résultats fourniront une preuve de concept pour étendre leur utilisation et évaluer leur capacité à soulager les symtômes du TSPT chez l'humain. Ils permettront aussi de savoir si des différences d'effet liées au sexe sont à prévoir.
Procédures
Exposition à 2 stimulations électriques de 2 secondes d'intensité faible à modérée. 1 à 4 injections intra-péritonéales (10 secondes). Confinement dans un compartiment de petite taille et exposition à des sons brefs et intenses pendant environ 15 minutes. Jeûne de 24 heures avant un test comportemental.
Impact sur les animaux
Le conditionnement de peur classique produit un stress aigu chez les animaux au moment des stimulations électriques (2 chocs de 2 secondes) ainsi qu'une anxiété lorsque le son est de nouveau présenté lors des premières séances d'extinction. Le modèle TSPT produit également un stress aigu chez les animaux au moment des stimulations électriques (2 chocs de 2 secondes), une anxiété lorsque le son est de nouveau présenté lors des premières séances d'extinction, ainsi qu'une anxiété et une hypervigilance modérées pendant les 4 semaines qui suivent le conditionnement. Le test de réflexe de sursaut implique un stress modéré associé au confinement dans le compartiment de test. Les animaux recevront aussi de une à quatre injections qui impliquent un stress d'environ 10 secondes.
Devenir
Les animaux seront mis à mort car les procédures auxquelles ils ont été exposés peuvent modifier leur comportement ultérieur. Pour une partie des animaux, des tissus doivent être prélevés pour étudier les circuits cérébraux impliqués dans les comportements observés.
Remplacement
L’objectif du projet étant l’étude de comportements complexes, le conditionnement de peur et les symptômes associés, il est indispensable de travailler sur un modèle animal. Il s’agit de valider une stratégie thérapeutique dans un modèle préclinique.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des conclusions valides : 16 animaux pour les études comportementales et 10 pour les analyses post-mortem. Afin de limiter le nombre d'animaux, les symptômes d'anxiété et d'hypervigilance seront étudiés sur les mêmes individus en prenant soin de respecter des pauses d'au moins 5 jours entre les tests. Le nombre total d'animaux utilisés pourra être réduit si certaines étapes du projet ne donnent pas de résultats positifs: 1) la deuxième molécule sera testée uniquement dans les conditions pour lesquelles la première aura montré un effet positif, 2) l'étude n'utilisera le modèle TSPT que si celui-ci est validé préalablement, 3) l'activité des neurones ne sera étudiée que dans les conditions pour lesquelles les molécules testées auront montré des effets positifs sur le comportement.
Raffinement
Les souris sont hébergées à 4 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu'une buchette pour l'enrichissement. Après réception, un temps d'habituation d'une semaine est respecté avant le début des expériences. Les animaux sont ensuite habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation. Les animaux ayant subi un stress aigu développent un phénotype anxieux mais celui-ci est relativement subtil. Il est révélé lors des différents tests comportementaux mais ne se traduit pas par des symptômes spontanés dans la cage d'hébergement. Les animaux sont cependant suivis de manière quotidienne par du personnel formé au soin. Si une altération de l'état est observée (isolement, baisse du comportement exploratoire, attitude prostrée, expression faciale modifiée, défense à la manipulation), une grille de scoring est utilisée pour déterminer la conduite à tenir en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Les modèles de conditionnement de peur et de TSPT sont bien caractérisés chez la souris et reproduisent une partie des symptômes observés chez l'humain. Le système nociceptine a également été très étudié chez la souris et présente de fortes similitudes avec celui de l'humain. L'objectif de l'étude est d'étudier l'effet des antagonistes NOP chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux âgés de 8 semaines dont on considère que le système nerveux est mature.
Développement d’un modèle de migraine chronique à l’aide d’injections répétées d’une préparation inflammatoire chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1836 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'un cathéter crânien, puis des injections répétées d'une préparation inflammatoire sur la dure-mère pour induire une migraine chronique, avec des tests de sensibilité douloureuse de la face et des pattes. Le porteur indique que les rats restent douloureux et les tue en fin d'expérience pour cette raison. Il annonce que le modèle mis au point "pourra être proposé à la commercialisation" pour tester des candidats médicaments.
Objectifs
La migraine est un trouble de la douleur neurologique. Elle a un impact sur la santé mais aussi socio-économique. Selon des rapports épidémiologiques, la migraine touche 1 personne sur 10 dans le monde et son incidence continue d'augmenter (2017). Dans le Global Burden of Diseases 2016, la migraine était la sixième maladie la plus courante parmi 328 maladies et méfaits. En plus des céphalées, les migraineux présentent d’autres symptômes comme des nausées, de la fatigue, une photo et/ou phonophobie et des allodynies mécaniques et thermiques. L’allodynie est un stimulus normalement non douloureux ressentie comme douloureux. Il est particulièrement ressenti au niveau de la face des patients. Les traitements médicamenteux actuelles sont des triptans, des corticoïdes et plus récemment des anti-CGRP (CGRP est un peptide impliqué dans la migraine). Malheureusement ces traitements ne sont pas sans effets secondaires. De plus, certains patients répondent mal à ces traitements. Il est donc important de développer de nouveaux traitements. Pour cela, nous souhaitons mettre au point un modèle de douleur migraineuse induit par injection répétée d’une préparation inflammatoire au niveau de la dure mère. Ce modèle, décrit largement dans la littérature, permet de montrer les mêmes symptômes qu’une personne migraineuse (baisse de l’activité, douleur spontanée, allodynie thermique et mécanique). De plus, la physiologie de l’animal est impactée de la même manière que chez l’homme. Ce modèle semble être le plus proche de l’homme et donc permettre des translations rapides. Dans le cadre de ce travail, nous souhaitons donc mettre au point ce modèle et tester la détection d’allodynie mécanique et thermique. Dans un second temps, nous testerons la réversion de l’allodynie par une molécule de référence (Triptan/antagoniste CGRP).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est la mise au point d’un modèle fiable et reproductible. Ce modèle pourra être proposer à la commercialisation. Ainsi, de nouveaux candidats médicaments pour l’homme pourront être testé. La caractérisation de ce modèle par de nombreux tests pourra donner lieu à un poster dans le cadre d’un congrès.
Procédures
Les animaux subissent une chirurgie implantatoire d’un cathéter au niveau du crâne (une chirurgie d’environ 20-40min). Selon les procédures ils peuvent être soumis à des mesures de sensibilité douloureuse tactile (face, patte), de mesure de sensibilité thermique (patte). Ces tests durent moins d’une minute chacun et sont répétés durant une cinétique de 5 points de mesures (15 min minimum de repos entre chaque). Ces animaux pourront recevoir une molécule de références selon une voie d’administration courantes afin de tester la réversion de la sensibilité à la douleur (moins d'une minute).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables que vont subir les animaux sont les chirurgies pour réaliser l’implantation de la canule au niveau de la duremère. Ceci peut entrainer une douleur. Ce modèle est un modèle de migraine les animaux peuvent développer des mgraines spontannées. Les animaux auront des tests de douleur mécanique ou thermique. Cette opération est réalisée tous les jours de D2-D16 sauf les week-ends dans une procédure. Ensuite, les tests ne seront réalisés que à D2, et le jour où les animaux seront considérés comme migraineux. Une cinétique de test pourra être réalisée allant jusqu’à 5 points de mesures espacés de 15min minimum.
Devenir
L’ensemble des animaux sont mis à mort. Le développement du modèle agit sur les mécanismes inflammatoires. Il est donc difficile de connaitre l’impact neurophysiologique sur d’autres modèles utilisés au sein du laboratoire. De plus, les animaux ont un modèle de migraine chronique. Ils restent donc douloureux. Pour l’ensemble de ces raisons, ils sont mis à mort dès la fin de l’expérience.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP (International Association for the study of pain), la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. Cet effectif par groupe sera confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié. A la fin de la procédure 1, le nombre d’animaux pourra être réajusté en fonction des résultats.
Raffinement
De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, papier kraft et briquettes en bois à ronger). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour. Pour les tests, des cut-off ont été fixé afin de limiter la douleur. De l’habituation aux tests/contention est faite afin de limiter le stress. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie isoflurane et un traitement antibiotique sera réalisé afin d’éviter les risques d’infections.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP (International Association for the study of pain) Ass est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés seront des rats pré-adolescent. Nous garderons les animaux environ un mois. Nous ne souhaitons pas avoir des animaux trop gros afin de pouvoir réaliser les tests sereinement. De plus, les crises de migraines chez l’homme sont souvent intensifiées à la période de l’adolescence avec les changements hormonaux.
Renforcer l’immunité innée dans les poumons des porcs pour lutter contre la grippe porcine
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Des porcelets arrivés à l'âge de 4 semaines reçoivent sous anesthésie une nébulisation, de flagelline pour les groupes traités, et une partie d'entre eux est inoculée avec le virus de la grippe porcine, dont les symptômes typiques sont la fièvre, la toux, l'écoulement nasal et les éternuements. 20 porcs vont être utilisés, avec jusqu'à cinq prises de sang et quatre écouvillons sous sédation. Une partie des procédures est déclarée d'un niveau de souffrance sévère, le reste modéré, et le porteur écrit que l'infection grippale chez le porc "n'est pas très grave" et que la fièvre attendue n'est "pas trop sévère". Tous sont tués à l'issue pour des lavages broncho-alvéolaires et des prélèvements de poumons. Le porteur présente le projet comme une réponse aux "besoins de la société" en matière de production de viande "responsable, durable et rentable".
Objectifs
La filière porcine est confrontée à un nombre croissant de défis, dans la perspective d'une production alimentaire durable et sûre. La lutte contre la grippe porcine est très difficile car les vaccins contre la grippe ne parviennent pas à conférer une immunité protectrice. La stimulation par la flagelline, un agoniste spécifique du système immunitaire inné respiratoire, est apparue comme une stratégie alternative pour favoriser la résistance aux maladies. Nous avons précédemment montré que l'administration de flagelline par voie systémique stimule les défenses immunitaires innées antibactériennes et antivirales de l'hôte dans les voies respiratoires. De plus, nous avons montré un effet protecteur de la flagelline dans un modèle d'infection de la grippe chez la souris, ce qui suggère que la flagelline pourrait également être efficace contre la grippe chez le porc. Cet effet bénéfique pourrait être attribué à son activité pro-inflammatoire et à un effet positif sur la maturation des cellules immunitaires résidentes. Nous proposons une approche de biologie systémique dans laquelle nous combinerons plusieurs nouvelles techniques (séquençage, imagerie confocale...) pour déchiffrer la complexité des réponses du porc aux infections par la grippe et les mécanismes de protection induits par la flagelline. Nous apporterons d'abord la preuve de concept que l'administration de flagelline protège contre la grippe porcine. Ensuite, nous identifierons les déterminants génétiques impliqués dans la réponse de l'hôte à la grippe et responsables de l’effet de la flagelline, et nous utiliserons des approches de machine learning pour produire un algorithme prédisant la susceptibilité des cellules à l'infection. Cette approche servira à développer des thérapies plus sûres et plus efficaces pour combattre la grippe porcine. Les résultats seront partagés avec les acteurs industriels pour assurer un transfert efficace.
Bénéfices attendus
Notre projet utilise une nouvelle stratégie pour stimuler le système immunitaire des porcs afin de lutter contre la grippe porcine. Cela répond aux besoins de la société en terme d'avoir une production de viande responsable, durable et rentable. Nous allons: • Montrer que la flagelline peut protéger les porcs contre la grippe porcine. • Étudier comment la grippe porcine affecte les cellules des poumons des porcs et comment la flagelline peut aider à renforcer leur immunité. • Trouver de nouvelles façons de combattre la grippe porcine en identifiant des voies moléculaires qui pourraient être ciblées par de nouveaux médicaments. • Développer des outils informatiques pour mieux comprendre comment les porcs réagissent à la grippe porcine et pour prédire leur susceptibilité à l'infection. Cette approche permettra de mieux prévenir la propagation de la grippe porcine et d'améliorer la santé des porcs, ce qui est important pour une production de viande durable et responsable. De plus, il est important de noter que la grippe porcine est une maladie zoonotique, ce qui signifie qu'elle peut se transmettre des animaux aux humains. En étudiant la grippe porcine et en développant de nouvelles méthodes pour la combattre, nous serons mieux préparés à faire face à une éventuelle vague de grippe porcine. Cela peut aider à prévenir une épidémie et à protéger la santé publique. En fin de compte, en améliorant la santé des porcs, nous améliorons également la santé des humains.
Procédures
Pendant la première expérimentation, nous utiliserons 8 animaux qui subiront : 2 prélèvements sanguins, sur animaux vigiles sédatés, 2 tubes de 5 mL, 2 min et 1 Nébulisation sur animaux anesthésiés, 30 minutes. Dans la deuxième expérience, nous utiliserons un total de 12 animaux qui subiront : 1 Nébulisation sur animaux anesthésiés, 30 minutes ; 1 administration en intranasale sur animaux anesthésiés, 15 min ; 5 prélèvements sanguins sur animaux sédatés, 2 tubes de 5 mL, 2 min et 4 Ecouvillons sur animaux sédatés, 2 min
Impact sur les animaux
Des expériences antérieures suggèrent que les animaux peuvent avoir une légère baisse de température après avoir récupéré de l'anesthésie et de la nébulisation de flagelline. Les prises de sang seront faites sous anesthésie. Pour les animaux inoculés avec de la grippe ; on s'attend à ce que les animaux développent de la fièvre (mais pas trop sévère) pendant quelques jours, elle peut persister jusqu'à la fin de l'expérience (3 jours). Les symptômes typiques de la grippe porcine sont de la fièvre, de la toux, de l'écoulement nasal et des éternuements.
Devenir
Les animaux à la fin de la procédure seront tous euthanasiés pour réaliser des lavages broncho-alvéolaires et différents prélèvements des poumons.
Remplacement
L'étude de l'effet de la flagelline comme thérapie dans le cas d’une infection grippale ne peut être effectuée en utilisant uniquement des lignées cellulaires in vitro. La réponse immunitaire présente un comportement complexe et dynamique qui dépend non seulement de la réponse des cellules épithéliales des voies aériennes, mais aussi de son interaction avec un grand nombre de cellules immunitaires (neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques, cellules T ...). En outre, la clairance de l'agent pathogène dans les voies aériennes dépend de cette réponse immunitaire, mais aussi du transport mucociliaire. Cette complexité rend presque impossible d'imiter la réponse à la flagelline in vitro. Pour ces raisons, l’utilisation des lignées cellulaires ne peuvent pas reproduire la complexité de la réponse immunitaire in vivo qu’implique une interaction entre différents types de cellules.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimum d'animaux qui peut nous donner un résultat scientifiquement valable. Pour la première expérimentation qui implique l'étude de l'effet pro-inflammatoire de la flagelline dans les poumons, nous utiliserons 4 porcs pour le groupe traité et 4 porcs pour le groupe de contrôle. Bien que le nombre d'animaux ne soit pas très élevé pour montrer l'effet de la flagelline, nous utiliserons une technologie qui peut être utilisée pour étudier la réponse immunitaire des cellules des voies respiratoires des porcs à l'infection par la grippe, en analysant l'expression de gènes dans chaque cellule individuelle. Cette technique permet de recueillir une grande quantité de données à partir d'un seul porc, ce qui peut réduire le nombre total d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Pour la deuxième expérimentation, des expériences précédentes réalisées chez les souris ont montré que 6 animaux par groupe expérimental suffisent pour observer un effet significatif de la flagelline sur la charge virale. Pour cette raison, nous utiliserons 6 porcs par groupe.
Raffinement
Des expériences et des publications antérieures utilisant des modèles expérimentaux porcins d'infection grippale montrent que l'infection grippale chez le porc n'est pas très grave. On s'attend à une légère hyperthermie quipeut être ou non associée à une toux et à des éternuements. La stimulation de la flagelline provoque une réaction inflammatoire transitoire dans les poumons (moins de 24 heures). Les porcelets seront sédatés ou sous anesthésie pour tous les actes techniques ; sous la supervision de personnel qualifié et formé. Les 8 animaux de la première expérimentation seront hébergés en groupe de 4 dans une cage de 2 m². Les 12 animaux de la seconde seront hébergés en groupe de 6 dans une cage de 4 m². Ils seront hébergés en groupe tout au long des 2 procédures. Dans chaque cage, il y aura un ballon, un nunchaku ou/et chaînes. Ils auront accès à la nourriture à volonté. Une semaine d’acclimatation est prévue dans chaque expérimentation pour que les porcelets s’habituent à leur nouvel environnement. Un renforcement positif sera mis en place avec des fraises tagada ou du pop-corn. Toutes les prises de sang et écouvillons seront réalisés sur animaux sédatés.
Choix des espèces
La grippe porcine est un pathogène du porc, ce qui fait du porc l'espèce animale la plus pertinente. D'autres modèles animaux existent, comme les souris, mais pourraient produire des réponses immunitaires différentes. Les porcs seront âgés de 4 semaines à l’arrivée. A ce stade, les animaux pèsent entre 8 à 10 kg, ce qui facilite la manipulation et les anesthésies.
Caractérisation d’une thérapie génique sur modèle murin de myopathie liée au gène Mtm1.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Modèles d'une myopathie liée au gène Mtm1, elles reçoivent des injections intramusculaires ou intrapéritonéales dès le premier jour après la naissance, subissent des tests de suspension et d'actimétrie et une mesure de force musculaire sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur signale que l'injection chez le nouveau-né peut déclencher le cannibalisme des parents et que la maladie provoque un phénotype sévère à partir de huit semaines. Il affirme que ces analyses ne peuvent être menées sur cellules en culture, seul l'"organisme entier" permettant d'étudier la maladie dans sa globalité.
Objectifs
Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions d’une protéine impliquée dans certaines myopathies ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Bénéfices attendus
Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine étudiée ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.
Procédures
Les 240 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 3 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 8 semaines d’âge. Les 390 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 8 semaines d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 8 semaines d’âge.
Impact sur les animaux
La souris atteinte de myopathie myotubulaire présente un phénotype sévère. Les premiers signes du phénotype dommageable n’apparaissent qu’à l’âge de 4-5 semaines pour atteindre un maximum à environ 8 semaines. A noter qu’il existe une certaine variabilité phénotypique entre les animaux mutants et que tous ne développeront pas l’ensemble des signes de la maladie. A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. L'injection intrapéritonéale effectuée au premier jour post-natal peut causer une douleur modérée au moment de l'injection, cependant, elle n'a pas d'incidence sur la prise de poids ultérieure. Il est à noter que cette manipulation peut, dans de rares cas, déclencher le cannibalisme des parents envers leur portée. L’injection intramusculaire de la patte sous anesthésie occasionne une douleur modérée au réveil mais qui n’empêche pas la mobilité ni l’accès à la nourriture.
Devenir
Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures car notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire.
Remplacement
Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus.
Raffinement
Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement après l’injection intramusculaire afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance éventuels comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et les difficultés ambulatoires. Une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole et la mise à mort des animaux par dislocation cervicale. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.
Choix des espèces
Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous traiterons ces animaux à des stades très précoces (premier jour post natal) pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également au stade adulte (4 semaines) pour étudier l’effet après l’apparition des symptômes.
Evaluation de l’effet de la photobiomodulation sur la viabilité et la fonctionnalité des îlots pancréatiques (NIRILO)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
115 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie réutilisée pour la formation de personnels, le reste tué. Ils reçoivent une ou deux injections de streptozotocine pour les rendre diabétiques, de nombreux prélèvements sanguins, une greffe d'îlots pancréatiques par chirurgie dorsale puis un prélèvement terminal, pour tester si la photobiomodulation améliore la survie des greffons. Les rats ne devenant pas diabétiques sont réaffectés à l'enseignement de techniques expérimentales, et une quarantaine d'autres sont ouverts puis tués sans réveil pour prélever leur pancréas. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier l'effet sur un "organisme entier" avant tout usage chez l'humain.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer si la photobiomodulation présente un intérêt thérapeutique dans le contexte des greffes d’îlots de Langerhans, et si oui quelles en seraient les modalités (mode d’illumination, dose, profil et timing d’illumination, etc..) dans le cadre d’un éventuel essai clinique.
Bénéfices attendus
Si les résultats sont positifs et mettent en évidence un avantage thérapeutique de la photobiomodulation (lumière de basse énergie), nous prévoyons de proposer une suite au projet à travers la continuité de tests précliniques ainsi que des validations réglementaires en vue d’un essai clinique (first in man), pour évaluer la sécurité et la fiabilité de cette approche thérapeutique innovante. De plus, le mécanisme biologique d’effet de la photobiomodulation étant assez générique, on peut imaginer, si les résultats sont concluants, le transposer à d’autres organes éligibles à la greffe, permettant ainsi d’augmenter le pool de greffons disponibles, et de réduire le nombre de patients en liste d’attente.
Procédures
40 à 75 rats seront recevront 1 ou 2 injections d’une molécule (la streptozotocine) les rendant diabétiques (30 sec). Afin de suivre leur glycémie et donc leur état diabétique, une goutte de sang sera prélevée de façon bi-quotidienne la première semaine puis toutes les semaines pendant 2 semaines, soit 14 prélèvements sanguins d’une durée de 1 minute chacun. Lors de la greffe d’îlots, les animaux seront anesthésiés, recevront un analgésique par injection et auront une chirurgie dorsale (30 min). La glycémie sera de nouveau suivie quotidiennement. 10 gouttes de sang seront prélevées toutes les semaines pendant 8 semaines, soit 8 prélèvements sanguins d’une durée de 3 minutes chacun. Un test de tolérance au glucose sera réalisé durant 120 minutes. Cela consiste à injecter du glucose (30 sec) puis à mesurer la glycémie à différents temps (13 gouttes de sang prélevées durant les 120 minutes du test). Les animaux seront enfin anesthésiés pour un prélèvement terminal. 40 rats seront anesthésiés et recevront un analgésique. Leur ventre sera ouvert pour prélever le pancréas puis l’animal sera mis à mort sans réveil. Durée totale de la procédure 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les inconforts prévisibles liés à la technique est le risque d’hypoglycémie pouvant survenir dans les 48h suivant l’injection de la streptozotocine suivie d’une hyperglycémie apparaissant dans les suites de l’injection de streptozotocine. La mesure de glycémie, l’injection de streptozotocine et la greffe d'îlots sera réalisée par une personne formée à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Devenir
Les rats non répondant à l'injection de streptozotocine ne seront pas considérer comme naïfs, ils permettront l'enseignement de techniques expérimentales au sein du laboratoire par et pour les personnes formées à l'expérimentation animale. Les 40 animaux ayant suivit l'étude (10 contrôles, 10 diabétiques, 10 diabétiques greffés d'îlots et 10 diabétiques greffés d'îlots pré-illuminés) seront mis à mort à la fin de celle-ci pour prélever les organes et faire des analyses moléculaires.
Remplacement
Les test ont été préalablement fait sur des lignées cellulaire et îlots isolés avant l'approche in vivo. Cette étape intermédiaire est essentielle après les tests sur lignées cellulaires et avant les tests sur ilots humains. Il est nécessaire de pouvoir étudier l'effet de la greffe d'îlots illuminé sur un organisme entier et pas uniquement sur des cellules isolées avant l'utilisation chez l'humain.
Réduction
Réduit au minimum le nombre d'animaux : nous prévoyons l'usage de 115 rats : 75 pour l'obtention de minimum 30 rats diabétique (l'injection de la molécule rendant les rats diabétique a une efficacité de 40% minimum), 10 rats contrôles et 30 rats pour obtenir des îlots à greffer. L'ensemble des ces effectifs ont été déterminé par des tests statistiques afin de pouvoir détecter un ré-équilibrage glycémique. A noter que si l'efficacité de la molécule rendant les rats diabétique est supérieur à 30%, les rats surnuméraire seront réaffectés sur d'autres projets. A noter que les rats injecté avec de la Streptozotocine et non devenu diabétique pourront être utilisé à des fins d'enseignement de techniques expérimentales au sein du laboratoire.
Raffinement
Raffinement : 1) Améliorer l’hébergement des animaux avec un milieu enrichi 2) Observation quotidienne (pesée, glycémies, comportement, aspect, détection de tout souffrance) 3) Dans les 48h suivant les injections de streptozotocine, risque d’hypoglycémie : mise à disposition d’eau avec du sucre durant 48h 4) Au long cours après l’injection de la molécule rendant les rats diabétiques, développement d’un diabète et hyperglycémie : si glycémie > 3g/L, injection d’une molécule pour diminuer le sucre dans le sang 5) Change d’animaux plus fréquent (toutes les 48h ou plus si nécessaire) 6) Chirurgie faite sous anesthésie + Analgésie préopératoire 7) Chirurgie effectuée sur un tapis thermostaté pour éviter le refroidissement des animaux au contact direct avec la surface de travail 8) Dans les suites opératoire, réveil sous lampe chaude, mise à disposition de nourriture semi-liquide, utilisation d’une litière en cellulose pour plus de propreté 9) Analgésie post-opératoire : avec injection d'un antalgique toutes les 8h durant 48h 10) Toutes les manipulations d’animaux sont faites par des personnes expérimentée et habilitée à l’expérimentation animale. Les points limites : un score est donné aux animaux selon 3 critères : Changement de poids corporel initial, Apparence physique, Comportement. Si le score est supérieur à 3, les animaux seront considérés en souffrance et seront euthanasiés par le responsable du projet après consultation de la cellule bien-être animal.
Choix des espèces
Modèle de rat classiquement utilisé pour l'isolement d'ilots pancréatiques par digestion enzymatique, et conditions fonctionnelles au laboratoire pour induction d'un diabète par la streptozotocine. Adultes d'environ 200-300g afin d'avoir un pancréas mature et pour avoir un meilleur effet de la streptozotocine.
Etude de l’induction de structures lymphoïdes tertiaires (TLS) par virothérapie dans des modèles syngéniques de souris porteuses de tumeur
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2484 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis des injections répétées de virus oncolytiques, par voie intratumorale, intranasale ou dans la muqueuse de la joue, avec un suivi des tumeurs par imagerie sous anesthésie. L'objectif est d'évaluer la capacité de ces virus à induire des structures lymphoïdes tertiaires et une réponse antitumorale, les retombées pour des patients atteints de cancer étant renvoyées à un éventuel développement clinique. Le porteur affirme que ces mécanismes ne peuvent être modélisés ni in vitro ni sur organoïdes et conclut qu'il est "primordial" de recourir à des souris pour observer l'interaction avec l'"organisme hôte".
Objectifs
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) représentent une cible nouvelle dont le contrôle de la formation est devenu un enjeu immunothérapeutique. En effet, les TLS sont à l’origine du développement de réponses immunitaires adaptatives locales souvent favorables pour les patients atteints de certains cancers. Il a été montré que certaines molécules pouvaient être à l’origine de leur induction. Notre projet vise à évaluer la capacité de ces molécules, exprimées localement par des virus oncolytiques, à induire la formation de TLS. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des virus de la vaccine dont certaines souches ont déjà montré une capacité à induire des TLS. Les objectifs de ce projet sont d’évaluer la capacité de nouveaux virus oncolytiques armés, à induire des TLS et à générer une activité anti-tumorale. Nous verrons dans un second temps, s’il est possible d’augmenter leur efficacité thérapeutique en les combinant avec une autre immunothérapie.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de valider chez l’animal les effets thérapeutiques de ce nouveau traitement, en vue de le transposer ensuite chez l’humain dans le but final d’améliorer le pronostic vital de patients atteints de cancers. Si un effet probant est observé, les virus armés avec les chimiokines humaines pourront être générés dans l’entreprise collaboratrice, de sorte à poursuivre le projet vers un développement clinique. Si elle s'avère bénéfique, maitriser l'induction des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans le microenvironnement tumoral pourrait être une nouvelle voie de traitement des cancers. Les résultats issus de ce projet nous permettront aussi d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux et les molécules intervenant dans la néogénèse de TLS.
Procédures
Des tumeurs seront implantées chez les souris, par injection de cellules tumorales en sous-cutané, intrapéritonéal ou en intraveineuse. L’intervention n’aura lieu qu’une fois, durera moins d’une minute et sera réalisée sur souris vigile. Les tumeurs injectées par voie intra-muqueuse de la joue seront réalisées sur des souris anesthésiées une dizaine de minutes par injection de kétamine et xylazine. L’administration du traitement par voie intra tumorale des tumeurs sous-cutanées sera aussi réalisée sur souris vigile, ne durera pas plus d’une minute et sera répétée au maximum 3 fois (un jour sur deux). L’administration du traitement par instillation intranasale se fera sur souris anesthésiées et tenues à la verticale. L’opération durera environ 5 min par souris et sera répétée un jour sur deux pendant six jours. L’administration du traitement par voie intra-tumorale des tumeurs de la joue se fera aussi sur souris anesthésiées et sera répétée un jour sur deux pendant six jours. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie IVIS à une fréquence de 2 fois par semaine. Pour cette opération les souris seront anesthésiées avec de l’isoflurane à 2 pourcent durant une quinzaine de minutes. Toute injection intra péritonéale d’anesthésiant ou de traitement sera réalisée sur souris vigile et durera moins d’une minute.
Impact sur les animaux
La douleur potentielle liée aux actes d’injections des cellules tumorales ou des virus oncolytiques se limitera à l'introduction de l'aiguille au site d'injection et aura lieu au maximum à 4 reprises par animal et par procédure. La contention des animaux peut procurer un stress ponctuel (quelques minutes). La croissance des tumeurs sous-cutanées ou intrapéritonéales pourra générer une gêne physique et des difficultés à la mobilité. La croissance des tumeurs pulmonaires orthotopiques pourra occasionner une gêne respiratoire. La croissance des tumeurs intra-muqueuses de la joue pourra générer une gêne physique et une difficulté à la prise alimentaire. Les anesthésies peuvent être associées à des risques d'hypothermie, d'hypoventilation ou encore d'arrêt cardio-respiratoires.
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées afin de prélever les tumeurs et d’analyser l’infiltrat immunitaire du microenvironnement tumoral après chaque procédure.
Remplacement
Nos travaux portent sur l’induction de structures lymphoïdes tertiaires au sein de tumeurs. Ce mécanisme fait intervenir plusieurs paramètres dynamiques et complexes (système immunitaire, vascularisation) qui ne peuvent pas être modélisés ailleurs que dans des modèles in vivo, pas même dans des modèles d’organoïdes. De plus, dans ce projet nous souhaitons valider de nouveaux virus oncolytiques candidats. Il est donc primordial d’utiliser des modèles in vivo afin d’appréhender leurs interactions potentielles avec l’organisme hôte.
Réduction
Avant d’être testés chez l’animal, les virus oncolytiques ont été caractérisés in vitro dans plusieurs lignées tumorales murines et humaines. Seuls ceux qui ont prouvé une activité efficace in vitro seront utilisés dans ce projet. Au sein d’une même expérience nous testerons plusieurs virus avec les mêmes groupes témoins, nous réduirons également le nombre d’animaux utilisés dans le groupe non-traités. Le suivi de la croissance tumorale dans le modèle pulmonaire orthotopique se fera par imagerie IVIS, ce qui permet de faire plusieurs mesures sur un même animal sans avoir à l'euthanasier. Des prélèvements pourront être fait sur les animaux destinés à être euthanasiés, avant et après euthanasie, afin d’évaluer en parallèle la pharmacologie des virus et des substances anti-tumorales utilisés et de réduire ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Ce projet implique l'utilisation de 2484 souris maximum.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés (6 souris maximum par cage) et ne seront expérimentées qu'après une semaine minimum de stabulation. Notre structure possède un programme d'enrichissement (placement de nids végétaux et de tunnels en carton dans les cages) lors d'expérimentations supérieures à 15 jours. La stabulation sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, 6 animaux maximum par cage de type-IIL, température de 22 degrés plus ou moins 2 degrés, éclairage alterné jour et nuit 12h-12h de 6h-18h), et celles-ci recevront un régime alimentaire classique (nourriture Mucedola 4RF25 ou 21 ad libitum+eau par abreuvage automatique). Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs et animaliers pendant la durée de chaque expérience. Les animaux seront pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Les points suivants seront considérés comme limitants : tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire ; toute modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos voûté) ; toute anomalie pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : perte de poids supérieur ou égale à 20 pourcent du poids initial de l’animal, plaies et ulcères, fractures, détresse respiratoire ou tout signe d’essouflement, tumeurs sous-cutanées et intra-muqueuses excédent respectivement 2000 mm3 et 300 mm3. Les instillations intra-nasales (i.n.) et les injections intra-muqueuses (i.m.) seront réalisées sur des souris anesthésiées puis remises dans leur cage au moment du réveil contrôlé visuellement, avec une lampe chauffante pour maintenir leur température corporelle. L'injection par voie intraveineuse (i.v.) sera réalisée dans la veine caudale préalablement dilatée par frottement à l'éthanol 70 pourcent et exposition sous une lampe chauffante. L’analyse de la croissance tumorale sera réalisée par imagerie IVIS chez des souris anesthésiées par l’isoflurane 2 pourcent.
Choix des espèces
La souris fait partie des modèles expérimentaux les plus utilisés, il est actuellement possible d'avoir accès à un grand nombre de protocoles et de réactifs adaptés ce qui a permis de comprendre de nombreux mécanismes transposables à l'humain. Le système immunitaire humain possède de nombreuses similitudes avec celui de la souris et des travaux ont montré qu'il était possible d'observer des structures lymphoïdes tertiaires (élément primordial de nos recherches) chez la souris. Par ailleurs, les cellules immunitaires ont été exhaustivement caractérisées chez la souris: les marqueurs des cellules d'intérêts de cette étude sont connus et de nombreux réactifs sont disponibles. Les animaux seront reçus à l'âge de 12 semaines, car ce stade de développement correspond à des souris sevrées, de taille adulte et qui dispose d'un système immunitaire mature.
Toxicité aiguë par voie orale, cutanée et par inhalation. Lignes directrices de l’OCDE n°423, 402 et 436
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1400
1 400 souris et 1 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont gavés, exposés par voie cutanée sous pansement pendant 24 heures ou placés en contention jusqu'à quatre heures pour une exposition par inhalation, afin de déterminer la dose de substances chimiques qui doit être considérée comme létale. Le porteur indique que l'exposition peut provoquer des effets locaux et systémiques faisant souffrir les animaux, la mortalité observée conditionnant la poursuite des études. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative reconnue sur le plan réglementaire, ces études in vivo étant "indispensables".
Objectifs
Les industriels doivent montrer qu’ils maîtrisent les risques de l’exposition aux substances chimiques qu’ils utilisent et/ou souhaitent mettre sur le marché pour répondre aux exigences réglementaires (règlementations REACH, CLP, Biocides, etc.). Les tests qui s’avèrent nécessaires pour en caractériser les dangers doivent être réalisés suivant les lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour les essais de produits chimiques. L’objectif de ces études est d’évaluer la toxicité aiguë de l’exposition par voie orale, cutanée et par inhalation à des substances chimiques chez le rongeur (rats ou souris). Suivant des signes de toxicité, la mortalité et la morbidité observées après l’exposition aux substances, elles permettront de les catégoriser selon le Système Général Harmonisé de classification et d'étiquetage des produits chimiques et de déterminer dans quelle gamme de doses elles doivent être considérée létale.
Bénéfices attendus
Ces études renseigneront sur les effets sur la santé de l’exposition aiguë par voie orale, cutanée et par inhalation à des substances chimiques pour répondre à des requis réglementaires ou des questionnements sanitaires.
Procédures
A réception les animaux seront identifiés par un marquage à la queue, puis manipulés au moins 2 fois par semaine, au maximum tous les jours, pour être pesés et observés au plan clinique. Toxicité orale aiguë : Ils seront mis à jeun de la veille du traitement jusqu’à 3 à 4h après pour les rats, et de 3 à 4h avant le traitement jusqu’à 1 à 2h après pour les souris. Pour le traitement, les animaux seront maintenus vigiles manuellement en contention (< 3 min) et gavés avec la solution d’essai. Suivant les modalités d’administration de la substance, une ou plusieurs contention et gavage seront pratiqués. Toxicité cutanée aiguë : Pour la tonte, ils seront maintenus vigiles manuellement en contention (< 3 min) et rasés à l’aide d’une tondeuse dédiée aux petits animaux. Pour une manipulation plus aisée, ils pourront au préalable être anesthésiés. Pour le traitement, les animaux seront maintenus vigiles manuellement en contention (< 3 min) et la substance appliquée au niveau de la zone rasée du dos et du flanc. Elle sera maintenue en contact avec la peau au moyen d'un pansement de gaze poreux et d’un sparadrap non irritant et un bandage entourant le corps de l’animal pendant 24h. Ils pourront pour cela être placés en contention au moyen de tubes dédiés. Ils seront dans ce cas, préalablement à l’exposition, habitués à la contention en étant stabulés dans les tubes jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Après l'exposition, ils seront maintenus vigiles manuellement en contention (< 3 min) et la zone exposée essuyée à l’aide d’un papier absorbant imbibé d'eau ou d’un solvant approprié pour éliminer tout résidu de substance. Toxicité aiguë par inhalation : Préalablement à l’exposition, les animaux exposés en mode « nez seul » seront habitués à la contention en étant stabulés dans les tubes jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Durant l’exposition, les animaux seront placés individuellement pendant (au maximum) 4h dans des loges dans une enceinte d’exposition en mode « corps entier » ou maintenus en contention dans des tubes en mode « nez seul ». Après exposition, suivant les objectifs de l’étude, les animaux pourront être soumis à une mesure de la température rectale. Ils seront pour cela maintenus vigiles manuellement en contention durant quelques minutes (< 5 min).
Impact sur les animaux
Toxicité orale aiguë : Préalablement au traitement par voie orale, les animaux seront mis à jeun. Réalisé sur animaux vigiles, le gavage et la contention manuelle nécessaire pour le réaliser constituent un stress pour les animaux. Une régurgitation de la solution d’essai pourra également être observée au moment ou suite au gavage. Toxicité cutanée aiguë : Préalablement au traitement cutané, les animaux seront rasés au niveau du dos et du flanc. La tonte et la contention manuelle nécessaire pour la réaliser, si elle est pratiquée sur animaux vigiles, constituent un stress pour les rongeurs. De plus, la présence du pansement et, le cas échéant, le placement en tube de contention durant 24h après exposition pourra gêner les animaux, impacter leur mobilité et constituer un stress. Toxicité aiguë par inhalation : En cas d’exposition « nez seul », la contention imposée par le placement dans les tubes constitue un stress pour les animaux, car ils seront durant cette période immobilisés et ne pourront se nourrir et s’abreuver. La mesure de la température rectale, si elle est réalisée, constitue également un stress. Dans les 3 types d’études, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité pendant et après l’exposition à la substance, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront. L’exposition à la substance pourra également induire des effets locaux (notamment cutanés, oculaires et au niveau des muqueuses) et systémiques (notamment gastro-intestinaux et respiratoires) susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux pourront être observés et leur physiologie être affectée.
Devenir
Conformément aux lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques, tous les animaux seront mis à mort selon une méthode autorisée au temps de sacrifice défini à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Il n’existe pas actuellement de méthodes alternatives à l’expérimentation animale qui permettent seules de déterminer la toxicité aiguë de substances suite à une exposition par voie orale, cutanée ou par inhalation et qui soient reconnues d’un point de vue réglementaire. Les études in vivo sont pour cette évaluation indispensables. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°423, 402 (utilisation de rats ou de souris femelles, ou de mâles si des informations sur la toxicité de la substance le justifient) et 436 (utilisation de rats mâles et femelles, ou uniquement d’un des deux sexes si des informations sur la toxicité de la substance le justifient) à l’âge adulte et de souches couramment utilisées en laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux qui sera utilisé suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques. Une analyse des données bibliographiques disponibles sur la substance et ses analogues sera réalisée préalablement à l’étude pour déterminer la dose initiale à tester parmi les niveaux prédéfinis par la ligne directrice, la plus proche de celle qui devrait a priori permettre de la catégoriser (choix justifié par des données toxicologiques sur la substance) ou la plus pertinente pour limiter le nombre d’animaux utilisés (dose définie par la ligne directrice en cas d’absence d’informations). Pour l’évaluation de la toxicité aiguë par voie orale et par inhalation, le taux de mortalité et le nombre d’animaux moribonds déterminent la poursuite des études. Pour l’évaluation de la toxicité aiguë par voie cutanée, la gravité des signes anormaux sera évaluée par rapport à un mode opératoire interne défini sur la base de données bibliographiques et données historiques du laboratoire. L’occurrence de signes de toxicité et le taux de mortalité déterminent la poursuite de l’étude. Pour les 3 types d’études, seule une analyse descriptive des données sera réalisée.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés préférentiellement à plusieurs par cage (par dose) pour leur socialisation. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront également disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Les animaux seront observés attentivement au plan clinique dans les heures qui suivront le traitement, et jusqu’à ce que leur bon état de santé soit avéré. Des points limites et des actions correctives spécifiques au projet ont été définis. En cas de pathologie pouvant être soulagée (anomalies externes), un traitement médicamenteux pourra être administré s’il n’interfère pas avec les objectifs de l’étude. Des critères supplémentaires à ceux listés dans la présente demande pourront être définis au cas par cas suivant les informations toxicologiques disponibles sur la substance étudiée. Le cas échéant, ils seront indiqués dans le protocole de l’étude. En particulier dans l’étude de toxicité cutanée aiguë, les animaux pourront être anesthésiés avant d’être tondus pour limiter le stress de la manipulation. Dans les études de toxicité aiguë par voie cutanée et par inhalation, en cas de mise en contention durant l’exposition, des tubes semblables à ceux utilisés pour l’exposition des animaux seront disposés dans les cages d’hébergement pour leur permettre de se cacher et se familiariser avec le dispositif d’exposition. Au préalable, les animaux seront habitués à la contention imposée par le placement dans les tubes en y étant stabulés jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Les tubes seront tapissés de matériaux absorbants pour assurer le confort des animaux. Après chaque jour d’habituation, de la nourriture sera déposée dans leurs cages d’hébergement en guise de récompense.
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées chez le rongeur car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets toxicologiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°423, 402 et 436, d’utilisation du rat ou de la souris, de souches communément utilisées en laboratoire pour la réalisation de ces études, d’animaux adultes (âgés au moment de l’exposition de 8 à 12 semaines), d’un poids de ± 20% du poids initial moyen des animaux traités au préalable, et de femelles nullipares et non gravides le cas échéant.
Biodistribution et toxicologie des cellules Tregulatrices genetiquement modifiees dans un modele tumoral
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
588 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Immunodéficientes, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sur les deux flancs et des injections répétées de cellules thérapeutiques, avec suivi du volume tumoral et imagerie sous anesthésie sur huit semaines. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer douleur, difficulté à se déplacer et à se nourrir, émaciation et prostration. Il affirme que le recours aux souris est "nécessaire" pour un produit de thérapie cellulaire destiné à l'humain, aucune méthode in vitro ne reproduisant selon lui la complexité de l'organisme.
Objectifs
Avant toute administration de produit à visée thérapeutique chez l'homme, la mise en évidence de l'efficacité et de l'innocuité du produit doit être démontrée chez l'animal. Dans le cas présent, le produit développé par notre société est un produit de thérapie cellulaire et doit répondre aux lignes directrices d'étude des produits ATMP (Advanced Therapeutic Medicinal Product). Parmi les études précliniques constituant le dossier de soumission d'essai clinique, des données de pharmacologie, de sécurité et de persistance/biodistribution sont demandées dans des modèles pertinents pour la pathologie ciblée. Les objectifs du projet sont de mettre en place un modèle de xénogreffe utilisant des cellules tumorales Jurkat exprimant un antigène d'intérêt spécifique du récepteur chimérique exprimé par des Tregs humains génétiquement modifiés afin de 1) de vérifier la distribution du produit dans des modèles de souris relevants 2) vérifier l'activation des cellules constituants le produit thérapeutique au site d'inflammation après reconnaissance de leur antigène cible et 3) de vérifier la persistance et l'absence de toxicité du produit
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont de : 1) obtenir des données précliniques préliminaires de distribution du produit 2) d'obtenir des données de sécurité/d'absence de toxicité du produit thérapeutique
Procédures
L'injection des cellules prend entre 30 secondes et 1 min par souris selon la voie d'injection, deux injections par animal à plusieurs jours d'intervalle selon la procédure. L'analyse du volume tumoral sera faite sur animaux vigiles 2 fois par semaine pendant 8 semaines maximum soit 16 contentions. En cas de stress de l'animal ou souffrance due à la tension/traction de la peau de la tumeur, cette mesure du volume tumoral pourra être faite sous anesthésie générale gazeuse en air avec de l'isoflurane (4% (induction), maintenance 1-2%, 2 fois par semaine pendant 8 semaines maximum soit 16 anesthésies. Dans le cas où nous injecterons un produit permettant la survie du produit thérapeutique, l'animal recevra au maximum 7 injections supplémentaires (injection tous les 3 jours pendant 14 jours maximum, 30 secondes à 1 minute par animal). Pour l'analyse par bioluminescence, les souris seront injectées avec un produit permettant la bioluminescence. L'injection prend environ 1 min par animal à chaque analyse hebdomadaire, 3 analyses maximum. Pour cette analyse par bioluminescence, les souris seront anesthésiées avec de l'isoflurane (4% (induction), maintenance 1-2% en air) pendant le temps de l'imagerie (3 anesthésies maximum). L'analyse dans le bio-imager prend environ 15min pour 5 souris à la fois.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont l'apparition d'une tumeur solide au niveau des deux flancs de l'animal engendrant une douleur et des difficultés à se déplacer, l'inactivité, une difficulté à s'alimenter ou boire résultant à une émaciation de l'animal. Ils peuvent également comprendre une perte de poids, un aspect hirsute du poil, la prostration (l'animal présente un dos voûté, reste recroquevillé dans un coin de la cage et ne se déplace plus).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour la récupération d'échantillons biologiques
Remplacement
L'emploi des modèles animaux est nécessaire au projet car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthodes alternatives permettant de reproduire in vitro la complexité physiologique des échanges entre les nombreux types cellulaires et l'impact du micro-environnement sur la stabilité de nos cellules.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisé, chaque groupe contiendra le nombre minimum indispensable à l'obtention de résultats statistiquement pertinents. De nombreux tests in vitro permettant une sélection importante de nos cellules seront effectués afin de valider leur qualité et leur efficacité avant les tests in vivo
Raffinement
Dans une approche éthique, nous prévoyons de limiter au maximum le nombre d'animaux avec des scores cliniques sévères et mettre en place des points limites adaptés. Nous utiliserons également une litière adaptée (douce, non-poussiéreuse) et un enrichissement qui favorise l'expression des comportements normaux de la souris (enfouissement, nidification...). Un apport de gel hydrique dans la cage est réalisé pour simplifier l'accès des animaux à une source hydrique et sera mis à disposition des animaux dès le début de leur hébergement pour les habituer à cette source hydrique. Les souris immuno-déficientes sont hébergées en portoir ventilé par groupe de 5 souris maximum par cage dans la zone stérile de l'animalerie. La nourriture et l'eau sont stérilisées avant administration. Pour la préhension des animaux et éviter le stress nous utiliserons un tunnel auquel nous les habituerons lors de leur phase d'acclimatation. Les procédures seront faites sous anesthésie générale gazeuse en air pour le confort de l'animal. Les anesthésies gazeuses en air seront pratiquées sur un tapis chauffant. Nous utiliserons également l'imagerie in vivo par bioluminescence (méthode non invasive). Les animaux seront alors manipulés sous une hotte stérile avant la mise en place dans la chambre d'analyse fermée et stérilisée pour maintenir leur statut stérile au maximum puis replacés dans leur cage stérile.
Choix des espèces
Seules les souris immunodéficientes acceptent les greffes de cellules humaines. L'injection de cellules humaines dans une souris immuno-compétente ne serait pas possible car les cellules et les tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire de la souris (xénogreffe). Souris adultes de 6 à 10 semaines (âge généralement utilisé pour les xénogreffes de cellules tumorales dans la littérature scientifique). Ces souris ont aussi un leur poids relativement stable en fin de croissance, pour la facilité de manipulation, de prélèvement et d'analyses d'échantillons, d'évaluation physique (bien-être)
Exploration de l’intégrité de la Barrière Hémato-Encéphalique au cours de l’évolution de la Sclérose Latérale Amyotrophique dans un modèle murin transgénique de cette maladie par une approche combinée in vivo et in vitro
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Porteuses d'un modèle de sclérose latérale amyotrophique, elles développent une paralysie progressive et reçoivent des injections d'agents de contraste et d'un agent inflammatoire sous anesthésie, avec des tests moteurs et de l'imagerie, pour étudier la barrière protégeant le cerveau. Le porteur indique que la maladie provoque des troubles de la marche, une atrophie musculaire et un décès prématuré, et que l'agent inflammatoire comporte un risque de choc septique. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires de cette barrière ne sont pas assez développés pour une pathologie comme la SLA.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de caractériser l’intégrité de la barrière entre le sang et le tissu nerveux (Barrière Hémato-Encéphalique (BHE)) au cours de l’évolution de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) chez un modèle murin transgénique de cette maladie portant une mutation dans un gène impliqué dans la maladie. Le second objectif est d’identifier des marqueurs circulants dans le sang et dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) de l’intégrité de la BHE chez la souris. Les autres objectifs sont de valider de nouvelles techniques non-invasive d’exploration de l’intégrité de la BHE chez l’animal vivant, réduisant ainsi la nécessité de mettre à mort les animaux et permettant de compléter la caractérisation de ce modèle murin de SLA.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons mettre en lumière l’implication de l’altération de la BHE dans la SLA. Les explorations innovantes prévues dans ce projet (principalement celles in vivo) n’ont jamais été réalisées dans la SLA, et particulièrement chez ce modèle murin, qui est peu décrit dans la littérature. Nous sommes convaincus que le ciblage de la protéine codée par le gène muté et l’amélioration des modes d’administration de médicaments sont tous deux cruciaux pour l’avancement des thérapies dans la SLA. La validation d’une technique d’évaluation de l’intégrité de la BHE par une méthode d’imagerie in vivo représenterait un réel progrès technologique pour nos projets futurs. Nous pourrons ainsi satisfaire à la régle des 3R avec une réduction du nombre d’animaux utilisés. Démontrer l’altération de la BHE comme mécanisme pathologique de la SLA pourrait inciter au développement de nouvelles molécules thérapeutiques visant à restaurer son intégrité. Les marqueurs circulants d’intégrité de la BHE identifiés chez la souris SLA seront évalués dans une cohorte humaine. Cette étude permettrait d’améliorer notre compréhension de la pathogénèse et du pronostic de la maladie. La recherche de ces marqueurs pourrait également aider à identifier des sous-groupes de patients chez qui les mécanismes de disruption de la BHE seraient différents, menant à une médecine personnalisée des patients avec l’adaptation des protocoles d’administration des médicaments. Il est également envisagé de poursuivre ces explorations chez l’homme à partir d’une autre collection d’échantillons biologiques.
Procédures
- Pesée lors de chaque manipulation (duree :
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques SLA développent spontanément un phénotype neurodégénératif, avec des symptômes moteurs, des troubles de la marche, une perte de poids et une atrophie musculaire. Ce modèle développe également une dysfonction intestinale responsable d’un décès prématuré, qu’il est possible de prévenir par la mise en place d’une alimentation gélifiée. Les nuisances attendues liées aux actes expérimentaux réalisés sur les animaux sont les suivantes : - Puçage : • Direct: douleur associée à l’injection de la puce par un trocart, prévenue par anesthésie • Indirect: possibilité d'inconfort les premiers jours post-injection. - Injection d’un agent permettant d’induire un syndrome inflammatoire : • Direct : douleur associée à une injection • Indirect (effets de l’agent) : risque de choc septique avec défaillance d’organes à haute concentrations. Il a été choisi une concentration inférieure à celle pouvant induire une mortalité. Une surveillance rapprochée (toutes les 2h pendant 8 h) sera réalisée après l’injection. Durée : < 24 h - Injection d’un agent de contraste photoacoustique: • Direct : douleur prévenue par anesthésie • Indirect : produit non nocif - Injection des microbulles servant d’agent de contraste ultrasonore: • Direct : douleur prévenue par anesthésie • Indirect : produit non nocif - Injection d’un cocktail de molécules fluorescentes: • Direct : douleur prévenue par anesthésie • Indirect : aucun, euthanasie après injection - Anesthésie : • Direct : stress lié à la manipulation • Indirect : risque lié à l’agent : baisse de la température corporelle. Durée < 1 h - Test comportementaux, pesée : stress lié à la manipulation : sortie de la cage, marche forcée sur un cylindre, contrainte à tenir une grille puis à la lâcher pour le test d’agrippement.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux car nécessité de prélever les organes afin d’observer la perméabilité au dextrans fluorescent et pour réaliser des analyses histologiques visant à caractériser la BHE.
Remplacement
Les modèles in vitro que nous utilisons pour nos projets sont inopérants dans une telle étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble : Les modèles de BHE cellulaires ne sont pour l’instant pas encore assez développés ni adaptés à l’évaluation d’une pathologie neurodégénérative telle que la SLA.
Réduction
Des analyses de faisabilité et de mises au point seront réalisées sur un faible nombre d’animaux (24 souris) afin d’éviter une utilisation excessive d’animaux liée à une non-maitrise de ces outils d’exploration in vivo de la BHE. Si les résultats de cette procédure sont satisfaisants, nous poursuivrons l’étude en comparant les souris mimant la SLA aux souris contrôles. Le nombre de 12 souris par groupe de souris SLA a été choisi : sur la base d’une analyse de la bibliographie portant sur un sujet similaire et utilisant un autre modèle de souris transgéniques que celui de ce projet et sur la prise en compte de la fragilité de cette souche de souris et de la variabilité du phénotype des souris transgéniques (début de symptômes, etc) et des tests comportementaux utilisés. Les souris contrôles présentant moins de variabilité phénotypique, un nombre de 6 souris par groupe a été retenu.
Raffinement
L’enrichissement dans les cages d’hébergement sera systématique : matériel de nidifications, objets de mastication, boite à œuf et/ou « igloo » en plastique ou autres objets conçus par le personnel de l’animalerie. Les souris transgénique SLA développant des troubles de la motilité intestinale liés au développement de la maladie, de la nourriture gélifiée sera également mise à disposition dès le stade présymptomatique afin de prévenir l’apparition de ce symptôme. Du fait des problèmes locomoteurs attendus chez ces animaux, un accès à l’eau et à la nourriture sera disponible à hauteur du sol pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés en groupe jusqu’à 5 animaux par cage. Hors expérimentation, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalier et les responsables du projet pendant l’intégralité de l’étude, voir plus régulièrement en cas de début de réactions négatives. Les souris seront sous anesthésie gazeuse lors de chaque expérimentation non comportementale afin de limiter le stress et la douleur. Les souris seront placées sur tapis chauffant (prévention de la baisse de température corporelle) et surveillées constamment durant les périodes d’anesthésie, y compris lors de la phase de réveil faite dans la cage d’hébergement pour limiter le stress. Nous mettrons une feuille d’essuie-tout dans la cage sur la litière pour poser les animaux après l’imagerie pour éviter que la litière colle sur la peau des animaux au niveau du site d’application du gel échographique (une légère couche résiduelle de gel peut être présente même après nettoyage de la peau). Une surveillance accrue (toutes les 2 heures pendant 8 heures) sera également réalisée après administration d’un agent provoquant une réaction inflammatoire aux 12 souris de la procédure de mise au point. La douleur des animaux sera évaluée et les points limites seront déterminés selon une grille de cotation, arbre décisionnel et critères d’arrêt de souffrance pour les souris contrôle, avec une deuxième grille adaptée aux souris SLA.
Choix des espèces
Il y a peu d’animaux modèle de la SLA, seul le modèle de souris transgénique utilisé ici possède les caractéristiques recherchées pour notre projet. C’est par ailleurs ce modèle qui est utilisé au cours de l’étude globale ayant fait l’objet du financement régional. Les modèles in vitro que nous utilisons pour d’autres projets sont inopérants pour notre étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble : Les modèles de BHE in vitro ne sont pour l’instant pas encore assez développés ni adaptés à l’évaluation d’une pathologie neurodégénérative telle que la SLA. Les souris seront reçues à leur 5ème semaine de vie. Ceci permettra d’effectuer les 1ères manipulations avant le début d’apparition des symptômes de la SLA. Ce stade de développement des animaux permettra d’intégrer des animaux dans nos groupes où la maladie est en phase pré-symptômatique.
Métabolisme du glycogène et stress du réticulum endoplasmique : impact sur la fonction musculaire
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées, elles passent chaque semaine des tests moteurs pendant huit semaines, certaines étant soumises à une course forcée sur tapis roulant jusqu'à épuisement, avant une analyse des muscles sous anesthésie puis la mise à mort. Le porteur indique que la course jusqu'à épuisement génère un stress et de possibles douleurs musculaires. Sur le remplacement, il reconnaît que l'analyse des propriétés musculaires pourrait se faire ex vivo, procédé qu'il dit vouloir privilégier à l'avenir sans le retenir ici.
Objectifs
La « différenciation myogénique » correspond à la transformation des cellules souches musculaires en cellules matures. Ce processus, très finement régulé, permet le développement des muscles squelettiques au cours de la période embryonnaire ainsi que sa réparation en cas de lésion chez l’adulte. Le processus de différenciation myogénique s’accompagne d’un stress transitoire du réticulum endoplasmique (RE). Le RE est un lieu essentiel, à l’intérieur de la cellule, pour la synthèse de nouvelles protéines. Lorsque des protéines anormales s’accumulent dans le RE, la cellule est soumise à un stress et des adaptations se mettent en place : les cellules souches défectueuses sont éliminées de façon sélective et en conséquence la formation de cellules musculaires fonctionnelles se trouve améliorée. Ce mécanisme est essentiel au bon fonctionnement du muscle. On observe une dérégulation du stress du RE dans différentes pathologies du muscle squelettique, telles que les myopathies. Chez la souris, il a été montré que l'activation du stress du RE dans des cellules souches musculaires est associée à une accumulation de glycogène dans la cellule. Cette accumulation de glycogène est nécessaire à la survie des cellules souches lors du stress du RE. Elle dépend d’une protéine appelée Stbd1. De manière intéressante, des cellules souches musculaires qui ne possèdent pas cette protéine ne peuvent pas se transformer en cellules musculaires. Nous ignorons toutefois quelles sont les répercussions de l’absence de cette protéine sur la fonction motrice. Notre objectif est donc de caractériser l’impact de la déficience de la protéine Stbd1 sur la fonction et la performance musculaires dans un modèle de myopathie. L’étude sera réalisée sur un total de 72 souris (36 souris sauvages et 36 souris transgéniques) dans le respect du principe des « trois R » (remplacement, réduction, raffinement). L’une de nos priorités majeures sera de minimiser l'inconfort, le stress ou la douleur des animaux et de maintenir le nombre d'animaux utilisés dans les procédures expérimentales au minimum. Les interventions invasives seront menées dans les conditions appropriées d'anesthésie et toutes les mesures nécessaires seront prises pour minimiser la douleur pendant et après l’intervention. Dans le cas où la vie d'un animal devra être interrompue, cela sera effectué rapidement pour minimiser la douleur et dans le respect des pratiques acceptées.
Bénéfices attendus
Le projet a pour objectif d’avancer dans la compréhension du processus de différenciation myogénique ainsi que des mécanismes à l’origine de myopathies telles que la dystrophie musculaire de Duchenne ou la dystrophie myotonique de type 1.
Procédures
L’ensemble des tests réalisés pour l’évaluation de la fonction motrice sont réalisés sur des animaux vigiles ; l’ensemble des animaux (36 contrôles et 36 transgénique de chaque sexe, soit 144 animaux) seront soumis, une fois par semaine pendant 8 semaines, à des tests comportementaux permettant d’évaluer la fonction motrice (force, marche, coordination…). Ces tests sont sans douleur pour l’animal. A l’issue de ces tests, 24 animaux de chaque sexe (12 contrôles et 12 transgénique) seront soumis à un test d’endurance qui consiste à courir sur un tapis roulant jusqu’à épuisement, puis seront mis à mort par euthanasiant chimique. Différents muscles seront alors prélevés. Les autres souris (24 contrôles et 24 transgéniques de chaque sexe) seront consacrées à l’étude des propriétés musculaires. Cette partie sera réalisée sous anesthésie. La durée est estimée à 45 minutes par animal. A la fin, les animaux seront mis à mort par euthanasiant chimique et les muscles prélevés.
Impact sur les animaux
L’ensemble des tests réalisés pour l’évaluation de la fonction motrice peuvent générer un stress modéré dû à la manipulation et au changement d’environnement. La durée de cette étude est estimée à 1h au maximum. En outre, la course forcée sur tapis roulant sera effectuée jusqu'à épuisement de l'animal, ce qui génère un stress et de possibles douleurs musculaires. L’étude des propriétés musculaires peut générer de la douleur mais cet effet indésirable sera prévenu par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse et analgésie chimique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les muscles pour une étude ultérieure. Cette étude musculaire est nécessaire évaluer les conséquences de l’invalidation du gène d’intérêt sur la structure du muscle, le nombre de cellules souches, ou encore l’accumulation de glycogène.
Remplacement
L'analyse comportementale nécessite d'être réalisée in vivo et ne peut être remplacée par des méthodes alternatives. L'analyse des propriétés musculaires pourrait être réalisée ex vivo. Cela nécessite un appareillage particulier, onéreux, et une longue période de tests. Des travaux préliminaires seront intégrés à cette étude, en parallèle de l’approche in vivo. Notre objectif est de privilégier cette alternative dans l'avenir.
Réduction
Le calcul du nombre d’animaux par groupe se base sur la nécessité d’avoir suffisamment d’animaux pour que l’analyse statistique soit possible entre les deux groupes. Les différentes interventions (étude du comportement, de la fonction contractile et prélèvement de muscles) seront réalisées successivement sur les mêmes animaux. Toutefois, en ce qui concerne l’analyse de la fonction contractile, l’étude des deux muscles d’intérêt ne pourra pas se faire sur les mêmes animaux. En effet, le maintien de la souris sous anesthésie profonde pendant 30 à 45 minutes pour l’étude du premier muscle peut potentiellement induire une variabilité qui nuirait à l’analyse des résultats.
Raffinement
Les souris bénéficieront d’une surveillance quotidienne et de pesées bi-hebdomadaires. L’enrichissement est effectué par ajout de carrés de coton dans la cage et d’un dôme.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés en recherche fondamentale ou appliquée chez les mammifères, notamment pour l’étude de pathologies humaines. Le laboratoire dispose du savoir-faire et des dispositifs expérimentaux nécessaires à l'étude de la fonction sensorimotrice chez les rongeurs. Les souris sont le modèle animal le plus couramment utilisées pour les knock out de gènes. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (entre 18 et 24 semaines).