Procédures sévères

Comprendre comment le cervelet module la peur doit, selon le porteur, aider à traiter l'anxiété, et aussi contribuer à des avancées en intelligence artificielle et en robotique. 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour l'examen de leur cerveau. Après une chirurgie d'implantation d'une à deux heures, elles subissent jusqu'à quarante séances d'enregistrement, deux tests de douleur non nommés, et pour une partie cinq chocs électriques précédés d'un signal, le porteur écrivant qu'elles "ressentiront de la douleur et de la peur". Il présente les mammifères autres qu'humains comme "la seule option viable".

Objectifs

Le cervelet tient un rôle essentiel dans la coordination du mouvement, mais régule aussi des émotions comme la peur. Des études sur des modèles animaux ont notamment montré que le cervelet accélère l’extinction de peurs induites par des souvenirs émotionnels négatifs. Une stimulation non invasive du cervelet par des méthodes magnétiques transcrâniennes pourrait donc être efficace dans le traitement de l’anxiété et du stress post-traumatique. Notre projet vise à comprendre les mécanismes fondamentaux qui sous-tendent la régulation de peur par le cervelet de manière à aider le développement de ces thérapies. Le cervelet reçoit des informations liées aux mouvements, aux sens, aux pensées et aux émotions venant de nombreuses régions du système nerveux. Il intègre ces informations pour prédire et anticiper les informations sensorielles. Les noyaux de sortie du cervelet relayent ces prédictions aux régions contrôlant l’activité motrice, mais aussi à des régions régulant la peur comme la substance grise périaqueducale (PAG) et l’amygdale. La PAG est la région du cerveau qui déclenche les réactions de peur. Ceci se traduit chez les souris par une immobilité. L’amygdale mémorise quant-à-elle le contexte associé à une expérience aversive. Lorsque ce contexte se représente, l’amygdale est capable d’activer la PAG pour un induire une réaction de peur. Cette réaction s’estompe ensuite si le contexte est présenté de manière répétée sans être associé à un stimulus aversif inné. La PAG, l’amygdale, sont enfin régulées par la dopamine, un modulateur sécrété par des neurones spécialisés, dont l’action reste mal comprise. Le présent projet a pour objectif d’explorer le rôle du cervelet dans l’acquisition, l’expression et l’extinction de la mémoire aversive.

Bénéfices attendus

Les troubles de la peur sont très répandus. Une personne sur trois est touchée de manière significative par les troubles de l’anxiété pendant sa vie ce qui représentent 4 à 5 pourcents de la population chaque année. Le stress post-traumatique peut quant-à-lui toucher jusqu’à un tier des personnes affectées par une situation de crise et les options de traitements sont pour le moment limitées. Des études récentes ont montré que le cervelet régule la peur et la mémoire aversive. En cherchant à comprendre les bases neurologiques de cet effet ce projet vise à permettre le développement de traitements de l’anxiété et du stress post-traumatique basés sur des stimulations non-invasives du cervelet. D’une manière plus large, ce projet génèrera des données qui permettront d’examiner comment le cervelet régule des régions diverses du cerveau. Ces données scientifiques pourront contribuer à des avancées dans un vaste éventail de domaines comme l’intelligence artificielle et la robotique.

Procédures

(1) Chirurgie (anesthésié générale, anesthésié locale et analgésie, 60 à 120 minutes) : toutes les souris subiront une procédure chirurgicale permettant l’injection de traceurs histologiques et/ou l’implantation de dispositifs permettant l’enregistrement et la manipulation de l’activité neurale. Cette implantation sera suivie d’une période de récupération et de surveillance de 5 jours minimum. (2) Habituation (vigile, 2 à 5 sessions journalières de 60 minutes) : les souris implantées seront habituées aux expérimentateurs et aux dispositifs expérimentaux. (3) Enregistrement pendant le comportement libre (vigile ; 1 à 40 sessions journalières de 30 à 90 minutes) : L’activité neurale sera enregistrée sur les animaux implantés pendant le comportement libre. (4) Test de la nociception (vigile ; 1 à 2 sessions journalières de 5 minutes) : Une partie des souris implantées subiront deux tests de la nociception. Les animaux sont exposés à des stimuli nociceptifs légers, retirés au premiers signe d’inconfort et la latence à leur réaction nociceptive est mesurée. (5) Conditionnement aversif (vigile : 4 sessions journalière de 10 ou 30 minutes) : Une partie des souris implantées subiront un conditionnement aversif de 10 minutes. Un stimulus électrique désagréable sera présenté 5 fois précédé d’un stimulus visuel, tactile ou auditif neutre. Durant les 3 jours suivants, le stimulus neutre sera présenté seul dans des sessions de 30 minutes. L’extinction de la mémoire aversive associative sera mesurée par la fréquence des réactions de peur se traduisant par une immobilité. Durant les étapes (3), (4) et (5) l’activité du cervelet ou d’autre régions pourra être modulée grâce à des protéines sensibles à la lumière ou à un composé injectable. (6) Euthanasie pour examen histologiques (anesthésie générale) : Toutes les souris seront anesthésiées puis euthanasiées pour procéder à un examen histologique des tissus cérébraux.

Impact sur les animaux

Trois types de nuisances sont attendues sur les animaux modèles utilisés : 1. des douleurs et de complications liées aux procédures chirurgicales, 2. un inconfort induit par les implants chirurgicaux ou les lésions neurales, 3. un stress généré par les études comportementales. 1) Les procédures chirurgicales permettant l’injection de marqueur histologiques ou la fixation d’implant produisent des effets modérés en conditions normale. L’anesthésie peut induire une hypothermie et une détresse cardio-respiratoire. Les injections d’analgésique peuvent induire un stress ou un hématome et il existe un risque de complications comme des infections ou des traumatismes nécessitant une surveillance. 2) Les implants permettant l’enregistrement de l’activité neurale ou la fixation de la tête sont en général bien tolérés par l’animal et induisent un inconfort considéré comme modéré. Ils peuvent néanmoins produire des ajustements posturaux et une fatigue chronique liés à leur encombrement. 3) Les nuisances liées à aux études comportementale peuvent être plus ou moins importantes en fonction des cas. Un stress modéré est susceptible d’être induit par l’interaction avec l’utilisateur et l’exposition aux équipements. En revanche, les tests comportementaux évaluant la peur produisent un stress important. Les souris ressentiront de la douleur et de la peur lors du stimulus électrique et de la peur lors de la phase d’extinction. Les tests comportementaux évaluant la nociception induise une douleur aigue et un risque d’élancement lié à des lésions tissulaires.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasié en la fin de procédure de manière à collecter le cerveau pour un examen histologiques. La procédure d'euthanasie se fait sous anesthésie générale.

Remplacement

Ce projet porte sur les bases neurales du comportement et des maladies psychiatriques. L'étude de ces fonctions implique de relier les connaissances à de multiples échelles, partant des gènes, molécules et cellules à la dynamique des circuits et au comportement. La complexité de ces interactions ne peut être modélisée efficacement in silico. D’autre part les études réalisées chez l’humain ne permettent ni l’enregistrement de zones d’intérêts multiples, ni le marquage et la manipulation de populations neurales ciblées par des méthodes génétiques. Ces considérations font des modèles animaux mammifères la seule option viable. Récemment, des efforts ont été déployés pour générer des ensembles de données accessibles au public, relatifs à l'activité neuronale enregistrée par électrophysiologie ou par microscopie à haute densité dans des régions cérébrales ciblées, en conjonction avec des mesures comportementales. Les ensembles de données disponibles ne permettent pas toujours de répondre aux questions abordées dans notre projet, notamment lorsqu'ils impliquent une manipulation ciblée de l'activité neuronale ou d'un comportement spécifique. Néanmoins, les données accessibles au public seront utilisées de préférence aux expériences chaque fois que cela est indiqué afin de réduire la nuisance aux animaux, les couts économiques et le temps investi.

Réduction

Le présent projet fera usage d’un maximum de 600 souris. Plusieurs mesures ont été prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés. L’enregistrement de l’activité neurale sera réalisé au moyen de sondes à haute densité. Ces sondes récemment développées permettent d’enregistrer simultanément l’activité d’un nombre important de neurones au travers de multiples régions cérébrales. L’utilisation de sondes à haute densité offrent la possibilité de réaliser des jeux de données riches dont l’analyse approfondie permet une lecture détaillée de l’activité neurale. Crucialement, en augmentant le nombre de neurones enregistrés simultanément, ces sondes permettent de réduire fortement le nombre d’animaux nécessaires pour permettre un échantillonnage satisfaisant des populations neurales. Nous anticipons donc des expériences comprenant un maximum de 12 animaux par condition. En ce qui concerne les analyses histologiques et les données comportementales, le nombre d’animaux est évalué de manière à être suffisant pour obtenir des résultats reproductibles et fiables. Pour les études histologiques, les coordonnées d’injections sont en premier lieu validés en sur une cohorte réduite de 3-4 animaux et ajustées en fonction des résultats pour obtenir des cohortes finales de 5 à 6 animaux générant un nombre maximal de 10 animaux par condition. Pour les études impliquant une perturbation de l’activité neurale ou une étude comportementale, un effectif maximal de 18 animaux par condition sera nécessaire sur la base d’une analyse de puissance et en considérant une marge d’erreur expérimentale. Les expériences seront réalisées en cohortes de 4 à 8 animaux. Les expériences seront stoppées au cas où des résultats significatifs concluants seraient obtenus avant l’utilisation du nombre total d’animaux.

Raffinement

Nous chercherons à minimiser l’inconfort, la douleur, ou le stress des animaux au cours des procédures de ce projet. Les expériences seront réalisées par du personnel formé et accrédité en accord avec la législation française et européenne. La mise en œuvre appropriée des gestes expérimentaux sera assurée par un système interne de validation de compétence et les protocoles seront évalués en accord avec un vétérinaire certifié. Les animaux seront hébergés en groupe avec eau et nourriture en libre accès, en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Les cages seront enrichies pour la nidification (lanière kraft), la mastication (bâton), et la disponibilité de refuges (hutte). Les animaux en provenance d’un fournisseur extérieur auront une période d’acclimatation minimale d’une semaine avant leur entrée dans les procédures du projet. Les chirurgies auront lieu sous anesthésie générale gazeuse. L’hypothermie sera contrôlée grâce à l’utilisation de tapis chauffant et un suivi de la température corporelle. Les douleurs seront minimisée grâce à une anesthésie locale et d’une couverture analgésique par des injections d’analgésiques et d'anti-inflamatoires durant la période peropératoire. Les animaux seront habitués de manière progressive aux dispositifs et aux procédures expérimentales de manière à minimiser le stress induit par ces dernières. Les binômes d’expérimentateurs resteront les mêmes tout au long de l’étude. Finalement, des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis selon un arbre décisionnel basée sur des critères d'arrêt des souffrances déterminés.

Choix des espèces

Le modèle animal souris est particulièrement adapté à nos objectifs scientifiques. Ces animaux ont divergé des primates relativement récemment dans l'évolution des mammifères (~80 millions d'année) et l'organisation de leur système nerveux, leur répertoire émotionnel et leur comportement présentent de nombreuses similitudes avec ceux des humains. L'existence d'une communauté scientifique importante travaillant sur ce modèle, a permis le développement de ressources cruciales pour notre projet comme la séquence complète de leur génome, la cartographie de l'expression des gènes de populations de neurones, des outils génétiques permettant de cibler ou de moduler l'activité de groupes de neurones ciblées et des jeux de données accessible en ligne qui permettront de compléter et de remplacer nos expériences. Le projet utilise des souris adultes, âgées de 6 à 12 semaines au moment des chirurgies : un stade de développement ou le cerveau est considéré comme mature et ou les animaux présentent des facultés de récupération qui leur permettent de supporter les chirurgies mieux que des animaux plus âgés.

Une chirurgie cérébrale d'une heure à deux heures trente, jusqu'à trois mois en habitat isolé pour protéger les implants, jusqu'à cinq jours de rationnement alimentaire : 1 344 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour contrôler la chirurgie. La plupart passent six tests comportementaux portant sur l'anxiété, la réaction à des événements positifs ou négatifs et la mémoire d'une situation menaçante, sans que le résumé les nomme. Le but est de comprendre le rôle de cellules régulatrices de l'amygdale dans la peur, une piste thérapeutique en psychiatrie n'étant évoquée qu'au conditionnel. Le porteur justifie le choix de l'espèce par l'existence de lignées de souris permettant de cibler ces cellules et par des tests "bien établis et largement validés chez cette espèce".

Objectifs

L’amygdale est une petite région du cerveau qui joue un rôle central dans nos émotions, en particulier la peur et l’anxiété. Elle nous aide à repérer ce qui est important pour nous — par exemple un danger — et à en garder le souvenir. Elle intervient aussi dans les expériences positives. Dans cette région, certaines cellules transmettent et stockent les informations. À côté d’elles se trouvent d’autres cellules, beaucoup moins nombreuses, qui agissent comme des régulateurs et coordonnent l’activité du réseau. Même si elles sont peu nombreuses, elles sont essentielles au bon fonctionnement de l’ensemble, jouent un rôle spécifique dans les comportements émotionnels et s’activent lors d’événements marquants, qu’ils soient positifs ou négatifs. Nous avons également montré que modifier leur activité au moment où un individu apprend à associer une situation à une menace peut renforcer le souvenir de cette expérience. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces cellules dans les réponses émotionnelles et anxieuses. Nous étudierons aussi l’influence d’un grand système de communication du cerveau impliqué dans la réponse aux événements importants, le système cholinergique. Ce système envoie de nombreux signaux vers l’amygdale et peut modifier l’activité des cellules que nous étudions. À terme, ce travail permettra de mieux comprendre comment de petits groupes de cellules du cerveau coordonnent nos réponses émotionnelles et façonnent nos souvenirs liés aux expériences marquantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment certaines cellules spécialisées de l’amygdale participent à l’organisation des réponses émotionnelles, comme la peur ou l’anxiété. Nous chercherons à préciser comment ces cellules interagissent entre elles et comment elles influencent l’activité des autres cellules du cerveau lors de situations importantes sur le plan émotionnel. Ces résultats apporteront de nouvelles connaissances sur le fonctionnement des petits réseaux de cellules nerveuses dans l’amygdale. Comme ces types de cellules existent aussi dans d’autres régions du cerveau, les informations obtenues pourront améliorer plus largement notre compréhension du fonctionnement cérébral. À plus long terme, une meilleure connaissance de ces mécanismes pourrait aider à comprendre pourquoi les émotions deviennent excessives ou inadaptées dans certains troubles psychiatriques et contribuer à orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux utilisés seront soumis à des chirurgies cérébrales afin de moduler ou d'enregistrer l’activité de nos neurones. Toutes nos chirurgies dureront de 1h à 2h30 selon leur difficulté. Elles seront également toutes conduites sous anesthésie générale. Chaque souris ne sera soumise qu’à une seule chirurgie. Cela concernera toutes les souris du projet. Parmi ces souris, la plupart seront soumises à 6 tests comportementaux différents. Un petit nombre seront soumises, en plus de la chirurgie, à seulement 4 de ces tests comportementaux. De plus, ces souris seront soumises à une injection avant le début des tests. Cette injection sera réalisée un maximum de 7 fois, avec un temps de repos d’au moins 24h entre chaque injection. Enfin, un petit nombre de souris opérées seront soumises à 3 tests permettant d’évaluer les émotions associées à l'activité neuronale.

Impact sur les animaux

- Les chirurgies réalisées sur les animaux sont susceptibles d’occasionner un stress et une douleur de manière aigüe. Cela se traduit habituellement par une perte de poids sur quelques jours. - Une fois certaines chirurgies réalisées, les animaux sont maintenus en habitat isolé afin de garantir l’intégrité des implants, et ce pendant une durée maximum de trois mois. - Un stress accru pourra être observé sur les quelques jours suivant les tests comportementaux. - Les souris seront rationnées en aliment pendant un maximum de 5 jours, ce qui pourra donner lieu à une faible perte de poids.

Devenir

Toutes les souris du projet subissant des chirugies cérébrales, il sera indispensable de contrôler la qualité de ces chirurgies à la fin de chaque procédure pour analyses post-mortem complémentaires. Tous les animaux devront donc être mis à mort, après sédation préalable.

Remplacement

Le présent projet cherche à mieux comprendre le rôle de certains neurones dans le traitement des émotions, qu'il soit normal ou pathologique. Nous nous intéressons à leur rôle au niveau local mais également dans le fonctionnement global du cerveau et dans le comportement émotionnel des individus, c'est pourquoi le modèle animal est indispensable pour répondre à nos objectifs. Toutefois, des enregistrements électriques sur des cellules seules ainsi que des modèles informatiques simulant leurs interactions avec d’autres cellules seront menées en parallèle par nos collaborateurs. Ces travaux apporteront un éclairage précieux pour interpréter nos résultats expérimentaux et viendront compléter nos propres approches tout en limitant au maximum le recours au modèle animal.

Réduction

Le rythme des reproductions sera adapté aux besoins de l’étude afin d’éviter la naissance d’animaux surnuméraires. Le nombre d’animaux utilisé sera réduit à son minimum, en prenant en compte l’effectif nécessaire pour obtenir des résultats significatifs, déterminé grâce à un calculateur de puissance statistique, ainsi que le taux de réussite des procédures, évalué lors de précédentes expérimentations.

Raffinement

Tous les soins seront pris afin de limiter la douleur et le stress des souris au minimum. Le temps de maintien des souris en habitat isolé sera réduit à son minimum, et les souris auront néanmoins accès à des stimuli olfactifs, visuels et auditifs provenant d’autres cages (ventilation collective et cages transparentes). Les souris seront quotidiennement pesées et évaluées pendant un minimum de trois jours après la chirurgie. La douleur sera prise en charge par un traitement analgésique pendant et après la chirurgie , et l'analgésie sera poursuivie au besoin. Si des signes de mal-être sont observés en dehors de la période post-opératoire, les animaux seront placés en observation quotidienne afin d’alléger ce mal-être et de remédier à la cause sous-jacente, selon un arbre décisionnel défini. Tout signe de douleur sera pris en charge médicalement, jusqu’à amélioration de l’état de l’animal ou euthanasie si dépassement des points limites. Afin de diminuer le stress provoqué par les expérimentations, les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention manuelle nécessaire à la connexion des différents équipements. Lorsque les paradigmes comportementaux nécessiteront un rationnement alimentaire, les animaux seront quotidiennement pesés à heure fixe afin de garantir que la perte de poids reste dans les limites imposées dans la procédure. Afin de maximiser le taux de réussite des procédures, un soin particulier sera mis dans l’optimisation des protocoles de chirurgies cérébrales.

Choix des espèces

Pour répondre à nos questions scientifiques, nous devons à la fois observer et modifier l’activité de certaines cellules, et étudier les conséquences sur le comportement. Nous évaluerons notamment des comportements liés à l’anxiété, à la réaction face à des événements positifs ou négatifs, ainsi qu’à la mémoire d’une situation menaçante. La souris est le modèle le plus adapté pour cette étude. Il existe des lignées de souris permettant d’identifier et de cibler précisément les types de cellules que nous souhaitons étudier. De plus, les tests comportementaux que nous voulons utiliser sont bien établis et largement validés chez cette espèce. Nous utiliserons de jeunes souris adultes âgées de 12 à 16 semaines. Notre projet ne portant pas sur une période particulière du développement, cet âge permet de travailler sur des animaux matures, ne présentant pas de fragilité spécifique, tout en limitant la durée d’élevage.

2 978 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Jusqu'à 1 728 d'entre elles subissent dix jours de "défaite sociale" face à des mâles plus âgés, jusqu'à 2 628 une chirurgie du cerveau d'une heure trente à deux heures pour implanter une fibre optique ou injecter des vecteurs viraux, puis des tests d'hédonie, d'anxiété, de comportement social et de prise de risque que le résumé ne nomme pas. Le bénéfice annoncé, de nouveaux antidépresseurs, reste au conditionnel. Le porteur décrit ces séances comme des "interactions sociales courtes" au "stress léger et passager", et choisit les mâles dominants, d'anciens reproducteurs, pour leur "agressivité territoriale suffisante".

Objectifs

Notre cerveau réagit en permanence à de nombreux signaux de l’environnement. Parmi eux, le stress joue un rôle important: il peut être utile lorsqu’il est bien géré, mais, s’il devient chronique, il peut favoriser des troubles mentaux comme la dépression. Pour comprendre comment le stress peut conduire à la dépression, notre équipe étudie deux régions du cerveau: toutes deux impliquées dans la réaction au stress et le système de récompense. Le stress perturbe l’équilibre entre deux messagers chimiques, la dopamine et le glutamate, ainsi que leurs récepteurs. Nous avons découvert qu’un stress prolongé augmente la formation de complexes (appelés hétéromères) entre ces récepteurs dans une région cérébrale, probablement à cause de changements dans l’activité dans une autre région. Ces mêmes changements ont été observés dans des tissus cérébraux de patients dépressifs. Grâce à des outils pharmacologiques, nous avons pu empêcher la formation de ces complexes et avons constaté que cela corrigeait certains effets négatifs du stress sur le comportement et les cellules. Notre objectif est maintenant de mieux comprendre comment ces complexes se forment, comment ils affectent les cellules, et de développer de nouveaux traitements ciblant ces mécanismes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines zones du cerveau réagissent au stress à l’âge adulte et comment des modifications dans la communication entre les cellules nerveuses peuvent influencer les émotions et le comportement. Il pourrait aussi ouvrir la voie à une nouvelle génération d’antidépresseurs agissant sur des récepteurs précis du cerveau. Ces nouveaux traitements offriraient une alternative aux antidépresseurs actuels, parfois peu efficaces ou responsables d’effets secondaires gênants.

Procédures

Les animaux (1728 max) seront soumis à des épisodes de stress social pour une durée maximale de 5 minutes par jour sur une période de 10 jours. Au maximum 2628 animaux subiront 1 injection de 5s pour anesthésie puis une chirurgie cérébrale avec implantation de fibre et/ou d’outils génétiques pour l’apport de molécule d’intérêt d’environ 1h30-2h. Les animaux (1728 max) subiront différents tests comportementaux permettant d’évaluer l’hédonie (recherche du plaisir), l’anxiété, les comportements sociaux, la prise de risque.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à des interactions sociales courtes, d’environ cinq minutes par jour pendant dix jours, pouvant provoquer un stress léger et passager. Dans certaines étapes, ils recevront une ou deux injections d’anesthésiques et d’antalgiques pour éviter toute douleur. Une partie d’entre eux subira une chirurgie pour injecter des vecteurs viraux ou implanter des fibres optiques. Après l’opération, une brève période de récupération est prévue, mais les animaux devraient retrouver un comportement normal rapidement. Une légère perte de poids (moins de 10%) peut survenir au cours des tests. Toutes les procédures sont conçues pour limiter au maximum la douleur, le stress et l’anxiété, et les effets secondaires attendus devraient rester temporaires et sans conséquences sur le long terme.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les souris C57BL/6JRj seront mises à mort pour prélèvement de cerveau dans le but de réaliser des études post-mortem. Les CD1 sont mis à mort afin de prévenir toute souffrance inutile liée à la dégradation physiologique de l'animal liée à l'âge.

Remplacement

Le projet repose sur des approches de physiologie intégrée visant à comprendre les mécanismes de communication inter-organes et les dérégulations affectant le système de récompense, un système hautement conservé au cours de l’évolution. À l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode substitutive in vitro ou in silico permettant de reproduire la complexité des interactions neuronales et comportementales impliquées dans ce système. Le recours à un modèle animal est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. La souris constitue le modèle le plus approprié, car elle présente une forte similarité avec l’humain en ce qui concerne les circuits neuronaux impliqués dans la motivation et la récompense. De plus, des tests comportementaux validés chez la souris permettent d’évaluer des altérations comparables à certains symptômes psychiatriques observés chez l’homme, renforçant ainsi la pertinence translationnelle du modèle.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à l’aide du logiciel G*Power, permettant d’estimer de manière fiable les effectifs nécessaires pour garantir une puissance statistique suffisante tout en limitant le recours aux animaux au strict minimum requis. Notre plan expérimental est conçu de telle manière que les premières expériences réalisées permettront d’optimiser les conditions des expériences suivantes et de réduire, par conséquent, le nombre d’animaux nécessaires à leur mise en œuvre en utilisant des stratégies de Go-NoGo. Les stratégies de Go/No-Go consistent à définir, après chaque étape expérimentale, des critères prédéfinis de poursuite (“Go”) ou d’arrêt/modification (“No-Go”) du protocole en fonction des résultats obtenus. Chaque individu sera impliqué dans plusieurs procédures expérimentales compatibles entre elles, dès lors que cela n’induit pas d’interférence physiologique ou comportementale, afin de maximiser les données obtenues tout en minimisant le nombre d’animaux requis pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes sociaux (sauf cas de la procédure de défaite sociale) avec un enrichissement du milieu comprenant des dômes, des briques en bois à ronger et du matériel de nidification. Les animaux sont observés quotidiennement. Des signes potentiels de souffrance sont recherchés et des points limites adaptés aux différentes phases des procédures ont été fixés. Quatre phases vont être à distinguer : • Phase 1 : le suivi hebdomadaire avec recherche de signes de souffrance • Phase 2 : le suivi de trois jours selon une grille de score comprenant des points limites et les actions associées si certains signes de souffrance sont relevés pendant la phase 1 de suivi quotidien • Phase 3 : le suivi pendant les périodes de défaites sociales imposées pendant 10 jours consécutifs • Phase 4 : les périodes pré et post-opératoire de chirurgie stéréotaxique (chirurgie crânienne très ciblée via l’utilisation de coordonnées), elles-mêmes obligatoirement suivies de cinq jours de surveillance selon la même grille de score. La douleur générée par la chirurgie sera limitée grâce à des anesthésiques et anti-inflammatoires. L’administration d’un anti-inflammatoire non stéroïdien après la chirurgie permettra de prévenir/limiter la douleur de l’animal.

Choix des espèces

Nous avons une très bonne connaissance des caractéristiques biologiques des souris par les travaux scientifiques et techniques publiés. L'élevage selon les mêmes conditions assure la reproductibilité des expérimentations. La souris possède une proximité évolutive, un cycle de vie court. C’est un excellent modèle pour l’étude des conséquences du stress d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires du stress ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures sous-corticales étudiées sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension des effets du stress et ainsi de pouvoir mieux cibler les approches thérapeutiques. Les mâles dominants sont des anciens reproducteurs âgés de plus de six mois, cet âge leur permet d’avoir développé une agressivité territoriale suffisante pour la procédure de défaite sociale. Les souris utilisées seront âgées de 1 à 4 mois. Bien que l’adulte (2 mois) soit la tranche d’âge étudiée, certains outils moléculaires ont besoin d’un temps d’expression relativement long (3 à 6 semaines), c’est pourquoi certaines souris seront utilisées dès l’âge d’1 mois.

1 480 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Après une greffe de cellules tumorales sous la peau ou dans le foie, certaines reçoivent jusqu'à dix injections autour de la tumeur et vingt-cinq injections intrapéritonéales ou gavages en cinq semaines, d'autres jusqu'à douze séances d'imagerie sous anesthésie et trois prises de sang. Pour ces prises de sang, le porteur décrit un risque de lésion oculaire, une "nuisance légère à modérée et permanente", et pour le gavage un risque de fausse route avec détresse respiratoire, suivi d'une mise à mort immédiate. Les retombées pour les patients, de nouvelles cibles contre le cancer du foie, restent au conditionnel et au "moyen terme".

Objectifs

Le cancer du foie est la 4ème cause de mortalité par cancer dans le monde. L'immunothérapie a révolutionné la prise en charge thérapeutique des patients à un stade avancé. Toutefois, environ 2/3 des patients ne répondent pas au traitement et les rechutes restent inévitables. Nos données préliminaires suggèrent qu'une intéraction entre certaines cellules immunitaires du foie et les cellules cancéreuses favorise la progression tumorale en augmentant leurs propriétés agressives. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment ces cellules immunitaires interagissent avec les cellules tumorales et d’identifier des stratégies permettant de bloquer ce dialogue afin d’améliorer l’efficacité des traitements. Le projet se décline en deux axes principaux : 1) Déterminer si une sous-population spécifique de cellules immunitaires, récemment caractérisée dans le cancer du foie chez l'homme, favorise l’initiation et la croissance tumorale. 2) Évaluer si le blocage de la communication entre cellulescancéreuses et cellules immunitaires, par des approches génétiques et pharmacologiques, permet de freiner l’initiation et la progression tumorale. À terme, ce projet pourrait améliorer la compréhension des mécanismes d’initiation et de progression du cancer du foie, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de contribuer au développement de stratégies visant à améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Bénéfices fondamentaux pour la santé humaine: Le cancer du foie est la 4ème cause de mortalité par cancer dans le monde. Ce projet permettra de : 1) Tester notre hypothèse selon laquelle l’interaction entre les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses impacte la croissance tumorale (court terme). 2) Comprendre par quels mécanismes les cellules immunitaires promeuvent la tumorigénèse (moyen terme). Bénéfices translationnels: 3) Identifier de nouvelles cibles :Valider le potentiel thérapeutique du ciblage de cette communication par le biais de candidats identifiés lors de nos études préliminaires chez l'homme (moyen terme).

Procédures

Projet A) Les animaux recevront une seule injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée sous anesthésie générale de moins de 3 minutes. La croissance tumorale sera suivie chez tous ces animaux à l'aide d'un pied à coulisse (21x au maximum au total). Ensuite, certains animaux recevront des injections péri-tumorales 1 à 2 fois par semaine sous anesthésie rapide (< 2 minutes) pendant 5 semaines (10x au maximum au total), et pourrons également être traitées par injection intra-péritonéale ou par gavage sur animaux vigiles 1 à 5 fois par semaine pendant 5 semaines (25x au maximum au total). Projet B) Les animaux recevront une seule injection de cellules tumorales dans le foie sous anesthésie locale et générale lors de procédures chirurgicales d'une durée moyenne de 5 minutes. Ces souris recevront ensuite des injections intra-péritonéales (sur animaux vigiles) 1 à 2 fois par semaine pendant 6 semaines (10x au maximun au total), avant de procéder à un suivi par imagerie sous anesthésie générale (moins de 20 minutes, 12x au maximum au total). Du sang pourra être prélevé sur les animaux, sous anesthésie rapide (< 2 minutes), toutes les 3 semaines (3x au maximum au total).

Impact sur les animaux

Les nuisances prévisibles sont liées à plusieurs facteurs : la greffe de cellules cancéreuses, les actes techniques (injections, prélèvements) et les effets potentiels des traitements. 1) Les injections répétées (à raison de 1 à 5 fois par semaine pendant 5 semaines maximun) peuvent induire une douleur légère et transitoire ainsi qu'une inflammation locale aux sites d’administration. 2) Les contentions régulières sont des sources de stress ponctuel et de courte durée pour l'animal. 3) Anesthésie : Pour et l'acte chirurgical et les phases de suivi de la croissance tumoral (2x semaines pendant 6 semaines) les souris subiront des anesthésies générales courtes. La nuisance est considérée comme légère avec un effet transitoire. 4) Complications procédurales : réouverture de plaie (post-chirurgie intra-hépatique) : nuisance modérée et persistante jusqu'à cicatrisation ; Irritation/œdème péritonéale (injections intra-péritonéales) : nuisance légère à modérée et transitoire (24-48 heures) ; Risque de fausse route (gavage) : nuisance sévère et immédiate (rare, détresse respiratoire) nécessitant une euthanasie immédiate ; Lésion oculaire (prélèvement sanguin toutes les 3 semaines) : Risque d'opacification ou de lésion nerveuse, constituant une nuisance légère à modérée et permanente. 5) Développement tumoral (6 semaines maximum) : la croissance de masse peut engendrer une gêne fonctionnelle, une altération de la fonction hépatique et une ulcération pour les injections s.c. 6) Les animaux immunodéficients peuvent présenter une fragilité accrue et un risque augmenté de développer des infections bactériennes, virales ou fongiques, pouvant se traduire par une altération de l’état général (perte de poids, apathie, troubles digestifs ou respiratoires).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des analyses post mortem nécessaires à l'évaluation du projet

Remplacement

Le projet vise à étudier le potentiel pro-tumoral de cellules préalablement étudiées en co-culture, notamment leur capacité à favoriser l’initiation et la croissance tumorale, à modifier les vaisseaux sanguins et à remodeler le microenvironnement tumoral. Il s'appuie sur des études réalisées au préalable chez l'homme qui ont permis d'identifier des cibles spécifiques d'intérêt et des acteurs pro-tumoraux (les cellules immunitaires). Cependant, ce système in vitro ne permet pas de reproduire la complexité d'un organisme entier, avec une vascularisation fonctionnelle, des interactions systémiques et une dynamique tumorale tridimensionnelle à long terme. C'est pour cela que nous avons recours à l'animal.

Réduction

Le rythme des reproductions sera adapté aux besoins de l’étude afin d’éviter la naissance d’animaux surnuméraires. Le nombre d’animaux a été déterminé par des calculs de puissance statistique et limité au strict nécessaire. Plusieurs analyses seront réalisées sur les mêmes animaux afin d’optimiser l’utilisation des modèles.

Raffinement

1) Gestion de la douleur : Utilisation systématique d'anesthésie et de médicaments adaptés pour prévenir toute douleur. 2) Points limites : Arrêt anticipé de l’expérience dès l'atteinte de seuils précis, bien avant qu'une souffrance sévère n'apparaisse. 3) Hébergement et soins : Logement et manipulation des animaux dans des conditions sanitaires strictes.

Choix des espèces

La souris est choisie car son organisme fonctionne de manière très proche de celui de l'Homme, ce qui permet d'étudier le développement des tumeurs et leur environnement direct. Sa petite taille, sa reproduction rapide et les méthodes standardisées de suivi permettent de mener cette étude dans des conditions optimales et rigoureuses. Les souris immunodéficientes rendent la prise de greffe de cellules humaines très favorable. Cette souche est utilisée dans la recherche sur le cancer en raison de sa capacité à développer le processus étudié (cancer du foie), de sa forte reproductibilité expérimentale, et elle est recommandée pour l’étude des interactions entre cellules immunitaires et cellules tumorales humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte et entre 6 et 8 semaines de vie. A cet âge, la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l’inoculation de cellules.

Anesthésiées puis greffées de cellules cancéreuses dans le pancréas au cours d'une chirurgie de trente minutes, ou sous la peau par injection, les souris sont ensuite anesthésiées deux à trois fois par semaine pour des échographies, ou mesurées éveillées. Le projet modifié en déclare 162 dans ses gravités, modérée à sévère, alors que la rubrique réduction annonce "134 souris au total au maximum", et le porteur écrit que la greffe dans le pancréas induit "une maladie tumorale sévère". Une partie sont des souris NMRI immunodéficientes, fragiles face aux infections, et la tumeur peut dégrader leur état général ou, sous la peau, provoquer douleurs et lésions cutanées. En fin de procédure, toutes sont tuées sous anesthésie après une ponction de sang dans le cœur, pour prélever pancréas, rate, foie ou tumeur.

Objectifs

Le cancer du pancréas (ADK) est un cancer agressif avec un des plus mauvais pronostic suivant l’annonce. Moins de 10% des patients ont une survie de 5 ans après le diagnostic. Des chimiothérapies existent mais il est nécessaire de développer de nouvelles thérapies ciblées pour permettre une meilleure survie des patients. La médecine nucléaire offre une alternative en plein essor pour le diagnostic et le traitement du cancer. Des éléments radioactifs peuvent être couplés à une molécule thérapeutique capable de se lier spécifiquement à un marqueur tumoral et de tuer uniquement la cellule tumorale. En fonction du radioélément utilisé, il est possible de diagnostiquer par imagerie la tumeur chez le patient, ou de la détruire. Nous avons identifié la protéine X comme un marqueur précoce de l’ADK pancréatique pouvant servir de porte d’entrée du radioélement dans la cellule. Nous avons développé un anticorps capable de la reconnaître et ainsi de porter la radioactivité dans la cellule . Une demande de brevet en cours nécessite l'anonymisation en protéine X. Afin de développer cette thérapie nous devons évaluer l’effet de cette rotéine X sur le développement des tumeurs dans un modèle vivant : la souris et nous assurer que son expression à la membrane des cellules tumorales est bien homogène Nous utiliserons des lignées cancéreuses humaines, et murines dont nous décrirons les cinétiques de croissance en présence de la protéine X surexprimée ou non. Nous disposons aussi de lignées cancéreuses dérivées de greffes de cellules de patients chez la souris exprimant la protéine X dont nous décriront aussi la cinétique de croissance mais aussi inhiberons l’expression, de façon stable. Pour répondre à ces objectifs, un modèle de greffe dans le pancréas et sous-cutané, pour chacun des modèles cellulaires, seront nécessaires au développement d’une radiothérapie ciblée contre la protéine X. En début et fin de procédure, nous réaliserons un prélèvement sanguin pour déterminer si la protéine X circulante permettrait de développer un diagnostic sanguin. Ce projet vise à mettre en place un modèle murin adapté au développement d’un outil pour la médecine nucléaire qui permettra de diagnostiquer le cancer du pancréas, mais aussi de le traiter. Il amènera également des connaissances fondamentales sur le rôle de ce marqueur précoce dans Le cancer du pancréas.

Bénéfices attendus

Le cancer du pancréas est un des cancers avec le plus mauvais pronostic suivant l’annonce du diagnostic dont l’incidence augmente en France et en Europe. Les traitements disponibles ne permettent pas aux patients de survivre au-delà de quelques années. Il est primordial d’identifier de nouvelles cibles biologiques pour développer de nouveaux traitements. Ce projet présente un enjeu majeur car l’identification d’une nouvelle cible thérapeutique, la protéine X, permettrait de développer une alternative thérapeutique dans cette maladie. 20 publications seulement sont référencées dans la littérature concernant cette protéine X qui n’a jamais été décrite dans le cadre du cancer du pancréas. Cette découverte laisse penser que la protéine X pourrait être un nouveau marqueur du cancer pancréatique. La mise au point des modèles animaux de cancer pancréatique que nous voulons développer permettrons de caractériser la présence et l’expression membranaire de la protéine X dans les tumeurs pancréatiques. Nous comparerons la cinétique de croissance des tumeurs exprimant ou non la protéine X, nous pourrons ainsi déterminer son rôle dans la croissance tumorale. Cette étape sera indispensable pour les tests d’efficacité de l’anticorps, capable de reconnaître spécifiquement cette protéine X, que nous avons développé. En attachant un agent thérapeutique à cet anticorps, il serait possible de détruire spécifiquement les tumeurs tout en épargnant les tissus sains. Cette seconde phase ne fait pas l’objet de cette demande et sera réalisée par nos collaborateurs. Afin d’évaluer le potentiel de ce nouveau traitement, nous aurons besoin d’étudier son efficacité dans un modèle animal que nous nous proposons donc de mettre au point dans ce projet.

Procédures

Certains animaux subiront une procédure chirurgicale pour la greffe orthotopique de cellules cancéreuses au niveau du pancréas (durée 30 minutes) sous anesthésie générale gazeuse avec un prélèvement sanguin (30 secondes) au niveau de la veine caudale, des anesthésies gazeuses répétées pour des échographies abdominales (durée 15minutes) 2 à 3 fois par semaine. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie gazeuse (15 minutes) pour procéder à prélèvement sanguin intracardiaque et prélever plusieurs organes (pancréas, rate et foie). D’autres animaux subiront une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses réalisée par injection sous-cutanée (1 minute) sous anesthésie générale gazeuse avec un prélèvement sanguin (30 secondes) au niveau de la veine caudale. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie gazeuse (15 minutes) pour procéder à prélèvement sanguin intracardiaque et prélever plusieurs organes (pancréas, rate et foie).

Impact sur les animaux

Les souris NMRI que nous utilisons présente une immunodéficience qui induit une fragilité aux infections mais une tolérance aux greffes de cellules humaines. La greffe de cellules cancéreuses induit une maladie tumorale sévère surtout pour la voie orthotopique dans le pancréas. Le développement de la tumeur pourrait rendre l’organe dysfonctionnel pouvant s’accompagner d’une dégradation de l’état général (perte de poids et d’activité). La chirurgie viscérale dure 30 minutes avec une anesthésie durant 45 min, l’incision de la peau et du péritoine nécessite des sutures internes et cutanées pouvant créer une gêne ou une douleur chez l'animal. Les animaux seront manipulés pour pesées et évaluations du bien-être le jour de la chirurgie, pour le suivi échographique des pesées régulières et des anesthésie gazeuses de 30 minutes seront nécessaires 2 à 3 fois par semaine selon la vitesse de croissance de la tumeur. Dans le cas des injections sous-cutanées,la mesure des tumeurs nécessite la manipulation des animaux éveillés donc pouvant induire un stress pendant 5 à 10 minutes 2 à 3 fois par semaine. Le développement de tumeur sous-cutanée peut induire une gêne voire des douleurs mais aussi des lésions cutanées.

Devenir

Pour la procédure 1, tous les animaux sont euthanasiés sous anesthésie gazeuse en fin de procédure pour le prélèvement du pancréas et d’organes supplémentaires (rate et foie). Un prélèvement sanguin intracardiaque est réalisé avant le prélèvement des organes. Pour la procédure 2, tous les animaux sont euthanasiés sous anesthésie gazeuse en fin de procédure pour prélever la tumeur sous-cutanée. Nous pourrons aussi prélever des organes (ex : pancréas).

Remplacement

Les modèles cellulaires de lignées cancéreuses ne reproduisent pas fidèlement le contexte tumoral pour étudier l’expression de marqueur membranaire comme la protéine X. Même s’il existe des modèles organoïdes de tumeurs pancréatiques, nous ne pouvons pas nous baser sur ce type de modèle dans le cadre de la mise au point de radiothérapie qui nécessite d’observer la réponse des tissus proches de la tumeur. Le modèle de greffe au niveau du pancréas de cellules cancéreuses pancréatiques permet de se rapprocher d’un contexte pathophysiologique proche de celui des patients en reproduisant la complexité tissulaire, cellulaire et du micro-environnement tumoral, ce qui est impossible in-vitro. Ce deuxième modèle de greffe, permettra de se placer dans les conditions les plus proches pour l’administration d’une radiothérapie curative. La greffe sous-cutanée présente l’avantage de reproduire le contexte tridimensionnel des tumeurs solides mais ne récapitule pas la spécificité de l’organe atteint. Le modèle sous-cutané permettra d’adapter les paramètres de la future radiothérapie qui nécessite un modèle vivant. Le modèle sera utilisé en cas de problème de croissances de nos cellules en implantation au niveau du pancréas. L’utilisation de cellules dérivées de tumeurs de patients, nous permettra de récapituler les caractéristiques des tumeurs pancréatiques humaines afin de reproduire plus fidèlement la pathologie observée chez les patients, notamment avec une expression sans doute plus faible de la protéine X. Les derniers modèles dans notre projet, nous permettrons d’étudier l’expression de la protéine X dans le contexte d’un système immunitaire fonctionnel comme chez les patients par rapport aux souris immunodéficientes.

Réduction

Nous envisageons une expérience pilote sur 6 souris pour calibrer la procédure chirurgicale, adapter le nombre de cellules tumorales à injecter et mettre au point l’imagerie par échographie au sein du laboratoire. Si nous observons la formation d’une tumeur à chaque implantation, et pas de mort des animaux due à la chirurgie du pancréas, nous pourrons envisager de diminuer le nombre d’individus prévus. Pour ce projet, nous utiliserons 134 souris au total au maximum. Ce nombre est évalué au plus près grâce à un outil statistique informatique EDA (Experimental Design Assistant) . Ils pourront être revus à la baisse. En effet suite à l’étude pilote d’injection orthotopiques de cellules humaines sur 6 souris, nous relancerons les calculs statistiques pour éventuellement réduire le nombre d’animaux nécessaires. Sur tous les animaux du projet, nous ne nous limiterons pas à prélever seulement la tumeur induite ou le pancréas mais aussi plusieurs organes (rate, foie, éventuellement poumons) qui peuvent être des sites de métastases. Aussi nous recueillerons le sang des animaux pour rechercher la présence circulante de notre cible la protéine X. Les coupes de tissus et tumeurs seront utilisés pour des immunomarquages et radiomarquages par nos collaborateurs. De plus, l’ensemble des prélèvements seront stockés pour étudier des partenaires de la protéines X inconnus à ce jour.

Raffinement

Nos animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; cycle jour/nuit : 12h/ 12h). Les conditions d’hébergement de notre animalerie respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux avec accès à l’eau et à des croquettes à volonté. Les souris seront hébergées par groupes de 5 animaux par cages pour respecter leur instinct grégaire, les cages seront en portoir ventilé individuel. Nous mettrons des enrichissements à disposition des animaux pour éviter tout comportement de stress. Nos animaux présentant une déficience immunitaire, nécessitant de travailler en environnement aseptisé. Nous prévoyons de travailler avec des souris mâles qui nécessitent une vigilance sur une potentielle agressivité entre les animaux dans les cages. Nous envisagerons d’isoler certains individus si nous observons des comportements de domination. . Tous les animaux de ce projet seront suivis quotidiennement à partir de la procédure de greffe de cellules cancéreuses et dès le développement de la maladie pour les modèles orthotopiques. Pendant la chirurgie, les yeux des animaux seront protégés pour éviter le dessèchement. Les animaux, ayant subi une greffe orthotopique au niveau du pancréas, seront réchauffés et retrouveront leurs congénères après la chirurgie pour éviter le stress lié à l’isolement. Nous évaluerons le degré de douleur au cours de la procédure avec une grille de score établie au laboratoire. Nous réaliserons des mesures régulières de croissance de la tumeur soit au pied à coulisse ou par échographie abdominale, et déterminerons une taille limite maximale. Un suivi quotidien des animaux sera assuré par les personnes habilitées pour ce projet et le personnel de l’animalerie et pourrons se rapprocher du SBEA en cas de doute sur un animal ayant subi une des procédures du projet. En cas de signe d’inconfort ou souffrance nous agirons en fonction de la grille de score établie soit en administrant un analgésique ou bien par l’arrêt de la procédure si un des points limites établis est atteint.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé pour étudier les processus de tumorigenèse. Le modèle murin présente une forte homologie génétique avec l’homme et permet de s’affranchir de la limitation d’accès à du matériel humain. Les tumeurs pancréatiques induites chez la souris montrent de nombreuses similarités avec ce qui peut être observé dans les tumeurs humaines, faisant de la souris un bon modèle d’étude. Les modèles de greffes ectopiques et orthotopique dans la souris sont rapides à obtenir, en quelques semaines, et reproductibles. Nous utiliserons des souris adultes pour tout le projet, elles seront âgées de 6 semaines au moment des procédures de greffes. Cet âge est choisi car nous étudions l’adénocarcinome canalaire pancréatique qui affecte les patients adultes. Les animaux doivent être âgés d’au moins 6 semaines pour s’assurer qu’ils supportent la procédure chirurgicale. Ces paramètres seront utilisés pour la deuxième phase de ce projet (non incluse dans cette demande et qui sera réalisée par nos collaborateurs) qui sera une radiothérapie interne vectorisée après le développement tumoral. Pour que les animaux tolèrent les radiations induites par le traitement ils doivent être âgés de 8 semaines.

Selon les groupes, 802 souris sont irradiées puis greffées de moelle osseuse, infectées par des bactéries jusqu'à 96 heures, opérées pour la ligature d'un vaisseau abdominal suivie de 48 heures de survie, ou maintenues sous anesthésie jusqu'à leur mise à mort pendant une thrombose induite au laser ou une inflammation provoquée. Elles sont utilisées dans ce volet d'un projet multisite, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque effet décrit reste pourtant qualifié de léger ou de modéré, l'infection étant dite "légère à modérée" et le porteur écrivant que "L'irradiation ne procure aucune douleur". Toutes les souris sont tuées à l'issue, pour prélever les tissus et organes analysés ensuite.

Objectifs

Nous avons identifié que l’inhibition d'une protéine diminuait de façon significative la progression des lésions dans un contexte inflammatoire. Dans le but de mieux comprendre le mode d’action de cette protéine sur la progression de ces lésions, nous allons évaluer son impact sur l’inflammation et la fonction de l’endothélium (cellules qui tapissent l’intérieur d’un vaisseau sanguin) grâce à des modèles précliniques d’infection (sepsis), d’inflammation et de thrombose (activation de l’endothélium avec une cytokine inflammatoire ou un laser).

Bénéfices attendus

Ces expériences permettront d’évaluer, dans un organisme vivant, les effets potentiels de la protéine étudiée sur la formation de caillots sanguins et l’inflammation, ce qui ne peut pas être reproduit en laboratoire sur des cellules isolées. Elles aideront également à déterminer si cette protéine pourrait représenter une cible intéressante pour développer de nouvelles approches thérapeutiques visant à protéger les vaisseaux sanguins contre les dysfonctionnements liés à des processus inflammatoires ou thrombotiques.

Procédures

Trois types d’interventions seront réalisées sur des lots différents d’animaux : 1- Dans le premier ou deuxième établissements utilisateur, des lots d'animaux seront soumis à une irradiation suivie d’une greffe de moelle osseuse (injection des cellules par voie intraveineuse). 2- Dans un troisième établissement utilisateur, des lots d'animaux seront soumis à une infection bactérienne. Une seule prise de sang sera réalisée sur chaque lot à differents temps (au plus tard 96h apres le début de l’infection). Pour cela les souris seront sous anesthésie générale profonde (mélange de Tilétamine, Zolazépam et Xylazine), et seront ensuite euthanasiées. 3- Dans un quatrième établissement utilisateur, les animaux seront hébergés pendant 1 semaine pour acclimatation. 4- Dans le cinquième établissement utilisateur, les animaux seront soumis, sous anesthésie profonde, à un modèle de thrombose (activation des cellules du vaisseau par un laser) ou d’inflammation (activation des cellules du vaisseau par une molécule inflammatoire). Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des expérimentations qui durent respectivement 4 heures pour étudier la thrombose et 7 Heures pour étudier l’inflammation locale. Pour étudier la thrombose veineuse, des lots différents d’animaux seront exposés à une chirurgie sous anesthésie avec ligation d’un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures après la chirurgie les animaux sont euthanasiés.

Impact sur les animaux

- Les animaux subiront une irradiation sans geste invasif suivi d’une reconstitution de leur moelle osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. Les animaux peuvent avoir un léger stress du fait de l'enfermement et du bruit, mais ce stress est de courte duréee. L'irradiation ne procure aucune douleur. - Après l’induction d’une infection (légère à modérée), les effets indésirables attendus dans ce modèle incluent une perte de poids, une diminution de l’activité et de la vitalité. Les souris seront ensuite euthanasiées au plus tard 96h apres le début de l’infection. D’autres expérimentations (modèles de thrombose et d’inflammation) sont conduites sans réveil des animaux. Les souris sont alors maintenues sous anesthésie générale pendant toute la durée des procédures expérimentales. À l’issue des expérimentations, les animaux sont euthanasiés sans reprise de conscience.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour collecter les tissus et organes qui seront ensuite analysés. Les animaux seront également euthanasiés si l'un des points limites était atteint.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation de souris exprimant la protéine d’interet inactive. Ainsi, l’utilisation d’animaux vivants constitue une étape nécessaire pour répondre aux objectifs du projet, aucun modèle de remplacement pertinent n’étant actuellement disponible.

Réduction

Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d'expérimentations supplémentaires. Dans les expérimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes de cinq individus, dans des cages ventilées, avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Si une diminution de l’activité est observée, de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage afin de faciliter l’accès à la nourriture. Du papier sopalin et des cubes de bois seront également rajoutés comme enrichissement environnemental afin de permettre des comportements naturels de nidification et d’exploration, contribuant ainsi à réduire le stress et à améliorer le bien-être des animaux. Une période d’acclimatation de sept jours est respectée avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié à l’environnement. Les transferts entre deux établissements seront réalisés par un transporteur agréé. Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation d’une semaine avant toute procédure expérimentale dans l’établissement d’accueil.

Choix des espèces

Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliquant une protéine kinase dans l’inflammation, la thrombose et la dysfonction endothéliale en contexte thrombo-inflammatoire. Ces processus reposent sur des interactions complexes entre la paroi des vaisseaux, les cellules sanguines et le système immunitaire, s’inscrivant dans une réponse physiopathologique intégrée qui ne peut être reproduite de manière pertinente par des approches in vitro ou ex vivo. Le recours à l’expérimentation animale constitue donc l’unique approche permettant d’étudier ces mécanismes dans leur globalité. Le modèle murin est largement reconnu comme le modèle de référence pour les études précliniques de la thrombose et de l’inflammation, en raison de fortes similitudes avec l’Homme, tant au niveau des cellules impliquées que des voies moléculaires mises en jeu. Par ailleurs, l’utilisation de souris génétiquement modifiées ciblant spécifiquement la protéine kinase, sans phénotype dommageable en conditions basales, permet une analyse mécanistique en contexte pathologique. Nous utiliserons des souris de 6 à 8 semaines pour les donneuses de moelle osseuse, et de 12 à 25 semaines pour les expérimentations (âge adulte, système cardiovasculaire mature).

Pour comprendre comment une kinase agit sur l'inflammation et la coagulation dans les vaisseaux, 802 souris vont être utilisées dans ce volet d'un projet réparti sur plusieurs établissements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Selon les groupes, elles sont irradiées puis greffées de moelle osseuse, infectées par des bactéries dans un protocole de sepsis puis tuées au plus tard 96 heures après, ou soumises sous anesthésie à une thrombose induite au laser, une inflammation provoquée ou la ligature d'un vaisseau abdominal suivie de 48 heures de survie. Une partie porte une version inactive de la kinase. Toutes sont tuées au terme de leur procédure pour prélever tissus et organes, et plus tôt si "l'un des points limites" est atteint, sans que le résumé dise lesquels.

Objectifs

Nous avons identifié que l’inhibition d'une protéine diminuait de façon significative la progression des lésions dans un contexte inflammatoire. Dans le but de mieux comprendre le mode d’action de cette protéine sur la progression de ces lésions, nous allons évaluer son impact sur l’inflammation et la fonction de l’endothélium (cellules qui tapissent l’intérieur d’un vaisseau sanguin) grâce à des modèles précliniques d’infection (sepsis), d’inflammation et de thrombose (activation de l’endothélium avec une cytokine inflammatoire ou un laser).

Bénéfices attendus

Ces expériences permettront d’évaluer, dans un organisme vivant, les effets potentiels de la protéine étudiée sur la formation de caillots sanguins et l’inflammation, ce qui ne peut pas être reproduit en laboratoire sur des cellules isolées. Elles aideront également à déterminer si cette protéine pourrait représenter une cible intéressante pour développer de nouvelles approches thérapeutiques visant à protéger les vaisseaux sanguins contre les dysfonctionnements liés à des processus inflammatoires ou thrombotiques.

Procédures

Trois types d’interventions seront réalisées sur des lots différents d’animaux : 1- Dans le premier ou deuxième établissements utilisateur, des lots d'animaux seront soumis à une irradiation suivie d’une greffe de moelle osseuse (injection des cellules par voie intraveineuse). 2- Dans un troisième établissement utilisateur, des lots d'animaux seront soumis à une infection bactérienne. Une seule prise de sang sera réalisée sur chaque lot à differents temps (au plus tard 96h apres le début de l’infection). Pour cela les souris seront sous anesthésie générale profonde (mélange de Tilétamine, Zolazépam et Xylazine), et seront ensuite euthanasiées. 3- Dans un quatrième établissement utilisateur, les animaux seront hébergés pendant 1 semaine pour acclimatation. 4- Dans le cinquième établissement utilisateur, les animaux seront soumis, sous anesthésie profonde, à un modèle de thrombose (activation des cellules du vaisseau par un laser) ou d’inflammation (activation des cellules du vaisseau par une molécule inflammatoire). Les animaux sont maintenus sous anesthésie tout au long de l’expérience et sont euthanasié à la fin des expérimentations qui durent respectivement 4 heures pour étudier la thrombose et 7 Heures pour étudier l’inflammation locale. Pour étudier la thrombose veineuse, des lots différents d’animaux seront exposés à une chirurgie sous anesthésie avec ligation d’un vaisseau sanguin abdominal (40 minutes). 48 heures après la chirurgie les animaux sont euthanasiés.

Impact sur les animaux

- Les animaux subiront une irradiation sans geste invasif suivi d’une reconstitution de leur moelle osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. Les animaux peuvent avoir un léger stress du fait de l'enfermement et du bruit, mais ce stress est de courte duréee. L'irradiation ne procure aucune douleur. - Après l’induction d’une infection (légère à modérée), les effets indésirables attendus dans ce modèle incluent une perte de poids, une diminution de l’activité et de la vitalité. Les souris seront ensuite euthanasiées au plus tard 96h apres le début de l’infection. D’autres expérimentations (modèles de thrombose et d’inflammation) sont conduites sans réveil des animaux. Les souris sont alors maintenues sous anesthésie générale pendant toute la durée des procédures expérimentales. À l’issue des expérimentations, les animaux sont euthanasiés sans reprise de conscience.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour collecter les tissus et organes qui seront ensuite analysés. Les animaux seront également euthanasiés si l'un des points limites était atteint.

Remplacement

Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation de souris exprimant la protéine d’interet inactive. Ainsi, l’utilisation d’animaux vivants constitue une étape nécessaire pour répondre aux objectifs du projet, aucun modèle de remplacement pertinent n’étant actuellement disponible.

Réduction

Dans un souci d'utilisation d'un nombre minimal d'animaux, le nombre d'animaux annoncé a été calculé au plus juste à l'aide d'outils statistiques. Cependant si une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant la réalisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d'expérimentations supplémentaires. Dans les expérimentations de thrombose, plusieurs types cellulaire et/ou molécules seront visualisés dans les mêmes animaux.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes de cinq individus, dans des cages ventilées, avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Si une diminution de l’activité est observée, de l’aliment hydraté sera mis à disposition dans la cage afin de faciliter l’accès à la nourriture. Du papier sopalin et des cubes de bois seront également rajoutés comme enrichissement environnemental afin de permettre des comportements naturels de nidification et d’exploration, contribuant ainsi à réduire le stress et à améliorer le bien-être des animaux. Une période d’acclimatation de sept jours est respectée avant le début des expérimentations afin de limiter le stress lié à l’environnement. Les transferts entre deux établissements seront réalisés par un transporteur agréé. Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation d’une semaine avant toute procédure expérimentale dans l’établissement d’accueil.

Choix des espèces

Ce projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes impliquant une protéine kinase dans l’inflammation, la thrombose et la dysfonction endothéliale en contexte thrombo-inflammatoire. Ces processus reposent sur des interactions complexes entre la paroi des vaisseaux, les cellules sanguines et le système immunitaire, s’inscrivant dans une réponse physiopathologique intégrée qui ne peut être reproduite de manière pertinente par des approches in vitro ou ex vivo. Le recours à l’expérimentation animale constitue donc l’unique approche permettant d’étudier ces mécanismes dans leur globalité. Le modèle murin est largement reconnu comme le modèle de référence pour les études précliniques de la thrombose et de l’inflammation, en raison de fortes similitudes avec l’Homme, tant au niveau des cellules impliquées que des voies moléculaires mises en jeu. Par ailleurs, l’utilisation de souris génétiquement modifiées ciblant spécifiquement la protéine kinase, sans phénotype dommageable en conditions basales, permet une analyse mécanistique en contexte pathologique. Nous utiliserons des souris de 6 à 8 semaines pour les donneuses de moelle osseuse, et de 12 à 25 semaines pour les expérimentations (âge adulte, système cardiovasculaire mature).