Procédures sévères

110 rats nouveau-nés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une hémorragie cérébrale leur est provoquée par injection de sang dans le cerveau, puis ils reçoivent du lactate et sont suivis par IRM et par des tests de réflexes, de mémoire et de dépression avec restriction alimentaire. Le porteur reconnaît que l'induction de l'hémorragie peut entraîner douleurs et perte de poids, et que la restriction alimentaire peut être une situation angoissante. Il affirme qu'il n'existe pas de remplacement à son modèle, l'application chez l'Homme restant renvoyée à plus tard.

Objectifs

Les hémorragies péri- et intraventriculaires sont extrêmement courantes lors de l’accouchement. Leur origine est multifactorielle : elle peut être induite par une variation du débit sanguin artériel et veineux, des troubles de la coagulation, une fragilité des veines dans le tissu cérébral immature. Ces hémorragies cérébrales peuvent être la cause de lésions cérébrales, plus ou moins sévères par destruction directe des tissus, suivie d'une destruction secondaire due à l'activité protéolytique des enzymes impliquées dans la formation de caillots sanguins, ainsi que dans la lyse et l'inflammation. Cependant, contrairement aux dommages dus à l'hypoxie-ischémie néonatale, largement étudiée, les effets délétères des hémorragies cérébrales néonatales sont peu renseignés. Ces hémorragies entraînent le passage d’un grand nombre d’érythrocytes (globules rouges) dans le milieu interstitiel. L’hypothèse du projet est que ces érythrocytes, présents de manière anormale hors des vaisseaux sanguins, consommeraient les sources énergétiques destinées initialement au bon fonctionnement cérébral et seraient ainsi responsables d’un déficit énergétique. L’administration de lactate, comme substrat énergétique alternatif, a montré une neuroprotection dans le cadre de l’hypoxie-ischémie néonatale, pathologie marquée aussi par un déficit du métabolisme énergétique. L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets d’une administration de lactate, dans une stratégie de substitution énergétique, dans le contexte des hémorragies cérébrales néonatales. Sur un modèle d’hémorragie cérébrale chez le raton, les effets neuroprotecteurs de l’administration de lactate seront évalués par IRM, méthode non-invasive, par suivi des paramètres biologiques (glycémie, lactatémie, cétonémie) ainsi que par des tests comportementaux.

Bénéfices attendus

L'hémorragie subarachnoïdienne est une des hémorragies intracrâniennes les plus courantes. Chez les nouveau-nés, elle peut résulter soit d'un traumatisme à la naissance (force mécanique excessive exercée sur le bébé pendant l'accouchement) de manière prépondérante chez le nouveau-né à terme, soit d'une lésion hypoxique-ischémique (manque de flux sanguin oxygéné vers le cerveau), chez le nouveau-né prématuré. Si les recherches ont montré que la majorité des hémorragies subarachnoïdiennes étaient mineurs et que les bébés survivaient généralement sans aucun problème durable, certaines complications peuvent néanmoins entraîner des lésions cérébrales permanentes, voire la mort du nouveau-né. De plus, ces hémorragies sont associées à un certain nombre de symptômes qui pourraient être amenuisés (convulsions, apnée, bradycardie, hydrocéphalie). L'hypothèse de ce projet de recherche est que les hématies, qui se retrouvent dans le liquide céphalorachidien consomment les substrats énergétiques cérébraux (le glucose), au dépend du cerveau. Nous proposons une stratégie de substitution énergétique en administrant du lactate pour pallier le déficit énergétique induit par l'hémorragie. Les bénéfices attendus sont un maintien de l'équilibre énergétique cérébral couplé à une limitation des symptômes et à un maintien des fonctions associées.

Procédures

Pour l'induction de l'hémorragie, les animaux subiront une chirurgie (prélèvement de sang au niveau de la queue et injection de ce sang dans la zone cérébrale péri-ventriculaire droite ; réalisée une fois d'une durée inférieure à 10 minutes). Des injections intra-péritonéales seront rélisées afin d'administrer le lactate (réalisée juste après l'hémorragie et sur les deux ou quatre jours suivants). Les animaux effectueront des examens par résonance magnétique nucléaire sous anesthésie gazeuse ; technique non-invasive pour les animaux (durée : 30 - 45 min). La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements de réflexes précoces (durée inférieur à 5 minutes) et de mémoire (durée : 10 minutes). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (10 minutes maximum), le poids des animaux sera surveillé par une pesée en début et fin de test.

Impact sur les animaux

L'induction de l'hémorragie intra-ventriculaire pourra entraîner une perte de poids ainsi que des douleurs postopératoires. L’administration de lactate sera réalisée par une injection intrapéritonéale, ce qui constitue une nuisance. Les suivis des volumes hémorragiques et des connections des réseaux neuronaux seront réalisés par IRM. L'IRM est une technique non-invasive cependant, durant l'examen un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé entre l'animal et le lit IRM, peut subvenir, du fait de la variabilité inter-animaux de la sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entraînera l'arrêt de l'expérimentation. Lors du test comportemental de dépression, la nécessité d’une restriction alimentaire pourrait entraîner une perte de poids et être une situation angoissante pour les animaux.

Devenir

L'induction de l'hémorragie néonatale ne permettra pas d'utiliser les animaux pour un autre projet.

Remplacement

Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de l’hypothermie et de pouvoir envisager une application rapide chez l’Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par le fait que l’imagerie par résonance magnétique est une technique d’investigation non invasive et permet donc une suivi longitudinal des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences inter-groupes seront mise en évidence par des tests statistiques.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie ; une injection d'analgésique sera réalisée avant l'injection de sang. La douleur post-opératoire sera prise en charge par une administration unique d'analgésique. Les pertes de poids seront surveillées et à partir d'un certain point, seront considérées comme atteignant un point limite. Des difficultés respiratoires post-opératoires entraîneront l'arrêt de la procédure. Les examens d'imagerie par résonance magnétique seront réalisés sous anesthésie générale. Une modification du rythme cardiaque ou du rythme respiratoire entraînera l'arrêt de l'expérimentation. L'utilisation de gel ophtalmique durant les examens d'imagerie par résonance magnétique préviendra le risque de sécheresse oculaire. Une surveillance particulièrement accrue sera mise en place pour les 5 jours post-opératoires (couleur de la peau, estomac plein, mouvements, interactions avec la mère et les autres membres de la portée). Tous les tests de comportement seront réalisés par un unique expérimentateur, et dans une salle unique dédiée, permettant une habituation des animaux aux manipulations et à l’individu lui-même. Pour le test de dépression, nécessitant une privation de nourriture ponctuelle, la prostration de l’animal représentera un point limite. . Au niveau de l’hébergement, les animaux seront élevés en cage collective, sur une litière de peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. Lors de ces observations quotidiennes, la capacité de l'animal à s'alimenter, le comportement et sa vivacité, la couleur de la peau ou l'état du pelage seront vérifiés.

Choix des espèces

Le rat présente de nombreux avantages par rapport à la souris : - la physiologie du rat est plus proche de celle de l'homme que ne l'est la physiologie de la souris. Notre étude ayant un axe translationnel, cette caractéristique est un atout - la volumétrie de son cerveau est plus compatible avec les examens d'imagerie par résonance magnétique (meilleur rapport signal sur bruit) - les tests de comprtements seront facilités par l'utilisation de cette espèce Nous souhaitons suivre les animaux par IRM à 4 stades de développement: P2 et P30, afin d'évaluer l'effet neuroprotecteur précoce des traitements administrés en phase aigüe de la pathologie (P2 et P3) et à P30 afin d’évaluer les effets neuroprotecteurs à long terme ; l’IRM fonctionnelle de repos permettra, à P50 d’évaluer les effets de la neuroprotection sur le remodelage des circuits neuronaux et la récupération fonctionnelle.

Jusqu'à trois prises de sang par semaine sur une étude de six mois au plus, et des tests de tolérance au glucose comptant chacun jusqu'à dix prélèvements en trois à six heures : 348 rongeurs, 116 souris et 232 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour des prélèvements terminaux. Rendus diabétiques par une injection de streptozotocine, ils reçoivent des îlots pancréatiques nus ou encapsulés, injectés ou implantés par chirurgie sous anesthésie, puis restent isolés environ une semaine pour récupérer. Jusqu'à une fois par semaine, l'équipe stimule leurs pattes au toucher ou à la chaleur pour mesurer la neuropathie, et examine le fond de leur œil. Les capsules doivent protéger les îlots greffés du système immunitaire, pour épargner un jour aux patients diabétiques de type 1 les traitements immunosuppresseurs. Ces procédures sont classées au niveau sévère, et le porteur écrit que "des effets indésirables légers peuvent apparaitre dans certaines procédures".

Objectifs

Le diabète est une maladie métabolique caractérisée par une hyperglycémie chronique résultant d’un défaut de sécrétion d'insuline (diabète type 1) ou d'action de l'insuline (diabète de type 2). L’hyperglycémie chronique expose les personnes atteintes à un risque accru de pathologies plus graves telles que la néphropathie, la neuropathie, les complications cardiovasculaires, oculaires (rétinopathie). Aujourd’hui, l’incidence du diabète a atteint une proportion pandémique et les estimations pour les prochaines années sont alarmantes, on estime que d’ici à 2045, le nombre de diabétiques s’élèvera à 700,2 millions dans le monde. Le diabète de type 1 (DT1), résulte d’une réaction auto-immune par une autodestruction progressive des cellules bêta des îlots de Langerhans du pancréas, productrices d’insuline. Ainsi, les patients souffrants de DT1 n’ont d’autre choix qu’un apport exogène d’insuline pour pouvoir réguler leur homéostasie glucidique. Aujourd’hui, malgré une amélioration non négligeable de la gestion du DT1 par le développement des analogues à l’insuline et l’utilisation de moniteurs de glycémie, la régulation glucidique reste compliquée pour certains patients. En effet, ces derniers sont souvent exposés à des épisodes d’hypoglycémie iatrogène.Une alternative offrant une meilleure capacité de régulation glucidique serait une greffe d’ilots pancréatiques. Toutefois, le recours systématique aux traitements immunosuppresseurs pour protéger les cellules greffes de la destruction à médiation immunitaire, reste le principal obstacle. Afin d’éviter l’utilisation de traitement immunosuppresseur, qui expose le patient à un risque accru de complications infectieuses, la greffe d’ilots pancréatiques encapsulés représente une stratégie thérapeutique prometteuse. En effet, les cellules d’ilots de Langerhans sont contenues dans une capsule semi-perméable, les protégeant ainsi du rejet par le système immunitaire, tout en permettant le passage à la fois des nutriments, de l’oxygène et de l’insuline. Ainsi, l’objectif du présent projet est d’évaluer l’efficacité des ilots encapsulés implantés chez les animaux diabétiques sur la régulation métabolique et à prévenir les complications liées au diabète (rétinopathie et neuropathie).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité des implants d’ilots pancréatiques sur la régulation métabolique et leur tolérance locale chez les rats diabétiques. Par ailleurs l'effet préventif des implants sur les complications du diabète (neuropathie, rétinopathie) est également évalué.

Procédures

Les troubles métaboliques sont induits par une administration unique d'un réactif (durée d'environ 1 minute). Après sélection des animaux diabétiques, les ilots pancréatiques nus ou encapsulés sont injectés ou implantés/explantés par chirurgie sous anesthésie qui dure généralement 1 heure. Par la suite, les animaux sont maintenus isolés avec enrichissement pour une meilleure récupération post-chirurgicale (généralement pour une semaine). Juste avant la chirurgie et durant la période post chirurgicale, anti-inflammatoire et antibiotique sont administrés par bolus rapide (quelques secondes) par voie sous-cutanée ou intramusculaire (de manière générale) selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (1/ mois) nécessitent une administration unique par voie orale, intrapéritonéale ou sous cutanée (durée d’environ 1 minute) suivie de prélèvements d'une goutte de sang (durée de quelques secondes, 10 prélèvements maximum, sur 3 à 6 h de test). Par ailleurs, des prélèvements de sang peuvent être réalisés de manière répétée par exemple : 3 fois par semaine au maximum pendant la toute durée de l’étude (6 mois au maximum), chaque prélèvement durant quelques secondes à 3 minutes. De plus, un hébergement individuel (durée maximum de 24 h) peut être nécessaire au cours de l'étude pour prélèvement d'urine ou de fèces. L’évaluation de la neuropathie se fait par stimulation tactile et/ou thermique au niveau des pattes de l’animal, la procédure dure quelques minutes et peut être répétée 1 fois par semaine au maximum. Enfin, un examen du fond de l’œil (durée de quelques minutes, répété 1 fois par semaine au maximum) est réalisé par méthode non invasive (ophtalmoscope).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des effets indésirables légers peuvent apparaitre dans certaines procédures, ceux-ci sont essentiellement marqués par : (1) une perte de poids suite à l'induction des troubles métaboliques, (2) des phases d’hypoglycémie ou d'hyperglycémie, (3) une courte privation de nourriture (pour une durée n’excédant pas 16h ± 1 h) ou des prélèvements sanguins et/ou urinaires. Toutefois, si une souffrance devait apparaître, l’atteinte de points limites clairement établis permettraient l'euthanasie de l'animal. Par ailleurs, de courtes périodes d'isolement n’excédant pas 24h ± 1h sont nécessaires au projet (en veillant à conserver le contact olfactif, visuel et sonore entre les congénères). En outre, lors de la phase de récupération post-chirurgicale, une attention particulière est apportée (surveillance des cicatrices, état général, poids, appétit, excrétion de fécès…).

Devenir

Tous les animaux sont soumis à des prélèvements terminaux ce qui implique leurs euthanasies.

Remplacement

De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires de concept, d’effectuer un tri du matériel d’encapsulation et de ne retenir que les matériaux présentant une certaine efficacité et inocuité.. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne donnent aucune indication sur la tolérance et l’efficacité du complexe (capsule-ilots) chez l’Homme. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.

Réduction

Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif (Implant sans ilots ou Placébo) et éventuellement à un contrôle positif et négatif (implantation d’ilots par voie intra-portale : ilot allogénique et ilot syngénique) si cela s'avère pertinent. Quand le protocole d'étude le permet, un groupe traité est utilisé comme son propre contrôle permettant ainsi d’utiliser un nombre d’animaux réduit. Les données de la littérature indiquent qu’un effectif de 8 animaux (rats et souris) en standard par groupe (nombre de groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. L’analyse statistique prévue repose sur des tests paramétriques. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.

Raffinement

Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques à la procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré/post-opératoires complets.

Choix des espèces

L’impact de substances pharmacologiques sur le métabolisme de rongeurs (rats, souris), est prédictif de leur efficacité et/ou sécurité en clinique. En effet, le rongeur s'est avéré être un modèle fiable pour découvrir et valider de nouveaux traitements du Diabète, il présente une physiologie proche de celle de l'Homme. Les études sont principalement menées sur des jeunes rongeurs sains dont l'âge est compris entre minimum 4 semaines (correspond à la fin du sevrage des animaux) et maximum 20 semaines (correspond à l'apparition du processus de sénescence). Par ailleurs les rongeurs soumis à la procédure d'induction du diabète par injection de streptozotocine seront agés au maximum de 12 semaines en début de traitement et ce afin d'éviter le risque de mortalité.

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du poumon puis des injections de liposomes par voie rétro-orbitaire, avant un prélèvement de la totalité du sang par ponction intracardiaque et le prélèvement de leurs organes, pour mettre au point une nanoparticule censée renforcer l'immunothérapie. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent métastaser et provoquer des douleurs, et que la contention et l'anesthésie stressent les animaux. Il annonce surtout des retombées de brevet et de modèle mathématique, et affirme ne maîtriser l'étude de l'immunomodulation que in vivo.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est de synthétiser une nanoparticule générique (appelée NanoBooster) pouvant être administrée en amont (ou simultanément) à l’immunothérapie, dans le but de remodeler le terrain immunitaire du patient et ainsi augmenter ses chances de bénéficier au mieux de ces traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra non seulement de consolider l’intérêt de développer des outils in silico pour la synthèse des nanoparticules mais aussi de définir des premières caractéristiques essentielles à un NanoBooster (taille, cytotoxique encapsulé ou non, dose de cytotoxique ) avec l’exemple de son association à un anticorps anti-PD-1 dans le cancer du poumon non à petites cellules. Ces résultats seront valorisés lors de congrès internationaux et dans le cadre d’une publication scientifique. Le modèle mathématique pourra également être valorisé par un brevet. Les perspectives de ce projet sont nombreuses. Elles consistent en : - La Validation du modèle mathématique sur un éventail plus large de molécules d’immunothérapies (nivolumab, Opdivo®, anti-PD-1 et l’atézolizumab, Tecentriq®, anti-PD-L1) et de type de cancers tels que le cancer du sein et du pancréas. - Le développement d’un modèle mathématique afin d’optimiser les modalités de ce schéma combinatoire.

Procédures

Pour l'étude d'immunomodulation: -Greffe de cellules tumorales (injection sous-cutanée sur le flanc de l'animal) : sur animal anesthésié -Administration du lot de liposome (vide ou avec cytotoxique encapsulé) par la voie rétro-orbitale: sur animal anesthésié -Suivi du poids de l'animal et du volume tumoral (3 fois par semaine) : sur animal vigile -Prélèvement de la totalité du sang par ponction intra-cardiaque, prélèvement de la tumeur et de la rate également: sur animal anesthésié Chaque souris subit 1 seule fois chacune des interventions évoquées ci-dessus (excepté le suivi du poids de l'animal et le suivi de la croissance tumoral). Pour l'étude de la pharmacocinétique: -Greffe de cellules tumorales (injection sous-cutanée sur le flanc de l'animal) : sur animal anesthésié -Administration du lot de liposome (vide ou avec cytotoxique encapsulé) par la voie rétro-orbitale: sur animal anesthésié -Suivi du poids de l'animal et du volume tumoral (3 fois par semaine) : sur animal vigile -Prélèvement de la totalité du sang par ponction intra-cardiaque, le cerveau, rein, foie, rate, tumeur, poumon, coeur, et pancréas seront également prélevés sur les animaux ayant reçu le lot de liposome avec cytotoxique : sur animal anesthésié. -Imagerie sur animaux réservés aux temps tardifs et ayant reçu le lot de liposome avec cytotoxique (6 temps seront définis en fonction du cytotoxique encapsulé): sur animal anesthésié -Imagerie pour les animaux ayant reçu le lot de liposome vide (les acquisitions des images auront lieu selon les mêmes temps définis pour le groupe ayant reçu le lot de liposome avec cytotoxique): sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Les animaux seront greffés avec des cellules de cancer du poumon (LL/2) pouvant métastaser dans de rares cas, et donc engendrer de la douleur. Les injections des traitements se font par voie intraveineuse rétro orbitale, ainsi une douleur courte au site d'injection peut apparaitre. Les animaux seront anesthésiés à l'aide d'une cage à induction ce qui peut les stresser quelques minutes avant l'endormissement. La mesure du volume tumoral sur animal vigile peut également être stressant pour l'animal.

Devenir

Chaque procédure nécessite le prélèvement de sang, et d'organes et donc la mise à mort des animaux. Les 6 souris utilisées pour les études de biodistribution par imagerie en fluorescence des liposomes vides seront mises à mort une fois le point limite atteint.

Remplacement

A ce jour, Il existe des modèles in vitro pour étudier l'immunité tumorale mais ces tests ne sont pas mit en place au sein de notre laboratoire. L'équipe du laboratoire est compétente pour l'étude de l'immunomodulation in vivo seulement. C'est pourquoi nous collaborons avec une autre équipe pour l'évaluation de l'immunomodulation in vitro. Ces études d'immunomodulation sur splénocytes,d'apoptose en co-culture splénocyte/cellules cancéreuses et d'étude d'interaction des liposomes avec les cellules immunitaires (lymphocyte et macrophages) nous permettront de remplacer les expériences initialement prévues in vivo pour sélectionner les deux nanoboosters les plus immunomodulateur.

Réduction

Le logiciel Kinetic pro sera utilisé pour définir des temps informatifs pour les études de pharmacocinétique, afin de réduire au maximum le nombre de temps de prélèvements nécessaires et la durée de l'étude. La pharmacocinétique des liposomes vides sera évaluée en imagerie par fluorescence permettant de faire un suivi non invasif, non destructif et longitudinale de la pharmacocinétique. Que ce soit dans le cadre de l'étude d''immunomodulation ou dans le cadre de l'étude de la pharmacocinétique, le volume tumorale est monitoré 3 fois par semaine et dès lors qu'un animal est mis à mort, la totalité de ses organes et de son sang sont prélevés. Malgré le fait que seuls le sang, la tumeur et la rate soient utilisés pour étudier l'immunomodulation, nous prélevons la totalité des organes afin de pouvoir générer des datas supplémentaires sur la pharmacocinétique de nos formulations. Ces datas (volume tumoral, données sur la pharmacocinétique supplémentaires) nous serviront à valider le futur modèle PBPK (physiologically based pharmacokinetics) développé en parallèle des études expérimentales et donc d'éviter d'utiliser des animaux supplémentaires pour la validation de ce modèle. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test non paramétrique de Mann et Whitney.

Raffinement

Le bien être animal est respecté: - temps d'acclimatation de 10 jours avant toute procédure - enrichissement des cages (dômes - copeaux de cellulose) , prévention de la douleur, réduction du stress (les manipulations telles que les administrations, prélèvements seront conduites sous anesthésie générale et aucun stress ou souffrance particulière n’est attendue au cours de ces diverses interventions sur l'animal) - définition des points limites et évaluation quotidienne du bien être animal.

Choix des espèces

Les données de la littérature montrent que la souris est un bon modèle expérimental pour des études de pharmacocinétiques et d'immunomonitoring , de plus notre laboratoire possède déjà l'expertise de ces procédures sur ces modèles . La souche de souris utilisée est la C57Bl/6, les souris C57Bl/6 sont immunocompétentes. En effet, une partie de l'étude consiste en l'évaluation in vivo de la régulation de plusieurs effecteurs de l'immunité tels que les cellules LT CD8, LT CD4, NK et Treg. Par ailleurs, la facilité de manipuler la souris dans un milieu confiné fait de cette espèce animale l’espèce la plus appropriée pour répondre aux questions posées. Les données bibliographiques se réfèrent principalement à des études effectuées sur des souris de 6 semaines. L'utilisation d’animaux de cet âge permettra une comparaison plus aisée avec les données déjà publiées dans la littérature et permettra ainsi de mieux évaluer la performance de nos nanoboosters. De plus le cancer touche généralement une population adulte.

308 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Modèles de la maladie de Huntington, elles développent des troubles moteurs et subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau de soixante-dix minutes, avant leur mise à mort pour analyser sang et tissus. Le porteur décrit des mouvements involontaires, des tremblements, des crises d'épilepsie et des vocalisations inhabituelles liés au phénotype. Il affirme que seuls les modèles murins reproduisent assez fidèlement la maladie et que ces étapes sont exigées par l'agence du médicament avant tout essai clinique.

Objectifs

Le but principal de cette étude est d’investiguer les conséquences générales, de la surexpression du gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum), sur le métabolisme cellulaire des souris de deux modèles pour la maladie d'Huntington (MH). Pour répondre à cette question, différentes molécules du métabolisme présentes dans les tissus et dans le sang seront analysées par chromatographie. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients à un stade précoce de la maladie d'Huntington. En effet, l’objectif est d’évaluer si la diminution de Huntingtine mutée (agent causal de la maladie d'Huntington), présente dans le striatum des modèles de souris de la MH (maladie d'Huntington), est corrélée à une diminution de la concentration de Huntingtine mutée soluble dans le sang (plasma) ainsi que d’autres biomarqueurs liés à la progression de la maladie/efficacité du traitement. Les prélèvements de sang et de tissus seront effectués suite à la constatation de la mort de l’animal.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de comparer dans deux modèles de souris de la maladie d’Huntington la concentration de biomarqueurs (métabolites) dont le profil est modifié à la suite de l’injection d’un virus adeno-associés exprimant le gène thérapeutique. Le métabolite ou les métabolites qui seront identifiés par spectrometrie pourront être utilisés comme marqueur d’efficacité de ce traitement dans le cadre d’un futur essai clinique.

Procédures

Les animaux développent un phénotype dommageable avec troubles moteurs. Une chirurgie avec injection d'une substance dans le cerveau sous anesthésie générale et sous analgésie (Durée 70 minutes). Une euthanasie sera réalisée par une méthode réglementaire d'une durée de 3 minutes. Il s’agit d’une procédure sous analgésie.

Impact sur les animaux

Pour minorer toutes douleurs post-chirurgie suite à la mise en barre d’oreille, une crème antalgique est appliqué au niveau des oreilles en préventif. Une perte de poids due à la chirurgie pourrait être observée (5 à 10% du poids de référence de l’animal). Un risque d’arrêt/détresse respiratoire, hypothermie ou bien un risque infectieux lié à la chirurgie pourrait être observé. Des effets neurologiques liés au phénotype dommageable sont attendus chez ses animaux tels que : les mouvements choréiformes, les mouvements stéréotypés involontaires, les tremblements et les crises d'épilepsie, ainsi que les composantes des troubles non liés aux mouvements, y compris les vocalisations inhabituelles.

Devenir

Les animaux intégrés dans la procédure d’injection de virus adéno-associés seront euthanasiés pour l’étude des différents métabolites dans le plasma et les tissus. Les prélèvements de sang et de tissus seront effectués suite à la constatation de la mort de l’animal.

Remplacement

A ce jour, seuls les modèles murins de la maladie d’Huntington permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études d'efficacité de nouveaux traitements. Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de l’approche thérapeutique chez l’Homme, nécessite une preuve de concept chez les rongeurs (souris modèle). Ces étapes sont requises par l'agence nationale de Sécurité du medicaments et des produits de santé (l’ANSM) pour toute demande d’autorisation d’étude clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (308) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, et les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires post-mortem seront dans la mesure du possible réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Les différents paramètres (biochimiques, histologiques, etc) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des contraintes expérimentales. De plus, un plan statistique complet a été rédigé et validé. Des résultats préliminaires nous ont également permis d’estimer, la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités.

Raffinement

Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les oreilles de l’animal de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines acquises avec l’expérience de nos études précédentes). Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. Entre 4h et 5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé à 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon hebdomadaire (période de repos d’un jour entre chaque test, favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.

Choix des espèces

Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèles. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la MH permettent de mimer assez fidèlement la pathologie et donc d'être utilisées dans des études d'efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, ces deux modèles présentent des différences pertinentes par rapport aux souris saines et l’une par rapport à l’autre (rapidité d’évolution de la pathologie). Cette étude nous permettra de comparer dans deux modèles de souris de la maladie d’Huntington les modification du profil métabolique suite de l’injection d’un virus adénoassociés exprimant le gène thérapeutique. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques à un âge adulte, 4 semaines ou 2 mois en fonction du modèle c'est à dire avant l'apparition des symptômes afin de maximiser les effets bénéfiques du traitement.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections pour supprimer la protéine Pax6, puis on leur induit une encéphalomyélite proche de la sclérose en plaques, jusqu'à une paralysie des pattes arrière qui déclenche leur mise à mort. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de démontrer le rôle de Pax6 dans un modèle animal et que les données ne peuvent être obtenues autrement. Il attend que la suppression de Pax6 aggrave la maladie et en avance l'apparition.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’implication de la protéine Pax6 dans l’inflammation du système nerveux à l’aide d’un modèle de souris de sclérose en plaques. La protéine Pax6 est essentielle à la formation du cerveau embryonnaire. Nos données récentes non publiées indiquent que cette protéine est importante pour contrôler l’inflammation du système nerveux, ce qui laisse penser que sa régulation puisse aider à traiter certaines maladies neurodégénératrices. La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique inflammatoire du système nerveux central ou la gaine protectrice des neurones est détruite par des cellules immunitaires. Cela conduit à la dégradation des neurones et la perte de communication entre le cerveau et les organes périphériques. Les cellules immunitaires du cerveau qui participent à la réparation de la gaine protectrice, sont défectives chez les patients atteints de SEP. Toutes les données originales que nous venons d'accumuler des expériences réalisées sur des cellules suggèrent que la protéine Pax6 est présente dans ces cellules immunitaires du cerveau et a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Pour la première fois, nous testerons des souris qui présentent une inflammation sévère de type sclérose en plaques en présence ou non de la protéine Pax6.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de comprendre le rôle de la protéine Pax6 dans la régulation de l’inflammation du système nerveux. Elle ouvrira de plus des perspectives concernant toutes les pathologies neuroinflammatoires, de type Alzheimer, Parkinson, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et autres. Les données que nous obtiendrons permettront d'identifier de nouveaux outils pronostics et peut-être thérapeutiques pour ces maladies du système nerveux.

Procédures

- Les souris recevront une injection dans le ventre pendant 4 jours consécutifs d’un produit qui permet de supprimer la protéine Pax6 dans les souris qui ont une modification génétique spécifique pour ceci. Cette injection dure moins de 2 minutes. - Les souris recevront au moins 8 jours plus tard, deux injections en dessous de la peau et dans le ventre d’une combinaison des substances qui produisent le modèle de sclérose en plaques chez l'animal (EAE). Ce traitement consiste à injecter deux produits qui induisent une inflammation du système nerveux. Cette intervention dure moins de 15 minutes sur des souris anesthésiées pour ne pas induire du stress chez la souris. Toutes les souris seront quotidiennement observées pour le niveau de gravité de la pathologie et ceux qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant seront immédiatement sacrifiées et analysées. Les autres seront sacrifiées au bout de 30 jours pour analyse.

Impact sur les animaux

Les souris permettant d’obtenir les souris étudiées après injection du produit, vivent normalement. Il a été démontré que ces souris continuent à vivre normalement après l’injection avec le produit et ne présentent aucune souffrance. Cependant, l’injection du produit pendant 4 jours consécutifs peut être une source de stress pour les animaux. Par la suite, l'induction de la maladie peut entraîner des souffrances aux animaux si la paralysie complète des pattes arrières et partielle des pattes avant est atteinte. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées et analysées. Enfin, nous nous attendons que la suppression de Pax6 après injection du produit dans les souris, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts.

Devenir

Les 120 souris étudiées (souris d’intérêts et souris contrôle) seront euthanasiées à la fin de l’étude, sauf celles qui présentent une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou souffrent de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pattes avant qui seront immédiatement euthanasiées et analysées. Toutes les souris seront euthanasiées. Des études post-mortem seront réalisées sur les cellules immunitaires prélevées à partir de cerveaux de ces souris.

Remplacement

Toutes nos données réalisées dans des cellules montrent clairement, et pour la première fois, que la protéine Pax6 est exprimé par les cellules immunitaires du cerveau. Pax6 est connue comme essentielle au développement normal du cerveau et nos travaux récents démontrent qu'il régule aussi la réponse inflammatoire du cerveau. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte car sa suppression au cours du développement de l'embryon est létale. Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques que nous utilisons chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique du développement de l’inflammation du système nerveux. La suppression de la protéine Pax6 ne peut être fait que chez l'animal et la complexité du cerveau et des interactions entre les nombreux types cellulaires impliqués (neurones, cellules immunitaires) ne peut être reproduit par des cultures en trois dimensions à partir des cellules souches.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. D'après la littérature du domaine, le nombre d’animaux pour le modèle de sclérose en plaques que nous proposons est normalement fixé à 10 par groupe de témoins et d’animaux d’intérêt avec au moins 2 expériences reproductibles. Cependant, compte tenu de la variabilité de l’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 par le produit injecté, nous avons besoin d'augmenter sensiblement le nombre de souris traitées pour obtenir suffisamment de souris à comparer en présence et absence de Pax6. Donc, nous allons utiliser 10 souris par groupe pour 4 expériences indépendantes. Si dans la première expérience, l’efficacité du produit injecté et le développement de la maladie présentent peu de variabilité, nous pourrons réduire le nombre d’expériences. De plus, pour réduire le nombre total de croisement et donc de souris, nous utiliserons aussi bien des femelles que des mâles, le modèle de sclérose en plaques ne montrant pas de différence dans le développement de la maladie due au genre.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des portoirs ventilés, 5 individus par cage. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec 1 bâtonnet en bois, des cotons et du kraft. Avant les injections sous la peau, les souris seront anesthésiées, pour éviter l’induction de stress. Des points limites suffisamment précoces et prédictives ont été définis pour éviter toute douleur, souffrance et angoisse infligée aux animaux. Ces points limites concernent l’apparence, le poids, le comportement et les signes cliniques de chaque animal. D’ailleurs nous avons choisi une dose des substances injectées pour induire la maladie, qui permet un bon développement des symptômes sans induction de douleur et sans perte significatif de poids. A partir du moment où les souris présentent une queue molle et faiblesse des pattes postérieures après l’induction de la maladie, nous veillerons à disposer de la nourriture dans la cage sous forme d’hydrogel (gel rempli d'eau). Cela permettra aux souris de continuer de s’hydrater et s’alimenter sans difficulté. Dans des cas rares des petits ulcères formés sur les sites d’injection, ceux-là seront traités avec une pommade cicatrisante après désinfection. Le suivi quotidien de l'état des souris permettra de réagir immédiatement en cas de souffrance par leur mise à mort dès la détection d’une dégradation importante de leur état (perte de poids importante ou réaction violente ou très faible) ou de paralysie complète des pattes arrière et partielle des pates avant. Ces points limites seront surveillés 1 fois par jour (état général et pesée). Enfin, nous nous attendons à ce que la suppression de Pax6, qui est un facteur anti-inflammatoire, va probablement induire la maladie plus tôt avec des symptômes plus forts. Si notre hypothèse est correcte, nous allons raccourcir la durée de l’expérience.

Choix des espèces

Nous travaillons sur la souris car c’est le meilleur modèle pour réaliser des animaux avec des mutations génétiques et comparer les phénotypes de ces animaux avec les pathologies humaines. Les souris avec des mutations génétiques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques des différentes maladies. L’objectif du projet est d’étudier le développement de l’inflammation du système nerveux en présence ou absence de la protéine Pax6 grâce à un modèle de sclérose en plaques chez la souris. Toutes nos données obtenues dans des expériences réalisées sur des cellules démontrent que la protéine Pax6 est présente dans les cellules immunitaires du cerveau. Cette protéine a un rôle essentiel dans la régulation de l’inflammation dans ces cellules. Afin de confirmer ce lien, il est indispensable de le démontrer dans un modèle animal. Nous utilisons une lignée de souris qui permet de supprimer la protéine Pax6 chez l'adulte, alors que sa suppression à la naissance est létale (développement précoce anormal du cerveau). Par ailleurs, le modèle de sclérose en plaques chez la souris est simple expérimentalement. Il permet de mimer au mieux la sclérose en plaques chez l’homme, une des maladies sévères du système nerveux qui est liée à une inflammation des cellules immunitaires du cerveau. Toutes les souris seront adultes, âgées de 6-8 semaines pour le traitement avec le produit. L’efficacité de la suppression de la protéine Pax6 induite par le produit aura atteint son maximum 8 jours après la dernière injection, donc les souris auront de 7 à 12 semaines au moment d'induire la maladie.

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des femelles gestantes subissent une électroporation in utero de trente minutes, puis des animaux sont anesthésiés et mis à mort par injection intracardiaque d'un fixateur, l'objet du projet étant de comparer des méthodes de mise à mort pour prélever du tissu cérébral. Le porteur indique que l'électroporation peut entraîner jusqu'à 10 % de mortalité fœtale et de rares difficultés de mise bas. Il présente ce travail comme un "raffinement" servant aussi le bien-être des animaux non-humains, tout en le classant en gravité sévère.

Objectifs

Le cortex cérébral est la région du cerveau responsable des fonctions cérébrales les plus élevées comme par exemple la perception sensorielle, le langage, la mémoire, les actions volontaires et la motricité. L’organisation du cortex cérébral repose sur des milliards de cellules appelées neurones, qui forment des connexions appelées synapses. L’étude de la formation du cortex cérébral pendant le développement embryonnaire est essentielle pour comprendre le fonctionnement cérébral dans des conditions normales, mais également pour comprendre pourquoi le cerveau dysfonctionne dans un certain nombre de maladies telles que l’épilepsie ou le retard mental, qui touchent presque 1 enfant sur 100 dans les pays industrialisés. Ce projet entre dans le cadre général d'études du développement du cortex cérébral, et en particulier de la fonction de gènes qui participent à la régulation de la production d’énergie neuronale. Pour atteindre ce but, il est nécessaire de prélever des tissus neuronaux chez des embryons de souris ou chez des souriceaux. Ce projet a pour but de raffiner la méthode par laquelle nous réalisons la mise à mort de souris pour prélever du tissu cérébral au laboratoire. afin d’identifier la méthode qui minimise la souffrance des animaux, tout en garantissant des résultats scientifiques de qualité.

Bénéfices attendus

Ce projet répond à une problématique scientifique et une problématique de bien-être animal. Il permettra d’optimiser les conditions expérimentales pour une expérience utilisée par de nombreux laboratoires en neurosciences, afin de garantir la robustesse et la validité des résultats scientifiques. Par ailleurs ce projet permettra de choisir les conditions expérimentales minimisant les souffrances subies par l’animal, constituant en cela un raffinement de la procédure expérimentale.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Des animaux seront anesthésiés et mis à mort par injection intracardiaque d'un agent de fixation histologique (durée entre 5 et 10 minutes selon la méthode testée).

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale avec réveil, sous anesthésie, une seule fois, d’une durée de 30 minutes. Dans de rares cas, nous pouvons observer une difficulté à la mise bas. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées. L’électroporation peut entraîner une mortalité fœtale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons électroporés). La procédure n’a pas de conséquence sur le développement du souriceau et il est impossible de distinguer après la naissance les souriceaux électroporés de souriceaux non électroporés, en dehors de l’expression de protéines fluorescentes.

Devenir

Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.

Remplacement

L’étude des tissus par microscopie est indispensable pour comprendre l’organisation d’un tissu complexe tel que le cortex cérébral. Puisque ce projet a pour but de raffiner lune méthode réalisée sur l'animal, il est impossible de remplacer ce projet par une méthode alternative n'utilisant pas l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base de notre expérience préalable. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation de la fluorescence au moyen d’une lampe LED au moment de la naissance, ce qui permettra de détecter très tôt un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne pas réaliser de procédure de perfusion intracardiaque inutilement sur un souriceau qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude. Pour ce projet, il nous faudra réaliser au minimum deux chirurgies. Ces deux premières portées seront analysées immédiatement pour déterminer si nous atteignons le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement en réalisant d’autres chirurgies. L’histologie cérébrale sera réalisée en aveugle, et les paramètres mesurés seront comparées par des tests statistiques appropriés. Nous tirerons par conséquent un maximum d’information des animaux inclus dans l’étude.

Raffinement

Ce projet a pour finalité de définir les conditions de mise à mort des animaux pour obtenir un résultat robuste. Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information pour chaque animal. Le transport des souriceaux de la zone d'élevage à la zone d'expérimentation est rapide et sera adapté pour limiter le stress subi par les animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des maladies du neurodéveloppement. Nous avons choisi un modèle de souris car il présente les avantages suivants : - une structure proche du cortex cérébral humain, - un développement embryonnaire rapide (21 jours) et un développement postnatal court (21 jours pour des circuits neuronaux « matures »), - une petite taille adaptée à des préparations histologiques (embryon entier) sur une seule lame. Par ailleurs, la méthode chirurgicale que nous souhaitons raffiner est bien établie chez la souris ce qui nous assure que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines, selon la disponibilité des animaux chez le fournisseur agréé. Les souriceaux seront utilisés au moment du sevrage (21 jours), correspondant à l’âge utilisé classiquement lors de l’essentiel des études de connectivité corticale.