Procédures sévères

9 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le modèle "resident-intruder" repose sur des confrontations où des souris résidentes isolées attaquent des souris intruses, ces dernières subissant les attaques d'individus d'une souche décrite comme "particulièrement agressive", avec en plus des administrations de composés, des privations d'eau et de nourriture et des prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien. Le but est de tester des molécules censées réduire l'agressivité observée dans des maladies comme Alzheimer. Le porteur reconnaît que les effets des produits ne sont pas prévisibles et que des attaques entre congénères sont à prévoir, tout en renvoyant les bénéfices thérapeutiques au "long terme".

Objectifs

L’agressivité est un instinct biologique de l’homme et de l’animal, sous-tendue par l’instinct de survie pour soi-même ou pour ses proches ou encore par l’instinct de reproduction. En ce sens, elle représente une manifestation normale et même nécessaire, car elle représente l’énergie qui permet à l’individu de développer une personnalité capable de s’affirmer et de se défendre par rapport aux autres. Cependant lorsque l'agressivité n'est plus canalisée ou maîtrisée, elle devient pathologique. Elle constitue un symptôme qui apparait dans différentes pathologies cérébrales (comme la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson). Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, les mécanismes associés à la maladie demeurent mal connus. Outre les déficits de mémoire, les patients souffrent notamment d'hyperagressivité ce qui altère fortement leur qualité de vie et celle de leur entourage. A l'heure actuelle, il n'existe pas de solution thérapeutique satisfaisante pour prendre en charge ces déficits associés à la maladie. Dans ce projet, les expérimentations pourront être réalisées sur des souris non transgéniques et/ou transgéniques dont la mutation génétique reproduit la mutation génétique observée chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer et va entrainer comme chez l’homme, des modifications dans le cerveau. Le but de ce projet est de démontrer la capacité de différents produits à réduire l'agressivité territoriale chez la souris.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments capables de traiter l'agressivité apparaissant dans certaines pathologies comme la maladie d'Alzheimer par exemple. En 2019, en France, 1.2 millions de personnes étaient atteintes de la maladie et il est projeté 2.2 millions de personnes atteintes en 2050. Du fait de la cible thérapeutique, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est actif dans un modèle expérimental de la pathologie ciblée ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

Une partie des animaux sera isolée (résident) afin de leur permettre de développer un comportement territorial pendant toute la durée de l'expérience et subira jusqu'à 4 tests (mise en présence avec un animal "intrus"), et l'autre partie des animaux (intruder) sera introduite dans la cage du « résident » et pourra subir des manifestations agressives de la part du résident (au maximum 3 confrontations par animal, sur une durée de 3 à 5 minutes à chaque fois). Les animaux résidents pourront faire aussi le test d'actimétrie où ils seront placés dans une cage sans accès à l'eau et nourriture pendant une durée pouvant aller jusqu'à 120 minutes maximum. Les animaux résidents recevront de 1 à 9 administrations par différentes voies (-2 minutes par administration) avec les composés à tester. Sur ces mêmes animaux, un à deux prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l'expérience sur l'animal vigile (2 min par prélèvement) ainsi qu'un prélèvement de liquide céphalo rachidien et de tissu sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux resident seront isolés pendant toute la durée de l'expérience. Ils recevront une ou plusieurs administrations des composés à tester. Des prélèvements de sang pourront être réalisés sur l'animal vigile. Les souches de souris utilisées étant particulièrement agressives, des attaques entre congénères sont à prévoir. Les effets potentiellement indésirables du/des produits ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Ils font donc l’objet d’échanges avec les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place des traitements de potentiels signes cliniques. Pour les animaux intruder, ils subiront des attaques de la part des animaux resident.

Devenir

Euthanasie des animaux à la fin des expériences étant donné la gravité de la procédure

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le comportement agressif. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Ce nombre (en général n=12 residents/groupe) est calculé pour pouvoir réaliser une analyse statistique robuste sans avoir besoin de répéter les expériences (et donc d'utiliser un nombre d'animaux encore supérieur). L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales la plus pertinente et la plus couramment utilisée pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur l'agressivité car elle présente un comportement de territorialité et a une tendance naturelle à attaquer un intrus qui entre sur son territoire. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

1600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur administre un carcinogène dans l'eau de boisson pendant 5 à 22 semaines, avec des injections intracérébrales et des cathétérisations, ce qui provoque des tumeurs, des douleurs, une perte de poids et des difficultés respiratoires, pour produire des modèles de cancer servant à tester des anticancéreux, y compris pour d'autres laboratoires. Le porteur euthanasie les animaux en fin d'étude, les tumeurs empêchant de les maintenir en bonne santé. Il affirme que ces modèles ne peuvent pas être remplacés par des méthodes in vitro.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé publique majeur et représente la deuxième cause de décès dans le monde. La complexité du microenvironnement tumoral, l'hétérogénéité moléculaire et biologique intra- et inter-tumorale, l'hétérogénéité des réponses immunitaires et métaboliques systémiques et tumorales, et la capacité des cellules souches initiatrices de cancers résistants aux médicaments à repeupler les cancers traités nécessitent des modèles prédictifs afin d’identifier de nouveaux traitements. Les modèles animaux de cancer humain et murin demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouvelles cibles et de nouveaux candidats médicaments et la compréhension des mécanismes de résistance. Ce type de modèle permet d’analyser l’effet de molécules sur le microenvironnement « normal » des tumeurs mais aussi sur la formation de métastases, sachant que les métastases sont la principale cause de mortalité liée au cancer. Dès lors, ces modèles représentent un intérêt prépondérant en recherche translationnelle offrant une analyse plus prédictive de la réponse thérapeutique des substances à tester sur les différents stades de progression de tumeurs. L’objectif est de tester des candidats médicaments dans différents types de cancer (évaluation de leur efficacité et de leur potentielle toxicité).

Bénéfices attendus

Le projet consistera à développer des modèles de tumeur induit par des molécule chimique dites carcinogènes chez le rongeur pour les différentes indications en oncologie. Ces modèles permettront de tester l'efficacité d'anticancéreux. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux pour des procédures de test dans un autre laboratoire dans le cas de collaboration.

Procédures

Les animaux seront traités par un carcinogène dans l’eau de boisson pendant plusieurs semaines (de 5 à 22 semaines). Pour l’administration de substances, les animaux seront contentionnés pendant 2 à 10 minutes avec ou sans anesthésie. En cas d'injection intracérébrale, une ouverture du plan cutané suivi d’une suture (un à trois points) sera réalisée en maximum 30 minutes. De plus, une procédure de cathétérisation de vaisseaux sanguins pourra être effectuée sous anesthésie gazeuse afin de réaliser des infusions de substances en intraveineux, procédure d’une durée de 30 minutes. Les mesures du poids des animaux (1 minute) et du volume des tumeurs (1 minute) seront réalisées jusqu’à 3 fois par semaine. Les administrations de substances pourront être réalisées jusqu’à 4 fois par jour (environ 1 minute par administration). Le cas échéant, l’imagerie sera répétée une à deux fois par semaine et durera 10 minutes incluant l’anesthésie. Les sessions de radiothérapie dureront 30 minutes et seront répétées de 1 à 7 fois par semaines sur une période de 4 semaines maximum imitant ce qui peut être réalisé chez les patients. Un test de la fonction respiratoire pourra, si pertinent, être réalisé en maximum 6 heures. Les tests comportementaux pouvant être proposés seront réalisés sur des périodes de 2 à 30 min en fonction des évaluations, incluant certaines évaluations de la douleur, de la démarche, de la locomotion ou de la force. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés (de l'ordre de 1 à 3 minutes, 6 prélèvement maximum).

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables inhérents au développement tumoral pourront apparaître pendant une étude : - Une perte de poids corporel - Un comportement amorphe marqué pendant les périodes de vigilance - Une hypothermie persistante - Une distension anormale de l’abdomen pouvant être le signe d’un épanchement - Des douleurs - Des problèmes de respiration pour l’animal - Une incapacité de se nourrir ou boire L’ensemble de ces symptômes sera monitoré pendant l’étude afin d’appliquer des mesures pouvant amener à l'euthanasie de l’animal avant la fin de l’étude pour raison éthique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs cela ne permet pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Ces modèles ne peuvent pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et d'asepsie pour réduire les risques d'échec à la chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à posteriori la catégorie si nécessaire.

Choix des espèces

Les rongeurs rats et souris demeurent essentiels pour étudier les tumeurs in vivo et comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. En effet, les tumeurs présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale, une prolifération et des métastases des cellules. Il n’est pas possible de reproduire ces éléments in vitro car requiert un système complexe comme les modèles animaux. Dans la majeure partie des études, les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines de développement que ce soient des rats ou des souris. En effet, il n'est pas pertinent de tester des animaux plus jeunes du fait de la très faible incidence de ce type de cancers chez l'enfant.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de staphylocoque doré dans la veine de la queue trois jours de suite et peuvent développer les signes d'une infection du sang, fièvre, faiblesse et déshydratation, avant leur mise à mort pour prélever sang et tissus, afin d'étudier la réponse des bactéries au cours d'une bactériémie. Les retombées thérapeutiques restent une simple perspective. Le porteur affirme qu'un modèle in vitro ne peut pas reproduire la complexité d'un animal.

Objectifs

Nos travaux portent sur l'étude de la réponse cellulaire chez l'hôte lors d'une infection du sang (bactériémie) au Staphylocoque doré.

Bénéfices attendus

Mettre en lumière les gènes bactériens clés dans le mécanisme d'infection cellulaire de l'hôte. Les protéines traduites de ces gènes pourront ensuite faire l'objet d'une étude thérapeutique pour tenter de mieux lutter contre les infections au Staphylocoque doré

Procédures

Injections de bactéries dans la veine caudale de l'animal 1 fois par jour pendant 3 jours. Il y aura donc 3 injections d'environ 15 secondes par animal répartis sur trois jours.

Impact sur les animaux

Possible douleurs lors de l'injection dans la veine caudale. Les animaux infectés pourront développer les symptômes d'une bactériémie (fièvre, faiblesses, risque de déshydratation). Les points limites ont été définis, classe sévère.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement de sang et de tissus.

Remplacement

Nous sommes limités par notre modèle simple in-vitro. Ce modèle était composé d'une lignée cellulaire cancéreuse. Il nous a permis de générer des données préliminaires mais apportent beaucoup de biais (lignée cancéreuse, un seul type cellulaire...). La complexité d'un modèle animal est nécessaire pour confirmer nos résultats préliminaires. Il est impossible d'envisager de travailler sur un modèle in-vitro reproduisant la complexité d'un animal. Aucune étude clinique sur l'Homme ne sera possible dans le cadre d'une induction d'un sepsis bactérien. L'intérêt du modèle animal sera de confirmer nos résultats in-vitro, à savoir que les mutants T7, psm et T7/psm ont une capacité réduite à engendrer une bactériémie à l'échelle d'un organisme. La souris est le modèle le plus adapté car il existe un nombre important de travaux en infectiologie/bactériologie sur ce modèle. La petite taille de l'animal et son coût permettent de rendre cette étude viable.

Réduction

Nous n'aurons pas besoin d'effectuer des génotypages et des sélections de génotypes puisque nous travaillerons sur des souris de lignées consanguines élevées dans des centres agrées (dites "sauvages"). Afin de minimiser le nombre d'individus nécessaires, un test statistique ANOVA a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire pour une puissance statistique significative.

Raffinement

Toutes les expérimentations sont réalisées dans une animalerie certifiée. Les souris seront manipulées une fois par jour pour être habituées à la présence et à l'odeur de l'expérimentateur avant le début des injections. Une perte de poids supérieure à 15% entrainera la mise à mort de l'animal par sédation sous isofluorane puis dislocation cervicale. Chaque individu sera pesé tous les jours durant la procédure pour surveiller la courbe de poids de chaque animal et limiter leurs souffrances en cas de perte excessive. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés si besoin (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes harmonieux (minimum de 2); dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum".

Choix des espèces

La souris est à l'heure actuelle l'animal le mieux adapté pour la modélisation de bactériémie (infection du sang) à Staphylocoques. Il se trouve que cet animal peut-être naturellement colonisé par le Staphylocoque doré. L'expériementation sur des animaux de petites tailles permet d'apporter des élements dans un contexte physipathologique impossible à atteindre in-vtro ou en clinique humaine. Les animaux seront utilisés dès l'âge de 1 mois. Ce stade de développement est optimal car l'animal aura atteint sa maturité immunologique.

230 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur induit une cirrhose par ligature chirurgicale du canal biliaire ou par injection d'un toxique hépatique, puis une infection bactérienne provoquée par injection de bactéries ou perforation de l'intestin, ce qui entraîne jaunisse et souffrances pouvant durer plusieurs semaines, pour tester un stimulant du système immunitaire. Le porteur indique arrêter l'étude au bout de neuf jours d'infection pour éviter le prolongement des souffrances. Il affirme que ce modèle animal est "incontournable" pour déterminer les doses avant des essais cliniques.

Objectifs

La cirrhose est une maladie du foie d’origine diverse (abus d’alcool, virus, obésité) qui entraine une défaillance du système de défense immunitaire, notamment des neutrophiles. Ces cellules représentent la plus grande famille des globules blancs du sang chez l’homme (50-60%) et jouent un rôle majeur dans l'élimination des bactéries. La défaillance des neutrophiles s’aggrave durant l’évolution de la maladie, ce qui augmente le risque d’infection bactérienne et de mortalité des patients, malgré le traitement de ces derniers par des médicaments antibiotiques. Ces médicaments sont généralement efficaces pour détruire la plupart des bactéries mais pas les bactéries « résistantes ». De plus, ils s’accumulent notamment dans les neutrophiles et inhibent leurs activités anti-bactériennes. Notre projet vise à corriger les défaillances d’activités antibactériennes des neutrophiles acquises au cours de la cirrhose, ce qui constitue une stratégie anti-infectieuse innovante. Elle est basée sur l’utilisation des molécules chimiques qui stimulent fortement les globules blancs. Des travaux invitro ont montré que ces molécules rétablissent efficacement l’activité anti-bactérienne des neutrophiles provenant de patients hospitalisés pour une cirrhose alcoolique sévère. De travaux préliminaires invivo chez des rats, confirment l’efficacité de ces molécules pour réduire l’infection bactérienne au cours de la cirrhose. Ce projet a pour objectif principal d’optimiser les conditions de traitement de l’infection bactérienne par ces molécules chimiques en recherchant notamment les doses thérapeutiques minimales. Les résultats attendus sont nécessaires pour mettre en place les premiers essais cliniques chez les patients ayant une cirrhose sévère, particulièrement ceux en attente de greffe de foie. Ils ouvrent également des perspectives originales en vue du traitement des infections par des bactéries résistantes aux antibiotiques. Ce projet utilisera un nombre réduit d’animaux (230 rats) sur une période de 4 ans, en respectant les principes fondamentaux de l’expérimentation animale. Les rats seront hébergés à raison de 2 animaux par cage avec un accès illimité à la nourriture et l’eau, dans un environnement enrichi pour apporter un confort maximal. Les opérations chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale avec un traitement analgésique pour prévenir les douleurs post-opératoires.

Bénéfices attendus

Les résultats préliminaires obtenus chez des rats ayant une cirrhose ont montré que les molécules chimiques qui stimulent fortement le système immunitaire permettent de réduire fortement le taux de mortalité des animaux infectés tout en corrigeant la défaillance de l’activité antibactérienne des neutrophiles acquises au cours de la cirrhose. Ce projet permettra de connaitre l’ensemble des doses thérapeutiques de ces agents stimulants, particulièrement les doses minimales. Ceci permettra d’initier sereinement les essais pré-cliniques chez les patients hospitalisés, de renforcer ainsi leur système immunitaire et de traiter les infections bactériennes en absence d’antibiotiques, y compris avec les bactéries « résistantes » aux antibiotiques. Ces effets bénéfiques devraient permettre de freiner l’évolution de la cirrhose vers ses formes plus sévères qui conduisent à des défaillances d’organes et au cancer. Il permettra ainsi d’améliorer l’état de santé des milliers de patients en attente de greffe de foie.

Procédures

Les animaux subissent une première étape d’induction de la cirrhose effectuée au jour zéro ( J0) par une opération chirurgicale consistant à sectionner le canal biliaire, après ouverture de l’abdomen. Cette étape est réalisée sous anesthésie générale et dure environ 15 minutes. Une deuxième méthode d’induction de la cirrhose, sans opération chirurgicale, est prévue; l'injection dans l’abdomen d’une substance chimique toxique pour le foie (2 injections par semaine jusqu’à J20). D'autres groupes d'animaux cirrhotiques subissent une infection déclenchée à J20 soit par injection dans l’abdomen de bactéries vivantes, soit par perforation de la partie initiale du gros intestin (caecum) après ouverture de la cavité abdominale. Cette opération est effectuée sous anesthésie et dure environ 15 minutes. Une partie des animaux infectés sont traités par injection de substances chimiques destinées à stimuler le système immunitaire. Des prélèvements de petits volumes de sang (100-250µl) sont effectués sur animaux à J0, puis à J15 et J20 pour les sous-groupes d'animaux non infectés. Pour les sous-groupes d’animaux infectés, 3 prélèvements sont effectués à J20, J21 et J22. Chaque animal subit ainsi au maximum 3 prélèvements effectués à différents endroits; à l'extrémité de la queue (par coupure) et à l’aide d’une micro-seringue au niveau de veine de la patte et de la queue. Ces prélèvements servent à vérifier différentes modifications pathologiques induites au cours de la cirrhose comme l’augmentation de la quantité de globules blancs dans le sang, les défaillances d’activités anti-bactériennes des globules blancs mesurées notamment par la production de agents antibactériens, et le taux de protéines directement impliquées dans la destruction des bactéries.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables sont attendus dès le début de l’étape d’induction de la cirrhose « BDL » à J0 car elle nécessite l'ouverture de l’abdomen puis la ligature et coupure du canal biliaire. Cette opération génère des douleurs et un risque d’infection bactérienne. Les animaux perdent un peu de poids (

Devenir

Les infections bactériennes aigües induites sont susceptibles de générer des souffrances pendant plusieurs semaines. Pour éviter le prolongement des souffrances, l’étude sera arrêtée au bout de 9 jours d’infection des animaux, ce qui est suffisant pour atteindre l’objectif de l’étude et tous les animaux infectés seront euthanasiés

Remplacement

La capacité des stimulants du système immunitaire à corriger les défaillances des neutrophiles a déja été montrée dans des expériences «in vitro » avec des cellules provenant de patients ayant une cirrhose. A ce stade du projet, le modèle de cirrhose chez l’animal vivant est nécessaire car il reproduit les réponses inflammatoires pathologiques complexes conduisant à la perte des fonctions anti-infectieuses des globules blancs, comme celles observées au cours de la cirrhose humaine. Ce modèle animal est donc incontournable pour la détermination précise de la gamme des doses thérapeutiques du candidat-médicament en vue de futurs essais cliniques chez les patients hospitalisés, et patients en attente de greffe de foie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en préservant les minima nécessaires pour les analyses statistiques des résultats entre les différents sous-groupes d'animaux, et en tenant compte du taux de mortalité élevé, particulièrement dans les deux modèles d’infection bactérienne aigüe (injection de bactéries purifiées dans l’abdomen, et perforation du caecum).

Raffinement

Tout au long de l’expérimentation, les procédures seront appliquées dans un souci permanent de préserver le bien-être animal et réduisant au maximum le stress, douleurs et souffrances occasionnés. Les opérations chirurgicales sont effectuées sous anesthésie générale. Un traitement anti-douleur sera appliqué juste avant l’opération chirurgicale pour l’induction de la cirrhose à J0 et pendant les 3 jours suivants. Les animaux seront remis dans leur cage sous lampe chauffante jusqu’au réveil (2 animaux par cage) et surveillés minutieusement tous les jours pendant la première semaine puis tous les 2 jours. Dès le déclenchement de l’infection bactérienne à J21, des traitements non médicamenteux seront appliqués. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour et des aliments humidifiés et un biberon d’eau seront déposés à l’intérieur de la cage à proximité des animaux afin qu’ils puissent s’alimenter sans faire d’effort. Au besoin, les rats seront réhydratés et alimentés manuellement à l'aide d'une sonde de gavage en vue de minimiser la perte de poids post-infection ou chirurgicale. Des mesures de poids des animaux et de température seront effectuées en vue d’examiner des signes de souffrance, et signes cliniques plus précoces que l’état moribond et prédictifs de la mortalité. En cas de signes de souffrance intense, les animaux seront euthanasiés. Enfin, tous les animaux infectés survivants après une courte période d’infection (9 jours) seront euthanasiés afin de ne pas prolonger d’éventuelles souffrances susceptibles de persister pendant plusieurs semaines.

Choix des espèces

Le modèle de cirrhose chez le rat est bien établi depuis une trentaine d’années pour la méthode par ligature/section du canal biliaire et pour l'induction avec les agants chimiques toxiques pour le foie. Les dégâts induits au niveau du foie (lésions) sont proches de ceux de la cirrhose humaine. Chez la souris en revanche, les lésions du foie induites sont plus proches de la fibrose (état pathologique du foie qui précède l’état cirrhotique), ce qui justifie le choix du rat. Les rats sont âgés de 4 à 6 semaines et considérés comme adultes, et la maturité de leurs systèmes de défense immunitaire est confirmée dans de nombreux nombreux travaux publiés.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules de myélome sous la peau et portent une tumeur qu'on laisse croître jusqu'à un centimètre cube, ce qui peut provoquer perte de poids, posture anormale et lésions cutanées, pour étudier le rôle de la protéine USP39 dans ce cancer de la moelle osseuse. Le porteur renvoie au conditionnel un éventuel nouveau traitement. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe et que seul le modèle animal permet d'étudier les relations entre système immunitaire et tumeur.

Objectifs

Le myélome est le 2ème cancer le plus courant de la moelle osseuse. La prise en charge de ce cancer a considérablement progressé au cours de la dernière décennie avec l'approbation de nouveaux médicaments. Les combinaisons de ces traitements ont encore prolongé la survie des patients atteints de myélome jusqu'à 8 ans voire d’avantage. Les déubiquitinases sont des protéines qui assurent des fonctions vitales dans la cellule. Cependant, dans le myélome, les fonctions de ces protéines ont été détournées afin permettre aux cellules cancéreuses d’échapper aux traitements en vigueur. Nous avons récemment montré qu’au sein de cette famille de protéines, USP39 représente l’une des actrices majeure dans le myélome. Dans ce cancer, nous avons démontré que son détournement donne à la cellule cancéreuse un important avantage en terme d’agressivité et de résistance aux traitements en vigueur. Nos résultats suggèrent ainsi que cette protéine représenterait une cible thérapeutique pertinente et que son ciblage représenterait le tendon d’Achille de ces cellules cancéreuses de myélome. L'objectif de ce projet a pour but de compléter notre étude qui est jusqu'a présent basée sur des expériences réalisées "in vitro". Pour cela, nous réaliserons des expériences de xénogreffe chez la souris nude afin de confirmer que cette protéine USP39 confère un avantage "in vivo" aux cellules humaines de myélome.

Bénéfices attendus

Le projet original que nous proposons est de déterminer si des membres d’une famille de protéines Déubiquitinases représentent de nouvelles cibles thérapeutique dans le contexte de la prise en charge des patients souffrants de myélome. Cette étape est nécessaire pour l’introduction de nouveaux médicaments en clinique et pourrait éventuellement aboutir à un nouveau traitement dans le contexte des cancers et plus particulièrement dans le myélome. La mission fondamentale de ce projet est d’améliorer la survie des patients et de répondre à leurs besoins non satisfaits.

Procédures

1/ 60 souris seront Injectées par les véhicules ou différentes cellules tumorales en sous-cutanée au début des procédures (environ 10 sec). 2/Une fois les tumeurs préformées, nous attendrons que la taille de la tumeur atteigne 1cm3. L’atteinte de ce point limite (quel que soit le groupe expérimental concerné) dictera la fin de l’expérimentation. La durée totale de l’expérimentation est évaluée entre 8 et 12 semaines.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur en sous-cutanée peut être à l'origine de multiples manifestations chez l'animal qui pourront, si l'un des points limite est atteint, conduire à la fin de l’expérimentation. En résumé, les effets indésirables prévus sur les animaux sont : perte de poids corporel ; posture anormale ; déplacement anormal, présence de taches sur la peau ; évolution de l’aspect et de la taille de la tumeur.

Devenir

Les animaux seront mis à morts pour effectuer des prélèvements lorsque la tumeur atteint 1 cm3 . Les souris ayant été injectées avec des cellules tumorales, elles ne pourront pas etre réutilisées, remplacées ou adoptées.

Remplacement

L'objectif de ce projet a pour but de compléter notre étude qui est jusqu'a présent basée sur des expériences réalisées "in vitro". Seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration entre les différents compartiments cellulaires, en particulier les relations complexes entre le système immunitaire et les tumeurs. Aucune méthode de remplacement n'existe à ce jour.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous nous baserons sur les données de la littérature et sur nos résultats antérieurs pour la prise de tumeur de nos 3 lignées humaine de myélome. Le nombre maximum de souris est établi à 10 par groupe, pour être statistiquement significatif.

Raffinement

Les expérimentateurs procéderont à une évaluation 3 fois par semaine de l'état général des souris pour déterminer la présence de signes de stress ou de souffrance (attitude soumise, dos vouté, respiration difficile, extrémités pales, démarche anormale, diarrhée).. Suite à l'injection des cellules tumorales, ils seront surveillés quotidiennement grâce à une grille de score et à des points limites adaptés. L'administration d’eau gélifiée et de nourriture directement dans la cage est prévue en cas de signe d'inconfort. Le site d'injection sera surveillé pour parer à ou traiter toute infection et la perte de poids éventuelle sera particulièrement surveillée.

Choix des espèces

Les souris "NMRI-_Foxn1nu /Foxn1nu" appelées " nude", sont des souris qui sont immunodéfiscientes qui permettent l'njection de cellules humaines sans rejet. Elles constituent ainsi le meilleur modele d'étude de xénogrefffe des cellules cancéreuses. Nous utiliserons ici des animaux agés de 6 à 8 semaines. Une fois les groupes expérimentaux réalisés, les animaux seront acclimatés durant une semaine avant de réaliser les injections sous-cutanées des cellules tumorales, ce qui implique de débuter les expériences sur des animaux agés de 7 à 9 semaines (utilisation de souris jeunes mais ayant déjà atteints leur maturité sexuelle et ayant une courbe de poids stable).

9 chiens atteints d'une myopathie de Duchenne vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent 38 prélèvements sanguins, trois biopsies musculaires, des IRM et un protocole de lymphodéplétion par cyclophosphamide qui affaiblit leurs défenses immunitaires, pour caler une étape préparatoire à un futur essai de cellules CAR-T contre la fibrose. Le porteur indique que les chiens seront mis à mort en fin de projet pour prélever de nombreux tissus, des points limites déclenchant leur mise à mort en cas de dégradation. Il affirme qu'il apparaît "incontournable" de mener cette étude dans un "organisme entier".

Objectifs

En cancérologie, l'une des approches thérapeutiques actuellement utilisées est basée sur l'utilisation de cellules CAR-T (lymphocytes T(=sous-population de globule blanc) avec récepteur antigénique chimérique, c'est-à-dire composé artificiellement de plusieurs parties d'origine différente). Les globules blancs du patient sont isolés par cytaphérèse (procédure s'apparentant à celle utilisée lors de dons de plaquettes par exemple), puis modifiés en culture pour cibler un marqueur spécifique de la tumeur à traiter. L'idée d'appliquer cette méthode à d'autres contextes pathologiques dans lesquels un marqueur spécifique d'une cible à détruire est exprimé, a émergé. En particulier, un marqueur spécifique de la fibrose a récemment été identifié et des cellules CAR-T pourraient être utilisées pour attaquer la fibrose qui est présente dans de nombreux contextes pathologiques. Une maladie dans laquelle une fibrose s'installe et entraîne une perte de fonction majeure est la myopathie de Duchenne. Chez le chien modèle de cette maladie, une fibrose s'installe dans les muscles et le coeur, comme chez les patients humains, et il a été démontré que le marqueur de la fibrose est bien présent dans ces tissus. Les nombreuses études portant sur l'utilisation de cellules CAR-T en cancérologie ont clairement démontré que leur efficacité n'est permise que dans un contexte où le patient a reçu un traitement préparatoire visant à réduire sa quantité de globules blancs circulants (lymphodéplétion). Avant de tester l'efficacité des CAR-T anti-fibrose chez des chiens malades, il apparaît nécessaire de mettre au point un protocole de lymphodéplétion à la fois efficace et bien toléré chez ces animaux. Par ailleurs, l’effet de ce traitement sur le phénotype des chiens devra être précisément déterminé afin de pouvoir conclure de manière robuste sur les résultats de l’essai pré-clinique qui suivra. Ce projet a donc pour objectif de tester des protocoles existants chez le chien, mais développés pour des chiens adultes atteints de cancers, afin de vérifier leur tolérance et leur efficacité chez de jeunes chiens atteints de myopathie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir un protocole de lymphodéplétion adapté et bien toléré, permettant d'établir les conditions optimales pour garantir l'efficacité des cellules CAR-T qui seront testées dans le futur. Par ailleurs, les données recueillies sur les chiens utilisés dans ce projet permettront de disposer de données de référence (fonction musculaire, imagerie, histologie) de chiens malades de cette tranche d'âge ayant subi une lymphodéplétion. Ces données pourront ensuite être utilisées comme point de comparaison pour les futurs chiens recevant ce même protocole de lymphodéplétion, et des cellules CAR-T.

Procédures

Des prises de sang seront effectuées aux âges de 2, 4 et 5 mois, puis de manière plus rapprochée autour du protocole de lymphodéplétion, afin de suivre au plus près la formule sanguine des chiens. Puis, des prises de sang seront effectuées lorsque les chiens auront reçu une injection de leurs propres globules blancs prélevés avant le protocole de lymphodéplétion. Au total, 38 prélèvements sanguins sont prévus sur les chiens, dont 28 sur chiens vigiles (temps estimé 5 minutes y compris préparation et compression pour éviter la formation d'un hématome), et 10 à un cathéter au cours d'une anesthésie générale (temps estimé moins d'une minute). Quatre prélèvements urinaires sont également prévus (prélèvement directement dans la vessie, sous anesthésie générale, durée 1 minute). Des biopsies musculaires seront prélevées chirurgicalement, à 3 reprises (temps d'intervention 30 minutes environ). Leur volume n'excédera pas 0.5 cm de diamètre x 1 cm de longueur. En outre, les chiens subiront également, sous anesthésie générale : trois examens IRM (durée 2h30), quatre mesures de force (durée 45 minutes). Vigiles, les chiens subiront des examens cliniques et neuf tests de marche (10 minutes), de fonction respiratoire (10 minutes) et d'enregistrement de l'ECG en holter (24 heures, équipement sans fil porté par le chien).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les chiens au cours de ce projet sont de deux ordres : - Celles liées à la maladie qui touche ces animaux : troubles locomoteurs, faiblesse des muscles respiratoires et de la déglutition. Les signes cliniques seront étroitement surveillés, et les animaux seront mis à mort en cas d'atteinte d'un point limite. - Celles liées au protocole de pré-conditionnement. Celui-ci peut induire une fatigue, et une sensibilité accrue aux infections. Durant la période au cours de laquelle la quantité de leurs globules blancs sera diminuée, les chiens traités seront hébergés par deux dans une salle qui permettra de prendre des précautions supplémentaires par rapport à celles prises habituellement pour des animaux immunocompétents. Par ailleurs une antibioprophylaxie sera mise en place. Des points limites adaptés permettront de décider de mettre à mort les chiens en cas de dégradation trop importante de l'état général suite à ce protocole. Au bout de quelques jours, la formule sanguine devrait se normaliser progressivement. Par ailleurs, le cyclophosphamide, qui est la molécule qui sera utilisée pour induire cette lymphodéplétion, a des effets secondaires décrits chez le chien. En particulier, il peut entraîner des cystites hémorragiques. Une vigilance particulière sera apportée à ce point et une analgésie et un traitement diurétique seront mis en place le cas échéant.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin du projet, par nécessité de prélever de nombreux tissus

Remplacement

Afin de déterminer un protocole optimal de lymphodéplétion chez les chiens atteints par la myopathie de Duchenne, il n'apparaît pas envisageable de le valider autrement que chez ces animaux. Par ailleurs, ce projet est une phase préparatoire d'un essai thérapeutique d'une stratégie ayant recours à une injection systémique de cellules du système immunitaire modifiées pour se diriger contre un marqueur de la fibrose et aller détruire les cellules responsables de cette fibrose dans les muscles, il apparaît donc incontournable de réaliser cette étude dans un organisme entier. Des tests réalisés in vitro ont confirmé que les globules blancs modifiés pour devenir des "CAR-T" se dirigent bien contre d'autres cellules si elles expriment le marqueur de fibrose. Reste à déterminer si, dans le contexte d'un organisme entier, le comportement de ces cellules est le même et si ces cellules arrivent bien à atteindre les zones de fibrose et les détruire.

Réduction

Un effectif de 9 chiens est prévu pour ce projet. Il s'agit d'un maximum qui pourra ne pas être atteint. En effet, nous ne prévoyons d'utiliser 5 chiens que dans la procédure pour laquelle les deux premiers chiens traités auront à la fois une baisse de leurs globules blancs détectable suite au traitement et une bonne tolérance à celui-ci (pas d'atteinte d'un point limite). La ou les procédures suivantes ne seront alors pas mises en oeuvre. L'effectif de 5 chiens est basé sur l'effectif envisagé dans la suite de l'étude. En effet nous prévoyons d'utiliser, lors de la phase thérapeutique, 5 chiens traités par les cellules CAR-T anti-fibrose, qui seront nécessaires et suffisants pour démontrer une réduction de la fibrose dans les muscles au niveau de celle mesurée chez des chiens malades traités de manière chronique par un corticoïde.

Raffinement

Les chiens seront évalués à l'aide de nombreuses mesures non invasives développées, pour la plupart d'entre elles, à partir de méthodes utilisées chez les patients et adaptées aux chiens. Les chiens seront hébergés en petits groupes d'âges proches et de tempéraments compatibles, avec accès à un lieu de couchage, des plateformes et des jeux variés. Ils seront sortis quotidiennement en groupes plus larges dans des espaces extérieurs. Cependant, durant les quelques jours entourant le protocole de lymphodéplétion, les sorties devront être interrompues. Du temps supplémentaire sera passé par les soigneurs avec les chiens afin de remplacer cette activité habituelle par du jeu ou des caresses. Des moments d'intéractions avec l'homme seront ménagés quotidiennement (temps de jeux, caresses). Ils bénéficieront d'un suivi vétérinaire quotidien afin de suivre au plus près les éventuelles complications liées à leur maladie. Des points limites précis, adaptés à cette maladie et suffisamment précoces pour leur éviter toute souffrance prolongée et inutile ont par ailleurs été définis. Dans le cadre du projet, les gestes potentiellement stressants seront réalisés sous anesthésie générale, et une analgésie sera mise en place pour tout geste potentiellement douloureux. Par ailleurs, des points limites adaptés aux effets secondaires possibles et connus chez le chien du protocole de pré-conditionnement ont été déterminés, et permettront, suivant le cas considéré, de soulager la souffrance des animaux le plus précocement possible par des traitements adaptés, ou de les mettre à mort sans délai.

Choix des espèces

L'étape préclinique de validation de l'efficacité du produit thérapeutique en développement est prévue chez le chien. En effet, il s'agit du modèle animal qui reproduit le mieux le maladie humaine notamment sur le plan de la fibrose, de l'expression de la protéine ciblée par la thérapie développée, et sur lequel les mêmes procédures que celles mise en oeuvre chez l'Homme pour le traitement par des cellules CAR-T pourront être appliquées (notamment, injections de cellules provenant de l'individu à traiter). Le présent projet ayant pour but de préparer cette étude d'efficacité, il est donc indispensable d'avoir recours à des chiens dans la même situation clinique et physiologique que ceux qui seront traités par les cellules CAR-T par la suite. Dans le cadre de ce projet, les chiens seront suivis de l'âge de 2 mois à l'âge de 6.5 mois, et le protocole de lymphodéplétion sera appliqué sur des chiens âgés de 5.5 mois. Il s'agit de la tranche d'âge décidée pour la future étude thérapeutique avec les cellules CAR-T. Celle-ci est basée sur le fait que la protéine cible est fortement exprimée à cet âge là chez les chiens malades, et au fait qu'à cet âge là, les chiens ont atteint une taille compatible avec les procédures mises en oeuvre (prélèvement de globules blancs par cytaphérèse notamment).

315 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une surdité leur est provoquée par traumatisme acoustique, par injection d'un antibiotique ototoxique, ou par chirurgie de pose d'un implant cochléaire. Le porteur reconnaît que l'implant provoque un vertige et des douleurs pendant environ 48 heures et que l'antibiotique peut altérer la fonction rénale. Il indique qu'il n'est pas possible d'étudier les tissus de l'oreille interne sans tuer l'animal.

Objectifs

Les expositions aux agents ototoxiques (bruit, cisplatine, aminosides) sont responsables de surdités. Un certain nombre de ces surdités continuent à évoluer après l’arrêt de l’exposition à l’agent ototoxique sans explication scientifique à cela. Par ailleurs, il a été montré que ces agents ototoxiques provoquaient l’afflux et un changement de fonction dans l’oreille interne de cellules immunitaires. Nous émettons l'hypothèse que le cette surdité progressive peut être due à une modification de cellules immunitaires appelées macrophages causant des dommages à l'oreille interne. Par conséquent, l'objectif principal est de déterminer quel est le rôle de chacun des macrophages dans l'évolution de la surdité induite par des agent ototoxiques.

Bénéfices attendus

Ce projet est le premier à aborder la question de la perte auditive progressive suite à une lésion aiguë de l'oreille interne. Suite à ce projet, des traitements contre la réaction inflammatoire, ou des régulateurs de l'activité des macrophages pourront être évalués dans les mêmes modèles animaux en vue d’une application chez l'homme en cas de succès. De plus, les marqueurs sanguins identifiés au cours de ce projet pourront être recherchés chez l’homme pour valider nos hypothèses. La détection précoce des personnes à risque de développer ces surdités grâce à ces marqueurs nous aidera à proposer des stratégies thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux auront 3 types de protocole de déclenchement de surdité: le traumatisme acoustique (100 animaux, réalisé chez un animal vigil), l'injection d'antibiotiques gentamycine (100 animaux, réalisé chez un animal vigil), et une chirurgie de mise en place d'un implant cochléaire (100 animaux, réalisé chez un animal sous anesthésie générale). Parmi ces animaux, 180 bénéficieront d'une évaluation de la fonction auditive (potentiel évoqués auditifs) sous anesthésie générale. Les animaux restant (120 animaux sourds et 15 contrôles) serviront à étudier l'expression de gènes dans l'oreille interne ou à mettre à point les différents protocoles. La durée de chaque procédure est la suivante : le traumatisme acoustique (15 minutes d'anesthésie puis 60 minutes d'exposition au bruit soit 90 minutes), l'injection d'antibiotiques gentamycine (10 secondes), et une chirurgie de mise en place d'un implant cochléaire (15 minutes d'anesthésie puis 45 minutes de chirurgie soit 60 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles concernant cette étude concernent les méthodes de déclenchement des surdités ainsi que les prélèvements sanguins. Le traumatisme acoustique peut être générateur d’un stress modéré pour l’animal. L’injection des aminosides (gentamycine) peut en cas de surdosage provoquer une altération aigue de la fonction rénale. Enfin l’implantation cochléaire provoque habituellement un vertige et des douleurs modérées pendant 48h au décours duquel l’animal reprend des activités normales.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. En effet, il n'est pas possible d'étudier les tissus cochléaires (oreille interne) d'un animal sans procéder à son euthanasie. Leurs tissus cochléaires et leur sang sera utilisé pour analyse à des fins scientifiques.

Remplacement

Il n'est pas possible à ce jour d'étudier in vitro ou in silico l'effet sur la fonction auditive d'un mammifère d'un dommage cochléaire, qui plus est modulé par le système immunitaire de l'animal. Il n'existe pas de modèle de remplacement pour mener à bien cette étude. Néanmoins, tous les efforts ont été portés sur les points concernant la réduction et le raffinement pour limiter l'usage d'animaux vivants.

Réduction

Afin de limiter au maximum le recours aux animaux vivants, des analyses statistiques ont été réalisées pour calculer le nombre nécessaire et suffisant d’animaux sur la base des résultats obtenus dans des expérimentations antérieures.

Raffinement

Toutes les méthodes utilisées pour provoquer la surdité ont déjà été validées dans le laboratoire et ne nécessiteront pas d'animaux pour la mise au point. Les point suivants: perte majeure d'activité locomotrice, d'amaigrissement de plus de 10% du poids, d'ascite, d'infections sévères, ou de signes évidents de douleurs (prostration, automutilation), seront évalués. En cas d'apparition de ces effets indésirables, les animaux seront euthanasiés et le protocole sera réévalué Chaque item sera côté de 0 (absence)) à 1 (présence), et la somme de chaque item sera effectuée (de 0 à 5). Si le score est supérieur à 3 pour au moins 2 animaux, le protocole sera réévalué.

Choix des espèces

La souris est le modèle de mammifère le mieux maitrisé et le plus couramment utilisé pour des expériences de transgénèse. Son utilisation pour valider des hypothèses physiopathologiques sur le mécanisme des surdités est la référence, notamment du fait de pouvoir utiliser des explorations de l'audition similaires à celles de l'homme (potentiel évoqués auditifs). De même, les données actuelles concernant le système immunitaire de la souris nous laissent penser que les données obtenues concernant l'interaction entre système immunitaire et auditif dans nos modèles seront transposables à l'homme. Les animaux de ce projet seront des souris adultes mâles et femelles (entre 2 et 4 mois). Le stade de développement des souris correspond à l'équivalent de la durée de vie chez l'homme auquel ces types de lésions de l'oreille interne peuvent survenir.

2 394 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent du busulfan puis une greffe de cellules immunitaires humaines, avec prélèvements sanguins répétés et imagerie par bioluminescence. Le porteur décrit une possible réaction du greffon contre l'hôte, avec perte de poids importante, poils hérissés et prostration. Il affirme que la complexité de l'effet des cellules NK ne peut être reproduite in vitro et que seules les souris NOG acceptent les greffes humaines.

Objectifs

Les objectifs du projet sont : 1) Mise au point d’un modèle de souris permettant la prise de greffe des cellules NK et des cellules T régulatrices du système immunitaire 2) Validation d’un modèle récapitulant la lyse de cellules T régulatrices génétiquement modifiées par les cellules NK. 3) test des inhibiteurs de la lyse des cellules T régulatrices génétiquement modifiées par les cellules NK. 3) Etude de la persistance des CAR-Tregs en présence de l’inhibiteur de l’activité cytolytique des cellules NK.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont 1) l'identification d'un inhibiteur permettant de protéger notre produit thérapeutique contre la lyse des cellules NK et ainsi de garantir leur efficacité chez le patient 2) obtenir des données précliniques de sécurité de l'inhibiteur identifié avant tout test chez l'humain dans des maladies autoimmunes comme la sclérose en plaque ou la maladie de Crohn.

Procédures

24h avant l'injection des cellules NK, une injection de busulfan sera réalisée. L'injection du busulfan et des cellules prend environ 1 minute par souris, une seule injection par animal. Selon notre expérience, la dose de busulfan que nous utilisons n'est pas toxique pour la souris. Après 8 à 9 semaines, une deuxième injection de cellules humaines sera réalisée (1 min par souris), Nous prélèverons 100 uL de sang tous les 14 jours à partir de J14 (jusqu'à J56 maximum) ou J21 (jusqu'à J63 maximum) après injection des cellules humaines en fonction des résultats obtenus lors de la procédure de mise au point du modèle puis un prélèvement terminal de plus de 100uL soit au total 4 à 5 prélèvements. Chaque prélèvement sanguin prend environ 2minutes/souris maximum. Le prélèvement terminal sera fait sous anesthésie locale et générale gazeuse sans réveil (anesthésie gazeuse à l'isoflurane 5% (mélange isoflurane/air) pendant 3minutes pour le prélèvement et mise à mort par asphyxie progressive par augmentation graduelle de la dose de CO2 qui prend environ 5min). L'anesthésie locale prend environ 3 à 4 min/souris. Pour l'analyse par bioluminescence, les souris seront injectées avec un produit permettant la bioluminescence. L'injection prend environ 1 min par animal à chaque analyse hebdomadaire, 3 analyses maximum. Pour cette analyse par bioluminescence, les souris seront anesthésiées avec de l'isoflurane (4% (induction), maintenance 1-2% en air) pendant le temps de l'imagerie (3 anesthésies maximum). L'analyse dans le bio-imager prend environ 25min pour 5 souris à la fois. La douleur des animaux pourra être atténuée par injection de buprénorphine.

Impact sur les animaux

Perte de poids qui se résout entre 5 et 7 jours après injection du busulfan. Développement de signes de rejet de l'hôte par le greffon qui est une réaction immunitaire entraînant une réaction inflammatoire sévère due à la réaction des cellules immunitaires humaines greffées contre les tissus de la souris. Ces signes se caractérisent par une perte de poids importante, une pilo-érection et la prostration de l'animal. Les nuisances liées aux gestes techniques sont pour l'injection intra-peritonéale la perforation de l'intestin ou de la vessie, un durcissement de la région abdominale; pour les injection en intra-veineuse, la formation d'un hématome au point d'injection, d'une plaie pouvant aboutir à une nécrose ou à une mort subite en cas de bulle d'air dans la seringue; pour les prélèvements de sang en sub-mandibulaire, une hémorragie et une plaie au site de prélèvement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour des prélèvements d'échantillons biologiques. Les animaux surnuméraires qui n'ont pas reçu le produit thérapeutique seront réutilisés pour la formation du personnel et le maintien de leurs compétences puis également mis à mort.

Remplacement

Avant toute administration de produit à visée thérapeutique chez l'homme, la mise en évidence de l'efficacité et de l'innocuité du produit doit être démontrée chez l'animal. En effet, l'emploi des modèles animaux est nécessaire au projet car il n'existe pas à l'heure actuelle de méthodes alternatives permettant de reproduire in vitro la complexité physiologique de l'impact des cellules NK sur les Tregs et de leur éventuelle protection à long terme due à la distribution des cellules dans l'organisme.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisé, chaque groupe contiendra le nombre minimum indispensable à l'obtention de résultats statistiquement pertinents.

Raffinement

Dans une approche éthique, nous prévoyons de limiter au maximum le nombre d'animaux avec des scores cliniques sévères et mettre en place des points limites adaptés. Nous utiliserons également une litière adaptée (douce, non-poussiéreuse) et un enrichissement qui favorise l'expression des comportements normaux de la souris (enfouissement, nidification...). Un apport de gel hydrique dans la cage est réalisé pour simplifier l'accès des animaux à une source hydrique et sera mis à disposition des animaux dès le début de leur hébergement pour les habituer à cette source hydrique. Les souris immuno-déficientes NOG sont hébergées en portoir ventilé par groupe de 5 souris maximum par cage dans la zone SOPF de l'animalerie. Pour la préhension des animaux et éviter le stress nous utiliserons un tunnel auquel nous les habituerons lors de leur phase d'acclimatation. Si possible, nous ferons un suivi longitudinal des cellules humaines injectées par bioluminescence. Pour les études par bioluminescence les animaux seront endormis par anesthésie gazeuse en air. Pour limiter la douleur des animaux, des analgésiques de type morphiniques pourront être administrés.

Choix des espèces

Seules les souris immunodéficientes comme la souche NOG acceptent les greffes de cellules humaines. Il n'existe pas d'autre modèle animal immuno-déficient. L'injection de cellules humaines dans une souris immuno-compétente ou des primates ne serait pas possible car les cellules et les tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire murin ou du singe (xénogreffe). Souris adultes de 6-8 semaines car la prise de greffe des cellules NK prend environ 4 à 6 semaines selon la littérature pour pouvoir analyser leur effet sur les cellules T régulatrices dans des souris adultes de 10-14 semaines qui auront alors un poids relativement stable en fin de croissance. A ce stade de développement, les souris sont plus facilement manipulables pour les prélèvements et l'analyse des échantillons et d'évaluation physique (bien-être)