Procédures sévères

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 72 en gravité sévère. Des souriceaux nouveau-nés sont infectés par injection de Bacillus cereus sur animal vigile, avec des prises de sang par section de la queue, le point limite retenu pour les fortes doses étant la mort des animaux. Le porteur précise que les femelles gestantes sont tuées par dislocation cervicale et les souriceaux par décapitation. Il présente le projet comme répondant à des saisines de l'EFSA et de l'ANSES sur les risques des bioinsecticides et affirme qu'une analyse in vivo dans un modèle proche de l'humain est "nécessaire".

Objectifs

Les bactéries du groupe Bacillus cereus sensu lato sont pour la plupart des bactéries omni présentes dans l'environnement. L'espèce Bacillus cereus sensu stricto est classiquement considérée comme responsable d'intoxications alimentaires collectives. A ce titre, elle est la 3éme cause d'intoxication alimentaire dans le monde après Salmonella spp et Staphylococus aureus. Cependant, de plus en plus d'études montrent maintenant qu'elle peut être aussi respopnsable d'infections de type bactériémies chez le nouveau-né prématuré, dont l'évolution peut être fatale. Les espèces du groupe B. cereus sensu lato sont difficiles à identifier par les méthodes standards en raison de la très grande proximité génétique des espèces qui le composent, et il est nécessaire de recourir au séquençage génomique complet de la souche pour l'identifier. Ce probléme est d'autant plus critique que plusieurs souches de l'espèce B. thurengiensis (Bt) de ce groupe sont utilisées comme bioinsecticide en agriculture biologique et largement dispersées dans l'environnement. Par exemple, de récentes analyses plus poussées de plusieurs cas d'intoxications d'abord attibuées à B. cereus ont mis en évidence que certaines étaient dues à la présence de souches de Bt commerciales. Afin d'essayer d'établir le rôle potentiel des souches de Bacillus cereus sensu lato dans la mortalité induite au cours de l'infection, nous avons effectué un recrutement de 55 souches de ce groupe, isolées au cours d'épisodes infectieux chez des nouveau-nés prématurés, et nous les avons identifiées précisément par séquençage génomique. Dans ce projet, nous testerons sur des souris nouveau-nés les effets de 10 souches (5 virulentes et 5 non virulentes), sélectionnées sur la base d'expériences préliminaires réalisées chez la Drosophile. Ce projet devrait permettre de répondre à la question de l'Autorité Européenne de Sécurité Alimentaire (EFSA) et de l'Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l'Environnement et du Travail (ANSES) sur les risques en santé publique liés à la présence de bactéries du groupe B. cereus sensu lato, parmi lesquelles B. thiurengiensis, dans l'alimentation (EFSA-Q-2015-00254 ; ANSES, saisine n° 2013-SA-0039), et dans l'environnement en général. Il permettra aussi de confirmer la nécessité de mesures strictes d'hygiène, et de protocoles permettant d'éviter la transmission bactérienne.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de répondre à la question de l’EFSA et de l’ANSES sur les risques en santé publique, des bactéries du groupe B. cereus, 3éme cause d'intoxication alimentaire dans le monde.

Procédures

Les animaux (souris nouveau-nés) seront infectés par injection par voie intra péritonéale, réalisée sur animaux vigiles. La bactériémie sera suivie aux temps 4h, 24h et 48h par des prises de sang effectuées par coupure de l'extrémité de la queue. A chaque temps 3 souris seront prélevées puis euthanasiées.

Impact sur les animaux

Les effets indésrables attendus sur les animaux seront différents dans les deux procédures. Dans la procédure 1, le point limite est la mort des animaux infectés, et les effets indésirables seront ceux liés à l'infection à B. cereus pour les plus fortes doses testées. Pour la procédure 2, nous utiloiserons une dose de B. cereus non létale déterminée dans la procédure 1. Dans ces conditons, nous n'attendons donc pas de signes de souffrance ou autres effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, par dislocation cervicale des femelles gestantes, après la mort des souriceaux qui seront euthansiés par décapitation.

Remplacement

Les effets en santé publique de l’utilisation des bioinsecticides Bt sont sans doute largement sous-estimés en raison (i) de la proximité génétique entre les souches de B. thuringiensis (base des bioinsecticides Bt) et de B. cereus, 3éme responsable d’intoxications alimentaires au niveau mondial et 2nd en France (ii) des méthodes standards de détection et d’énumération de B. cereus qui ne permettent pas de différencier B. cereus de B. thuringiensis. Il convient donc d’analyser in vivo, dans un modèle le plus proche possible de l’Homme, les risques d’intoxication liés à la présence de B. thuringiensis dans l’environnement en raison de l’épandage en constante augmentation des bioinsecticides Bt.

Réduction

Des expériences sont en cours sur des cellules (macrophages), ainsi que dans un modèle de Drosophile, infectées avec une collection de souches de Bacillus, afin d'identifier les souches d'intérêt qui seront ensuite testées ches la souris.

Raffinement

En termes de raffinement, après infection, les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel animalier et par les responsables du projet et l’application de points limites permettra de détecter toute apparition de signes de souffrance durables. Le cas échéant, les animaux concernés seraient immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement décrit dans la littérature comme modèle d'étude de l'infection in vivo. De plus, les systèmes de défense contre les bactéries pathogènes sont très conservés de la Drosophile aux Mammifères, et en particulier, les réponses cellulaires de l'hôte vis à vis du pathogène sont très similaires entre la souris et l'homme. Plus précisément, ce modèle est celui que nous avons utilisé dans nos études précédentes dans un modèle de bactériémie à Escherichia coli chez la souris (Diabate et al., 2015, PLoS Pathogens, PEA NCE/2012-64), dans un modèle murin de bactériémie induite au cours d'une pneumonie à Staphylococcus aureus (Courjon et al., 2015, Toxins, autorisation MENSR n°02330.01) et dans un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa (Bouillot et al., 2017, Sci Reports, PEA311). Les animaux utilisés seront des souriceaux nouveau-nés de 2 jours.

130 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 100 en gravité sévère. On leur sectionne un nerf vestibulaire pour reproduire une névrite, ce qui provoque des troubles de l'équilibre, une inclinaison de la tête et des déficits locomoteurs, avant des tests comportementaux nommés comme le labyrinthe radial, le labyrinthe en T, la reconnaissance d'objets et le labyrinthe en croix surélevé. Tous les rats finissent perfusés au paraformaldéhyde pour prélever le cerveau. Le porteur affirme que l'étude cellulaire de la neuroplasticité ne peut se faire que chez un modèle vivant et que le recours au rat reste "nécessaire".

Objectifs

Les pathologies vestibulaires se caractérisent par des épisodes imprévisibles et récurrents de vertiges, associés à des déséquilibres posturaux. Ces atteintes sont accompagnées d’étourdissements et de nausées, ainsi que de difficultés à stabiliser le regard lors de mouvements de la tête. Ces symptômes impactent considérablement la vie quotidienne des patients. En France, le vertige constitue le 3e motif de consultation chez le généraliste et représente 5% des urgences hospitalières. La névrite vestibulaire est une pathologie associée à une inflammation du nerf vestibulaire. L’administration aigüe de corticoïdes anti-inflammatoires est actuellement le traitement de référence pour ce type d’atteinte. Bien que ce protocole thérapeutique soit utilisé depuis de nombreuses années, ses bénéfices sont aujourd’hui remis en question. En effet, différentes méta-analyses soulignent l’absence d’amélioration de l’état des patients, suggérant un potentiel effet bénéfique de l’inflammation aigüe dans la récupération fonctionnelle. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle de la réaction inflammatoire aigüe observée à la suite d'une atteinte vestibulaire unilatérale. Notre modèle d'étude est la neurectomie vestibulaire unilatérale (NVU) chez le rat adulte, consistant à sectionner le nerf vestibulaire. La NVU reproduit la névrite vestibulaire rencontrée chez l'Homme en générant une inflammation du système vestibulaire. De plus, elle permet d'engendrer un syndrome composé de symptômes posturaux-locomoteurs, oculomoteurs et cognitifs, similaires à ceux observés chez les patients. Nous modulerons pharmacologiquement la réaction inflammatoire durant les 3 premiers jours post-lésionnels, considérés comme la phase aigüe du syndrome. Nous utiliserons différentes investigations comportementales et cellulaires afin de comprendre les acteurs de la réaction inflammatoire aigue, les conséquences de sa modulation pharmacologique sur la plasticité post-lésionnelle, ainsi que sur la récupération fonctionnelle. Nous espérons ainsi comprendre son rôle physiologique d'un point de vue fondamental mais nous souhaitons également apporter des réponses aux questionnements soulevés par la corticothérapie en clinique humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mettre en évidence, pour la première fois, les conséquences comportementales et les mécanismes cellulaires réactionnels à un traitement anti-inflammatoire administré dans les mêmes conditions que la clinique vestibulaire. La compréhension du rôle de la réaction inflammatoire dans la compensation vestibulaire permettra de proposer en perspective un protocole thérapeutique sans effets secondaires, mieux adapté et plus efficace. De plus, au délà de l'aspect clinique, ce travail nous permettra de mieux appréhender les mécanismes et sites d'action de ce type de traitement.

Procédures

Ce projet comprend au total 130 animaux au maximum. Dans une première étape, l’expérimentateur sera formé à la neurectomie vestibulaire unilatérale (NVU). Cette première phase d’apprentissage prévoit l’utilisation de 10 animaux qui seront gardés pour la suite du projet dans le cas où la chirurgie est réussie. Leur nombre sera déduit des effectifs nécessaires à la constitution des groupes expérimentaux. Dans un second temps, les groupes expérimentaux seront constitués (n=120). Nous étudierons les conséquences de la lésion combinée à différents traitements pharmacologiques modulateurs de la réaction inflammatoire, administrés durant les 3 premiers jours post-lésionnels. Le projet prévoit l’étude de 4 groupes expérimentaux différents : un groupe contrôle non lésé qui sera anesthésié et opéré mais dont le nerf vestibulaire ne sera pas sectionné (n=30), un groupe lésé et traité avec un placebo (n=30 ; NaCl 0,9%, 2ml/kg, i.p), un groupe lésé et traité avec un corticoïde inflammatoire classiquement utilité en clinique (n=30 ; Solu-médrol® 10mg/kg, 2ml/kg, i.p) et enfin un groupe lésé et traité avec une endotoxine pro-inflammatoire (n=30 ; Lipopolysaccharide 10µg/kg, 2ml/kg, i.p). À la suite des chirurgies, 2 axes d'études différents seront mis en place : une étude comportementale et une étude cellulaire, ayant pour but de mettre en évidence les mécanismes de plasticité sous-jacents. Concernant l’étude comportementale, 10 animaux par groupe (n=40) seront concernés et suivis de manière longitudinale. Les différentes tâches comportementales utilisées permettent d’évaluer les fonctions vestibulaires et posturo-locomotrices (mesure de l’intensité du syndrome vestibulaire, mesure de la surface d’appui au sol ; mesure de la distribution pondérale et mesure de paramètres posturographiques, 10 minutes par session) mais également les fonctions cognitives spatiales (labyrinthe radial (5minutes/session), labyrinthe en T (5minutes/session), test de reconnaissance d’objets (4minutes/session), tâche de navigation continue (10minutes/session). Nous prévoyons également l’évaluation de l’anxiété chez nos animaux via l’utilisation du labyrinthe en croix surélevé (10minutes/session). Ces tâches durent au total 3 mois et 1 semaine, de l'habituation à la dernière session réalisée 90 jours après la chirurgie. Pour l’étude cellulaire, tous les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque au paraformaldéhyde 4%, à différents délais post-lésionnels.

Impact sur les animaux

La NVU induit un syndrome vestibulaire dont les conséquences ont été décrites à multiples reprises dans la littérature. Le syndrome vestibulaire induit par cette procédure est caractérisé par une phase aigüe, dont l’apogée des symptômes est observable jusqu’au 3ème jour post-lésionnel, puis par une phase compensée caractérisée par une diminution progressive des troubles. D’un point de vue comportemental, la résection du nerf vestibulaire entraîne des troubles posturaux, locomoteurs et oculomoteurs disparaissant en moyenne à partir du 10ème jour post-lésionnel. Parmi ces troubles, une inclinaison de la tête du côté ipsilésionnel, une hypotonie musculaire, une diminution de l’activité locomotrice et un déséquilibre postural entravant le comportement de redressement de l’animal sont observés. Cet ensemble de symptôme atteste d’un déficit de la fonction d’équilibration posturale et locomotrice tel que rencontré en clinique. Les traitements pharmacologiques qui seront utilisés dans ce projet ont été adaptés en termes de dosage à ce que aucun effet secondaire ne soit observé. En outre, la dose du traitement anti-inflammatoire a été adaptée au traitement utilisé en clinique humaine. Les tests comportementaux utilisés dans cette procédure ne sont pas reconnus pour stressants ou contraignants ou pour engendrer une douleur quelconque. Tous les animaux seront habitués à l’expérimentateur ainsi qu’à la salle d’expérimentation pendant une semaine avant le début du protocole expérimental, limitant ainsi tout stress ou angoisse lors des manipulations. Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement tout au long du protocole expérimental à l’aide d’une grille de score mise en place par la SEBA de notre laboratoire. Des mesures appropriées de gestion de la douleur sont prévues dans cette grille, qui définit également les points limites de ce projet.

Devenir

40 animaux opérés (procédures n°1 et 2) sont gardés en vie afin de réaliser des tests comportementaux (procédures n°3 et 4). 80 animaux opérés (procédures n°1 et 2) seront perfusés (procédure n°5) au délai post-lésionnel adéquat (détaillé dans la section 3.3.2.2). Tous les animaux du projet sont destinés à la procédure n°5, la perfusion intracardiaque (classée sans réveil), afin d'assurer une conservation optimale des tissus cérébraux, pour des marquages d'immunohistochimie.

Remplacement

Remplacement : Le recours aux modèles animaux est, pour l’instant, nécessaire pour vérifier d’un point de vue cellulaire les bénéfices comportementaux des traitements pharmacologiques utilisés dans ce projet. Par ailleurs, l'étude de la cinétique d'expression des mécanismes cellulaires de neuroplasticité dans les structures cérébrales impliquées dans la fonction vestibulaire (noyaux vestibulaires déafférentés) et celles impliquées dans la cognition spatiale (hippocampe, etc.) est un processus biologique dont l’étude ne peut se faire que chez un modèle vivant.

Réduction

Réduction : Les rats correctement lésés durant l’apprentissage seront transférés vers le groupe contrôle lésé. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour chaque groupe en fonction de l’expérience précédente de l’équipe et avec l’aide d’un statisticien avec lequel nous avons effectué un test de puisssnce statistique permettant de réduire au maximum le nombre d'animaux tout en ayant suffisamment de données pour une inférence statistique valide. Les animaux étant suivis de manière longitudinale, nous analyserons nos données à l'aide d'ANOVA à 2 facteurs (groupes; délai post-lésionnel) à mesures répétées.

Raffinement

Raffinement : La souffrance des animaux est limitée au maximum. Une grille de score adaptée est utilisée pour évaluer le bien-être animal. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie sont adaptés pour les différentes procédures du projet. L’hébergement des animaux est adapté durant les premiers jours post-lésionnels pour garantir la sécurité et le bien-être animal. Les co-porteurs du projet sont formés en expérimentation animale (niveau concepteur de projet), en chirurgie sur rongeurs et sensibilisés au bien-être animal.

Choix des espèces

Les tests comportementaux utilisés chez le modèle félin NVU depuis de nombreuses années ont été transposés chez le rat (nombreux avantages : manipulation, coût, taux de reproduction). Les intérêts de ce modèle rongeur sont la reproduction du syndrome vestibulaire rencontré chez différentes espèces, dont l’Homme. De plus, la durée totale du syndrome vestibulaire est significativement réduite chez le rat (2 à 3 semaines) comparativement à l’Homme (90 jours) et au chat (60 jours). Ce gain temporel est avantageux pour l’étude des sites et mécanismes d'actions de composés pharmacologiques et pour la compréhension des mécanismes neurobiologiques corrélés au décours du syndrome vestibulaire. A un niveau cellulaire, nous retrouvons, chez le rat, les mêmes modifications post-lésionnelles que celles observées chez le chat : neurogénèse, modification d'expression de la glie, de l'inflammation et des marqueurs de l'excitabilité. Actuellement, le manque de connaissances ne nous permet pas encore de transposer les études sur des modèles murin ou de type in silico. La présente étude s’intéresse au processus de compensation post lésionnelle chez l'adulte, présent après neurectomie vestibulaire unilatérale. L’étude de ces mécanismes dans les noyaux vestibulaires sera donc réalisée sur des rats adultes afin de s'assurer d’être sorti de la période développementale. Par ailleurs, pour un rat, la maturation des neurotransmetteurs et la densité synaptique est atteinte à + de 8 semaines. Il est donc nécessaire de travailler sur des rats adultes d'au moins 10 semaines pour qu'une maturation complète du système nerveux central soit présente.

718 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere a severe. Chaque animal subit des chirurgies cerebrales pour injecter des composes et implanter des fibres optiques, puis des tests d'evitement d'un lieu associe a un danger, avant d'etre tue pour prelever ses organes. Le porteur relie ce travail a l'evitement persistant observe dans le stress post-traumatique et signale que l'isolement des souris entraine un inconfort. Il affirme qu'il est impossible de remplacer l'animal vivant pour l'etude du comportement et presente la souris comme un "modele de choix".

Objectifs

Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans l’évitement comportemental chez la souris. Ce projet se focalisera sur les neurones de l’aire tegmentale ventrale, une région du cerveau qui jouent un rôle clef dans la les comportements de défense. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’aire tegmentale ventrale contrôle l’évitement de place chez la souris. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de cette région.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.

Procédures

Les souris auront comme intervention : 1) des injections dans le péritoine (1 injection de quelques secondes) 2) des chirurgies pour injecter des composés dans le cerveau à des sites précis pour d’identifier des neurones spécifiques du cerveau (1 injection de 60 min), 3) des chirurgies pour implanter des fibres optiques dans le cerveau à des sites précis pour d’identifier des contrôler l’activité des neurones avec de la lumière rouge (1 implantation de 60 min), 4) des tests de comportement pour l’évitement (1 semaine) et 5) la mise à mort pour collecter les organes pour analyse ultérieure.

Impact sur les animaux

Le comportement d’évitement de place, les injections intrapéritonéales, les approches de chirurgie d’injection dans le cerveau, et la mise à mort engendrent des douleurs et stress modéré. L'isolement engendre de l'inconfort modéré.

Devenir

Notre étude nécessite de mettre à mort les animaux pour récupérer les organes que nous étudierons notamment par histologie

Remplacement

Il est impossible de remplacer l’animal vivant pour l’étude du comportement d’évitement. La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical.

Réduction

Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 718 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées. La détermination des effectifs et le traitement des données se feront en utilisant des outils statistiques adaptés.

Raffinement

Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont proches les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien-être et des points limites adaptés. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté. Des analgésiques et anesthésiques adaptés sont utilisés pour les chirurgies et en cas d’identification d’un animal en souffrance

Choix des espèces

L’évitement est un comportement extrêmement important pour la survie et est donc conservé chez les mammifères. Par ailleurs, ce projet requiert l’étude fine de populations de neurones accessibles uniquement via des modèles murins transgéniques. Les souris se reproduisent rapidement (une portée par mois) et leur système nerveux atteint son développement adulte en 12 semaines. Ainsi, la souris adulte représente un modèle de choix pour étudier les mécanismes neuronaux qui contrôlent le comportement d’évitement.

La première étape comprend l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique par des ultrasons focalisés, l'injection dans une veine d'un vecteur de thérapie génique, quatre prises de sang, quatre ponctions de liquide céphalo-rachidien et trois IRM, sous anesthésie générale, et le projet porte sur 8 macaques à longue queue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. La seconde ajoute une chirurgie de deux heures et demie à trois heures pour injecter des vecteurs dans le cerveau, cinq prises de sang, cinq ponctions lombaires, six IRM et trois scanners dans un autre laboratoire, à une heure de transport dans chaque sens. Le porteur qualifie l'approche de "non invasive", tout en signalant un risque d'arrêt cardiaque lié aux microbulles injectées et des fuites de liquide céphalo-rachidien pouvant causer maux de tête et vomissements. Le titre évoque un "modèle de primate non humain de la maladie de Parkinson", sans que le résumé dise comment la maladie est provoquée chez ces macaques. Tous sont tués à la fin du projet pour l'étude de leurs tissus et de la diffusion du vecteur.

Objectifs

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative conduisant à une atteinte majeure de la qualité de vie chez les patients, consécutive à une perte des neurones dopaminergiques d’une partie du cerveau. De nos jours, les patients parkinsonniens sont majoritairement sous traitements médicamenteux de L-Dopa, efficaces pour une durée dépendante de chaque patient, mais qui ne permet qu’un effet transitoire et évoluant ensuite vers une paralysie progressive et une perte importante de qualité de vie. L’enjeu majeur est donc de trouver un traitement pour ces patients permettant de ralentir voire de corriger les symptômes de la pathologie. Grace à la thérapie génique, nous exprimons dans le cerveau un vecteur-médicament qui va entrainer la surexpression de l’enzyme impliquée dans la transformation du cholestérol dans le cerveau, pour tenter de corriger la perte neuronale responsable des symptômes parkinsoniens. Nous avons démontré l’efficacité de notre approche thérapeutique dans 3 modèles murins de la maladie de parkinson. Ce vecteur sera injecté par voie veineuse et pourra pénétrer jusqu’au cerveau grâce à l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique, réalisée de manière non invasive (dispositif disposé sur la tête de l’animal et envoyant des ultrasons de manière focalisée. Les objectifs du projet sont d’évaluer la faisabilité, l’efficacité et la tolérance d’une administration non invasive par voie intraveineuse de ce vecteur-médicament chez le primate non humain (PNH) pour permettre ensuite de réaliser ce traitement chez l’Homme. Le bien-être animal sera surveillé tout au long du projet avec la mise en place de critères précis d’interruption.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est de proposer un essai clinique pour un nouveau traitement très peu invasif de thérapie génique (nouveau médicament-vecteur d’intérêt) pour des patients atteints de maladie de Parkinson.

Procédures

Dans ce projet, comme décrit précédemment, tous les gestes techniques sont réalisés sous anesthésie générale, et une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien et/ou imagerie par résonance magnétique (IRM) et spectropscopie (RMRS) selon les temps d’intérêt de l'étude). Pour l’étape 1: - Une procédure d’ouverture de barrière Hématoencéphalique couplée à une administration intraveineuse de vecteur médicament (environ 1h30) - 4 prélèvements sanguins, 4 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (sang et LCR maximum 30-45min) - 3 Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 1h30) Pour l’étape 2: - Une procédure d’ouverture de barrière Hématoencéphalique couplée à une administration intraveineuse de vecteur médicament (environ 1h30) - Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : injection intracérébrale de vecteurs (durée environ 3h) (durée environ 2h30) - 5 prélèvements sanguins , 5 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (sang etLCR maximum 30-45min), - 6 examens par Imagerie par résonance magnétique (IRM + RMRS) (environ 1h30) - 3 examens de scanner (durée environ 1h30) avec transport de l’animal pour réaliser l’examen dans un autre laboratoire (1h de transport aller et 1h retour dans la journée par transporteur agrée). Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Une chirurgie sous anesthésie générale avec un risque anesthésique et infectieux Une ouverture de barriere hematoencéphalique avec injection de microbulles et un risque d’arrêt cardiaque associé. Plusieurs prélèvements de sang et de LCR avec un risque de fuite de LCR (maux de tête, vomissements, signes neurologiques) et la formations possibles d’hématomes Il existe aussi un stress lié à la capture des animaux dans la cage suite à l'induction de l'anesthésie.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études histologiques et de biodistribution afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de l’approche.

Remplacement

Toutes les études in vitro (en dehors de l’animal) possibles pour valider la cible thérapeutique ont été effectuées avant ce projet afin de valider l’utilisation de ce médicament-vecteur comme nouvelle cible thérapeutique dans la maladie de Parkinson. Ensuite la stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de nos vecteurs ont été réalisées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de son efficacité et de sa toxicité, sur un modèle animal de plus grosse taille, le plus pertinent pour reproduire le modèle de la maladie de Parkinson est le PNH. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence nationale de la sécurité des médicaments (ANSM) pour toute demande d’autorisation d’étude clinique (chez l’Homme). Enfin les procédures sont faites sous anesthésie et analgésie et le suivi des animaux avec des points limites adaptés.

Réduction

Il y a 8 animaux au total sur ce projet, ce qui correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité de l’approche thérapeutique. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie, l'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et la chirurgie d’injection virale, pour éviter tout inconfort. Une observation journalière sera faite tout au long du projet de manière à suivre les points limites mis en place dasn le projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire.

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du PNH en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (chez l’homme). L'injection de vecteurs adeno associés chez le primate est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́ compte tenu des patients ciblés par notre approche

126 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal subit un modèle de parodontite par pose répétée de ligatures imbibées de bactéries, avec prélèvements sanguins et radiographies sous anesthésie sur trente jours, une partie subissant ensuite un accident vasculaire cérébral provoqué chirurgicalement avant d'être tuée. Le porteur indique que la parodontite peut provoquer des abcès gingivaux et que l'AVC entraîne prostration, difficultés à se déplacer et perte de poids. Il affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour étudier les interactions entre parodontite et maladies cardiovasculaires.

Objectifs

La parodontite est une maladie fortement prévalente (47% de la population adulte américaine) qui entraine une destruction des tissus de soutien des dents, et des pertes de dents précoces. Elle est déclenchée par un déséquilibre de la flore bactérienne au sein de la bouche, dont la bactérie Porphyromonas gingivalis (P gingivalis) est clée. La parodontite est une source chronique de bactériémie (passage temporaire de bactéries dans le sang) et d'une inflammation systémique de bas grade (c’est-à-dire diffusée dans tout le corps et de faible intensité). La parodontite favorise des maladies à distance telles que les pathologies cardiovasculaires dont les accidents vasculaires cérébraux (AVC). Cependant, à ce jour, aucune étude n’a pu mettre en évidence un lien de cause à effet entre parodontite et AVC même si P gingivalis est une des principales bactéries de la bouche retrouvées dans les parois des vasseaux sanguins malades et lésées lors des AVC (plaque d’athérome et et zones d’anévrisme). Récemment, il a été identifié que certaines cellules sanguines dites de défense, les globules blancs, comme les macrophages ou les neutrophiles, peuvent conserver une mémoire en réponse à de précédentes infections ou phénomène inflammatoire antérieur, ce qui leur permet de réagir plus fortement lors de futures expositions identiques ou différents. Cet état de réactivité accrue se nomme «immunité innée entraînée » (TII). Elle pourrait expliquer les liens entre parodontite et d’autres maladies inflammatoires chroniques. L’inflammation systémique, généralisée dans le corps, liée à la parodontite induirait une reprogrammation de l'expression de gènes des progéniteurs des cellules sanguines dont les cellules myéloides/globules blancs. Ceci conduirait à une production accrue de globules blancs avec une capacité proinflammatoire augmentée, augmentant le risque cardiovasculaire. Dans ce projet, nous souhaitons tester l’impact de la parodontite sur l’activation et la production des globules blancs par la moelle osseuse, le lien avec la réponse inflammatoire lors d’un AVC et ses conséquences sur l’étendue de l’AVC.

Bénéfices attendus

Grace à cette étude, nous souhaitons étudier si la parodontite, via certaines bactéries, active à distance les cellules de l’immunité en développement au sein de moelle osseuse et favorise la production de cellules activées, « inflammées » dans le sang. Une fois en circulation, ces cellules inflammées pourraient contribuer à l’aggravation de l’AVC. Ceci démontrerait un lien de cause à effet entre parodontite et AVC et appuyerait l’importance du traitement de la parodontite en prévention de l’AVC.

Procédures

Les souris seront soumises au modèle de parodontite : pose d’une ligature (5 minutes) et 1 prélèvement sanguin 3 minutes) par souris sous anesthésie profonde, renouvelés tous les 3 jours pendant 30 jours. Avant et à la fin de la mise en œuvre de ce modèle, une radiographie 3D des machoires sera réalisée pour toutes les souris sous anesthésie (durée 5 minutes/souris). Nous aurons alors 3 groupes de souris : souris contrôle (anesthésie, radiographie et prise de sang réalisés) et 2 groupes test (l’un avec une ligature simple, l‘autre avec une ligature imbibée de bactéries agressives pour le parodonte). Les animaux seront mis à mort à 30 jours pour évaluer l’impact de la parodontite avec ou sans bactérie agressive sur les globules blancs de la moelle osseuse. La meme expérimentation sera réalisée sur de nouveaux lots de souris. Au bout de 30 jours, celles-ci seront transportées au sein de l’animalerie d’un autre laboratoire. Après acclimatation, elles seront soumises sous anesthésie profonde au modèle d’AVC (Durée 15 minutes). Les souris seront gardées en élevage pendant 2 jours avant d’être mises à mort : cette étape vise à évaluer l’impact de la parodontite sur l’AVC. Une sesonde série d’expérience sera réalisée au cours de laquelle une période de cictarisation de 15 jours après induction de la parodontite sera réalisée. Nous aurons à nouveau 3 groupes de souris : souris contrôle (anesthésie, radiographie et prise de sang réalisés) et 2 groupes test (l’un avec une ligature simple, l‘autre avec une ligature imbibée de bactéries agressives pour le parodonte). Les animaux seront mis à mort à 45 jours (30 jours de parodontite et 15 jours de cicatrisation) pour évaluer la cicatrisation du parodonte et le retour à un état basal du nombre et de l’activité des globules blancs de la moelle osseuse. D’autres lots (contrôle, ligature simple et ligature + bactérie agressive) soumis au modèle de parodontite et cicatrisation seront quant à elles transportées au sein de l’animalerie d’un autre laboratoire. Après acclimatation, elles seront soumises sous anesthésie profonde au modèle d’AVC (Durée 15 minutes). Les souris seront gardées en élevage pendant 2 jours avant d’être mises à mort : cette étape vise à évaluer l’impact de l’immunité innée entrainée sur la parodontite sur l’AVC

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour l’animal sont : - exceptionnellement pour les souris soumises au modèle de parodontite : des douleurs gingivales post-opératoires, voir des abcès gingivaux, diminuant la mastication et la prise de poids des animaux. -pour les souris soumises au modèle d’AVC : une prostration, des difficultés à se déplacer et la perte de poids. - pour tous les animaux : une hypotherime à l’anesthésie.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux sont mis à mort permettant le prélèvement des tissus nécessaires à nos travaux.

Remplacement

A notre connaissance, il n’existe pas de méthodes alternatives pour l’étude des interactions entre parodontites et maladies cardiovasculaires.

Réduction

Afin de minimiser le nombre d’animaux, une étude statistique a été réalisée pour le modèle de parodontite et pour le modèle d’AVC/ Pour le modèle parodontite, d’après une publication sur la comparaison des modèles de parodontite expérimentale avec ligature +/- P gingivalis chez la souris, et notre expérience, un effectif de 5 souris /groupe est suffisant pour obtenir une puissance statistique. Une souris supplémentaire par groupe est prévue en cas de mort prématurée au cours de l’expérimentation, soit 6 animaux/groupe pour le modèle parodontite (sans AVC). Pour le modèle d’AVC, une étude préliminaire a montré que 8 animaux/groupe sont nécessaires pour obtenir une puissance statistique. En tenant compte d’une perte d’animaux de 20 % dû à la mortalité inhérente au modèle, nous anticipons l’utilisation d’un nombre de 10 animaux pour les lots parodontite + AVC.

Raffinement

Des mesures de raffinement seront prises pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux : (1) avant chaque examen radiologique, sans intervention chirurgicale,une anesthésie légère mais dont l’efficacité est validée, est effectuée (2) avant chaque pose de ligature et prélèvement sanguin (même séquence opératoire), les souris sont anesthésiées profondément (3) après chaque anesthésie, les souris sont placées dans un environnement chauffé et surveillées jusqu’à leur réveil (4) les animaux sont surveillés le lendemain de chaque intervention puis tous les 2 à 3 jours par le personnel dédié de l'animalerie ou les responsables de projet (5) des analgésies sont prévues avant les procédures de sévérité élevée et en cas d'atteintes de points limites et (6) des points limites ont été établis.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus couramment utilisée pour l’étude de la parodontite et tout particulièrement pour l’étude de la composante systémique de la parodontite. De nombreux outils d’analyses, qu'ils soient commerciaux ou dans notre laboratoire, sont développés et adaptés à ce modèle. Il en est de même pour l'étude de l'AVC. Les souris seront agées de 3 mois, âge adulte avec croissance des maxillaires achevée.

304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les mâles porteurs de la myopathie myotubulaire développent une faiblesse musculaire généralisée qui gêne leurs déplacements et leur accès à la nourriture, puis reçoivent une injection de vecteurs, des mesures de force et des prélèvements de muscle sous anesthésie sans réveil. Le porteur teste dix vecteurs de thérapie génique pour réduire les doses et les effets sur le foie observés en clinique. Il juge l'animal "indispensable" car les modèles cellulaires ne reproduisent pas la perte de force musculaire, les retombées thérapeutiques restant à venir.

Objectifs

Il n’existe aucun traitement approuvé pour la myopathie myotubulaire, une maladie congénitale sévère affectant les garçons et entrainant la mort prématurée souvent avant un an. Cette maladie est due à des mutations dans le gène MTM1 qui code pour la myotubularine. Sa déficience implique une hypotrophie et une faiblesse musculaire généralisées entraînant une difficulté respiratoire. Dans un essai clinique en cours, un vecteur de type AAV (dérivé de virus associé à l’adénovirus) est injecté par voie intraveineuse pour introduire le gène MTM1 dans les muscles des patients. Ce produit a déjà été testé dans des souris déficientes en myotubularine et dans un modèle canin. Dans ces modèles animaux, ce traitement a permis d’obtenir une restauration du phénotype. Cependant, le vecteur AAV8 utilisé ne cible pas spécifiquement les cellules du muscle et la quantité de vecteurs nécessaire pour un effet thérapeutique est élevée ce qui peut engendrer des effets indésirables notamment sur le foie. Le but de ce projet est de sélectionner dans le modèle murin de la myopathie myotubulaire des vecteurs plus efficaces et spécifiques pour le muscle, qui pourraient également être utilisés pour traiter d’autres pathologies musculaires, ce qui permettrait de réduire les doses de vecteur à administrer chez les patients. Le(s) vecteur(s) optimisés pourront être associés à des stratégies de correction permanente de la pathologie pour un effet thérapeutique synergique et durable.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait de proposer une solution thérapeutique plus efficace et plus spécifique que le traitement de référence, dans le contexte de la myopathie myotubulaire. Grâce à l’étude de différents critères, nous espérons sélectionner un ou des candidats permettant de traiter ce modèle animal à une dose plus faible que le vecteur de référence. Cette diminution de quantité de vecteurs engendrera certes une diminution du coût mais surtout réduira les effets indésirables liés à des doses élevées. En effet, dans des essais cliniques de maladies neuromusculaires traités par vecteur AAV, notamment dans le contexte de la myopathie myotubulaire, des effets dommageables sur le foie, par exemple, ont été reportés et sont en partie corrélés à la dose importante de vecteurs injectés. Les vecteurs sélectionnés pourraient également être associés à d’autres stratégies d’optimisation de l’expression de la protéine, étudiées dans d’autres études, pour augmenter l’efficacité du traitement. Enfin, les bénéfices attendus pourraient s’étendre à d’autres pathologies neuromusculaires telles que la myopathie de Duchenne ou tout autre myopathie ou dystrophie touchant essentiellement les muscles, puisque cet outil de transport de gène médicament étudié ici peut être simplement modifié en changeant le gène transporté sans affecter l’efficacité et la spécificité de cet AAV à cibler le muscle.

Procédures

Injection des traitements dans la veine caudale : injection unique, environ 2 min par souris. Mesure de l’activité des animaux : 1 fois 1h30. Mesure de la force musculaire globale : 1 fois 10min par souris. Mesure de la force spécifique d’un muscle, sur animaux vivants anesthésiés : environ 1h15 par souris. Prélèvements de muscles sur animaux vivants anesthésiés sans réveil: prélèvements uniques, environ 5 min par souris. Prélèvements sanguins sur animaux vivants anesthésiés : 1 prélèvement, maximum 5 min par souris.

Impact sur les animaux

Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine myotubularine. Les mâles hémizygotes développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Il n’y a pas d’effets indésirables prévus suite aux traitements, sauf dans le cas d’une injection à dose sub-optimale, auquel cas, les nuisances seront liées à celles du modèle. Le test de force musculaire globale peut générer une légère nuisance liée au pincement de la queue, générant rarement un léger saignement. Les injections intraveineuses et intra-péritonéales (traitements ou anesthésiques) ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère liée à la piqûre. Il n’y a pas d’effet indésirable lié à la mesure de la force spécifique d’un muscle et au prélèvement de muscle ou de sang sur animal vivant puisque celui-ci est anesthésié puis euthanasié à la fin de la procédure.

Devenir

Certaines des souris issues des croisements mais ne présentant pas de pathologie seront utilisées pour les croisements nécessaires au maintien et à l’amplification de l’élevage. Les animaux issus des croisements mais ne présentant pas de pathologie et non nécessaires au maintien et à l’amplification de l’élevage seront euthanasiés. Toutes les souris présentant le phénotype pathologique seront incluses dans les procédures expérimentales, et seront euthanasiées à la fin de la procédure expérimentale ou en cours de procédure si leur état de santé le nécessite.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable pour faire des preuves de concepts thérapeutiques, car les modèles cellulaires de la maladie ne permettent pas d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle (perte de force non mesurable sur des modèles cellulaires, pas de remplacement possible), et ne permettent pas non plus d’étudier la répartition d’un vecteur dans l’ensemble des tissus et les niveaux de biomarqueurs de la pathologie dans le sang. A l’opposé, le modèle de souris qui sera utilisé dans ce projet reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des muscles squelettiques et la distribution du vecteur dans les différents organes pour analyser leur spécificité.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de tests statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux pour observer des différences entre les vecteurs testés. En amont de cette étude expérimentale sur des modèles animaux, nous avons créé à l’aide d’outils informatiques et de recherches bibliographiques des vecteurs AAV avec un fort potentiel pour cibler les cellules musculaires. Par des tests in vitro, nous avons sélectionné ensuite les 10 meilleurs candidats. La première étape de ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de ces 10 vecteurs pour cibler l’ensemble des muscles et traiter la myopathie myotubulaire. Les meilleurs candidats seront sélectionnés afin de déterminer la dose thérapeutique optimale. En ne testant pas directement tous les vecteurs à différentes doses, nous réduisons par 3 le nombre de souris pour les vecteurs qui ne retiendront pas notre intérêt. S’il s’avère qu’aucun des vecteurs n’améliore le phénotype de la maladie par rapport au vecteur référence dans la première étape de sélection de vecteurs, la procédure expérimentale pour déterminer la dose optimale ne sera pas réalisée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies. Un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès aux souris. Dès leur arrivée en zone d’expérimentation, les souris seront manipulées afin d’être familiarisées aux expérimentateurs et aux gestes expérimentaux, dans le but de réduire leur stress. Les prélèvements sanguins ou les évaluations de force musculaire seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress de l’animal lié à l’acte et assurer son immobilité. Des points limites adaptés ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement afin de minimiser les effets indésirables, avec une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

Repris automatiquement des 3.4.3 et 3.4.11 Les souris déficientes en myotubularine ont été choisies comme animaux modèles pour deux raisons : 1) Ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène Mtm1, responsable de la myopathie myotubulaire, ce qui en fait le plus petit modèle animal le mieux caractérisé reproduisant les signes cliniques et moléculaires, caractéristiques de la maladie humaine. 2) La gestation étant de 3 semaines, les animaux nécessaires peuvent être obtenus rapidement. Les souris mâles saines et les femelles hétérozygotes pour la mutation sur le gène Mtm1 seront mises en reproduction entre l’âge de 6 semaines et de 1 an, ou seront euthanasiés si les accouplements ne sont plus productifs ou si les points limites sont atteints. Les symptômes de la maladie apparaissent dès la troisième semaine de vie chez les souris mâles hémizygotes. Notre étude vise à corriger les symptômes de la myopathie myotubulaire : les animaux mâles porteurs de la mutation seront donc utilisés juste après l’apparition des premiers symptômes (essentiellement un gain de poids plus faible que les animaux sains).