Procédures sévères
Modélisation des malformations corticales génétiques épileptogèneses chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 4 368 d'entre elles et sévère pour 1 120. Des femelles gestantes subissent une chirurgie pour induire des mutations chez leurs embryons, puis les petits reçoivent des électrodes intracrâniennes et développent une épilepsie avec plusieurs crises par jour, avant des traitements par injection, gavage ou injection intracérébrale. Le porteur décrit une possible agressivité envers les congénères, des douleurs après la chirurgie et un risque de rejet des petits par la mère. Il affirme que ni la modélisation informatique ni la culture cellulaire ne reproduisent les crises d'épilepsie et revendique le recours à des "organismes entiers".
Objectifs
L'épilepsie touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Les épilepsies focales sont parmi les plus fréquentes et sévères des épilepsies, et sont souvent liées à une malformation cérébrale. Parmi elles, les dysplasies focales corticales (DCF) sont caractérisées par une désorganisation locale du cortex cérébral et la présence de cellules neurales anormalement grande. Ces anomalies du développement sont responsables d’épilepsies qui résistent aux traitements médicamenteux et sont associées à des retards du développement et des déficits cognitifs. Notre laboratoire s’intéresse aux causes génétiques des DCF et a déjà montré l’implication de plusieurs gènes de la voie de signalisation cellulaire mTOR qui régule de nombreuses fonctions cellulaires (croissance, prolifération, métabolisme,…). Ces anomalies du développement cérébral peuvent être dues à des mutations génétiques présentes uniquement dans une population neuronale restreinte et apparaissant précocement au cours du développement du cerveau. Il est nécessaire de mieux comprendre l’origine des crises épileptiques suite à ces mutations afin de pouvoir développer de nouveaux médicaments antiépileptiques ciblés, et potentiellement proposer une médecine personnalisée. Afin de modéliser ces épilepsies focales d’origine génétique, nous proposons d’induire ces mutations au cours du développement du cerveau chez la souris afin d ‘étudier les crises d’épilepsie et tester des molécules antiépileptiques. Ce travail de recherche permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des crises épileptiques en fonction des différents gènes mutés et d’identifier des cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche permettra de créer de nouveaux modèles d’épilepsie induits par des variants génétiques. Ces pathologies sont rares, graves et orphelines. En effet, la majorité des patients atteints par ces mutations présente une épilepsie pharmacorésistante qui nécessite donc le recours à une chirurgie invasive pour contrôler les crises. Il est donc urgent d’utiliser des modèles reproduisant la physiopathologie de ces maladies afin de : - tester des thérapies ciblées sur les voies moléculaires en cause afin de permettre à court terme de diminuer le recours à ces chirurgies mais également de proposer une thérapie aux patients présentant une forme non opérable. - découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter à la fois l’épilepsie mais également les comorbidités associées à ces pathologies (autisme, dépression, troubles de l’hyperactivité, …) - Mieux comprendre les mécanismes qui sont à l’origine des crises d’épilepsies et autres comorbidités.
Procédures
Chirurgie sous anesthésie et analgésies sur les mères gestantes pour induire les mutations, afin de générer les groupes d’animaux. Durée maximale 1h, une seule fois. Après le sevrage des souriceaux, les femelles seront euthanasiées. Groupe exploratoire : Chirurgie sous anesthésie et analgésie pour l’implantation d’électrodes (1h maximum) puis isolement et enregistrement des crises sur animal vigile (session d’1 semaine séparé par 1 semaine de repos, jusqu’à l’apparition de crises ou à un âge maximal d’un an). Les souris seront ensuite euthanasiées. Traitement ip : Chirurgie sous anesthésie et analgésies pour l’implantation d’électrodes (1h maximum) puis isolement et enregistrement des crises sur animal vigile (session d’1 semaine séparée par 1 semaine de repos, jusqu’à l’apparition de crises ou à un âge maximal de 6 mois) PUIS injection intrapéritonéale de molécules thérapeutiques (1 injection de 30s tous les 2 jours pendant 2 semaines), PUIS enregistrement des crises sur animal vigile (4 sessions d’1 semaine séparées par 1-2 semaine de repos). Les souris seront ensuite euthanasiées. Traitement par gavage : Chirurgie sous anesthésie et analgésie pour l’implantation d’électrodes (1h maximum) puis isolement et enregistrement des crises sur animal vigile (session d’1 semaine séparée par 1 semaine de repos, jusqu’à l’apparition de crises ou à un âge maximal de 6 mois) PUIS Gavage de molécules thérapeutiques (1 gavage de 1 min tous les 2-3 jours pendant 3 semaines maximum), PUIS enregistrement des crises sur animal vigile (4 sessions d’1 semaine séparées par 1-2 semaine de repos). Les souris seront ensuite euthanasiées. Traitement par injection intracérébrale : Chirurgie sous anesthésie et analgésie pour l’implantation d’électrodes + injection en même temps (1h10 maximum) puis isolement et enregistrement des crises sur animal vigile (4 sessions d’1 semaine séparées par 1-2 semaine de repos). Les souris seront ensuite euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : 1) Pour la laparotomie subie par la femelle gestante : Isolement préopératoire et jusqu’à la naissance de embryons. Risques de déficience respiratoires, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Douleur au niveau du site d’ouverture et utérin, inconfort général durant les heures suivant la chirurgie, perte d’embryon(s), mise bas prématurée à E18 (jour embryonnaire 18). Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. 2) Induction d’un phénotype épileptique : Le développement prédit d’un phénotype épileptique avec plusieurs crises par jour. Possible agressivité des souris envers leurs congénères. 3) Pour la chirurgie due à l’implantation intracrânienne d’électrodes : Risques respiratoires, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Douleur, inconfort général, isolement des animaux durant la période suivant la chirurgie. Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. Risque de non acceptation post-chirurgie par la mère des animaux implantés avant sevrage. 4) Injection chronique IP : stress durant les contentions, perte de poids et possible douleur (œdème) dus à l’insertion répétée de l’aiguille sur le site d’injection. 5) Gavage oral : stress durant les contentions, perte de poids et possible douleur au niveau de l’œsophage due à l’insertion répétée de la sonde dans le système digestif.
Devenir
(1)Induction de mutations : les femelles gestantes seront euthanasiés dès qu’un point limite sera atteint, ou après le sevrage des souriceaux. Elles ne peuvent être réutilisées pour des accouplements à cause de la chirurgie. Les souris GFP négatives suite à l’induction de mutations ne peuvent être utilisées en procédure 2 à 5 du fait de leur génotype et elles ne peuvent être utilisées dans un autre projet car il est impossible de savoir si elles n’ont pas été induites (du fait de leur inaccessibilité lors de la chirurgie) ou si elle n’a pas été suffisamment efficace (ce qui pourrait induire un phénotype léger). (2)Enregistrement des crises et traitements : les animaux seront euthanasiés dès qu’un point limite sera atteint, ou à la fin de la procédure, dans la limite d’un an d’âge si aucune crise ne survient. Les animaux étant implantés avec des électrodes, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux.
Remplacement
Les résultats attendus de cette étude ne peuvent être obtenus par modélisation informatique car celle-ci nécessite des données expérimentales encore manquantes. De même, la culture cellulaire ne reproduit pas les interactions cellulaires, les voies de migration cellulaires, ni les crises d’épilepsie. La modélisation in vitro n’est donc pas indiquée dans notre type d’étude. De plus, nous ne pouvons éthiquement pas reproduire les modifications cérébrales nécessaires à notre étude chez des patients sains, ni tester nos traitements expérimentaux sur les patients atteints de ces troubles sans études précliniques préalables. Enfin l’utilisation d’organismes entiers, à la physiologie proche de l’humain et communément utilisé en étude préclinique nous permettra de tenir compte de la pharmacodynamie et de la pharmacocinétique de nos potentiels traitements. Nous pourrons ainsi rapporter les éventuels effets indésirables, la durée de traitement, la dose efficace et les effets attendus de nos traitements lors de nos discussions avec les cliniciens en charge des patients atteints de ces troubles avec lesquels nous travaillons étroitement.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences en testant préalablement la faisabilité des expériences, en combinant différents protocoles au cours d’une même expérience et en réalisant une exploitation maximale des données à l’aide de l’utilisation appropriée de tests statistiques fiables. Le calcul du nombre d’animaux est fait suivant les recommandations internationales. Il nous faut donc au moins 10 souris par groupe traitement. Ce calcul de puissance sera ajusté selon les premiers résultats, car nous ne pouvons pas encore prédire les différences de moyennes entre nos groupes. Nous utiliserons un premier groupe exploratoire afin de déterminer le stade le plus propice à notre étude et limiter ainsi le nombre d’animaux dans les autres procédures. De plus, pour les traitements administrés par injection et par gavage, chaque animal sera son propre contrôle : le phénotype épileptique sera comparé avant et après traitement, ce qui augmente la puissance statistique. Nous avons prédit 10 animaux par groupe soit 1120 souris si nous réalisons toutes les procédures décrites. Pour générer ces souris il est nécessaire d’utiliser des femelles gestantes. Nous avons choisi d’utiliser préférentiellement une souche de souris largement décrites dans la littérature scientifique. Cette souche offre aussi l’avantage de concevoir un nombre optimal d’embryons pour l’induction de mutations génétiques, d’être peu sensibles au stress et d’avoir peu de perte d’embryon ou de souriceaux entre l’induction de mutations et le sevrage. Nous avons prévu d’utiliser au maximum 336 souris gestantes. Parmi les souris issues de ces mères, une partie ne sera pas génétiquement modifiée (inaccessibilité des embryons lors de la chirurgie ou induction de mutations inefficace). Nous avons prévu un nombre maximum de 4032 souris générées mais négatives. Le nombre maximal de souris utilisées en procédure sera donc de 5488.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages ventilées (maximum 6 par cage), enrichies d’un nid de coton. En cas d’animaux isolés (souris gestantes, inconfort, ou opération chirurgical), la cage sera enrichie d’une maison et de coton afin de diminuer le stress des animaux impliqués. Nous n’avons pas encore caractérisé le phénotype de nos lignées. Si un animal fait une crise épileptique de plus de 15 minutes, ou présente une posture hypertonique après une crise, nous l’euthanasierons pour abréger ses souffrances. De même lors des enregistrements des crises: si un animal fait plus de 15 crises par jour. Les animaux feront donc l'objet d'une surveillance étroite par le personnel de soin animalier. Le poids, l'apparence physique et des changements de comportement seront les facteurs pris en compte. Suite à la chirurgie nécessaire à l’induction de mutation, les animaux feront l'objet d'un suivi postopératoire avec une surveillance rapprochée de l'expérimentateur jusqu'au réveil complet de l'animal et surveillance quotidienne étroite de l'expérimentateur et du personnel de soin animalier pendant les deux semaines suivant la chirurgie, ou jusqu’à la mise bas des souriceaux. Les mouvements, le poids, la respiration et les réflexes tels que le retrait de la patte seront observés. En cas de signe de souffrance on administre un analgésique toutes les 24h jusqu’à la mise-bas des souriceaux. Si les signes de douleur persistent malgré l’analgésie, l’animal sera euthanasié. Après cette mise-bas, nous surveillerons les signes de douleur de la femelle, et si les souriceaux sont bien nourris. Suite à la procédure d’implantation d’électrodes, on administre de la un analgésique toutes les 12h. Ce traitement pourra être prolongé jusqu’au rétablissement de l’animal. L'expérimentateur pèsera les animaux chaque jour suivant la chirurgie pendant une semaine, puis une fois par semaine, et évaluera objectivement l'apparence physique de l'animal (convulsions, dos voûté) et son comportement (lenteur des mouvements) au moins une fois par semaine. Si une perte de poids supérieure à 20 pourcent chez l'animal adulte ou des signes de douleur sont notés, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Nous travaillerons sur une espèce animale: la souris. Notre choix a été motivé par des raisons scientifiques: (1) Nos études portent sur des modèles génétiques d'épilepsie nécessitant des modifications génétiques ciblées, possibles chez ces animaux. (2) L'établissement de lignées pures avec un fond génétique stable et homogène utilisées dans les laboratoires du monde entier permet la reproductibilité et la comparabilité des résultats et donc la réduction du nombre d’animaux. (3) Ces deux souches sont majoritairement utilisées pour modéliser les crises d’épilepsies. Elles ont donc été explorées de manière exhaustive de la molécule au comportement, permettant une solide base scientifique sur laquelle baser nos travaux. (4) Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les femelles gestantes seront utilisées à l’âge adulte (plus de 2 mois). Leurs embryons seront génétiquement modifiés à E14.5, afin de cibler la couche corticale 2-3. Pour les implantations et traitement, les animaux seront utilisés après sevrage (plus de P21), une fois que les souris sont autonomes afin de caractériser au plus tôt leur phénotype prévu épileptique.
Evaluation et traitement de la douleur dans un modèle de drépanocytose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 330 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une drépanocytose, elles subissent des crises vaso-occlusives déclenchées par une exposition à un air appauvri en oxygène pendant trois heures ou à une température de 10 °C pendant une heure, puis des tests de douleur tactile, thermique et de force musculaire, pour évaluer des candidats médicaments antalgiques. Le porteur indique que ces souris développent des douleurs qui augmentent avec l'âge, ce qui justifie leur mise à mort en fin de projet. Il affirme que ces conditions ne peuvent pas être reproduites in vitro et conclut à l'impossibilité de remplacer le modèle animal.
Objectifs
La drépanocytose est une pathologie génétique due à une mutation de l’un des gènes codant l’hémoglobine. Elle est caractérisée par la présence conjointe de globules rouges en forme de faucille et d’une anémie chronique hémolytique. Les cellules falciformes étant moins souples que les hématies normales, elles peuvent obstruer la circulation sanguine au niveau des capillaires, entraînant une réduction de l’alimentation en oxygène vers les tissus concernés. Cette obstruction peut provoquer des douleurs voire causer des lésions à différents organes (rate, reins, cerveau, os…). De plus, chez les patients atteints de drépanocytose, toute situation provoquant une augmentation de la consommation d’oxygène (e.g. exercice physique intense, localisation en altitude...) peut déclencher une crise dite vaso-occlusive (=crise drépanocytaire). Une crise vaso-occlusive est un épisode d’aggravation des symptômes qui peut se caractériser par l’aggravation soudaine de l’anémie, mais aussi par l’apparition ou l'augmentation des douleurs. L’objectif du projet consiste à évaluer des symptômes associés à la douleur, et tester des candidats médicaments pour réverser ces symptômes (allodynie / hyperalgésie tactile et thermale, hyperalgésie musculo-squelettique) dans un modèle de souris de drépanocytose (communément appelées souris SCD, pour sickle cell disease). Les douleurs et les traitements seront évalués en condition standard, et suite à un protocole de crise vaso-occlusive.
Bénéfices attendus
La drépanocytose, touchant tous les organes, peut causer de nombreuses complications. Les crises vaso-occlusives (CVO), se traduisant par des épisodes de douleurs souvent très intenses, constituent le symptôme majeur de cette maladie. Le traitement repose sur la prise de médicaments antalgiques en cas de douleurs intenses, mais peut nécessiter une hospitalisation lors des crises (notamment chez les enfants). Il n'existe à ce jour pas de traitement de fond satisfaisant de cette pathologie ; en cas de CVO très fréquentes, un traitement de fond reposant sur des transfusions ou la prise d'un traitement médicamenteux peut être proposé, mais ce traitement est accompagné d'importants effets secondaires parfois graves (aussi est-il proposé uniquement dans les formes les plus graves de la pathologie). Il apparait donc nécessaire de développer de nouveaux traitements qui permettraient de soulager les douleurs ressenties par les patients atteints de drépanocytose, voire de diminuer la fréquence de leurs crises, et ainsi d'améliorer leur qualité de vie. Ce projet permettra d'évaluer l'efficacité antalgique de candidats médicaments dans un modèle murin de drépanocytose.
Procédures
Une phase d'administration (durée de l'ordre de la minute) sera réalisée (principalement 1 fois (2 fois max) par jour; pendant 1 à 6 semaines en fonction de la spécificité du traitement). Les animaux seront soumis à des tests comportementaux permettant d'évaluer leur comportement général ainsi que leur seuil de réponse à des stimulations tactiles ou thermiques, et leur force musculaire. Ces tests dureront de 15 secondes à 5 minutes environ. Ils seront répétés maximum 8 fois en 2 semaines. Dans le cas des CVO, le déclencheur sera une exposition à un air moins concentré en oxygène pendant 3 h ou une exposition à une température ambiante de 10°C pendant 1 h. Les tests comportementaux seront réalisés 1 fois avant le déclenchement puis 3 fois en 24 h. Il n'est pas prévu de prélèvement sanguin en cours d'étude dans ce projet ; cependant, si cela devait s'avérer nécessaire, 1 seul microprélèvement veineux sera réalisé (durée de l'ordre de la minute).
Impact sur les animaux
Les souris Townes et Berkeley développent une maladie de type drépanocytose. Celle-ci se traduit par une modification des paramètres sanguins (augmentation des leucocytes, diminution de l'hématocrite, de l'hémoglobine...) et l'expression d'hématies de type drépanocytaire. Ces souris sont viables et fertiles mais il est attendu (et sera évalué dans ce projet) qu'elles présentent des douleurs, notamment en réponse à une stimulation (tactile ou thermique) ou suite à l'induction d'une crise vaso-occlusive. Les tests comportementaux, et plus particulièrement l'exposition à des conditions d'hypoxie ou à une température de 10°C, peuvent entraîner un stress le temps du test. Ce stress sera diminué au maximum grâce à des périodes d'habituation aux différents dispositifs.
Devenir
A l'issue des procédures de ce projet, tous les animaux sont euthanasiés car ils présentent une pathologie chronique et non curable pouvant leur causer des douleurs (qui selon la littérature peuvent augmenter avec l'âge).
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car les conséquences de la drépanocytose sont directement liées à l'impact de la présence d'hématies anormales sur la fonction de divers organes, et l'apparition des douleurs est fortement dépendante de certaines conditions (stimuli tactiles, thermiques, crises vaso-occlusives). Ces conditions spécifiques ne peuvent actuellement pas être reproduites in vitro, et l'étude de l'efficacité des traitements anti-douleur ou de la thérapie cellulaire nécessite l'utilisation d'animaux présentant cette pathologie. Cependant, dans la majorité des cas les traitements médicamenteux étudiés dans le cadre de ce projet ont été sélectionnés au cours d'études in vitro et/ou in silico avant leur évaluation chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose/effet ou la comparaison par rapport à une substance de référence. Quand pertinent, un groupe contrôle négatif (souris HbAA, exprimant des gènes normaux) pourra être ajouté. Un effectif acceptable sera défini afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. En fonction des paramètres étudiés (dans le cadre des différentes évaluations de douleurs), les tests paramétriques ou non paramétriques pertinents seront appliqués. Aussi, autant que cela sera possible sans affecter le bien-être des animaux, des prélèvements sanguins en cours d'étude seront envisagés, permettant ainsi de collecter des données biochimiques sur la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales pour réduire au maximum la souffrance animale est mis en oeuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de souffrance ou d'angoisse dépassant le cadre de l'étude. En cas de doute sur l’état général de l’animal, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu'au retour aux paramètres physiologiques normaux (ou attendus) ou jusqu’à atteinte des points limites. Un formulaire interne spécifique à l’espèce sera alors complété. Il intègre l’aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal quand il est approché ou stimulé, la respiration, l’appétit, le poids, l’état d’hydratation, les tremblements ou les convulsions, la présence de plaie, de tumeurs ou autres évènements imprévisibles. Ce formulaire de suivi des points limites permet de prendre les bonnes décisions en évitant toute souffrance animale. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans l'hébergement des animaux (e.g. sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères...). Ce projet est en développement dans notre établissement utilisateur, et une évaluation interne impliquant la cellule de bien-être animal sera demandée afin de permettre de réévaluer et d’adapter a posteriori la catégorie éthique et les méthodes de raffinement, si pertinent.
Choix des espèces
Les modèles étudiés dans le cadre de ce projet ont été choisis car sont des modèles transgéniques permettant de reproduire la drépanocytose chez la souris. Ces 2 modèles sont bien caractérisés dans la littérature. Ces animaux seront utilisés à l'âge adulte (il est notamment prévu de commencer les études autour de l'âge de 4 mois) car les douleurs sont décrites comme de plus en plus importantes avec l'âge.
Etude des fonctions des structures cérébrales des poissons téléostéens cichlidés
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
900 poissons cichlidés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie cérébrale d'environ une heure avec ouverture du crâne et lésion d'une structure, puis des tests comportementaux, avant euthanasie vingt jours plus tard pour prélever le cerveau. Le porteur reconnaît une récupération possiblement difficile après la longue anesthésie et des déficits moteurs liés à la lésion. Il affirme que ces trois espèces ne peuvent être remplacées et que la taille de leur cerveau, contrairement au poisson zèbre, rend la chirurgie possible.
Objectifs
Certains poissons téléostéens comme les Labres et les Cichlidés présentent des comportements semblables à ceux de l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau des cichlidés, en particulier les espèces Amatitlania nigrofasciata (A. nigrofasciata), Neolamprologus brichardi (N. brichardi), et Pseudotropheus zebra (P. zebra). Ces trois espèces ont des origines géographiques, une taille et des comportements différents. Les cerveaux des poissons téléostéens sont organisés de façon très différente par rapport aux cerveaux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. En particulier, une structure de la partie ventrale du cerveau, le lobe inférieur, n'existe que chez les téléostéens, et n’est pas retrouvée chez les mammifères ou les oiseaux. Les fonctions de cette structure demeurent inconnues, et nos travaux précédents suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans les fonctions cognitives remarquables des cichlidés et des labres. Mieux connaître la fonction du lobe inférieur chez les poissons téléostéens permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux aussi différents que ceux des téléostéens ont pu permettre l’émergence de comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Bénéfices attendus
Les cichlidés présentent des comportements assez complexes incluant certaines capacités cognitives dites de « haut niveau ». Cependant, les structures cérébrales impliquées demeurent méconnues. Afin d’expliquer comment les cerveaux des poissons produisent ces comportements, des études lésionnelles sont nécessaires. Nos études précédentes montrent que l'organisation globale du cerveau de poissons téléostéens est très différente de celle des tétrapodes, et que le lobe inférieur, une structure unique aux téléostéens, pourrait être impliquée dans ces comportements complexes. Cette étude lésionnelle permettra de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Procédures
Procédures chirurgicales durant environ une heure, puis tests comportementaux. Les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement du cerveau 20 jours après la chirurgie.
Impact sur les animaux
En plus de l'intervention chirurgicale, deux nuisances post opératoires potentielles sont attendues : une récupération potentiellement difficile dues à l'effet de la longue anesthésie ; et l’effet de la chirurgie elle-même : douleur potentielle, déficit moteurs liés à la lésion cérébrale.
Devenir
L'euthanasie des individus est nécessaire au prélèvement de leur cerveau pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet, permettant de visualiser précisément le site de chaque lésion.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées. Notre étude nécessite un échantillonnage d'espèces qui ont un grand cerveau avec des capacités cognitives de haut niveau, et qui possèdent un lobe inférieur développé, ce qui est le cas des cichlidés. Les tests comportementaux prévus ne peuvent être réalisé que sur ces animaux. Les trois espèces que nous souhaitons utiliser, A. nigrofasciata, N. brichardi, P.zebra, ont des comportements très différents et des cerveaux organisés de façon différentes. De ce fait, il est pertinent et nécessaire d'utiliser ces trois espèces de cichlidés.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses, et nous privilégierons des tests statistiques non-paramétriques (Mann Whitney U test, Kruskal Wallis, Wilcoxon) qui permettront de limiter le nombre d’individus nécessaires. Des études précédemment publiées chez les téléostéens nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être sera particulièrement observé par des zootechniciens compétents. La température de la pièce ainsi que son taux d’humidité seront surveillés. Lors de la chirurgie, après l'induction de l'anesthésie, une injection est pratiquée dans les muscles entourant la boite crânienne afin d'analgésier localement la zone avant la craniotomie (attendre 2 minutes avant incision). Après la chirurgie cérébrale, le bien-être des animaux est plus attentivement surveillé par des expérimentateurs compétents jusqu'à l’euthanasie des animaux (20 jours maximum après la chirurgie). Aussi, une communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs permettra un suivi adéquat des animaux. Pour surveiller la santé des animaux, des points limites seront utilisés, prenant en compte des comportements ou signes visibles. Dans le cas où des animaux montreraient des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Selon la gravité de ces signes, les animaux pourront être soignés via une analgésie dans l’eau de nage, ou si ce n'est pas possible de soigner, ils seront euthanasiés dans les délais les plus brefs. L’analgésie par bain plutôt que par injection en post opératoire a été choisi pour réduire le stress de l’animal, puisqu’une injection demanderait la manipulation du poisson (sortie de son aquarium, anesthésie, puis injection), ce qui produirait un stress trop important pour un poisson déjà en souffrance. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement avant l'opération chirurgicale pour fournir de l'enrichissement. Un contact visuel entre les poissons sera possible avant et après l’opération puisque les aquariums seront placés les uns à côté des autres. En revanche, aucun enrichissement n'est prévu au niveau de l'hébergement pour des raisons de sécurité lors de la récupération post-opératoire. En effet, les enrichissements traditionnels (tubes, cachettes), pourraient être utilisés par les poissons après leur chirurgie pour se frotter ou essayer de "gratter" le site de la chirurgie. Dans ce cas, le risque serait présent d'une réouverture de la plaie.
Choix des espèces
Les poissons téléostéens ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses anatomiques étudiant les structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez A. nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra, mais chaque espèce présente des comportements particuliers et qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude neuroanatomique de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser les chirurgies nécessaires à ce projet. L’utilisation de cichlidés, et en particulier de ces trois espèces, dont la taille du cerveau permet la chirurgie, semble donc toute indiquée. Nous travaillerons sur des jeunes adultes (taille du corps à partir de 3 cm) car il nous est nécessaire d’étudier un cerveau pleinement développé.
Etude du rôle des mastocytes embryonnaires dans la résistance à une envenimation de la mère
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
156 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les femelles gestantes et leurs petits tués à cinq jours et les mâles reproducteurs transférés vers d'autres expériences. Les femelles reçoivent une injection sous-cutanée de venin de crotale, avec pesées et prises de température rectales répétées, le venin provoquant œdème, hémorragie et nécrose musculaire locale. L'objet est de savoir si les mastocytes de l'embryon protègent le fœtus lors de l'envenimation de la mère. Le porteur affirme que la souris est un modèle incontournable pour cette étude, faute de modèle cellulaire satisfaisant.
Objectifs
Dans la nature, tous les mammifères possèdent des mastocytes, cellules immunitaires innées. Chez la souris et chez l'Homme, les mastocytes apparaissent tôt durant l'embryogénèse et colonisent les tissus dans lesquels ils seront retrouvés chez l'adulte. A l'âge adulte, il a été montré que les mastocytes sont responsables de la détoxification de multiples venins grâce à la sécrétion de protéases (enzymes qui décomposent les protéines et peptides), inactivant les protéines contenues dans ces venins mais, leur fonction dans l'embryon reste à ce jour inconnue. Dans ce projet, nous émettons donc l'hypothèse que l'apparition très précoce de cette population de cellules immunitaires durant l'embryogénèse pourrait conférer un "avantage évolutif" dans la protection des fœtus contre les agressions de type envenimation que pourrait subir la mère. Le but de ce projet sera donc de déterminer le rôle des mastocytes dans la protection du fœtus lors de l'envenimation de la mère et plus globalement comprendre pourquoi nous développons ce type de cellule immunitaire si tôt pendant l'embryogenèse.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait mettre en évidence pour la première fois l'implication des mastocytes du fœtus dans la protection de celui-ci contre une agression de type envenimation, et plus globalement comprendre pourquoi nous développons ce type de cellule immunitaire si tôt pendant l'embryogenèse.
Procédures
Les animaux seront soumis à : des prises de poids journalières 1 fois par jour (procédure d'environ 5 secondes par souris), une seule injection unique en sous cutané de venin de crotale (contention de l'animal puis procédure de 5 secondes) et des prises de température par thermomètre sonde rectale (6 fois pendant l'heure suivant l'injection de venin puis 1 fois toutes les heures pendant les 5 heures suivantes, cette procédure dure environ 10 secondes par prise de température).
Impact sur les animaux
Les doses de venin utilisées ne seront pas mortelles. Elles induisent cependant localement un œdème, une hémorragie et une nécrose musculaire partielles qui guérissent en quelques jours.
Devenir
Les souris mâles utilisées lors de la reproduction seront proposées à la communauté de l'institut afin qu'elles puissent servir à d'autres expérimentations. Les femelles gestantes et les souriceaux seront sacrifiés à J5 après la naissance afin d'analyser l'état d'activation des mastocytes dans différents organes. En effet, grâce à des données préliminaires du laboratoire, nous savons qu'à 5 jours de développement, nous sommes capables d'observer une activation des mastocytes par immunohistochimie si celle-ci a eu lieu.
Remplacement
Ce projet vise à étudier l'effet des mastocytes embryonnaires sur la protection des fœtus lors de l'envenimation par la mère. Il n'existe pas à ce jour de modèle cellulaire satisfaisant qui puisse rendre compte de ce phénomène. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier l'impact des mastocytes, in vivo.
Réduction
L'expérience du porteur du projet dans l'étude de l'effet des venins de serpents nous permet d'anticiper et d'optimiser le nombre d’animaux à analyser dans chaque modèle. Nous effectuerons l'analyse trois fois indépendamment sur la progéniture issue de 3 souris femelles hétérozygotes Sash accouplées à un mâle hétérozygote Sash. Les expériences qui seront réalisées, in vivo, ont été conçues de façon à n’utiliser que le nombre strictement minimum de souris nécessaire à l’obtention de données validées statistiquement (nombre déterminé sur la base de la littérature et une approche statistique). Les souriceaux seront sacrifiés à J5 après la naissance. En effet, grâce à des données préliminaires du laboratoire, nous savons qu'à 5 jours de développement, nous sommes capables d'observer une activation des mastocytes par immunohistochimie si celle-ci a eu lieu.
Raffinement
Lors de la mise en place des procédures expérimentales l’état clinique des animaux sera surveillé tous les jours. Nous analyserons les paramètres suivants : poids (prise du poids initial à l'arrivée des animaux puis suivi constant et régulier (tous le jours) lors de la gestation, température (par thermomètre sonde rectale toutes les 10 minutes pendant une heure après injection du venin puis toutes les deux heures jusque 6h après injection), signes extérieurs de stress tels que le comportement, la prostration ou l’aspect du pelage (poils luisant ou bien collé et gras etc). Si lors d’une procédure expérimentale nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine ou bien une perte de température corporelle de - 8°C (un critère courant de morbidité utilisé dans plusieurs modèles), les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le plus utilisé pour étudier la physiopathologie des maladies humaines. En effet, l’élevage de souris est très productif (avec une variation possible en fonction des fonds génétiques étudiés) et nécessite peu de place. Les connaissances et avancées technologiques actuelles permettent de disposer de nombreux modèles sophistiqués. D’ailleurs, les animaux qui portent la mutation c-kit (souris sash) nécessaires à la réalisation de ce projet sont uniquement disponibles chez la souris et sous un fond C57Bl/6 standardisé et bien contrôlé. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour la première procédure (accouplement) et les souriceaux issus de ces accouplements seront utilisés à J5 de développement. En effet, grâce à des données préliminaires du laboratoire, nous savons qu'à 5 jours de développement, nous sommes capables d'observer une activation des mastocytes par immunohistochimie si celle-ci a eu lieu dans l'embryon.
Évaluation du potentiel thérapeutique de la stimulation d’une modification protéique, la O-GlcNAcylation, dans le choc hémorragique chez le rat Wistar de 10 – 13 semaines
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
1 128 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, la moitié sous anesthésie sans réveil et la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'environ deux heures trente provoquant un choc hémorragique, un prélèvement de sang à la queue, puis une seconde chirurgie suivie de la mise à mort pour prélever sang et organes. Le porteur décrit un état de choc avec mobilité fortement réduite et absence de réaction aux stimuli, et indique que les rats trop douloureux sont sacrifiés en cours de protocole. Il conclut que ces réactions systémiques complexes rendent l'animal indispensable faute de méthode alternative.
Objectifs
Les buts du projet sont de 1) valider l’innocuité des molécules 2) valider une cinétique d’administration de molécules plus spécifiques et stables, 3) valider une dose d’administration de molécules plus spécifiques et stables, 4) valider une voie d’administration et enfin, de manière plus transversale, mieux comprendre les mécanismes dans lesquels est impliquée l’O-GlcNAcylation via l’identification de protéines cibles. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’O-GlcNAcylation dans l’état de choc hémorragique et potentiellement de développer une nouvelle stratégie thérapeutique.
Bénéfices attendus
Avec les différents résultats précédemment obtenus par l’équipe et celle de John C. Chatham, les résultats attendus sont une amélioration de la réponse inflammatoire, une amélioration de la fonction cardiovasculaire et des différents marqueurs de stress et ceux à différents temps d’administration, à différentes doses et selon les différentes voies d’injection. Ces résultats seront objectivés par l’étude in vivo de la fonction et du stress cardiovasculaire (pression artérielle, fréquence cardiaque), rénaux et hépatiques mais également par des tests biochimiques (RT-qPCR, Western blot) validant l’effet des molécules testées. Un bénéfice à très long terme peut être le développement d’une nouvelle approche thérapeutique dans la prise en charge du choc hémorragique.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 interventions. La première intervention consiste à la chirurgie permettant de développer le choc hémorragique (juste la chirurgie pour le groupe contrôle). Cette chirurgie durera environ 2h30 (sur la base des études précédemment menées). La seconde intervention consiste en un prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue sur un animal vigile. Cette intervention ne durera que quelques secondes. La troisième et dernière intervention consiste à la chirurgie permettant d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques de l’animal 24h après l’induction du choc. Cette chirurgie durera environ 10 minutes et sera suivi du sacrifice de l’animal pour prélèvement du sang et des organes de l’animal.
Impact sur les animaux
Le modèle de choc hémorragique est un modèle sévère. Au cours de ce protocole, l’état de santé des animaux va s’aggraver du fait du développement du choc hémorragique avec une mobilité fortement réduite, une absence de réaction aux stimuli sonores et toucher mais également une diminution de la prise alimentaire, sans toutefois de réel impact sur le poids, le protocole n’ayant une durée que de 24h. Enfin, une douleur peut être associée à la chirurgie réalisée sur l’animal. L’apparition de ces effets indésirables est environ 2 à 3h après l’induction du choc et jusqu’au sacrifice.
Devenir
En fin de procédure 1 (développement du choc hémorragique), les animaux présentant des signes de douleur trop importants seront sacrifiés. Seuls les animaux ne présentant pas des signes de douleur trop importants seront conservés pour la procédure 2. En fin de procédure 2, l’ensemble des animaux seront mis à mort pour prélever le sang et les organes pour effectuer des analyses.
Remplacement
Le choc hémorragique est une pathologie sans traitement et faisant intervenir des mécanismes complexes et intégrés, nécessitant impérativement l'utilisation de modèles animaux, en effet, les réactions systémiques complexes de l'organisme ne peuvent pas être reproduites in vitro sur des modèles cellulaires, rendant l'utilisation d'animaux indispensables pour mieux comprendre les mécanismes associés et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire notre modèle et évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude) qui ne nécessiteront pas l’utilisation de nouveaux animaux. Les rats utilisés sont des Wistar mâles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les différentes procédures expérimentales de la première étape (mise au point) seront réalisées sur des effectifs réduits afin de déterminer les conditions d’utilisation optimales. Dans un second temps, lorsque les conditions d'utilisation optimales auront été déterminées, les procédures seront réalisées sur un plus grand nombre d’animaux avec seulement les conditions sélectionnées dans la première étape. Afin de raffiner le modèle, des mesures seront mises en place afin de maximiser le confort des animaux par exemple avec la mise en place de scores et de points limites comprenant des critères morphologiques (aspect, comportement) et physiologiques (température, fréquence respiratoire, lactates), l’administration d‘un antidouleur en début de procédure (lidocaïne 2%, gouttes sur les zones d’incision (maximum de 0,49mL pour un rat de 350g), en fin de procédure (buprénorphine à 0,05 mg/kg) et à 8 heures post-chirurgie (buprénorphine à 0,05 mg/kg) est prévue et la réinjection d’une dose supplémentaire peut être considérée en cas de signe de douleur. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés par 2, dans des cages avec enrichissement, sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Après chirurgie, afin d’éviter au maximum le stress, les animaux seront placés dans la même cage. Un respect strict des cycles jour/nuit sera observé.
Choix des espèces
Ce modèle est, historiquement et actuellement, le plus utilisé et le mieux décrit. Sa proximité avec la symptomatologie du choc hémorragique chez l’Homme et sa très bonne reproductibilité font un modèle efficace pour cribler et valider l’efficacité des traitements. De plus l’ensemble des travaux et des résultats précédemment obtenus par l’équipe de JC Chatham sur l’étude du choc hémorragique ont été réalisé sur ce modèle, preuve de son utilisation et donc de la connaissance de ce modèle. Les rats utilisés sont des Wistar mâles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les effectifs sont choisis pour avoir une puissance statistique suffisante pour conclure sur nos résultats. Ils sont choisis sur la base des tests statistiques utilisés et de l'expérience de ce modèle, permettant de réduire le nombre d'animaux. 10-13 semaines – c’est un âge standard pour ce genre de manipulations.
Essai de thérapie cellulaire de la sclérose en plaques en utilisant des cellules B régulatrices chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune est induite sous anesthésie puis les souris reçoivent, selon dix-neuf protocoles, des injections de cellules régulatrices et d'autres composés, développant une paralysie ascendante des membres avant une phase de rémission. Le porteur indique que les souris sont mises à mort si elles perdent plus de 20 % de leur poids ou en cas de paralysie complète, et vise à faire de cette approche une thérapie pour guérir la sclérose en plaques. Il conclut que les migrations cellulaires en jeu ne sont pas modélisables in vitro.
Objectifs
L'objectif du projet est de caractériser l'effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B régulatrices dans un modèle de sclérose en plaques (SEP).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l’optimisation de cette approche pour en faire une thérapie pour guérir la SEP.
Procédures
L'EAE sera induit dans les 1608 souris sous anesthésie générale. Ces souris suivront 19 traitements différents. Le nombre de souris est indiqué pour chaque traitement additionnel: 1) 1 prélèvement de sang par veine mandibulaire, analyse J30: 24 souris 2) 1 injection Bregs, analyse J30: 624 souris 3) 1 injection Bregs, 1 prélèvement de sang par veine mandibulaire, analyse J30: 24 souris 4) Analyse J7: 24 souris 5) 1 injection Bregs, analyse J7: 72 souris 6) Analyse J10: 24 souris 7) 1 injection Bregs, analyse J10: 24 souris 8) Analyse J17: 24 souris. 9) 1 injection Bregs, analyse J17: 24 souris 10) Analyse J19: : 48 souris 11) 1 injection Bregs, analyse J19: 144 souris 12) Analyse J30: 264 souris 13) 1 injection Bregs, 4 injections TACI-Ig, analyse J30: 24 souris 14) 1 injection anti-CD25, 1 injection Bregs, analyse J30: 24 souris 15) 1 injection anti-CD25, analyse J30: 24 souris 16) 3 injections toxine diphtérique, analyse J30: 48 souris 17) 3 injections toxine diphtérique, 1 injection Breg, analyse J30: 24 souris 18) 4 gavages tamoxifène, analyse J30: 48 souris 19) 4 gavages tamoxifène, 1 injection Bregs, analyse J30: 48 souris.
Impact sur les animaux
L'induction de l'EAE est faite sous anesthésie générale. Le protocole d'induction de l'EAE par immunisation a été optimisé pour que la maladie entre en rémission, et pour réduire le nombre de souris requises, en rapport avec les 3Rs. Les souris développent la maladie vers J11 avec une phase de paralysie ascendante atteignant un maximum vers J17 puis une rémission avec récupération des fonctions motrices des quatre membres vers J22. L’évolution de la maladie est suivie de manière quotidienne sur un maximum de 30 jours, exceptionnellement 40 jours en cas de délai de développement. Nous employons une échelle de scores internationalement reconnue comprenant 6 stades. Les souris développent en général un score de 3 qui correspond à une paralysie partielle des membres postérieurs pendant quelques jours au pic de la maladie avant d’entrer en rémission et atteindre un score 2 correspondant à une démarche anormale vers J22. Ces souris restent donc mobiles et peuvent accéder à la nourriture et l'hydrogel placés au fond de la cage avant rémission des signes cliniques. Les souris souris seront systématiquement mises à mort si elles atteignent une perte de poids supérieure à 20%, ou bien une paralysie complète des membres postérieurs et partielle des membres antérieurs durant 24 heures, ou bien une paralysie complète des membres postérieurs et des membres antérieurs. Avant le développement de l'EAE, les souris sont suivies avec une grille de score incorporant poids, apparence et comportement. Les souris sont mises un mort lorsque l'un des critères ou la somme des critères dépasse un seuil limite tel qu'une perte de poids supérieure à 20%, ou bien un comportement très agité ou immobile ou avec automutilation, ou bien une apparence avec un poil très ébouriffé, des yeux plissés ou bridés, ou une posture anormale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que le statut de leur système immunitaire sera alors caractérisé.
Remplacement
Les protocoles expérimentaux nécessaires pour ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue de remplacement pour réduire le nombre de souris nécessaires. En outre, le protocole pour produire des Bregs a été sélectionné suite à un long travail d'optimisation in vitro afin de générer des cultures ne contenant que des Bregs. Les propriétés moléculaires de ces Bregs ont déjà été étudiées in vitro afin de réduire le recours à l'expérimentation animale. Ce projet vise à caractériser l’effet de Bregs dans un modèle de SEP. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires, et impliquent des processus d’interactions entre différents types cellulaires et de migrations cellulaires qui ne sont pas modélisables in vitro actuellement. Les maladies auto-immunes du SNC impliquent aussi la migration des cellules du système immunitaire dans le SNC, puis l’interaction de ces cellules avec des cellules résidentes du SNC. Ces processus ne sont également pas étudiables in vitro. Il n’y a donc pas d’alternative au fait de conduire les investigations décrites chez la souris.
Réduction
Le protocole d'induction de l'EAE a été optimisé de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Les mesures de remplacement et de raffinement décrites en 1 et en 3 ont également permis de réduire le nombre de souris nécessaires pour ce projet.Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum pour avoir des résultats statistiquement interprétables. Cest estimations sont basées sur notre expérience, et les estimations obtenues avec le programme d'analyse de puissance statistique G*Power.
Raffinement
Le protocole d'induction de l'EAE a été raffiné de manière à ce que les souris entrent en rémission rapidement après un court épisode clinique afin de réduire la souffrance des animaux. Le protocole a de plus été raffiné de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés par groupe de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés dans leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés tous les jours par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal, et les expérimentateurs. Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement.
Choix des espèces
Le modèle d’EAE chez la souris proposé est bien standardisé. Le savoir disponible sur ce modèle permet de mieux définir les plans d’expérience et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ce modèle, qui permettent d’aborder les problématiques posées de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d’information. Ce modèle expérimental a été utilisé pour le développement de thérapies aujourd’hui utilisées chez les patients atteints de SEP. Bien que ce modèle ne soit pas un calque parfait de la SEP, c’est un modèle utile pour le développement de pistes thérapeutiques pour cette pathologie humaine. L’utilisation de souris de fond génétique C57BL/6 de 6 à 14 semaines est appropriée pour ces études.
Altération de la myéline, activité cérébrale et cognition – étude pilote
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont six dans des procédures classées d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent de la cuprizone dans leur nourriture pour détruire la myéline de leur cerveau, subissent des craniotomies avec ou sans réveil pour enregistrer l'activité cérébrale, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour extraire le cerveau. Cette étude pilote cherche à relier renouvellement de la myéline et cognition, dans l'espoir lointain de mieux comprendre la sclérose en plaques et le vieillissement. Le porteur reconnaît l'absence de base statistique pour fixer le nombre d'animaux et conclut qu'aucune méthode ne remplace l'expérimentation animale.
Objectifs
Comprendre le fonctionnement du cerveau et traiter ses troubles nécessitent d’étudier cet organe complexe à plusieurs niveaux d’analyse, ce qui n'est pas encore possible sur des modèles in vitro. En l’absence d’alternatives adéquates, répondre à ces questions nécessite hélas encore à ce jour le recours à l’expérimentation animale. En apportant de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux impliqués dans la cognition, ce projet permettra à plus long-terme de mieux comprendre la sclérose en plaques ou bien les troubles associés au vieillissement.
Bénéfices attendus
En apportant de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux impliqués dans la cognition, ce projet permettra à plus long-terme de mieux comprendre la sclérose en plaques ou bien les troubles associés au vieillissement. Ce projet s’inscrit donc dans un cadre de santé publique.
Procédures
Les animaux seront soumis : - Traitement Cuprisone qui induit une démyélinisation transitoire ; ce traitement est donné dans la nourriture - Procédures chirurgicales (craniotomies) sans réveil sous anesthésie générales et analgésie afin d’enregistrer l’activité cérébrales avec des sondes adaptées - Procédures chirurgicales (craniotomies) sous anesthésie générale et analgésie avec réveil et traitement adapté de la douleur éventuelle, afin d’enregistrer l’activité cérébrales avec des sondes adaptées chez l’animal vigile - Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale et analgésie profondes dans le but d’extraire les cerveaux
Impact sur les animaux
Le modèle à la Cuprisone et les techniques d'enregistrement utilisés dans ce projet sont maitrisés depuis longtemps par les experimentateurs
Devenir
Procédure #1 : 10 souris traitées à la Cuprisone + 6 contrôles maintenues en vie. Procédure #2 : réutilise toutes les 16 souris issues de la procédure #1 10 souris traitées à la Cuprisone, dont 4 seront gardée en vie pour entrer dans la procédure #3 et 6 sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux ; 6 souris contrôles, dont 2 seront gardée en vie pour entrer dans la procédure #3 et 4 sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux. Procédure #3 : réutilise 4 souris traitées à la Cuprisone et 2 souris contrôles préalablement enregistrées dans la procédure #2. Elles entreront en fin de procédure dans la #4. Procédure #4 : réutilise les 6 souris issues de la procédure #3 où elles sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux.
Remplacement
Le cerveau est un des organes les plus complexes, et l’objectif de ce projet est de décrypter le lien possible entre le renouvellement physiologique et pathologique de la myéline. Le caractère méconnu du fonctionnement cérébral implique que ce projet ne peut pas se passer de l'utilisation d'animaux afin d'en déterminer les mécanismes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour réaliser ce travail.
Réduction
Il s’agit d’une étude pilote et il n’y a pas de bases statistiques pour définir le nombre d’animaux. Compte tenu du caractère individuel des lésions, l’unité expérimentale correspond à l’animal. Seulement deux groupes d’animaux (contrôles et traités) seront utilisés, et le nombre d’animaux par groupe a été optimisé à 6 et 10 respectivement pour réduire au minimum le nombre de souris tout en obtenant des résultats significatifs. Sur la base de notre expérience en neurophysiologie, nous estimons que 6 à 10 animaux par groupe représentent un nombre nécessaire et suffisant.
Raffinement
Ce projet propose des méthodes pertinentes pour limiter la douleur, la souffrance, le stress et l’inconfort. Nous avons mis en place des points limites adaptés et précoces pour chaque procédure (comme les interventions chirurgicales) et une réponse rapide (suivi post-opératoire, analgésie (Buprécare 0,05mg/kg/24h sCut et Metacam 1mg/kg/24h sCut), suivi quotidien des animaux). Tous les actes invasifs seront pratiqués sous anesthésie générale utilisant une association de kétamine-xylazine (100 mg/kg et 10mg/kg) - Buprécare 0,05mg/kg et ropivacaïne (2mg/kg). Le bien-être animal est aussi privilégié au niveau des conditions d'hébergement (animaux à plusieurs dans de grandes cages, eau et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en cartons et divers objets) pour minimiser le stress et être au plus près du comportement naturel de l'espèce animale.
Choix des espèces
La myéline compacte telle qu’on la trouve chez l’homme n’existe pas chez les Invertébrés ; c’est une « astuce » de l’évolution permettant d’accélérer la vitesse de conduction du signal en adéquation avec l’augmentation de la taille des organismes. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle animal vertébré. Parmi ceux-ci, les rongeurs sont particulièrement intéressants de par leur capacité à remyéliniser assez efficacement après lésion. Le modèle utilisant la Cuprisone chez la souris est le modèle de référence. De plus, les dynamiques cérébrales générales analysées dans ce projet sont conservées entre les rongeurs et l’Homme. Les résultats de notre étude permettront de mieux extrapoler les mécanismes cérébraux chez l’Homme. Les expérimentations seront initiées sur des souris adultes soit relativement jeunes (2-3 mois) soit plus âgés (6-8 mois), dont certaines seront conservés pendant 6 mois avant sacrifice (à ce moment les souris seront alors âgées de 8 à14 mois).
Plateforme comportement rongeur : Validation méthodologique et formation utilisateurs
- Enseignement supérieur
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 70
1 140 rongeurs, des souris et des rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 360 dans des procédures classées d'un niveau de souffrance sévère. Ils sont placés dans des tests de comportement dont la durée va de quelques minutes à plusieurs heures, répartis en trois classes de gravité sans que le résumé précise en quoi consiste le test sévère. Ces manipulations ne visent pas à produire des connaissances mais à valider les appareils d'une plateforme de comportement et à former ses utilisateurs. Le porteur affirme que le recours aux souris et aux rats est une "étape obligatoire" impossible à remplacer.
Objectifs
Le projet vise à 1- évaluer les tests comportementaux présents dans la plateforme, à valider les différentes méthodes possibles et de créer une base de données sur les modèles commerciaux couramment utilisés au sein de l'institut et 2- former les utilisateurs aux tests au sein de l'institut par petit groupe de 2-3 personnes maximum donnant lieu à un suivi des validations internes des personnels.
Bénéfices attendus
La plateforme a pour vocation de former les utilisateurs aux différents appareillages de mesure comportemental utilisés par ces derniers. Pour cela, la plateforme pourra mettre à disposition les lots d'animaux à des fins éducatives. Les données recueillies serviront de base aux analyses des utilisateurs de la plateforme
Procédures
Dans les trois procédures, de classe légère (procédure 1), de classe modérée (procédure 2) et de classe sévère (procédure 3), les animaux sont placés dans le test et la réponse comportemental est observée. La durée d'observation dépend du test et s'étale de quelques minutes à plusieurs heures en fonction du test
Impact sur les animaux
Aucun, nous utiliserons tous les méthodes adéquates pour l'hébergement et les grilles d'évaluation de la réponse comportementale en fonction des tests.
Devenir
Procédure 1 (comportement de classe légère) : euthanasie, procédure 2 (comportement de classe modérée), procédure 3 (comportement de classe sévère)
Remplacement
S’agissant d’une plateforme comportement rongeur, le recours à des souris et des rats est une étape obligatoire du processus. Il nous est impossible de substituer ces travaux avec d’autres méthodes n’utilisant pas ces animaux.
Réduction
le nombre d'animaux utilisés est réduit au maximum mais doit permettre une formation adéquate des utilisateurs
Raffinement
raffinement, les procédures prennent en compte des temps de récupération et des nombres d’essais visant à réduire le stress et la fatigue des animaux. les animaux sont hébergés en groupe jusqu'à 6 animaux par cage, dans un milieu enrichi avec un nid et une maisonnette si l'animal est hébergé individu. Le monittoring de la température, de l'hygrométrie ainsi que le suivi est réalisé quotidiennement
Choix des espèces
la plateforme est dédiée à l’étude comportementale des rongeurs. Notre projet nécessite donc l’utilisation de souris et de rats. Les animaux seront utilisés après sevrage et jusqu’à 24 mois . Nous réaliserons la formation des utilisateurs en fonction de la thématique de recherche et des modèles animaux utilisé: par exemple maladie d'Alzheimer avec des animaux de plus de 10 mois et maladie de Charcot avec des animaux au sevrage et 2/3 mois, dans ce cas les animaux sont identifié par tatouage car génotypé entre P10-P115. Pour l'évaluation et la validation des aspects méthodologiques de ces tests comportementaux, nous utiliserons des modèles commerciaux de 2 /3 mois. Dans ce cas, les animaux ne sont pas génotypés et sont marqués sur la queue avec un stylo.
Evaluation préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires articulaires chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 6300
29 500 rongeurs, des souris et des rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont plus de vingt-sept mille dans des procédures classées d'un niveau de souffrance sévère. On leur provoque une polyarthrite rhumatoïde par injections de collagène dans la queue ou une arthrite psoriasique par un vecteur viral, ce qui gonfle et enflamme les articulations, puis on leur administre des composés par gavage. Le projet sert à évaluer des candidats médicaments anti-inflammatoires déjà criblés sur cellules. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours aux modèles animaux et renvoie les bénéfices pour les patients à un horizon lointain.
Objectifs
Les maladies inflammatoires articulaires peuvent divisées en en deux catégories, la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’arthrite psoriasique (AP). - La PR est une maladie auto-immune plurifactorielles qui survient vers 45 ans avec une prévalence de 0.5-0.8% de la population générale. - L’AP est une forme d’arthrite inflammatoire qui survient ordinairement chez des personnes atteintes d’un psoriasis. De 10 à 30 % des personnes atteintes de psoriasis seront atteintes d’AP. Cette pathologie touche autant les hommes que les femmes et se manifeste généralement entre 20 et 50 ans. Il n’existe aucun moyen de guérir l’AP, mais grâce à un diagnostic précoce et à un traitement approprié, il est possible de maîtriser la maladie et de prévenir les lésions articulaires graves. Ces deux maladies inflammatoires articulaires se caractérisent par une atteinte et une dégradation osseuse de l’articulation conduisant à un enraidissement douloureux puis à une incapacité du patient à mobiliser l’articulation affectée. De nombreux patients ne répondent pas aux traitements actuels qui reposent sur les antiinflammatoires non-stéroïdiens, les corticoïdes et les immunosuppresseurs, des anticorps monoclonaux anti-CD20, des anti-TNFa ou encore des anti-IL-6. Des traitements plus performants sont nécessaires. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de maladie inflammatoire articulaire.. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules utilisées chez les animaux ont préalablement été testées et validées in vitro.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et d’arthrite psoriasique.
Procédures
Dans ce projet, les souris recevront 2 injections indradermiques de collagène dans la queue pour les modèles de polyarthrite rhumatoïde. Un modèle AP inductible par une unique injection intraveineuse d'une vecteur viral codant une cytokine pro-inflammatoire sera également utilisé chez la souris. Nous utiliserons également des souris génétiquement modifiées ne présentant pas de phénotype dommageable. Les composés seront administrés par gavage. Un prélévement sanguin sera également éffectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés.
Impact sur les animaux
Les animaux developperont les signes cliniques de la la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’arthrite psoriasique (AP) qui se caractérisent un gonflemment et une inflammation des articulations du poignet et des doigts.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptée à l'espèce. Le réalisateur s’assurera de la mort effective de l’animal avant l’élimination du cadavre. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro.
Réduction
Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analgesie sera prévu. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature
Projet Fibrose
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1550
11 000 rongeurs, des souris et des rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chez une partie, des fibroses du poumon, du foie, du rein ou de la peau sont provoquées de façon accélérée, et tous reçoivent des composés par voie orale, intra-péritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse une à deux fois par jour pendant six à huit semaines, avec prélèvements sanguins et chirurgies. Le projet teste des molécules anti-fibrose en vue de leur développement clinique et de leur "mise sur le marché". Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à des modèles animaux reproduisant la pathologie humaine, que les tests sur cellules ne remplacent pas.
Objectifs
A ce jour, aucun médicament utilisé dans le traitement de la fibrose n'a permis de reverser et/ou stopper complètement une fibrose établie sur le plan histologique ou clinique. Le but des expérimentations mises en place est de développer des molécules pouvant ralentir et/ou stopper le développement de la fibrose dans nos modèles expérimentaux.
Bénéfices attendus
A ce jour, aucun médicament utilisé dans le traitement de la fibrose chez l’homme n'a permis de reverser et/ou stopper complètement une fibrose établie sur le plan histologique ou clinique. Toute fibrose confondue représente 45% des décès dans les pays développés. Le but des expérimentations mises en place est de développer des molécules pouvant ralentir et/ou stopper le développement de la fibrose dans nos modèles expérimentaux. Les différentes procédures utilisées dans ce projet vont nous permettre d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des différentes fibroses. Elles vont également nous permettre, en support du travail réalisé in vitro, la recherche et la validation de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de la fibrose. De plus ces procédures nous permettront, une fois une cible identifiée, de développer de petites molécules permettant de reverser et/ou stopper le développement de la fibrose et aussi d’évaluer des combinaisons thérapeutiques afin d’augmenter l’efficacité ou de limiter les effets non désirables de certains composés prometteurs pour le traitement de la fibrose. L’ensemble de ces travaux a pour but d’avancer au maximum le développement préclinique de traitement anti-fibrotique en vue de leur développement clinique et leur mise sur le marché.
Procédures
Les gestes techniques réalisés sur animaux se pratiquent sur rats et souris, vigiles ou anesthésiés. - Sur animaux vigiles : o Identification individuelle (oreille, queue, patte). Tous les animaux de ce projet sont concernés par au moins un type d’identification. o Administration de composés par voies orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse. Ces gestes concernent la totalité des animaux de ce projet. Les administrations par voies orale, péritonéale et sous-cutanée peuvent être réalisées une à deux fois par jour, pendant 6 à 8 semaines. Les administrations par voie intraveineuse peuvent être réalisées une à deux fois par semaine, pendant 6 à 8 semaines. -Sur animaux anesthésiés par voie gazeuse ou par voie systémique : oAdministration par voie oropharyngée. Acte unique. oAdministration par voie sous-cutanée. Acte réalisé au maximum 5 fois par semaine, pendant 4 semaines. oPrélèvements sanguins intermédiaires au maximum 4 fois par animal ou terminaux. Ils sont réalisés en respectant les recommandations en termes de volumes et temps de récupération. Tous les animaux de ce projet sont concernés. oMises à mort par une méthode règlementaire ou une méthode validée par un comité d’éthique. Tous les animaux de ce projet sont concernés. oChirurgie (acte unique). Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas.
Impact sur les animaux
Quatre procédures décrivent des modèles de fibroses (pulmonaire, hépatique, rénale et dermique) qui, par conséquent, recréées de façon accélérée le développement de ces pathologies. Ces modèles sont bien caractérisés dans nos laboratoires et n’engendrent pas d’effets indésirables autres que ceux liés aux modèles eux-mêmes. Nous ne nous attendons pas à avoir d’effets indésirables dans nos modèles lorsque nous évaluons des composés car ils ont pour but de guérir la fibrose et ont, en amont de nos modèles, démontré une efficacité dans nos tests in vitro. Ils sont également passés dans des études de pharmacocinétique vitro puis vivo durant lesquels les composés qui auraient montré des effets indésirables sont écartés. Toutefois en cas d’éventuels signes cliniques observés, le traitement serait suspendu ou adapté. Sans amélioration, les animaux seraient mis à mort. Des points limites sont définis pour chaque procédure afin d’anticiper les actions à mettre en œuvre et de préserver leur bien-être.
Devenir
La mise à mort des animaux à l’issue des procédures est indispensable afin de pouvoir prélever le sang et les organes et réaliser les analyses permettant de répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Pour tester l’activité in vivo des composés issus du screening cellulaire in vitro, il est indispensable de recourir à l’utilisation de modèles animaux reproduisant le plus possible la pathologie humaine, qui intègrent toute la complexité des réactions physiologiques (interactions intercellulaires, inter-organes, inflammations…). Tous les modèles utilisés sont très bien décrits dans la littérature scientifique et ont été validés avec des composés qui ont montré leur efficacité chez l’homme dans des études cliniques. Le processus de screening des composés est réalisé sur des tests cellulaires ou non-cellulaires in vitro. Ces tests permettent de réduire le nombre de composés à tester chez l’animal mais ne permettent malheureusement pas de se passer des modèles animaux.
Réduction
La sélection des composés est faite en utilisant des tests cellulaires ou non cellulaires in vitro. Seules les molécules présentant une activité sur les tests in-vitro et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront testées sur les animaux. Ce système permet de réduire considérablement le nombre de molécules testées chez l’animal et donc le nombre d’animaux utilisés. Seuls les modèles animaux, bien décrits et validés par la communauté scientifique sont réalisés. En règle générale, 8 à 12 animaux sont utilisés par groupe (1 groupe par composé à tester incluant le véhicule du composé). Une analyse de variance à 1 ou 2 facteur(s) suivi d’un test de Dunnett comparant le véhicule avec le composé à tester permettent de mesurer si l’effet du composé est significatif. L’étude est répétée une deuxième fois pour évaluer la reproductibilité du test.
Raffinement
Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. Ils sont observés tous les jours et leur état clinique est évalué au minimum deux fois par semaine. Les conditions de chaque procédure expérimentale sont étudiées individuellement par la Structure Chargée du Bien-Être Animal (SBEA) qui émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. Les animaux affaiblis sont maintenus dans des conditions aménagées facilitant l’accès à l’aliment et à l’eau de boisson (par exemple ajout d’eau gélifiée).
Choix des espèces
En pharmacocinétique, la souris puis le rat sont les espèces standards dans les premières phases de recherche et développement de nouveaux candidats médicaments. Le rat est choisi pour les molécules les plus intéressantes, afin de commencer la comparaison pharmacocinétique inter espèce, ainsi que de préparer les études de toxicologie futures. En pharmacologie, la souris est l’espèce recommandée et largement utilisée pour les premières étapes de la recherche. Elle permet de réduire les quantités de composés nécessaires à l’évaluation de leur efficacité. Les souris génétiquement modifiées permettent de valider de façon plus spécifique certains mécanismes d’action. Les modèles de fibrose ainsi que les études de pharmacocinétique sont réalisés avec des animaux juvéniles à adultes qui permettent une bonne évaluation de leur efficacité et la détermination de l’exposition des composés.
Elevage et procréation d’animaux pour l’étude d’anomalies génétiques chez le bovin
- Recherche appliquée
- Maladies animales
235 bovins vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance de léger à sévère, la plupart tués à l'issue et 25 réutilisés. Le projet fait naître des veaux porteurs de variants génétiques par collecte d'embryons, collecte de semence, synchronisation et transfert embryonnaire, pour étudier des anomalies présentes naturellement dans certaines races. Une fois le nombre de fœtus ou de veaux atteint, les animaux porteurs de l'anomalie sont euthanasiés puis autopsiés, et les vaches receveuses gestantes abattues en abattoir commercial pour récupérer le fœtus. Le porteur présente ces gestes comme des pratiques d'élevage courantes et revendique le bovin comme "animal modèle" plus proche de l'humain que la souris.
Objectifs
Ce projet vise à procréer des bovins porteurs de variants génétiques suspectés d’être responsables d’anomalies génétiques, détectés dans le cadre de différents projets de recherche en cours ou à venir sur ce thème.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à étudier chez le bovin l’effet de mutations apparues naturellement dans cette espèce et à améliorer notre connaissance de la fonction de gènes impactés. Dans le cas de mutations présentant des similitudes avec des syndrômes humains, le bovin peut alors servir d'animal modèle, plus proche de l'homme que la souris par exemple.
Procédures
Les animaux seront soumis, selon leur sexe, à des procédures de reproduction classiquement utilisées en élevage telles que collecte d'embryons, collecte de semence, synchronisation et transfert embryonnaire. Du sang leur sera également prélevé une fois.
Impact sur les animaux
Lélevage et les procédures appliquées aux animaux de ce projet ne diffèrent pas de pratiques d'élevage classiques.
Devenir
Lorsque le nombre de foetus ou de veaux nécessaires à l'étude de l'anomalie sera atteint, les animaux porteurs de l'anomalie d'intérêt seront euthanasiés et soumis à des prélèvements post mortem afin d'étudier les symptômes de l'anomalie. De même, les vaches receveuses qui seront gestantes à l'issue du transfert et dont on souhaite récupérer le foetus seront abattues dans un abattoir commercial. Les porteuses qui donneront naissance à un veau pourront être réutilisées.
Remplacement
L’expérimentation sur les animaux sera remplacée tant que possible par des études in vitro et in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux étudié par anomalie sera réduit au strict nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables (nmax=10 cas et 10 contrôles). Les animaux cas et contrôles analysés seront tous issus d'un même père voire des mêmes parents si possible, afin de réduire la variabilité de leur fond génétique et la variabilité phénotypique qu'elle peut induire à l'intérieur de chaque groupe. Notre choix se portera sur l'étude de variants et anomalies génétiques à pénétrance complète, i.e. pour lesquelles tous les animaux du groupe cas sont sensés exprimer des symptômes, et donc réduire le nombre d'animaux nécessaire à la mise en évidence d'un effet significativement différent. Un effet sexe sera pris en compte dans les analyses.
Raffinement
Quel que soit l’âge des animaux étudiés, les prélèvements invasifs ne sont effectués que post-mortem. Les conditions d'hébergement, d'alimentation, de prophylaxie et de traitement des animaux sont peu ou pas modifiées par la mise en oeuvre du projet. Les divers prélèvements seront assurés par du personnel expérimenté, avec du matériel et une contention adaptés.
Choix des espèces
Les mutations étudiées sont présentes naturellement dans certaines races bovines et nous disposons dans cette espèce de tous les outils nécessaires pour étudier leurs conséquences phénotypiques. Recréer ces mutations à l’identique dans des espèces modèles conventionnelles (souris, rat, etc.) serait techniquement difficile et pas toujours pertinent en fonction des symptômes attendus. En fonction de l’anomalie étudiée, les animaux seront utilisés au stade fœtal dans le premier tiers de la gestation ou après la naissance. Dans ce cas ils seront conservés jusqu’à attendre l’âge de produire des gamètes (environ 15 à 24 mois). Enfin les mères porteuses des embryons seront des vaches en fin de carrière productive destinées à la réforme, en bon état physiologique et capables de recevoir des embryons.
Impact de l’incubation à basse température des œufs embryonnés de truite arc-en-ciel
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 356 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère. Elles subissent un stress de confinement à 200 kg par m3 pendant quatre minutes puis un stress thermique où l'eau est chauffée jusqu'à leur faire perdre l'équilibre, un test qui dure sept à dix heures. Une partie est mise à mort sans sédation préalable pour éviter une hausse artefactuelle du cortisol, le reste en raison de la sévérité de la procédure. Le projet évalue les effets d'une pratique d'élevage, incuber les œufs au froid pour ajuster l'offre à la demande des clients, et le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative in vitro maitrisée".
Objectifs
Une pratique courante des sélectionneurs français est d’incuber les oeillés (œufs embryonnés) de truite arc-en-ciel, l’espèce piscicole majeure de la filière française, à basse température (2-4°C) pendant des durées pouvant aller jusqu’à 2-3 semaines. Ceci leur permet de ralentir le développement embryonnaire et ainsi de pouvoir s’adapter à la demande des clients. Or, les conséquences d’une telle pratique n’ont jamais été évaluées. L’objectif général de ce projet est d’étudier les conséquences de l’incubation à basse température (3°C) des oeillés de truite arc-en-ciel. En effet, des études récentes ont montré que l’exposition précoce à des stimuli environnementaux (tels que l’hypoxie ou la température) pouvait avoir un impact sur la physiologie des poissons à plus ou moins long terme. Plusieurs mécanismes peuvent être sous-jacents à cette programmation, parmi eux les modifications des patrons d’expression de gènes et les régulations épigénétiques comme par exemple la méthylation de l’ADN. Dans ce projet, l’impact d’un stimulus précoce (ici température froide pendant le développement embryonnaire) sera évalué sur plusieurs caractères d’intérêt aquacole, à savoir les performances zootechniques (survie, croissance et malformations), le métabolisme intermédiaire, le développement du muscle et sa qualité ainsi que la résistance à des stress ultérieurs (température et confinement). Nous essaierons également de comprendre par quels biais l’exposition précoce au froid peut impacter la physiologie des poissons ultérieurement, en analysant les patrons d’expression génique et la méthylation de l’ADN.
Bénéfices attendus
Ce projet se basera sur l’utilisation d’un modèle biologique tout à fait pertinent, deux lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipide du muscle : lignée grasse (LG) et lignée maigre (LM). Ces deux lignées expérimentales divergentes constituent un modèle biologique de choix dans ce projet, en effet elles ont montré une utilisation différente de l’énergie et possèdent un métabolisme intermédiaire (en particulier en ce qui concerne les lipides et les glucides) bien différencié, surtout au niveau hépatique, nous faisons l’hypothèse qu’elles réagissent différemment à l’effet du froid pendant l’incubation. La comparaison de ces deux lignées expérimentales divergentes permettra d’évaluer en quoi le fond génétique peut avoir un impact dans cette modulation de la physiologie des poissons par des stimuli environnementaux subis précocement. Sur le plan scientifique, Ce projet, en combinant plusieurs niveaux d’analyse, phénotypique (caractères d’intérêt aquacole) à moléculaire (expression de gènes et méthylation de l’ADN), permettra d’étudier comment une programmation peut s’établir par le biais de modifications des patrons d’expression de gènes et de régulations épigénétiques. Ces connaissances seront utiles à l’avenir pour l’étude d’autres stress précoces.
Procédures
Test de résistance un stress aigu de confinement: le stress de confinement consiste à pêcher puis augmenter la densité des poissons (200kg/m3) dans un seau, sans renouvellement d’eau ni ajout d’oxygène pendant 4 minutes. les poissons sont remis en bac d'élevage à l'issue du test pour une phase de récupération. 12 tests avec 36 poissons chacun seront réalisées. Mise à mort dérogatoire par surdose d'anesthésiant : Après un temps de récupération, les poissons ayant subi le stress aigu de confinement sont mis à mort sans sédation préalable. La perte totale de réactivité et l'arrêt des battements operculaires précédent immédiatement la mort qui intervient dans les 2-3 minutes. Test de résistance à un stress aigu de température : la température est élevée très progressivement de la température d’élevage de 11 °C environ (environ 1° par 20 min jusqu’à 22 °C, puis 0.1 °C par 10-15 min jusqu’à la perte d’équilibre du poisson. Les poissons sont observés en permanence, ils sont retirés du bac avec une épuisette dès qu’ils perdent l’équilibre pendant plus de 5 secondes et le poisson est ensuite mis à mort. Le test dure au total 7 à 10 heures. 3 tests de de 200 poissons seront réalisées.
Impact sur les animaux
Une partie des poissons de ce projet subiront un stress aigu généré par un confinement à une densité de 200kg/m3 pendant 4 minutes, suivi d'une phase de récupération à une densité inférieure à 200kg/m3. Les poissons prélevés pour la mesure de l'axe corticotrope subiront un stress généré par une mise à mort sans sédation préalable. Tandis que des poissons subiront un stress aigu généré par une élévation très progressive de la température de l'eau d'élevage de 11 °C environ (environ 1° par 20 min jusqu’à 22 °C, puis 0.1 °C par 10-15 min jusqu’à la perte d’équilibre du poisson. Ils sont alors retirés du bac avec une épuisette s’ils perdent l’équilibre pendant plus de 5 secondes et mis à mort. Le test dure au total 7 à 10 heures.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables de projet ou par les responsables du projet eux-mêmes. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés. Tous les éléments justifiant leur mise à mort sont conservés et transmis à la SBEA de l'établissement et au vétérinaire référent de l'établissement, ainsi qu’au responsable du projet. Le cortisol plasmatique augmentant de façon artéfactuelle, une mise à mort est nécessaire (procédure n°3) pour les poissons utilisés pour mesurer la réponse de l'axe corticotrope (procédure n°1 test de résistance à un stress aigu de confinement). Les poissons utilisés pour la procédure n°2 (test de résistance à un stress aigu de température) seront mis à mort en raison de la sévérité de la procédure, il n'est pas envisageable de les garder en vie.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé qu’in vivo. Il n’y a pas d’alternative in vitro maitrisée pour caractériser les capacités d’adaptation de la truite en réponse à un stress de confinement ou de température. Il existe en effet quelques publications sur la mise en place de tests in vitro de température ; cependant à ce jour, les corrélations entre tests in vitro et tests in vivo ne sont pas suffisantes pour pouvoir justifier de remplacer les tests in vivo par ces tests in vitro. De plus, l’objectif appliqué étant d’améliorer le bien-être des poissons d’élevage pour promouvoir une aquaculture durable, il est nécessaire de mesurer les capacités d’adaptation des poissons dans un milieu d’élevage proche de l’élevage commercial.
Réduction
Nous avons recours à un matériel biologique original, les lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipide du muscle, que nous allons mutualiser avec d’autres chercheurs (physiologistes du muscle et du métabolisme intermédiaire notamment). Nous avons réduit le nombre d'animaux au minimum nécessaire pour avoir une puissance statistique suffisante. Le nombre d'animaux impliqués correspond au strict minimum requis pour déterminer avec le plus de précision possible la loi de distribution des caractères ciblés et ainsi d'être mieux en mesure de différencier statistiquement les caractéristiques de chaque lignée. Ces chiffres permettent de s'assurer de la robustesse de nos analyses statistiques et nous semblent être un minimum pour mettre en oeuvre une analyse de variance fiable.
Raffinement
Avant et pendant les procédures, une surveillance du comportement des animaux est effectuée pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse subies. Le stress aigu de confinement est de courte durée (4 minutes) et permet de mesurer la réponse de l'axe corticotrope chez les poissons exposés. Les poissons sont ensuite remis dans un bassin d'élevage pour une phase récupération avant leur mise à mort. Le stress aigu de température dure environ 7 -10 h (procédure sévère), et les poissons sont observés en continu et dès que l’un d’entre eux perd l’équilibre plus de 5 secondes, il est pêché et mis à mort.
Choix des espèces
La truite arc en ciel est l’espèce principalement étudiée au laboratoire. Il s’agit d’une des espèces les plus élevées en Europe et particulièrement en France. En outre, il s’agit d’un modèle biologique largement étudié dans de nombreuses disciplines, offrant des possibilités de collaboration variées. Les truites arc-en-ciel sont utilisées au stade juvénile (animaux non matures). Ce stade est plus sensible aux stress que les poissons maturants.