Procédures sévères

1 440 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit une chirurgie cérébrale sous anesthésie pour l'injection bilatérale d'une neurotoxine détruisant les neurones dopaminergiques, afin de reproduire la maladie de Parkinson, puis reçoit des candidats-médicaments et passe jusqu'à sept tests comportementaux mesurant l'activité, la motricité, l'anxiété, la résignation et la mémoire. Le porteur indique une perte de poids post-opératoire, une cicatrice crânienne et des effets secondaires des molécules testées. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne suffit et qu'un "organisme entier" est nécessaire pour modéliser la maladie.

Objectifs

Chez l’homme, la maladie de Parkinson est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente après la maladie d’Alzheimer. Elle touche actuellement plus de 10 millions de personnes dans le monde et son impact socio-économique est en constante augmentation due à l’allongement de la durée de vie. La maladie de Parkinson se caractérise par l’apparition de troubles moteurs importants causés par la mort des neurones dopaminergiques dans une région particulière du cerveau appelée substance noire compacte. Cette maladie se caractérise également par des symptômes non moteurs tels que : perte de l’odorat, dépression, troubles du sommeil et de l’humeur, anxiété, addiction, hallucination, etc. L’objectif de ce projet est de modéliser la maladie de Parkinson en injectant la 6-hydroxydopamine (6-OHDA), un analogue de la dopamine, dans le cerveau de rat afin de reproduire la destruction sélective des neurones dopaminergiques dans la même région cérébrale que chez l’homme. Ce modèle permettra d’évaluer le potentiel thérapeutique de candidats-médicaments via l’utilisation de tests comportementaux spécifiques sur différents symptômes non moteurs de la maladie (anxiété, dépression, troubles cognitifs). Le développement de modèles animaux de maladies neurodégénératives est indispensable pour la réalisation de futurs essais thérapeutiques chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la mise au point de nouveaux médicaments pour traiter les symptômes de la maladie de Parkinson. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (rat) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendus.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale permettant l’injection de 6-OHDA dans le cerveau, protocole qui dure maximum 1h30. Cette technique est composée d’un protocole chirurgical et analgésique maîtrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au minimum. Après trois semaines de récupération post-anesthésie, des candidats-médicaments seront administrés aux animaux durant l’étude afin d’évaluer leurs effets sur les symptômes non-moteurs du modèle via différents tests de comportements (~2 minutes par administration). Les candidats médicaments pourront être administrés par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, souscutanée ou intramusculaire. Les animaux (vigiles ou anesthésiés) pourront également être soumis à des prélèvements de sang (~2 minutes par prélévement). Les animaux pourront être utilisés dans sept tests de comportements différents avec au maximum 5 tests par semaine pendant 5 semaine. Chaque test dure entre 5 minutes et 90 minutes. Ces tests permettent de mesurer l'activité spontanée, la motricité, l'anxiété, la résignation et la mémoire.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux subiront plusieurs effets indésirables : perte de poids transitoire post-opératoire, cicatrice au niveau de la tête, effets secondaires des candidats-médicaments, douleur équivalente à une piqûre pour un prélèvement de sang et/ou administration de candidats-médicaments. Les animaux pourront être utilisés dans sept tests de comportements différents, ce qui implique de les déplacer de leur cage vers un nouvel environnement.

Devenir

A l’issue des tests de comportements, les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes, comme le cerveau, ce qui permettra d'évaluer la lésion cérébrale réalisée et l'éventuel impact d’un candidat-médicament sur cette lésion. Les animaux seraient également euthanasiés si des effets indésirables étaient provoqués par les candidats-médicaments et atteindraient les points limites fixés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les symptômes non-moteurs de la maladie de Parkinson. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

En se basant sur la littérature et une évaluation rétrospective de notre précédent projet, nous avons été en mesure d’établir un nombre minimal et suffisant d’animaux requis afin d’obtenir des résultats rigoureux et significativement pertinents. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours aux procédures les moins invasives possibles, la détermination des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, un protocole analgésique adapté pour l’injection et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un candidat-médicament sur les symptômes non-moteurs liés à la maladie de Parkinson. En effet, pour modéliser la physiopathologie associée à la maladie de Parkinson nous avons besoin d’un organisme entier afin de réaliser une évaluation comportementale avec des tests fiables, reproductibles, validés et reconnus par la communauté scientifique. Ce projet utilisera uniquement des animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent sous anesthésie une injection de cellules macrophagiques destinée à reproduire une maladie articulaire rare, la synovite villonodulaire pigmentée, et sont suivies jusqu'à douze semaines. Le porteur indique qu'elles peuvent développer un gonflement articulaire, une gêne à la marche et une douleur prises en charge par une médication. Il affirme que cette maladie ne peut pas être étudiée in vitro en raison du nombre de cellules impliquées et vise à disposer d'un modèle murin pour développer de nouveaux médicaments.

Objectifs

La synovite villonodulaire pigmentée (PVNS) est une maladie articulaire rare dont l'incidence est estimée à 14 par million d’habitants. Elle affecte les grosses articulations en premier lieu le genou. La PVNS est une lésion cancéreuse bénigne de l’articulation entraînant une réaction inflammatoire, des douleurs et des destructions articulaires. Il a été montré que seule quelques cellules mutées sont présentes dans l’articulation et que la majeure partie de, l’articulation est infiltrée par des cellules inflammatoires réactionnelles, les macrophages. Au vu de cette composante inflammatoire majeure, la PVNS présente des similitudes avec la polyarthrite rhumatoïde. Les seules options thérapeutiques sont aujourd’hui la chirurgie et quelques traitements systémiques peu efficaces, de ce fait le risque de récidive reste très élevé et la PVNS a un impact majeur sur la qualité de vie des patients. En effet, plus de 50% de récidive a été rapporté sur le long terme après chirurgie. L’objectif du projet est de disposer d’un modèle de PVNS chez la souris permettant le développement de nouveaux médicaments

Bénéfices attendus

La mise en place d’un modèle de PVNS chez la souris permettra le développement de nouveaux traitements et d’améliorer la prise en charge des patients PVNS.

Procédures

Au début de la procédure, les animaux seront anesthésiés par anesthésie gazeuse pour une durée maximale de 10 minutes. Au cours de cette période ils recevront une injection d’une suspension de cellules macrophagiques qui durera moins d’une minute. La durée totale maximale de la procédure sera de 12 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront avoir un gonflement d’une articulation avec une gène à la marche et une douleur qui seront pris en charge par une médication adaptée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir évaluer la perte de masse osseuse post-mortem

Remplacement

La spécificité de la maladie PVNS chez l’homme qui se développe dans l’articulation et autour de l’articumation ne peut pas être déterminée par des tests in vitro en raison du grand nombre de cellules impliquées provenant de l’articulation, de l’os et du système immunitaire et de la pression mécanique.

Réduction

Pour évaluer la croissance tumorale et la dégradation osseuse chaque souris sera son propre contrôle grâce aux stratégies d’analyses non invasives par radiographie et par mesure au pied à coulisse au début et tout au long de la procédure. De plus à l’aide d’approches statistiques nous avons calculé le nombre minmal d’animaux par groupe.

Raffinement

Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (maison rouge, coton) renouvelé une fois par semaine. Afin de permettre l’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, les souris seront placées en stabulation durant deux semaines au sein de l’animalerie d’accueil sous surveillance journalière. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des principaux signes physiologiques, comportementaux et de l’apparence de l’animal. Les animaux seront pris en charge au premier signe d’inconfort. La douleur sera traitée à l’aide d’analgésiques et les prises de mesures régulières seront effectuées sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Les souris adultes BALB/C âgées de 8 semaines. Ces souris disposent d’un système immunitaire complet nécessaire à l’étude de la progression tumorale intra-articulaire.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une inflammation est déclenchée chez elles, aiguë par injection de lipopolysaccharide ou chronique par des anticorps anti-collagène, puis elles reçoivent chaque jour de la curcumine ou de l'amarante, avec des prélèvements sanguins et des passages sous anesthésie pour l'imagerie osseuse. Le porteur indique que l'inflammation aiguë provoque un état fiévreux et une perte osseuse et que l'inflammation chronique provoque des gonflements articulaires, la douleur étant censée être atténuée par du paracétamol dans l'eau de boisson. Il affirme que la complexité du tissu osseux rend ces effets "impossibles à reproduire in vitro".

Objectifs

Les maladies inflammatoires sous formes aigües ou chroniques induisent fréquemment la dégradation des articulations et des os. Ces maladies induisent des douleurs conduisant à une dégradation importante de la qualité de vie des patients. La mise en place de nouveaux traitements permettant de stopper la dégradation osseuse dans ces conditions constitue une priorité de santé publique. Le projet a pour objectif d’étudier de nouveaux traitements. Le recours à un modèle animal est nécessaire en raison de la complexité du processus de progression de la maladie qui est impossible à reproduire in vitro. Le projet a pour objectif de tester l’effet protecteur de la curcumine et de l’amarante sur la dégradation ostéoarticulaire dans deux conditions inflammatoires différentes, l’inflammation aigüe et l’inflammation chronique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra le développement de nouveaux traitements permettant de bloquer l’inflammation et la dégradation osseuse chez les patients atteints d’inflammation articulaire aigüe et chronique suite à une infection bactérienne et chez les patients souffrant de polyarthrite rhumatoïde.

Procédures

Le projet est constitué de deux procédures. Au début de la procédure 1, les animaux recevront une un traitement de lypopolisaccharide qui durera moins d’une minute, puis de façon quotidienne avec la curcumine ou l’amarante avec des interventions qui dureront moins d'une minute chacune. La procédure 1 a une durée totale de 7 jours. Au début de la procédure 2, les animaux recevront un traitement avec une solution d’anticorps anti-collagène qui durera moins d’une minute puis quotidiennement avec la curcumine ou l’amarante avec des interventions qui dureront moins d'une minute chacune. La durée totale de la procédure 2 sera de 28 jours. Un prélèvement sanguin qui durera moins d'une minute sera réalisé en fin de chacune des deux procédures, et à J+14 pour la procédure 2. Dans les deux procédures les animaux seront anesthésiés pendant 10 minutes par anesthésie gazeuse en début et en fin de procédure afin de procéder à l’analyse non invasive du tissu osseux par microtomographie.

Impact sur les animaux

Dans le cas de la procédure 1, le projet vise à induire une inflammation aigüe qui se caractérise par un état fiévreux transitoire et par une chute de la masse osseuse. L’intensité de la douleur sera atténuée par l’ajout de paracétamol dans l’eau de boisson durant la totalité de la procédure. De plus, dans le but de réduire l’exposition des animaux au stress et à la douleur, la procédure 1 sera arrêtée 7 jours après l’induction de l’inflammation. Dans le cas de la procédure 2, le projet vise à induire une inflammation chronique qui se caractérise par des gonflements articulaires et une chute de la masse osseuse. La durée de la procédure 2 est de 28 jours. Nous avons choisi le modèle d’inflammatoire chronique induite par des anticorps car c’est un modèle transitoire qui présente une diminution spontanée de l’inflammation au cours de la deuxième partie de la procédure. L’intensité de la douleur sera atténuée par l’ajout de paracétamol dans l’eau de boisson durant la totalité de la procédure incluant l’ensemble des phases de développement et de diminution de l’inflammation. Les effets attendus pour chaque procédure sont une réduction de l’inflammation et de la perte osseuse dans les groupes d’animaux recevant les différents traitements par rapport au groupe contrôle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir évaluer la perte de masse osseuse post-mortem.

Remplacement

L’influence que peuvent avoir la curcumine et l’amarante sur l’inflammation aigüe ou chronique ou sur la dégradation du tissus osseux induite par l’inflammation aigüe ou chronique ne peut pas être appréciée par des tests in vitro car le tissu osseux est très complexe, impossible à reproduire in vitro car il fait intervenir un grand nombre de cellules différentes présentes dans le tissu osseux qui dialoguent entre-elles parmi lesquelles les ostéoblastes, les ostéoclastes, les ostéocytes, les chondrocytes du cartilagine articulaire et tout cela sous le contrôle des cellules du système immunitaire et du système endocrinien.

Réduction

Pour évaluer la perte osseuse chaque souris sera son propre contrôle grâce à la stratégie d’analyse non invasive à l'aide d'un scanner au début et à la fin de chaque procédure. De plus, à l’aide d’approches statistiques nous avons calculé le nombre minimal d’animaux par groupe.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (maison rouge, coton) renouvelé une fois par semaine. Afin de permettre l’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, les souris seront placées en stabulation durant deux semaines au sein de l’animalerie d’accueil sous surveillance journalière. La prise en charge de l’état de bien être des souris sera effectuée quotidiennement par l’observation des principaux signes physiologiques, comportementaux et de l’apparence de l’animal. Nous utiliserons une grille de score de bien-être incluant des points limites qui permettront la prise en charge adaptée dès les premiers signes d’inconfort. Nous mettrons des récipients contenant de l’eau et de la nourriture au fond des cages en cas d'inconfort. La douleur sera traitée à l’aide d’analgésiques et les prises de mesures régulières sur les chevilles seront effectuées sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Nous avons choisi les souris adultes BALB/C âgées de 10 semaines car elles sont adultes et disposent d’un système immunitaire complet nécessaire à l’étude de l’inflammation.

1 200 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après un jeûne de seize heures, chaque animal reçoit par voie orale une dose unique d'un des cinquante composés testés puis est observé quatorze jours avant euthanasie et autopsie, pour évaluer la toxicité de nouveaux aliments. Le porteur précise qu'aucun traitement antidouleur ne peut être administré dans une étude de toxicité, un animal convulsant ou paralysé étant mis à mort. Il retient les femelles, jugées plus sensibles, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet d'évaluer la toxicité sur un "organisme entier".

Objectifs

La toxicité est la mesure de la capacité d’une substance à provoquer des effets néfastes et mauvais pour la santé ou la survie chez toute forme de vie (animale telles qu’un être humain, végétale, bactérienne...), qu'il s'agisse de la vitalité de l'entité ou d'une de ses parties (ex: foie, reins, poumons.... chez l'animal). La toxicité orale aiguë est l'effet néfaste qui se produit dans un court laps de temps et qui résulte de l'administration par voie orale d'une dose unique d'une substance. Une étude de toxicité aiguë aboutit classiquement à la détermination de la dose maximale tolérée (DMT). La DMT orale est la valeur dérivée d'une dose unique de substance dont l'administration par voie orale peut provoquer la mort de 50 % des animaux d'expérience. C'est une technique exploratoire, permettant de "trier" les produits les plus toxiques et le but d’une étude de toxicité orale aiguë est d'évaluer les effets d'une forte exposition, préalablement à la réalisation d’études de toxicité avec une exposition pendant 90 jours. L’objectif de ce projet d’une durée de 5 ans, réalisé selon les exigences réglementaires de lignes directrices, sera d’évaluer la toxicité éventuelle de 50 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments, administrés par voie orale en traitement unique en prenant une dose de départ selon les données d’études in vitro effectuées au préalable. Ces études seront réalisées chez des rats femelles uniquement, celles-ci étant considérées comme étant plus sensibles que les mâles aux effets toxiques potentiels de substances. Après mise à jeun la veille au soir, les animaux seront traités le lendemain matin par une administration orale unique de chacun des composés à tester. Les animaux seront ensuite observés et évalués pendant 8 heures après l’administration orale de chacun des 50 composés à évaluer, l’aliment usuel étant redonné 3 heures après l’administration orale, puis les animaux seront observés deux fois par jour au minimum au cours des 14 jours de suivi, week-end et jours fériés compris, afin de détecter tout comportement anormal ou atteinte de point limite pouvant nécessiter leur euthanasie. Les animaux seront pesés régulièrement pendant les 14 jours de suivi jusqu’à leur euthanasie avant la réalisation d'une autopsie macroscopique.

Bénéfices attendus

Un nouvel aliment, appelé également Novel Food, reste défini dans le Règlement de l'Union Européenne comme étant un aliment pour lequel la consommation humaine est restée négligeable dans l’Union Européenne avant le 15 Mai 1997, lorsque la première réglementation sur les nouveaux aliments est entrée en vigueur. Les nouveaux aliments ne peuvent pas être mis sur le marché ou utilisés dans des denrées alimentaires destinées à la consommation humaine tant qu’ils ne sont pas inscrits sur la liste de l’Union Européenne, qui stipule les spécifications du nouvel aliment et ses conditions d’utilisation dont la notion de dose, et regroupant les nouveaux aliments autorisés à être mis sur le marché dans l’Union Européenne. Une demande dite Novel Food doit prouver la sécurité du nouvel aliment et sera transmise aux autorités pour évaluation. Un tel dossier a pour objectif de caractériser le nouvel aliment et prouver sa sécurité à travers des tests toxicologiques notamment. L’enjeu social est donc de prouver l’absence éventuelle de toxicité des 50 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments pour une utilisation future chez l’homme et d’un point de vue économique de permettre le développement de la consommation de ces 50 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments par l’industrie agro-alimentaire afin de proposer de nouvelles solutions pour l’alimentation de demain.

Procédures

La totalité des rats utilisés dans ce projet, entre 300 et 1200 au maximum, sera soumise à une mise à jeun de 16 heures (20h00-12h00), une administration orale unique d’un composé à évaluer effectuée sur animale vigile nécessitant une dizaine de secondes pour être réalisée, à des observations régulières, chaque heure pendant 8 heures puis 2 fois par jour pendant 14 jours suivant l’administration orale, avec la réalisation de tests de réflexe de retournement, 1 par heure pendant 8 heures suivant l’administration orale unique effectuée, réalisé en moins d’une minute à chaque fois.

Impact sur les animaux

Au cours de l’évaluation de la toxicité orale aiguë de 45 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments que nous avons menée sur un projet précédemment autorisé, après administration d’une forte dose unique de chacun de ces composés, nous n’avons observé aucun signe de toxicité pour l’ensemble de ces 45 composés évalués, aucune perte de poids significative, aucun comportement anomal, et surtout aucune mortalité ni directe ni retardée. Les observations effectuées sur l’ensemble des organes et tissus après euthanasie des animaux n’ont jamais montré d’anomalies liées à l’administration des 45 composés évalués, en dehors de quelques anomalies spontanées retrouvées dans la souche de rat même sans aucun traitement. Nous ne devrions pas non plus observer de toxicité pour les 50 nouveaux composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments que nous serons amenés à évaluer dans ce projet, d'autant que des points limites stricts et spécifiques à celui-ci seront suivis afin de ne pas observer de mortalité ou dans de très rares cas.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 1200 rats au maximum nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiés avant la réalisation d’une autopsie macroscopique des organes et tissus pour s'assurer de l'innocuité des composés testés.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer la toxicité d’ingrédients et d’aliments sur un organisme entier. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ces évaluations toxicologiques permettant d’obtenir des résultats prédictifs quant aux objectifs envisagés, selon les recommandations internationales en vigueur. La dose de départ la plus élevée possible sera déterminée sur la base des résultats d’études in vitro effectuées sur les composés à évaluer afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux. Ainsi, et sur la base de l’évaluation de la toxicité orale aiguë de 45 composés naturels, ingrédients et nouveaux aliments que nous avons menée sur un projet pécédemment autorisé et pour laquelle nous n’avons observé aucun signe de toxicité pour l’ensemble de ces 45 composés évalués à partir d’une dose de départ de 2000 mg/kg correspondant à la dose limite à utiliser, nous devrions avoir à utiliser seulement 6 animaux pour chacun des 50 nouveaux composés à évaluer, soit un maximum de 300 animaux. Cependant, en cas de toxicité avérée, ce nombre pourrait être porté au maximum à 24 animaux pour chacun des 50 nouveaux composés à évaluer, soit un maximum de 1200 animaux. Aucune analyse statistique ne sera effectuée pour l’ensemble de ce projet.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’administration orale des composés à évaluer et à la suite de celle-ci. Les animaux seront ainsi observés chaque heure pendant 8 heures après l’administration orale de chacun des 50 composés à évaluer, l’aliment usuel sera redonné 3 heures après l’administration orale, avec réalisation d’un test de réflexe de retournement toutes les heures. Ils seront ensuite observés deux fois par jour au minimum au cours des 14 jours de suivi, week-end et jours fériés compris, afin de détecter tout comportement anormal ou atteinte de point limite. Les animaux seront pesés régulièrement pendant les 14 jours de suivi jusqu’à leur euthanasie avant la réalisation d’une autopsie macroscopique. Etant donné qu’il s’agit d’études de toxicité, aucune médication ne pourra être donnée aux animaux pour soulager leur éventuelle souffrance. Par contre si un animal présente un niveau de souffrance trop important se traduisant par des tremblements importants (convulsions), une paralysie, une immobilité complète, un arrêt de prise alimentaire…, il sera mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. Le jour et l’heure de son euthanasie seront notés avec le plus de précision possible et une autopise macroscopique sera réalisée pour détecter toute anomalie en terme de forme, taille et couleur sur l’ensemble des organes et tissus des cavités abdominales et thoraciques et de la surface corporelle. Une analyse des organes et tissus anormaux observés, prélevés et fixés sera réalisée. Les rats seront hébergés par 3 dans des cages transparentes (48x27x20 cm), avec pour enrichissement une maisonnette ouverte (16x15x9 cm), en matière spéciale certifiée sans contaminant, transparente, lavable, et suffisamment grande pour que les 3 rats puissent s’y positionner dessous. Cet enrichissement sera toutefois retiré lors de la mise à jeun des animaux jusqu’à la remise de l’aliment usuel dans la cage, soit pendant une durée de 16 heures, pour éviter qu’ils ne le grignotent et ingèrent des particules pouvant induire un effet toxique. Les rats étant des animaux nocturnes, actifs donc la nuit, ils seront placés en cycle de lumière jour/nuit inversé (obscurité de 8h00 à 20h00) pour respecter leur rythme biologique et observer leur comportement pendant leur phase active.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet et celle qui est recommandée par les lignes directrices suivies pour mener de telles études de toxicité orale aiguë. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 8 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9 semaines pour le démarrage des expérimentations, avec un poids de 175-200 g. Cela correspond au poids de rat recommandé par les lignes directrices qui seront suivies pour mener de telles études.

245 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie cardiaque d'environ 80 minutes sous anesthésie générale pour provoquer un infarctus du myocarde, une injection de molécules testées, puis une mise à mort dans les 24 heures pour prélever le cœur. Le porteur indique qu'un infarctus massif peut conduire au décès de l'animal pendant la chirurgie et que des points limites encadrent les complications au réveil. Il affirme les modèles in vitro "inadaptés" à l'étude de ces voies de signalisation et espère reproduire par voie pharmacologique une cardioprotection qui, obtenue par conditionnement ischémique, n'est pas applicable en clinique.

Objectifs

La sévérité de l'infarctus du myocarde peut être réduit, expérimentalement, en réalisant de très courtes séquences « d'occlusion-désocclusion » de l'artère coronaire avant de la désocclure définitivement. Cette méthode de "cardioprotection" s'appelle le " conditionnement ischémique" et n'est malheureusement pas adapté à la clinique. Il y a donc un besoin médical à pouvoir mimer cet effet cardioprotecteur par d'autres stratégies, dont la pharmacologie. Cela nécessite néanmoins de bien comprendre les mécanismes moléculaires à l'œuvre dans la cardioprotection. Ce projet de recherche vise à identifier les mécanismes moléculaires qui participent à la modulation bénéfique de la réponse inflammatoire contrôlée par le conditionnement ischémique. En cas de réussite du projet, nous espérons identifier une nouvelle stratégie de traitement de l'infarctus du myocarde, qui puisse être transférée vers la clinique.

Bénéfices attendus

Du point de vue clinique, l'infarctus du myocarde est encore aujourd'hui l'une des principales causes de décès dans le monde et le facteur principal de développement de l'insuffisance cardiaque dans les pays développés. Ce projet permettra d'identifier des cibles moléculaires d'intérêt visant à mimer pharmacologiquement (applicable chez l’Homme) la protection générée par le conditionnement post-ischémique (non applicable chez l’Homme) de sorte à reproduire l’effet cardioprotecteur chez le patient humain

Procédures

L’expérimentation consiste en une chirurgie cardiaque sous anesthésie générale profonde et analgésie adaptée (durée : environ 80mn). Pour certains groupes expérimentaux, une injection intraveineuse de molécules tests non toxiques est prévue pendant la chirurgie (

Impact sur les animaux

La chirurgie est réalisée intégralement sous anesthésie générale profonde et analgésie adaptée. Les conséquences directes d’un infarctus massif conduisent à un décès rapide pendant la chirurgie (sous anesthésie et analgésie). Les complications au réveil sont rares et connues et font donc l’objet d’un suivi adapté et de points limites établis en conséquence pour permettre d’interrompre l’expérimentation en cas de douleur/stress/angoisse/dommage durable que nous ne serions pas en mesure de supprimer ou soulager.

Devenir

Les animaux sont mis à mort dans chaque procédure car les mesures effectuées nécessitent le prélèvement du cœur (pour les mesures de tailles d’infarctus ou les analyses du tissu cardiaque)

Remplacement

Des données préliminaires obtenues in vitro ne correspondent pas du tout à ce qui est connu in vivo dans la littérature, nous laissant penser que les modèles in vitro classiquement utilisés sont inadaptés pour l’étude des voies de signalisations dans ce contexte particulier d’infarctus. Par ailleurs, Il est question dans cette étude de mesurer un effet généralisé sur tous les types cellulaires composant le tissu cardiaque. Le recours à l’animal est donc nécessaire. Néanmoins, afin de limiter l'utilisation des animaux, lors d’une partie préliminaire à ce projet, la mise au point d'analyses et la caractérisation des doses efficaces des molécules d’intérêt ont été réalisées sur cellules (ex vivo). Suite à celle-ci, une phase test a été réalisée pour vérifier l'absence de toxicité aigüe et la réalité de l'efficacité de l'injection de ces molécules d’intérêt chez les animaux. La stratégie de recherche développée par l'équipe inclue, depuis plusieurs années, la standardisation des protocoles, de sorte à pouvoir réutiliser les données dans des « méta-analyses ». Ce projet s'inscrit dans cette même stratégie.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux, les différents temps choisis pour l’infarctus seront basés sur une précédente étude mise en place au laboratoire. Les effectifs ont été calculés au plus juste (tests statistiques) pour permettre l’exploitation des résultats. Les différentes étapes se succèdent, permettant de réajuster si besoin à chaque étape en fonction des résultats de l’étape précédente (en réduisant les effectifs prévus initialement, en abandonnant la réalisation d’un groupe expérimental qui s’avèrerait finalement superflu ou en arrêtant le projet, en cas de résultats non concluants). De même, quand cela est possible, la réduction du nombre de groupes expérimentaux est réalisée. Enfin, des données obtenues lors de précédents projets seront utilisées pour éviter d’avoir à réaliser certains groupes dans ce projet. Les échantillons organiques résiduels sont conservés dans une « biobanque » (banque d’échantillons), de sorte à pouvoir être ré-exploités autant que possible, 1) pour répondre aux questions des rapporteurs validant la publication de l'article, 2) pour réaliser des tests préliminaires servant à construire de futurs projets. Deux mises au point seront réalisées dans ce projet, de sorte à augmenter notre capacité d'exploitation des prélèvements et permettre ainsi d'obtenir plus d'informations avec un nombre d'animaux restreint. Si cette approche fonctionne, elle pourra être appliquée aux futurs projets.

Raffinement

Pour réduire au maximum la souffrance et la douleur imputables à la chirurgie, cette dernière est effectuée sous anesthésie profonde et couverture analgésique adaptée. Une attention particulière est apportée aux soins post-opératoires des animaux. Un suivi renforcé dans les heures suivant le réveil est assuré à l'aide d'une fiche d'observation éprouvée, spécifique à cette chirurgie, consistant en la détermination d'un score de symptômes bien déterminés, dans le but d'intervenir de manière rapide et efficace, le cas échéant, en concertation avec le chef de projet et le vétérinaire référent. Le fait de réaliser les prélèvements au plus tard 24h après la chirurgie, permet de s’affranchir des complications éventuelles à long terme d’un infarctus du myocarde.

Choix des espèces

Le modèle murin d’infarctus, parfaitement maîtrisé au laboratoire, permet de reproduire et d'étudier au mieux l'infarctus du myocarde. Il a été largement éprouvé dans la littérature, et est particulièrement adapté à l'étude des voies de signalisations. C'est par ailleurs ce modèle qui a été utilisé lors de la précédente étude, sur laquelle nous nous sommes appuyés pour choisir les temps clefs d'ischémie-reperfusion. Le recours au même modèle permettra ainsi de mettre en corrélation les résultats obtenus. L'expérimentation portera sur des animaux de 8 à 14 semaines, afin de comparer les résultats avec ceux obtenus dans le laboratoire, en particulier ceux du précédent projet.

150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent l'implantation d'une canule à travers le crâne, puis jusqu'à huit applications d'une protéine sur les méninges pour déclencher une douleur de type migraine, avec mesures de sensibilité par filaments et jets d'air sur la face et isolement en cage individuelle pendant deux semaines. Le porteur décrit une douleur qu'il qualifie de modérée et à laquelle l'animal peut se soustraire, les rats étant tués pour prélever le cerveau. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace ce protocole, l'intégration de la douleur mobilisant de nombreuses régions nerveuses.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle de migraine en se basant sur les derniers résultats scientifiques et la clinique. Ainsi pour être au plus proche de la réalité clinique, nous souhaitons utiliser une petite protéine (qui est libérée au niveau des méninges pendant la migraine) en application sur les méninges pour provoquer l’activation des circuits de la douleur impliqués dans la migraine chez le rat. Pendant la phase « mal de tête », la douleur ne peut être générée qu’au niveau des méninges puisqu’il n’existe pas de récepteurs à la douleur dans le cerveau. Nous évaluerons les effets de cette petite protéine au niveau du comportement, mais également en utilisant des marqueurs d’activation neuronale chez le mâle et la femelle. Nous souhaitons comparer d’une part l’activation des régions du système nerveux central chez les mâles et les femelles pour voir s’il y a des différences entre les mâles et les femelles, mais aussi en fonction des variations hormonales qui ont lieu pendant le cycle sexuel chez la femelle.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de développer un modèle animal plus proche de la clinique et des dernières études scientifiques. Ceci devrait nous aider par la suite à mieux comprendre les mécanismes d’intégration de la douleur méningée au niveau du système nerveux périphérique et central chez les mâles et les femelles. En effet la migraine touche plus les femmes que les hommes, mais les études ont été majoritairement réalisées chez les mâles. Pourtant, il est connu qu’il existe des différences d’intégration inhérentes au sexe et au cycle hormonal. Ainsi à moyen terme, identifier les différences ainsi que le rôle des différentes régions cérébrales dans ce nouveau modèle murin de migraine nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A plus long terme, mieux comprendre la pathologie peut nous aider à développer de nouveaux traitements qui pourraient mieux soulager les patients en tenant compte des différences hommes/femmes.

Procédures

Les animaux seront soumis à 1 intervention chirurgicale qui consiste à implanter une canule juste au-dessus des méninges en passant à travers l’os du crâne, pour appliquer à la surface des méninges une petite protéine, ce qui permettra de mimer ce qui se passe pendant les crises de migraines. Les chirurgies sont réalisées chez les animaux anesthésiés. Chaque chirurgie dure environ 30 à 45 min. Injection de la petite protéine sur les méninges afin de mimer les crises de migraine: 8 injections (au maximum) tous les 2 ou 3 jours ; l'injection se fait sous anesthésie brève et dure moins de 2 min ; réveil des animaux en 5 min. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air sur la face ou la patte arrière toutes les 15 min pendant 4 h après l'injection des molécules sur la dure-mère (chaque application dure 3 secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois.

Impact sur les animaux

Nous réalisons une procédure chirurgicale (implantation de la canule). La douleur est prise en charge en post-opératoire. Par ailleurs, nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments fins ou le jet d’air induisent un retrait de la face signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure 3 secondes maximum. Un autre effet indésirable est l’obligation de séparer les animaux (un par cage) après la chirurgie pour la mise en place de la canule. En effet, si les animaux restent ensemble, ils arrachent les canules. Ils sont donc seuls dans une cage pendant 2 semaines.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau: les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Cependant, l’expérience montre qu'un certain nombre d'échecs est rencontré lors des études qui incluent une chirurgie (perforation des méninges, anesthésie, canules bouchées, échec de l'habituation) soit des échecs dans environ 20% des cas, ce qui nous amène à prendre 10 animaux par groupe. Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles.

Raffinement

Les nuisances identifiées sur le bien-être des animaux sont : la douleur engendrée par la chirurgie, la douleur engendrée dans le cadre du modèle, et la séparation des animaux après la mise en place de la canule sur les méninges. Afin de réduire la douleur de la chirurgie, un traitement avec un antalgique est donné pendant 3 jours. Pour éviter le dessèchement de la cornée pendant la chirurgie, la cornée est protégée par de la vaseline pendant toute cette étape. Concernant la douleur générée par l’application des filaments de Von Frey, nous respectons les recommandations de l'International Association for the Study of Pain (IASP). Nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Pour améliorer le bien-être des animaux après la chirurgie, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher avant la chirurgie. Après l’implantation de la canule, les animaux seront seuls dans une cage pour éviter de s’arracher les canules. Les rouleaux seront remplacés (risque d’arracher la canule) par des feuilles de sopalin blanc et des lanières de papier kraft pour permettre aux animaux de faire un nid. Après l’implantation de la canule, les animaux seront seuls dans une cage pour éviter de s’arracher les canules. Les rouleaux seront remplacés (risque d’arracher la canule) par des feuilles de sopalin blanc pour permettre aux animaux de faire un nid.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les rats sont considérés comme adultes.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie au cou pour injecter des caillots dans une artère et provoquer un accident vasculaire cérébral, puis reçoivent un traitement et sont soumis à des tests comportementaux jusqu'à vingt-huit jours, avant prélèvement du cerveau. Le porteur assume viser une gravité sévère avec paralysie et déficits moteurs, tout en cherchant à maintenir les rats dans un état jugé "acceptable" sur le plan éthique. Il affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne peut modéliser la complexité de l'AVC humain.

Objectifs

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la 2ème cause de mortalité dans le monde. Environ 80% des AVC sont induits par une interruption de la circulation sanguine dans le cerveau. A l’heure actuelle, un seul médicament est préconisé dans cette pathologie mais il possède de nombreuses limites : efficalité limitée et risque de complication avec aggravation des symptômes. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra le développement de nouveaux traitements dans la lutte contre l’AVC chez l’Homme.

Procédures

Les 300 animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir injecter des caillots sanguins dans une artère pour induire l’accident vasculaire cérébral (AVC). Cet acte chirurgical durera 40 minutes sous anesthésie générale. Deux heures plus tard, sur animaux vigiles, un traitement sera administré. Avant et après chirurgie, un prélèvement sanguin sera réalisé sur animaux vigiles. Des séries de tests comportementaux, s’étalant de J2 à J28 post AVC, seront réalisés pour une durée totale de 15 minutes maximum. Enfin, à la fin du projet, le cerveau sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à un traitement pour limiter cette douleur.

Impact sur les animaux

L’hébergement en cage individuelle des animaux induits, nécessaire durant les 72h suivant la chirurgie, pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture ou le cathéter nécessaire au traitement, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes. Le modèle par définition reproduit les effets d’un AVC à savoir : déficit moteur et lésions cérébrales. Cela peut occasionnellement entrainer des pertes d’équilibre, une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion et une atteinte des fonctions motrices. L’AVC est un évènement grave chez un patient et sa survie est engagée. Le modèle d’étude chez l’animal présente, lors de l’induction et durant les 48 premières heures suivant l’induction, des signes cliniques d’inconfort manifestes (paralysie). Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé et une mise à mort en conformité avec les recommandations éthiques. Pour évaluer les effets de notre produit, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique en conservant toute pertinence scientifique.

Devenir

Procédure expérimentale n°1 (seule procédure expérimentale) : tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort 3 ou 28 jours après l’induction de l’AVC, c’est-à-dire à la fin de la procédure expérimentale 1.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas de prédire l’efficacité d’un traitement dans le cadre d’une intervention visant par exemple à limiter la taille des lésions cérébrales au cours d’un AVC chez l’Homme. Le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux chez l’Homme ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez le rat. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Sur la base de notre expérience de ce modèle, le nombre de rats utilisé pour chaque étude est réduit au minimum et révisé à la baisse au fur et à mesure de nos expériences tout en garantissant une interprétation statistique et scientifique des résultats. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations du cerveau post-mortem. Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. En effet, l’analyse des expériences passées a révélé qu’environ 10% à 20% des animaux ne se réveillent pas après la chirurgie et que 40% à 60% des animaux étaient exclus des études (intensité des troubles et des lésions cérébrales trop induites ou trop peu).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Les rats seront 3 par cage avec du papier kraft et des briques de bois comme enrichissement et auront un accès non restreint à la nourriture et à l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5 jours sur 7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant et après la chirurgie (analgésie, anesthésie générale, maintien de la température corporelle, désinfection et anesthésie locale). Après chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle dans une pièce dédiée chauffée à 28°C jusqu’à leur réveil. Pour pallier aux problèmes liés aux signes cliniques du modèle (perte d’équilibre, faiblesse musculaire, atteinte des fonctions motrices), les animaux seront habitués quelques jours avant la chirurgie à une nourriture sous forme de gel nutritif en plus de leurs granulés conventionnels. Ce gel améliore la prise en charge des rats après la chrirugie et demeure davantage accessible (placé sur le sol de la cage, contrairement aux granulés situés en hauteur). Une litière spéciale sera également utilisée pour éviter les risques d’étouffement après la chirurgie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil et durant les 48h suivantes. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chrirugie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. La remise en cage par 3 ne sera réalisée que lorsque la récupération des animaux sera suffisante (reprise de poids après la perte attendue liée à la chirurgie). Une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant l’intégralité du projet : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Les mécanismes et les conséquences physiologiques de l’AVC sont similaires chez le Rat et chez l’Homme. Le Rat est donc une espèce pertinente pour modéliser les AVC chez l’Homme. Les animaux utilisés seront des rats mâles de 300-350 g (3 mois) à l’arrivée à laboratoire. Nous effectuerons notre modèle sur des rats adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles AVC.