Procédures sévères

4948 animaux, 3548 souris et 1400 hamsters dorés, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal est infecté par un virus puis reçoit des molécules antivirales à tester, sous anesthésie pour les injections et prélèvements, l'infection pouvant provoquer des atteintes neurologiques, hépatiques, rénales ou digestives. Le porteur précise que les manipulations ont lieu dans un laboratoire à haute sécurité biologique, ce qui impose la mise à mort de tous les survivants en fin de procédure. Il présente ces essais comme une étape vers de futurs traitements antiviraux, les retombées restant renvoyées au futur.

Objectifs

Actuellement, il existe encore un nombre limité, voir aucun traitement thérapeutique curatif et/ou prophylactique (molécules antivirales, vaccins) contre plusieurs virus pathogènes pour l’Homme. Les maladies infectieuses résultant de ses agents viraux constituent un problème de santé publique majeur, avec un risque élevé de mortalité et morbidité au sein de la population. Il est donc important de concevoir et développer des stratégies de lutte antivirale contre ces virus. Ce projet propose donc d’évaluer l’activité antivirale de différentes molécules dans un modèle animal, ces molécules ont été sélectionnées suite à plusieurs tests in vitro et ex-vivo, démontrant une réduction de la réplication virale de plusieurs virus

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de confirmer l’efficacité préclinique de molécules antivirales. Ils participeront également au développement pharmaceutique d’un panel de molécules thérapeutiques dans le futur, pour lutter contre des infections virales humaines, pour lesquelles il n’existe pas de traitements efficaces, approuvés et disponibles à ce jour.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés lors des étapes de : - prélèvements sanguins (durée : 5min – anesthésie + prélèvement – via veine caudale ou saphène selon l’espèce animal) - infection virale (durée : 4-7min - anesthésie + prélèvement- par voie sous-cutanée, intra-dermique, intrapéritonéale ou intranasale) - administration des molécules thérapeutiques (durée : 4-7min - anesthésie + prélèvement - par voie sous-cutanée, intra-dermique, orale, intranasale ou intrapéritonéale) - euthanasie (durée : 5min)

Impact sur les animaux

Ce projet porte sur la mise au point de modèle infectieux viral. L’infection par ces virus est susceptible d’entrainer une infection virale potentiellement sévère pouvant être caractérisée par des atteintes neurologiques, hépatiques, rénales, digestives et/ou articulaires. Les injections, les prélèvements sanguins et les manipulations quotidiennes (pesées) font également partie des nuisances infligées aux animaux. L’utilisation de molécules antivirales pourraient conduire à l’observation de toxicité et des effets secondaires chez les animaux.

Devenir

Les manipulations s'effectuant avec des virus infectieux et ayant lieu dans un laboratoire possédant un niveau de sécurité biologique élevée, l'ensemble des animaux survivants sont mis à mort à la fin de chaque procédure

Remplacement

De multiples tests poussés in vitro et ex-vivo sont réalisés en amont afin de caractériser le pouvoir antiviral des molécules candidates, ainsi ne seront testées dans les modèles animaux, uniquement les molécules dont les propriétés antivirales auront été validées. L’étude de l’efficacité d‘une molécule antivirale à visée préclinique, passe obligatoirement par l’utilisation d’un modèle animal avant une possible mise sur le marché pharmaceutique et prescription au patient. Par ailleurs, les modèles animaux (souris ou hamster) générés permettront de confirmer les propriétés antivirales des molécules testées, à l’échelle d’un organisme vivant entier physiologiquement proche de l’Homme.

Réduction

Les effectifs ont été calculés à l’aide d’un logiciel statistique afin de n’utiliser que le nombre d’animaux permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables dans le respect des 3R. Des lots de 4 ou 6 animaux (hamsters ou souris) seront utilisés pour les groupes contrôles ou les groupes d’étude. Afin de garantir l'utilisation de modèles pertinents, des études pilotes seront réalisées avant l'évaluation de l'efficacité des molécules antivirales. En effet, en dépit de la disponibilité de données scientifiques sur le processus infectieux pathologique sur chaque modèle animal étudié, les résultats peuvent varier en fonction des souches virales utilisées.

Raffinement

Après une période d’acclimatation de 5 jours minimum, les animaux seront hébergés en ISOcages adaptées (enrichies de « aspen brick » et « paper shaving ») sur portoirs ventilés. Ils ne seront soumis à aucune privation de nourriture et d’eau. Les animaux seront observés quotidiennement et suivis cliniquement durant toute l’expérimentation. Pour réduire à son minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés lors des étapes de prélèvement sanguin, d’inoculation virale, administration des molécules antivirales et euthanasie. Un tapis chauffant sera utilisé en cas d’anesthésie prolongée (dans le cas d’injections par voie souscutanée et intradermique) afin de maintenir la température corporelle de l’animal. De plus, les virus que nous étudierons sont susceptibles d’induire une infection potentiellement sévère chez l’animal ainsi une étude pilote sera réalisée lors de la mise au point des modèles (souris et hamster), cette étape permettra d’affiner les grilles de score en fonction des atteintes pathologiques induites par l’infection, afin de prévenir et réduire toute souffrance et prendre en charge la douleur de l’animal dans le respect des 3R. Un traitement analgésique est prévu en cas d'identification de douleurs légères à moyennes des animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons à la fois le modèle hamster et le modèle souris car en fonction du virus étudié (genre : Adenovirus, Alphavirus, Antavirus, Bunyavirus, Enterovirus, Flavivirus, Picornavirus, et Phlebovirus), la permissivité à l’infection et la réplication virale au sein de ces deux espèces peuvent s’avérer différentes, de plus l’espèce Mus musculus ou Mesocricetus auratus sont les modèles de référence utilisés par la communauté scientifique. Les animaux (hamsters et souris) seront âgés de 3 à 10 semaines. Ces âges correspondent aux stades de développement des souris et hamsters utilisés par la communauté scientifique pour la mise au point des modèles infectieux que nous souhaitons développer ainsi que pour l’étude de molécules pharmacologiques.

528 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un choc septique leur est provoqué, avec trois injections et trois prélèvements sanguins et, pour certaines, une chirurgie avec réveil, pour tester de nouveaux traitements anti-inflammatoires. Le porteur indique que les souris développent alors déplacements ralentis, hypothermie et perte de poids, et prévoit des points limites précoces pour arrêter la procédure. Il juge le passage à l'animal "incontournable" pour reproduire la complexité de la maladie et avance aussi un argument de coût d'hospitalisation, les bénéfices pour les patients restant conditionnels.

Objectifs

Le sepsis est la principale cause de décès dans les unités de soins intensifs dans le monde, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 50% en cas de choc septique. Le sepsis se caractérise par une réaction inflammatoire systémique exacerbée en réponse à une infection généralisée. Non traitée, cette activation incontrôlée du système immunitaire peut provoquer une défaillance multiviscérale jusqu’à entrainer le décès du patient. A l’exception de traitements antibiotiques associés à une assistance cardiaque et respiratoire, il n'y a actuellement aucune thérapie reconnue contre le sepsis. Un des obstacles rencontrés lors du développement de traitements anti-inflammatoires du sepsis est la difficulté d’atténuer la phase inflammatoire sans affaiblir le système immunitaire du patient nécessaire pour combattre l’infection. Nous souhaitons donc développer de nouvelles stratégies innovantes afin de bloquer le processus hyper-inflammatoire du sepsis sans induire de phase immunosuppressive.

Bénéfices attendus

Nous envisageons que ces traitements innovants soient combinés avec des soins déjà approuvés tels que l’administration d’antibiotique et une assistance cardio-pulmonaire. Cette combinaison pourra conduire à un effet synergique qui non seulement améliorera considérablement la survie des patients, mais réduira également la durée d’hospitalisation. Ainsi, l'impact sociétal de ce projet sera non seulement médical mais également économique, le sepsis induisant généralement une longue hospitalisation en unité de soins intensifs pour un coût moyen dans les pays industrialisés de 30 000 € par patient atteint de sepsis sévère.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à trois injections qui dure 2 minutes (induction de modèle, administration d’anesthésique ou de traitements) et trois prélèvements de sang qui dure 3 minutes. Certains animaux seront soumis à une procédure chirurgicale avec réveil qui dure 20 minutes environ.

Impact sur les animaux

Les souris soumises à un choc septique présentent un état physique altéré avec des déplacements ralentis et une réponse aux stimuli tactiles diminuée. Leur état physiologique est aussi altéré avec une hypothermie et une perte de poids. Dans de rare cas, une diarrhée peut apparaitre. Une grille d’évaluation multicritère nous permettra d’évaluer l’état général de la souris très précisément et de mettre en place des points limites très précoces qui permettront de fixer des critères d’arrêt de la procédure pour limiter la souffrance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort soit parce qu’ils ont atteints les points limites, soit parce qu’ils sont en fin de procédure. Leur sang sera prélevé pour réaliser des analyses cellulaires pour évaluer nos traitements.

Remplacement

Le sepsis est une maladie inflammatoire complexe conduisant à une phase précoce d'hyper-inflammation qui induit des effets néfastes sur les organes vitaux puis à une phase immunosuppressive où le système immunitaire ne peut plus combattre l’infection. Les études in vitro sur des lignées cellulaires ont montré l’efficacité de nos traitements à réduire l’inflammation. Le passage à un modèle animal à ce stade de l‘étude est incontournable pour mimer la complexité de la pathologie. L’effet ne peut donc être considéré qu’à l’échelle d’un organisme.

Réduction

Seuls les traitements ayant montré une efficacité in vitro seront évalués in vivo. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui nous a permis de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Une étude pilote avec un nombre limité d’animaux permettra la mise au point du modèle avant de tester les différents traitements. Si les traitements ne présentaient pas l’efficacité escomptée, la procédure sera arrêtée. L’étude de biodistribution se fera en imagerie par fluorescence ce qui permet un suivi longitudinal des animaux et de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et la douleur sera gérée grâce à la mise en place d’un protocole analgésique adapté en pré et post-opératoire. L’hypothermie sera limitée avec l’utilisation d’une plaque chauffante. Une grille de score détaillée permettra de suivre l’état général des animaux et de définir des points limites très précoces qui seront strictement appliqués. Un arbre décisionnel sera appliqué en fonction du score. L’étude de biodistribution se fera en imagerie par fluorescence qui est une technique non invasive. Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Des mesures seront mises en place pour faciliter la prise de nourriture et d’eau.

Choix des espèces

Les modèles murins sont très bien décrits dans la littérature et la souris est l'espèce la plus utilisée pour le modèle du sepsis. Cette espèce nous permettra donc de bénéficier de données déjà existantes pour la mise en place du modèle et de pouvoir comparer nos résultats avec ceux déjà publiés. Les souris seront âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à des souris adultes avec un système immunitaire mature.

189 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit dans le cerveau une injection de cellules cancéreuses humaines lors d'une chirurgie d'une heure, puis est pesé chaque jour pendant deux à trois mois le temps que la tumeur se développe, avant d'être tué pour prélever son cerveau. Le porteur indique que la pousse tumorale peut provoquer perte de poids, baisse des déplacements et retrait du groupe social. Il affirme que le pouvoir métastatique de ces cellules ne se vérifie qu'in vivo et juge le recours à "l'animal entier" "absolument nécessaire", les retombées thérapeutiques restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Les métastases cérébrales sont les tumeurs intracrâniennes du système nerveux central les plus fréquentes chez les adultes, elles représentent la troisième maladie neurologique en termes d’incidence avec plus de 30.000 nouveaux patients par an en France. Ces métastases sont associées à un mauvais pronostic et à une altération de la qualité de vie. La maladie métastatique implique plusieurs évènements dont la dissémination des cellules tumorales à partir de la tumeur primitive. Les données récentes suggèrent que ce sont essentiellement les cellules souches cancéreuses qui sont capables de donner des métastases. Ces cellules souches cancéreuses sont caractérisées par une capacité d’auto-renouvellement, une prolifération extensive, une capacité à se différencier et à reproduire une seconde tumeur identique à la tumeur d’origine. Les hypothèses actuelles postulent que les cellules souches métastatiques sont des cellules souches cancéreuses migrantes qui ont initié une tumeur à distance dans un nouveau site. Dans ce contexte, nous nous focalisons sur l'étude des cellules souches de métastases qui ont migré dans le cerveau. Les cellules souches de métastases cérébrales issues de cancers humains primitifs différents (colorectal, sein), seront caractérisées de manière complète in vitro en laboratoire. Une fois les cellules parfaitement décrites d'un point de vue biologique, la dernière étape de la caractérisation consiste en la vérification de la capacité de ces cellules à reproduire une tumeur humaine chez la souris. Cette dernière étape, in vivo, est, d'une part standardisée et internationalement reconnue comme telle et, d'autre part, absolument nécessaire à la validation de l'hypothèse. En effet, la finalité est de mieux décrire les cellules à l'origine des métastases chez l'homme issues de divers cancers primitifs afin de bloquer la migration de ces cellules. Ceci permettra l'ouverture vers de nouvelles thérapies ciblées chez l'Homme.

Bénéfices attendus

A court terme, nous souhaitons prouver que certaines cellules sont à l'origine des métastases cérébrales les caractériser. A long terme, nous espérons pouvoir ainsi les bloquer pour éviter un échappement du site primitif (sein, colorectal) vers le cerveau. Ceci permettra de développer de nouveaux médicaments empêchant la formation de métastases chez l'Homme.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à une injection de cellules cancéreuses humaines dans le cerveau. Cette chirurgie dure approximativement 1 heure et est réalisée sous anesthésie avec antalgiques. Suite à ces injections, les souris seront pesées (durée approximative 3 minutes) quotidiennement pendant 2 à 3 mois, qui est le temps nécessaire au développement tumoral.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, nous pouvons observer un inconfort sur les premiers jours post chirurgie puis, lors du développement tumoral : la perte de poids, la diminution des déplacements ainsi que le retrait de l'individu du groupe social établi. La chirurgie peut aussi induire un inconfort au niveau de la plaie du crâne et de la présence des fils de suture.

Devenir

Le but est la récupération du cerveau des animaux. Il nous faut donc mettre à mort les animaux afin de récupérer leurs organes.

Remplacement

Dans le domaine de la cancérologie, les potentiels tumorigénique et métastatique ne peuvent pas être appréhendés seulement par des expérimentations in vitro. Toutes les expérimentations in vitro classiques concernant les cellules souches (autorenouvellement, dilution limite, présence de marqueurs souches mis en évidence par différentes technologies de pointe) ont été réalisées en amont des expérimentations in vivo faisant l'objet du présent projet. L'administration des cellules à l'animal permet aux cellules souches de métastases cérébrales d'être au contact d'un environnement complexe qu'il n'est pas possible de reproduire in vitro. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier à ce stade du projet qui consiste à vérifier sans aucun doute qu'il s'agit bien de cellules souches de métastases cérébrales.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons déterminé par un test statistique de calcul de puissance le nombre minimum d’animaux nécessaire dans chaque groupe expérimental afin d’obtenir des résultats statistiquement valides (Ce nombre est de 7 souris par groupe). Compte tenu des procédures à mettre en place pour valider les cellules souches de métastases cérébrales et du nombre de cellules souches de métastases cérébrales à valider, nous utiliserons 189 souris au total sur les 5 ans du projet. De plus, l'utilisation de souris ayant un statut hormonal identique à la personne d'où sont extraites les cellules souches de métastases cérébrales nous permet d'avoir une meilleure prise tumorale. Ceci limite aussi le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les souris sont élevées en portoirs ventilés en accord avec le statut sanitaire d'animaux immunodéprimés. Les souris seront maintenues constamment en groupe d'au moins 2 individus afin de limiter le mal-être engendré par l'isolement d'individus. Un enrichissement adapté à l'espèce utilisée est mis à disposition dans les cages. Afin de s’assurer de leur bien-être, les souris seront pesées et observées quotidiennement à la recherche de signe de souffrance ou de comportement inadapté pendant toute la durée de la procédure. Les chirurgies seront réalisées selon des règles de bonnes pratiques chrirugicales (aseptie, anesthésie, antalgie, contrôle de la température) et par des personnes expérimentées. Une habituation en pré-opératoire est réalisée pour les pesées quotidiennes, afin de limiter le stress occasionné par celles-ci, pendant 7 jours. Une habituation à une nourriture enrichie riche en glucides et en lipides est aussi réalisée 48 heures avant les chirurgies pour veiller à la bonne reprise alimentaire en partie post-chirurgicale. Une prise en charge antalgique est réalisée en parties pré et post-opératoires. Des points limites (critères d'arrêt) spécifiques des procédures expérimentales appliquées sur les animaux ont été établis et seront appliqués. Au moindre signe clinique d'inconfort, une surveillance particulière de l’animal réalisée et un antidouleur puissant est introduit (morphinique). Si après 48h, le comportement de l'animal n'est pas revenu à la normale, l'animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) athymiques « nude »sont à ce jour l’espèce modèle de mammifères pour les études en cancérologie. En effet, ce modèle ne possède pas de système immunitaire compétent et ne peut donc pas rejeter une greffe d'origine humaine. Nous utiliserons des souris âgées de 6 semaines pour cette étude. Nous travaillerons avec des jeunes souris imprégnées d’hormones et facteurs de croissance permettant une meilleure croissance du greffon. Ceci permettant aussi de limiter le nombre d’animaux utilisés.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie est immunisée pour déclencher une myocardite auto-immune, l'autre subit une chirurgie du thorax reproduisant une sténose de l'aorte, les deux menant à une insuffisance cardiaque avant la mise à mort pour analyses. Le porteur indique que les deux procédures sont classées sévères parce qu'elles conduisent à cette défaillance du cœur. Il prévoit quelques expériences in vitro mais juge l'animal "nécessaire" faute de modèle de myocardite ou d'hypertrophie cardiaque hors de l'organisme entier, les cibles visées restant renvoyées à d'éventuelles études cliniques.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les intéractions moléculaires des cellules immunitaires avec les vaisseaux lymphatiques pendant l’inflammation cardiaque afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies cardiovasculaires (MCV) tels que la myocardite ou l’hypertrophie pathologique. Nous souhaitons utiliser un modèle de myocardite auto-immune expérimentale (EAM) induit par immunisation contre la troponine I (TpnI) pour : 1) caractériser l’expression des molécules de co-signalisation et 2) moduler la réponse immunitaire à l’aide de traitement ICI (immune checkpoint inhibitors) afin de comprendre au mieux les cas cliniques rapportés dans la littérature de myocardite induite par traitement ICI chez des patients atteints de cancers. D'autre part, le modèle de sténose aortique (TAC : transverse aortic constriction) permet de modéliser une cardiomyopathie hypertrophique pathologique. En caractérisant finement la communication entre les cellules immunitaires infiltrant le cœur et les vaisseaux lymphatiques au travers des cytokines, chimokines et des molécules de co-signalisation, nous souhaitons proposer de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de moduler cette hypertrophie pathologique. Ensemble, ces deux modèles vont permettre d’améliorer notre compréhension de la réponse immunitaire cardiaque lors de MCV. Nous pourrons alors proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour la médiation de cette réponse immunitaire et ainsi prévenir le développement d’une insuffisance cardiaque.

Bénéfices attendus

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans le monde suivi dans les pays industrialisés du cancer (OMS, 2017). Le besoin de nouvelles thérapeutiques anti-tumorales a permis l’émergence de l’immunothérapie. Cependant, l’utilisation en oncologie d’immunothérapie a rapporté la présence d’effets indésirables d’origine auto-immune tel que les myocardites. Bien que rares, ces évènements sont associés à une mortalité élevée. C’est pourquoi nous avons choisi de mettre en place le modèle EAM pour comprendre le développement de ces effets indésirables à la suite d’un traitement d’immunothérapie. Ce projet va nous permettre de caractériser le remodelage lymphatique et la réponse immunitaire cardiaques au cours de maladies cardiovasculaires. Nos deux modèles décrit dans cette DAP permettent d’étudier deux maladies cardiovasculaires d’origine non-ischémique présentant un phénotype cardiaque différent. Dans un premier temps, la caractérisation précise de la communication qui existe entre cellules structurantes cardiaques (cardiomyocytes, fibroblastes, etc), cellules lymphatiques et cellules immunitaires dans le contexte de ces deux modèles de maladies cardiovasculaires au travers des cytokines, chimiokines et des molécules de co-signalisation va nous permettre, dans un second temps, de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de moduler l’inflammation, l’œdème et la fibrose afin de restaurer la fonction cardiaque. Ce projet s’inscrit dans un axe de recherche en plein essor qu’est la cardio-immunologie. A terme, ces nouvelles cibles thérapeutiques pourront faire l’objet d’études cliniques chez le patient et ainsi proposer de nouvelles solutions pour l’utilisation de l’immunothérapie antitumorale en limitant la survenue d’effets indésirables cardiaques mais également de nouvelles solutions pour le traitement de l’insuffisance cardiaque.

Procédures

Dans la procédure N°1 les animaux vont etre immunisés en 3 fois ( 1 par semaine pour les 310 souris). Des prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie générale (1 fois par quinzaine, pour 360 souris) Dans la procédure N°2, une opération chirugicale de type mini Thoracotomie sera réalisée sur 180 souris. Des prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale (1 fois par quinzaine, pour ses 180 souris).

Impact sur les animaux

Les deux procédures sont classées sévères. Les deux procédures mênent à une insufisance cardiaque, la première procédure est produite par une immunisation, induisant une inflammation cardiaque. La deuxième procédure est réalisée par une chirurgie cardiaque (minimalement invasive).

Devenir

mise a mort de tous les animaux en fin d'etude pour analyses cellulaires et moleculaires

Remplacement

Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous mettrons en place certaines expériences par des études in vitro (prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle de myocardite ou d’hypertrophie pathologique in vitro.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM) puis des mesures invasives (hémodynamique, lymphangiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de détecter une différence de 15% (ex : one way ANOVA et test de Tukey). Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles tel que l’échocardiographie. Un meilleur suivi post-opératoire permet de limiter le nombre d'animaux par groupe dans le modèle TAC.

Raffinement

Pour raffiner, les animaux sont hébergés aux normes requises et un enrichissement des cages est mis en place. Des points limites adaptés, une stratégie d’anesthésie et d'analgésie seront mise en place avec un suivi quotidien du bien-être animal. Nous allons dans ce projet utiliser des souris femelles, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire avec des modèles de cardiomyopathies chez la souris. La souris a également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, comme certains anticorps monoclonaux qui ne sont parfois pas accessibles pour le rat. De plus, dans notre laboratoire, nous avons depuis de nombreuses années une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous allons inclure uniquement des souris adultes de 20-24g pour ces études. La taille des souris à cet âge permet une réalisation facilitée des chirurgies et correspond à un âge habituel dans la littérature pour l’induction du modèle.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par chirurgie une greffe de cellules tumorales du foie, puis des traitements par injection ou radiothérapie, des prélèvements sanguins et un suivi par imagerie sous anesthésie, la mise à mort survenant par prélèvement d'organes ou dès que la tumeur les dégrade trop. Le porteur consacre une seule phrase à décrire l'objectif, évaluer de nouveaux traitements du cancer du foie, pour 1 200 souris toutes classées en gravité sévère. Il présente l'animal comme un "passage obligatoire" avant l'homme et renvoie les bénéfices pour les patients au moyen terme.

Objectifs

Le projet consiste à évaluer les effets de nouveaux traitements dans des modeles de cancers du foie

Bénéfices attendus

A moyen terme, les bénéfices attendus sont de trouver des nouveaux traitements pour soigner les personnes atteintes de cancer du foie (une pathologie humaine touchant plus de 11 000 personnes par an en France).

Procédures

Les animaux recevront 1 greffe de cellules tumorales par chirurgie (durée de la chirurgie estimé à 15-30 min). Application / Administrations des traitements(moins de 2min pour les injections et environ 5min pour la radiothérapie). En cas de prélèvement de sang (moins de 2min) ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).

Impact sur les animaux

Les souris de ce projet pourront subir un stress lié à l'anesthésie, un stress post-opératoire, une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du produit, un stress lié au transport de l’animalerie vers la plateforme d’imagerie, un stress lié à la contention lors de l’irradiation ou de l’imagerie et lors des suivis cliniques, une douleur liée au développement des tumeurs variable selon la localisation.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'hepatocarcinome. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 10 / par groupe. Les molécules thérapeutiques utilisé seront systèmatiquement sélectionnées sur la base de leur efficacité in vitro.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : •la mise au point de procédures rigoureuses, •la formation du personnel, •un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, •le recours à des procédures les moins invasives possibles, •Le suivi d’éventuel signes cliniques, •La détermination des points limites, •Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, •Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, •La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, •La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'hepatocarcinome. Ce projet a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal adulte. Les produits testés n'ont pas de visée pédiatrique.

64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des femelles gestantes subissent une électroporation in utero sous anesthésie, une chirurgie de trente minutes, avant d'être mises à mort, et les souriceaux sont tués pour prélever leur tissu cérébral. Le porteur présente le projet comme un raffinement, dont l'objet est d'identifier la méthode de mise à mort qui réduit la souffrance tout en garantissant des résultats, alors même que les 64 souris sont classées en gravité sévère. Sur le remplacement, il affirme qu'il est "impossible" de se passer de l'animal puisque le but même est de raffiner un geste réalisé sur la souris.

Objectifs

Le cortex cérébral est la région du cerveau responsable des fonctions cérébrales les plus élevées comme par exemple la perception sensorielle, le langage, la mémoire, les actions volontaires et la motricité. L’organisation du cortex cérébral repose sur des milliards de cellules appelées neurones, qui forment des connexions appelées synapses. L’étude de la formation du cortex cérébral pendant le développement embryonnaire est essentielle pour comprendre le fonctionnement cérébral dans des conditions normales, mais également pour comprendre pourquoi le cerveau dysfonctionne dans un certain nombre de maladies telles que l’épilepsie ou le retard mental, qui touchent presque 1 enfant sur 100 dans les pays industrialisés. Ce projet entre dans le cadre général d'études du développement du cortex cérébral, et en particulier de la fonction de gènes qui participent à la régulation de la production d’énergie neuronale. Pour atteindre ce but, il est nécessaire de prélever des tissus neuronaux chez des embryons de souris ou chez des souriceaux. Ce projet a pour but de raffiner la méthode par laquelle nous réalisons la mise à mort de souris pour prélever du tissu cérébral au laboratoire. afin d’identifier la méthode qui minimise la souffrance des animaux, tout en garantissant des résultats scientifiques de qualité.

Bénéfices attendus

Ce projet répond à une problématique scientifique et une problématique de bien-être animal. Il permettra d’optimiser les conditions expérimentales pour une expérience utilisée par de nombreux laboratoires en neurosciences, afin de garantir la robustesse et la validité des résultats scientifiques. Par ailleurs ce projet permettra de choisir les conditions expérimentales minimisant les souffrances subies par l’animal, constituant en cela un raffinement de la procédure expérimentale.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Des animaux seront anesthésiés et mis à mort par injection intracardiaque d'un agent de fixation histologique (durée entre 5 et 10 minutes selon la méthode testée).

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes subiront une procédure chirurgicale avec réveil, sous anesthésie, une seule fois, d’une durée de 30 minutes. Dans de rares cas, nous pouvons observer une difficulté à la mise bas. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées. L’électroporation peut entraîner une mortalité fœtale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons électroporés). La procédure n’a pas de conséquence sur le développement du souriceau et il est impossible de distinguer après la naissance les souriceaux électroporés de souriceaux non électroporés, en dehors de l’expression de protéines fluorescentes.

Devenir

Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.

Remplacement

L’étude des tissus par microscopie est indispensable pour comprendre l’organisation d’un tissu complexe tel que le cortex cérébral. Puisque ce projet a pour but de raffiner lune méthode réalisée sur l'animal, il est impossible de remplacer ce projet par une méthode alternative n'utilisant pas l'animal.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base de notre expérience préalable. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation de la fluorescence au moyen d’une lampe LED au moment de la naissance, ce qui permettra de détecter très tôt un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne pas réaliser de procédure de perfusion intracardiaque inutilement sur un souriceau qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude. Pour ce projet, il nous faudra réaliser au minimum deux chirurgies. Ces deux premières portées seront analysées immédiatement pour déterminer si nous atteignons le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement en réalisant d’autres chirurgies. L’histologie cérébrale sera réalisée en aveugle, et les paramètres mesurés seront comparées par des tests statistiques appropriés. Nous tirerons par conséquent un maximum d’information des animaux inclus dans l’étude.

Raffinement

Ce projet a pour finalité de définir les conditions de mise à mort des animaux pour obtenir un résultat robuste. Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information pour chaque animal. Le transport des souriceaux de la zone d'élevage à la zone d'expérimentation est rapide et sera adapté pour limiter le stress subi par les animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des maladies du neurodéveloppement. Nous avons choisi un modèle de souris car il présente les avantages suivants : - une structure proche du cortex cérébral humain, - un développement embryonnaire rapide (21 jours) et un développement postnatal court (21 jours pour des circuits neuronaux « matures »), - une petite taille adaptée à des préparations histologiques (embryon entier) sur une seule lame. Par ailleurs, la méthode chirurgicale que nous souhaitons raffiner est bien établie chez la souris ce qui nous assure que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines, selon la disponibilité des animaux chez le fournisseur agréé. Les souriceaux seront utilisés au moment du sevrage (21 jours), correspondant à l’âge utilisé classiquement lors de l’essentiel des études de connectivité corticale.