Procédures sévères

1 390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Une fibrose pulmonaire ou cutanée leur est provoquée, puis elles reçoivent des injections répétées, dont une quotidienne pendant 28 jours, et des gavages, pour tester des inhibiteurs des protéines HSPB1 et HSPB5. Le porteur annonce une perte de poids et une baisse de la capacité respiratoire, applique une pommade anesthésiante avant les injections douloureuses et prélève les poumons après mise à mort. Il juge l'expérimentation in vivo "indispensable" faute de reproduire la complexité du tissu pulmonaire, les nouvelles stratégies thérapeutiques restant à mettre en évidence.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie extrêmement grave associée à la destruction de la structure des poumons, par accumulation de collagène. C’est une maladie rare avec une prévalence de 10 à 20 cas pour 100 000. Elle conduit à une insuffisance respiratoire et au décès avec une médiane de survie de 2 à 6 ans après diagnostic. Il n’existe actuellement aucun traitement médicamenteux efficace. Seuls le Nintedanib (NTD) et la Pirfenidone (PFD) sont utilisés mais ne font que ralentir la pathologie. La fibrose pulmonaire est la conséquence d’une cicatrisation exagérée du tissu pulmonaire suite à une lésion, ce qui stimule une production excessive de collagène qui s’accumule et encombre les alvéoles pulmonaires. Cette fibrose peut être idiopathique (sans cause identifiée) ou bien survenir progressivement en conséquence d’une autre pathologie auto-immune comme par exemple une pathologie qui touche la peau, et qui est aussi associée à un dépôt excessif de collagène, la sclérodermie (SSc-ILD). Ces fibroses progressives secondaires sont tout aussi graves que la fibrose idiopathique et l’efficacité de la pirfénidone (PFD) et du nintédanib (NTD) dans ces cas tout aussi modeste. Notre équipe a pu montrer que plusieurs médiateurs endogènes, dits protéines de choc thermique (HSP), telles que HSPB1, HSPB5 sont impliquées dans le développement de la fibrose pulmonaire. On les retrouve en grande quantité dans le tissu pulmonaire des patients atteints de cette maladie et celui des souris rendues fibreuses dans les modèles murins de FPI. Nous avons précédemment mis en évidence l’efficacité de molécules qui inhibent HSPB1 et d’HSPB5 à limiter le développement de la fibrose dans des modèles de fibrose pulmonaire chez la souris. Notre objectif actuel est de poursuivre l’évaluation de l’efficacité de nos inhibiteurs d’HSPB1 et d’HSPB5, seuls ou associés aux traitements conventionnellement utilisés actuellement pour traiter les patients, la pirfénidone et le nintédanib. Nous testerons ces traitements sur un modèle de fibrose pulmonaire idiopathique et sur 1 modèle de fibrose pulmonaire secondaire à la sclérodermie induite chez le rongeur. Ces expérimentations nous l’espérons permettront de mieux caractériser l’intérêt de poursuivre le développement de ces molécules pour traiter la fibrose pulmonaire.

Bénéfices attendus

La fibrose pulmonaire idiopathique ou progressive et secondaire à une autre pathologie systémique est un processus pathologique létal, pour lequel il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique curatif efficace. Ces expériences permettront de mettre en évidence de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant HSPB1 et HSPB5.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection intratrachéale : une seule fois sur souris préalablement anesthésiées. Durée moyenne : 30 secondes - Injection sous-cutanée : quotidiennement en vigile durant 28 ou 42 jours. Durée moyenne : 5 secondes. - Injection intrapéritonéale : quotidiennement en vigile durant 14 ou 18 ou 31 jours. Durée moyenne : 4 secondes. - Injection intraveineuse : tous les deux jours en vigile avec un total de 8 ou 9 ou 16 injections. Durée moyenne : 2 minutes - Gavage : quotidiennement en vigile durant 14 ou 18 ou 31 jours. Durée moyenne : 1 minutes.

Impact sur les animaux

- Injections intra-trachéales : Celle-ci se dérouleront sous anesthésie générale (inhalation d’isoflurane). Nous avons l’expérience, il s’agit d’un geste invasif mais non traumatisant car rapide et n’entrainant pas de lésions tissulaires. Les animaux tout au plus présentent une toux transitoire, avant de retrouver une activité normale. - Injections intrapéritonéales et sous-cutanée : L’injection en elle-même est associée à un inconfort léger lié à la perforation de la peau et à la contention. - Injections intraveineuses et gavages : Seule la contention liée à la procédure d’injection est susceptible de provoquer un inconfort chez les animaux. - Rasage : Cette étape se réalise sous anesthésie générale (inhalation d’isoflurane). - Induction de la FPI : Les symptômes pouvant être observés sont ceux associés à la maladie (diminution de la capacité respiratoire) ou à l’exposition à des adénovirus (phase d’inflammation durant les trois jours post-injection). Les animaux perdent du poids classiquement lors de la première phase d’induction de la maladie.

Devenir

A la fin de chaque expérience ou si les points limites sont atteints, les animaux seront placés sous anesthésie générale profonde afin d’effectuer une laparotomie puis un prélèvement de sang via l’artère abdominale pour des études post mortem. Nous canulerons par la suite la trachée afin de réaliser un lavage broncho-alvéolaire (LBA) avant de récupérer les poumons pour des études post-mortem. De plus, une partie du derme au site d’injection sera récupéré pour examens histologiques.

Remplacement

Cette expérience fait suite à la mise en œuvre de tous les tests in vitro possibles pour commencer à répondre à nos questions scientifiques. Mais le tissu pulmonaire est un tissu complexe issu de différentes cellules épithéliales, fibroblastiques, mésothéliales, organisées en tissu et interagissant dans un système dynamique. La fibrose pulmonaire et cutanée sont des processus complexes dont le développement implique plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire, le recrutement de cellules de l’immunité, etc…). Notre objectif est de tester les effets de traitements administrés de façon chronique. Tout ceci rend indispensable la réalisation d’expérimentations in vivo.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum tout en respectant nos objectifs scientifiques. Le nombre d’animaux représentera le nombre minimal d’animaux permettant de produire des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit). Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers (permettant leur isolement dans la cage). De plus, ils bénéficieront depuis 7 jours avant le début du protocole et pendant toute sa durée, d’une alimentation enrichie sous forme d’aliments gélatineux déposés sur la litière, ce qui en facilite l’accès pour limiter la perte de poids et la déshydratation qui caractérisent le modèle de FPI. Les modèles mis en œuvre seront appliqués par du personnel qualifié et entrainé. Afin de réduire la douleur, les animaux seront suivis au moyen d’une échelle d’évaluation de la douleur. Les points limites fixés nous permettront de décider de la mise à mort des animaux si nécessaire. Afin de limiter l’inconfort de l’injection de BLM tous les jours, pendant 28 jours en s.c. dans le bas du dos, une pommade à la lidocaïne (EMLA) est appliquée 10 minutes avant chaque injection.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est très bien documenté dans la littérature dans cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. Ces souris seront âgées de 8 semaines, correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant. Pour minimiser la dégradation de l’état général des animaux induit par le développement de la fibrose pulmonaire, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g.

2 709 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 645 d'entre elles et sévère pour 2 064. Elles subissent une chirurgie d'injection d'un virus dans le cerveau, une chirurgie d'implantation puis une imagerie tête immobilisée, après une déplétion en dopamine reproduisant la maladie de Parkinson et un traitement à la L-DOPA. Le porteur décrit peu les procédures elles-mêmes et n'en précise pas la durée pour chaque animal. Il affirme qu'"aucun modèle in vitro ne peut reproduire" la connectivité cérébrale étudiée, ce qui justifie selon lui le recours à la souris.

Objectifs

Nos actions quotidiennes nécessitent la sélection de comportements moteurs adaptés tout en supprimant les comportements indésirables. Cette fonction, que l'on appelle la régulation des actions motrices, est essentielle à l'interaction et à la survie dans un environnement en constante évolution, comme l'illustrent peut-être le mieux les conditions neurologiques dans lesquelles cette capacité est perturbée. Par exemple, dans la maladie de Parkinson (MP), la perte de la dopamine, un neurotransmetteur, est associée à des déficiences motrices dévastatrices qui commencent d'abord par une bradykinésie/hypokinésie (c'est-à-dire le ralentissement/l'incapacité d'initier une action volontaire), mais qui peuvent rapidement passer à un comportement extrême et opposé sous traitement à la lévodopa, comme les mouvements involontaires amormaux (MIAs), également connus sous le nom de dyskinésie induites par la lévodopa (DIL). Notre projet vise à mettre en lumière les bases neuronales qui sous-tendent le déclenchement normal de l'action motrice et la façon dont ces mécanismes sont perturbés dans des conditions pathologiques qui entraînent soit une incapacité à exécuter un plan moteur désiré (comme dans l'état akinétique de la maladie de Parkinson : MP), soit, au contraire, l'incapacité à s'abstenir de mouvements indésirables (comme dans les DIL). Nous avons montré récemment que le globus pallidus (GPe) est composé de deux populations neuronales, nommées neurones prototypiques (PROTO) ou arkypallidaux (ARKY) qui ont des fonctions distinctes dans le contrôle du mouvement. L'hypothèse principale de notre projet est que les neurones ARKY représentent un substrat cellulaire clé dans le réseau des ganglions de la base pour contrôler l’exécution du mouvement volontaire. En outre, nous proposons également que la dérégulation de la fonction des neurones ARKY pourrait contribuer aux déficits moteurs présents dans l'état akinétique (MP) ou dyskinétique (DIL) de la maladie de Parkinson. Toutes les expériences seront réalisées sur des souris contrôles (Sham), des souris déplétées en dopamine (MP) et des souris déplétées en dopamine avec un traitement à la L-DOPA (DIL).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour l'amélioration des traitements, ou le développement de nouveaux traitements pour réduire les symptômes moteurs des patients atteints de la maladie de Parkinson et des effets secondaires "dyskinésies" qui surviennent suite à la prise de traitements dopaminergiques.

Procédures

Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 20 et 40 min, - procédure chirurgicale avec implantation : entre 1 et 2H, imagerie avec tête restreinte

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu sur les animaux est inhérent à l'induction de la maladie de Parkinson qui induit un déficit moteur (réduction d'activité locomotrice et comportement rotatoire). Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post- chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure

Remplacement

Le but du projet est connaitre la fonction d’une sous-population neuronale du globus pallidus externe (GPe) et le reste du réseau des ganglions de la base dans le contrôle de la motricité volontaire. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections stéréotaxiques, afin de rapporter des protéines capables d'être activer ou d’inhiber l’activité neuronale avec des d'enregistrements électrophysiologiques ou optique ex vivo sur tranches de cerveau, ou in vivo chez l’animal se comportant et nécessite donc le recours à l’animal. Aucun modèle "in vitro" ne peut reproduire la connectivité complexe entre le GPe et le reste du réseau des ganglions de la base.

Réduction

L'utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R. En effet, tous les animaux transgéniques produits seront utilisés et ainsi moins d'animaux seront sacrifiés inutilement. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).

Raffinement

Nous utilisons plusieurs procédures de raffinement, à savoir: 1/ choisir le modèle rongeur de maladie de Parkinson et de dyskinésies le mieux adapté pour reproduire les symptômes moteurs observés chez les patients Parkinsonsiens 2/ l'utilisation d'animaux hébergés dans la même strucutre ce qui ne nécessite aucun transport et donc limite le stress des animaux 3/ une manipulation des animaux par l'expérimentateur afin là aussi de limiter le stress 4/ l'établissement de points limites 5/ La mise en place de soins adéquats si nécessaire pendant et après l’opération et l'utilisation de l’anesthésie/analgésie leur de chaque protocole invasifs. A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures chirurgicale. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du systéme nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les procédures expérimentales seront réalisées sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 120 d'entre elles et sévère pour 24. Elles reçoivent des régimes contenant un cocktail de polluants dans l'eau de boisson pendant cent vingt jours, des injections, des tests de glycémie et des jeûnes qui exposent certaines lignées à des hypoglycémies, pour étudier un diabète lié aux contaminants de l'environnement. Le porteur affirme que la maladie "influence l'ensemble du métabolisme" et que le recours à des animaux est "nécessaire". Sa rubrique de réduction annonce 114 souris là où les nombres déclarés en atteignent 144.

Objectifs

Le diabète, qui est une maladie caractérisée par des taux de sucre trop élevés dans le sang (hyperglycémie), est un enjeu majeur de santé publique. Le diabète présente des formes et origines diverses, qui restent encore mal connues. En dehors des formes classiques induites par l’obésité, il en existe des formes où les patients ne sont ni en surpoids, ni obèses. Parmi les facteurs de risque, l’exposition à des polluants de l’environnement joue un rôle important. En effet, ces produits chimiques toxiques présents dans notre alimentation, les emballages, et dans les produits d’entretien ou cosmétiques favorise l’apparition de maladies, dont le diabète. Même s’il existe une réglementation et que des seuils d’exposition maximum à ces toxiques ont été mis en place à l’échelle mondiale, ils ont des répercussions sur notre santé. En effet, il a été récemment rapporté qu’à des doses, même très faibles, ces polluants peuvent provoquer le diabète lorsqu’ils sont consommés de façon chronique. Néanmoins les mécanismes impliqués sont encore mal compris. Après ingestion via les aliments, ces molécules chimiques auraient un impact sur le métabolisme en augmentant la production de glucose(sucre) par l’intestin et le foie, ce qui conduirait à l’apparition du diabète au cours d’une exposition chronique à ces polluants. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition du diabète suite à une exposition chronique à un cocktail de polluants administré à faibles dose à des souris.

Bénéfices attendus

Des études menées dans différents pays, dont la France et l’Inde, ont exploré l'association entre les polluants environnementaux et la prévalence du diabète. En effet, l’exposition à des doses élevées de polluants est connue dans la littérature pour induire le diabète et de nombreuses autres complications. Néanmoins, bien que la dangerosité de ces composés soit généralement étudiée à court terme et à très forte dose chez l’animal, peu de travaux s’intéressent aux effets délétères d’une exposition à long terme à un mélange de faibles doses de toxiques, ce qui est pourtant la situation la plus fréquente. Ce projet devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement du diabète associé à une exposition chronique à un cocktail de contaminants chimiques de l’environnement, et de potentiellement les différencier de ceux associés à l’obésité. En effet, les résultats préliminaires indiquent que ce cocktail de contaminants induirait un diabète sans association avec l’obésité. Ces diabètes sont toujours difficiles à traiter et résistants aux traitements. Ce projet pourrait donc d’abord contribuer à une meilleure connaissance des diabètes sans obésité, mais aussi des diabètes induits par les polluants en général. L’objectif à terme est de proposer une meilleure prise en charge des patients diabétiques obèses et non obèses.

Procédures

Une biopsie de tissu (geste réalisé en quelques secondes) sera réalisée pour vérifier la modification génétique. L’invalidation de la production de sucre par le foie ou par l’intestin sera réalisée dans des modèles de souris transgéniques qui nécessitent un traitement injecté (5jours de suite). Les souris sans modification génique recevront le même traitement pour s’affranchir de ses effets possibles. Ce geste est réalisé en quelques secondes. L’activation de la production de sucre par l’intestin ne nécessite aucune intervention supplémentaire. Les souris recevront pendant 120jour, soit une alimentation standard, une alimentation riche en graisses et en sucres ou une alimentation standard et un mélange de produits chimiques dans l’eau de boisson. Le taux de sucre dans le sang (glycémie) sera mesuré tous les mois à partir d’une goutte de sang grâce à l’utilisation d’un glucomètre(réalisé en quelques secondes). Des tests permettant de caractériser le diabète seront réalisés soit à l’état nourri, ou à jeun. Ces tests consistent à administrer du sucre, de l’insuline ou du pyruvate aux souris et de suivre l’évolution de la glycémie (mesure avec un glucomètre à partir d’une goutte de sang). Une semaine entre chaque test permettra d’éviter le stress des animaux. Une prise de sang nécessitant une contention de 1-2minutes sera réalisée. Au total: - Les souris incapables de produire du glucose par le foie seront soumises à 10interventions dont 1biopsie, 1série d’injections, 3tests avec injections et prises de glycémie, 1mise à jeun de 6h, 1 mesure de glycémie, et 1prélèvement de sang terminal. - Les souris chez lesquelles la production de glucose par l’intestin est activée ou inactivée seront soumises à 9interventions dont 1biopsie, 3tests avec injections et prises de glycémie avec 3mises à jeun, 1mesure de glycémie, 1mise à jeun de 6h et 1prélèvement de sang terminal. Enfin, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes (dont le foie et l’intestin pour analyser la production de glucose).

Impact sur les animaux

Les souris qui ne sont pas capable de produire de sucre par le foie, peuvent réguler leur glycémie grâce à une production de sucre par les reins et l’intestin, ce qui permet de limiter les hypoglycémies(baisse du taux de sucre dans le sang) au cours d’un jeûne. Les souris seront soumises à un jeûne de 6h, ce qui représente une période entre deux repas. Dès 2h après l’arrêt de la prise de nourriture ces souris peuvent développer des hypoglycémies pendant cette période. La connaissance du modèle animal a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie. Ainsi, des croquettes sont accessibles aux souris directement dans la cage pour leur éviter la perte d’énergie nécessaire pour atteindre les mangeoires. Avant la mise à jeun, une partie de leur cage est placée sur une plaque chauffante pour éviter les hypothermies (baisse de la température corporelle). Un suivi très régulier de ces animaux est réalisé par le technicien en charge du protocole expérimental. En effet, le suivi des premiers signes d’hypoglycémie qui se caractérisent par une diminution de la mobilité, prostration, et/ou refroidissement de l’animal est réalisé très régulièrement afin de pouvoir mesurer la glycémie et injecter une solution de glucose en cas de mal-être ou de valeurs de glycémie trop basse(mesure avec un glucomètre sur une goutte prélevée au niveau de la queue). Chez les souris saines, la glycémie est normalement régulée lors d’une période de jeûne grâce à une production de glucose assurée par le foie(majoritaire), les reins et l’intestin. Les souris sans production de sucre par l’intestin présentent un phénotype anxieux léger. Néanmoins, les conditions d’hébergement en milieu enrichi(nid, maison pour se cacher) sont suffisantes pour atténuer leur anxiété. Après 16 semaines de régime riche en graisses et en sucres, les souris sans modification génétique deviennent obèses et diabétiques. Dans cette étude, elles seront étudiées à un stade précoce du développement de l’obésité et du diabète afin de limiter les complications liées à ces maladies. Des travaux précédents avec le cocktail de polluants dans l’eau n’ont révélé aucune modification de la prise de boisson, ni aucun effet secondaire indésirable, aucune anxiété, ni aucun changement de comportement chez les souris. Les souris soumis à l’exposition chronique de ce mélange de polluant pendant n’ont pas développé d’obésité mais présentent comme attendue une hyperglycémie, signe de diabète.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et de différents tissus. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin d’évaluer l’impact du mélange de contaminants chimiques sur le développement du diabète et la production de glucose par les différents organes producteurs de glucose (foie, reins et intestin). Des tissus non nécessaires à ce projet seront également prélevés afin de constituer une banque de tissus qui permettra à l’avenir de réduire le recours à des animaux supplémentaires.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la pathologie étudiée, le diabète, influence l’ensemble du métabolisme de l’organisme et implique des dialogues entre organes. De plus, les contaminants chimiques testés sont capables de moduler la production de sucre par le foie et l’intestin. Ainsi, puisqu’elle implique de nombreux organes (et une communication entre eux), notre étude nécessite l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, du métabolisme glucidique, et d’outils statistiques. Afin de pouvoir faire une analyse statistique adaptée, des groupes de 8 souris seront analysés. Au total, ce projet nécessitera 114 souris mâles transgéniques et non transgéniques (témoins). En fin de procédures, les animaux seront mis à mort afin de prélever différents tissus à analyser, mais également de nombreux autres tissus pour constituer une banque de tissus utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans animaux supplémentaires.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe, dans un milieu enrichi pour favoriser la nidation et limiter le stress. L’invalidation de la production de sucre uniquement dans le foie évite les hypoglycémies sévères au cours d’un jeûne long grâce à l’induction de la production de sucre par les reins et l’intestin. La connaissance du modèle a permis de définir des points limites, en contrôlant les risques d’hypoglycémie et en limitant les efforts pour accéder à la nourriture et à l’eau de boisson. Pour limiter les hypoglycémies, le suivi des premiers signes d’hypoglycémie est réalisé très régulièrement. Si nécessaire, un suivi de glycémie sera réalisé et une injection d’une solution de glucose ou une mise à mort de l’animal sera réalisée si l’hypoglycémie intervient en fin de procédure (prélèvement des tissus dans ce cas). Enfin, une partie de la cage est placée systématiquement sur une plaque chauffante afin de maintenir la température corporelle de la souris. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés chaque semaine pour suivre leur prise de poids. Le recours à des grilles de score ou à l’échelle de grimace de souris permettra une évaluation précoce du bien-être. Lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet, les souris pourront être mises à mort selon les méthodes autorisées par la législation. Enfin, la dose de contaminants utilisée dans ce projet n’entraine aucune altération physique. En effet, la dose utilisée dans les expériences sur les animaux est très faible (sous les seuils de tolérance admis chez l’Homme).

Choix des espèces

Souris (Mus musculus) En ce qui concerne la fonction étudiée, c’est-à-dire la production de sucre par l’organisme, les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser ces expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme. De plus, le phénotype des modèles murins utilisés dans ce projet est bien caractérisé ce qui permet d’utiliser les modèles adaptés, dans des conditions limitant l’apparition de phénotype dommageable et dans le respect du bien-être animal. A l’âge de 6-8 semaines, les souris recevront des injections pour induire la modification génétique et leurs témoins (sauf pour le modèle d’activation de la production de sucre par l’intestin). Ainsi, après réalisation de la modification génétique à l’âge adulte, les animaux seront étudiés à l’âge de 11-13 semaines (soit 5 semaines après les injections, temps nécessaire à la disparition des effets potentiels de la molécule sur le métabolisme). Ensuite, les souris recevront un traitement (voir composition des groupes) pendant 120 jours. Enfin, les souris seront mises à mort pour prélever des tissus à analyser à l’âge de 28-30 semaines

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 200 d'entre elles et sévère pour 10. Ces souris sans système immunitaire reçoivent des greffes de cellules tumorales sous la peau et par injection dans le sang, puis des molécules d'imagerie dont le porteur reconnaît qu'elles peuvent provoquer des chocs anaphylactiques ou des détresses cardio-respiratoires. L'objectif est de tester de nouveaux traceurs pour détecter et suivre les tumeurs et leurs métastases, avec un bénéfice médical annoncé au conditionnel et à terme. Le porteur affirme qu'il n'existe aucune alternative aux animaux pour ces mesures physiologiques en temps réel, et toutes les souris sont tuées pour analyser les métastases.

Objectifs

Nous poursuivons 2 objectifs scientifiques et technologiques principaux : i) le développement d'un modèle métastatique afin d'améliorer la détection et le suivi de ce type particuliers de tumeur, ii) le développement de nouveaux candidats d'imagerie afin d’améliorer le traitement des tumeurs. Ainsi, l’utilisation d’animaux est nécessaire pour évaluer les effets validés in vitro, en les validant in vivo dans des modèles de tumeurs chez la souris.

Bénéfices attendus

D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à differentes injections : -des injections i.v. (durée : 2 secondes) de suspension cellulaire tumorale et des "candidats imageries" seront réalisées dans la veine caudale -une injection intraperitonéale (durée : maximum 2 secondes) de substrat luciferine, -les implantations des cellules tumorales se font en sous-cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié et prennent quelques secondes. Les imageries dureront de quelques minutes à quelques heures.

Impact sur les animaux

Dans ce projet nous proposons d’étudier la biodistribution de nos candidats imagerie sur des temps d’incubations relativement courts. Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous-cutanées et injectées par i.v., les injections en i.v. des candidats imagerie, ainsi que le développement de la tumeur primaire et des métastases chez l’animal en tant que pathologie. Les composés pharmacologiques peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des troubles comportementaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour caractériser ex-vivo les métastases et afin de prélever certains organes pour analyse ex vivo de la biodistribution.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos candidats imagerie ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le nombre total de souris pour cette étude s'élève à 210 souris. Il tient compte du suivi des modèles expérimentaux développés dans le projet et de la variabilité de développement des tumeurs qu’il peut exister dans les différents modèles. L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus ainsi que le fait que chaque animal est son propre controle. Cela sera suffisant pour appréhender la détection et l’accumulation de nos molécules dans les tumeurs. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société et pour permettre d'obtenir un résultat significatif.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Dès leur arrivée les souris sont placées dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et alternance d'enrichissement, dômes, tubes, fibres pour faire des nids. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale + chirurgie) réalisera les injections des cellules tumorales qui se feront sous anesthésie gazeuse. Une observation hebdomadaire des animaux (poids, douleurs/souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie ou au cours du developpement tumoral constituera un point limite. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs d'un seul fournisseur extérieur.

Choix des espèces

- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection du candidat imagerie) en fonction de la taille des tumeurs.