Procédures sévères

66 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une inoculation de cellules cancéreuses qui provoque une tumeur et un état de cachexie progressif, avec fonte musculaire, sur vingt-neuf jours, complété par des tests de force et un séjour de 48 heures en cage sans enrichissement, avant d'être tué pour prélever ses muscles. Le porteur indique développer ce modèle "suite à un besoin de nos clients", afin de leur offrir la possibilité d'y tester leurs composés. Il suit la souffrance par une grille de score et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier l'efficacité réelle d'un composé sur la cachexie.

Objectifs

Suite à un besoin de nos clients, nous souhaitons développer un modèle de cachexie liée au cancer du colon. Nous avons déjà une forte expérience dans l'utilisation du modèle de cachexie liée au cancer du poumon par l'inoculation ectopiques de cellules cancéreuses du poumons (Lewis Lung Carcinoma). La mise en place de ce nouveau modèle nous permettra non seulement d'étendre notre expertise dans le domaine mais également d'offrir à nos clients la possibilité de tester leurs composés sur un autre type de modèle de cachexie liée au cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude permet d'avoir un suivi longitudinale sur un modèle sévère de cachexie liée au cancer. Une analyse complète sur différents paramètres in vivo tels que le poids, la prise alimentaire, la taille des tumeurs, la composition corporelle, la force des pattes, l'activité spontanée et les échanges respiratoires assure une caractérisation bien défini de ce modèle afin de proposer le proposer à nos clients. Ces derniers pourront alors tester leurs composés dans un but thérapeutique.

Procédures

Ce projet comporte 5 types d'interventions différents: Inoculation de cellules CT-26 : Durée de 5 minute environ. Test de force (2 tests : pattes avant et 4 pattes) : Durée 30sec/session (3sessions/test ; répété 2 fois au cours du projet). Mesures de composition corporelle : Durée de 1-2 minutes (répétée 3 fois au cours du projet). Administrations sous-cutanées : Durée 10 secondes environ; administrations quotidiennes jsuqu'à 29 jours maximum. Physiocages : Durée de 48h ; à partir de D-2 avant euthanasie

Impact sur les animaux

Le modèle employé dans le présent projet est un modèle de cachexie résultant du développement d'une tumeur sous-cutanée induite par l'inocculation de cellules CT26. Le développement tumoral induit un état de cachexie progressif s'accompagnant d'une réduction de masse maigre et d'une perte de poids corporel. Pour des raisons éthiques, le modèle est limité à 29 jours post inoculation des cellules CT26 après lesquels les animaux seront euthanasiés. L'hébergement individuel est nécessaire de par la nécessité de la mesure individuelle de la prise alimentaire. L'anesthésie constituera une nuisance sur les animaux. Les mesures de tumeur peuvent générer un stress voire une douleur pour l'animal. L'ensemble des traitements (par voie sous-cutanée) ainsi que les pesées et les mesures de composition corporelle peuvent être source d'angoisse. Le test de force constitue une légère nuisance sur l'animal. Enfin, les physiocages consitituent également un stress sur l'animal qui sera privé par définition d'enrichissement pendant 48h.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des anayses biochimiques et histologiques sur les muscles des pattes arrières qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’efficacité réelle d’un composé sur l’état de cachexie. Or, nous souhaitons développer un modèle de cachexie liée au cancer du colon. Nous avons choisi un modèle utilisant l'espèce souris qui est parfaitement caractérisé dans la littérature scientifique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe contrôle du modèle a été réduit à 6 animaux (contre 8 pour les groupes cachectiques) du fait d'une moindre variabilité des paramètres mesurés, ces souris ne développant pas de tumeur. Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt en concordance avec une analyse bibliographique. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict minimum nécessaire pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, poids corporel cumulé, prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire, volume tumoral, densité tumorale, poids de la tumeur, poids corporel sans tumeur, composition corporelle (masse grasse, masse maigre, masse fluidique ; animal, carcasse avec/sans tumeur, tumeur seule), test de force par grip test (2 et 4 pattes), activité spontanée, échanges respiratoires et poids des muscles de la patte.

Raffinement

Le modèle animal utilisé est parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé en préclinique. C'est un modèle de cachexie chez la souris induit par une inoculation de cellules de cancer du colon (CT-26). Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés individuellements et un enrichissement du milieu sera assuré par des dômes en carton, de briquettes en bois et de matériel de nidification. Afin de réduire toute douleur, l'inoculation des cellules sera réalisée sous anesthésie gazeuse (sur tapis chauffant) et les mesures de composition corporelle seront réalisées chez l'animal vigile (durée de la mesure : 2 minutes). Les administrations sous-cutanées seront réalisées par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique, et deux sites d'administration seront utilisés (alternance d'un jour à l'autre). Enfin, compte-tenu du développement d’une tumeur et d’un état de cachexie chez les animaux, le développement de cette dernière sera limité à 29 jours et un suivi journalier étroit des animaux à l'aide d'une grille de score de souffrance permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Les points limites sont défini ainsi : - score >20 (ou 15, si le vétérinaire référant décide de l'euthanasie de l'animal) - taille de tumeur >3000mm3 - propagation de la nécrose de la tumeur - perte de poids >20%. Au-delà des points limites, la souffrance de l'animal est évaluée. Au-delà d'un score de 5, la souffrance définie comme légère induit une surveillance renforcée de l'animal (2x/jour). Au-delà de 10, la souffrance définie comme modérée induit une surveillance renforcée de l'animal et traitement analgésique jusqu'à réduction du score

Choix des espèces

Le modèle souris Balb/c ANn Crl est très bien documenté dans la littérature en tant que modèle de cachexie induit par une inoculation de cellules CT-26. Le choix du modèle souris Balb/c ANn Crl a été validé avec le client et le chef de projet. Les animaux utilisés seront de jeunes souris adultes (5 semaines à réception ; 7 semaines au début du traitement). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine qui sera ciblée par les composés à tester, à savoir une population adulte présentant un état cachectique lié au cancer.

30 souris porteuses de la mutation de la mucoviscidose vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Nées avec un poids faible et une mortalité d'environ 20 % que le porteur intègre à la procédure, elles reçoivent jusqu'à vingt-cinq injections sous-cutanées sur douze mois, avant d'être tuées pour analyse de leurs organes. Le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer une inflammation locale et que les souris perdant 20 % de leur poids sont mises à mort. Il décrit le modèle murin comme "incontournable" pour valider cette approche thérapeutique par l'ARN, les retombées pour les patients restant renvoyées au conditionnel.

Objectifs

L’objectif de ce projet a pour but de valider une approche thérapeutique basée sur les ARN dans le but de trouver un nouveau médicament pour les patients atteints de mucoviscidose qui ne peuvent bénéficier des traitements actuels.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de cette étude, nous voulons montrer le bénéfice que pourrait apporter notre approche thérapeutique sur la survie des souris. D’autres paramètres importants seront étudiés comme la prise de poids. Ces données seront importantes pour, à terme, proposer cette nouvelle stratégie à des patients atteints de mucoviscidose qui ne peuvent bénéficier des traitements actuels.

Procédures

Les souris -/- ont un caractère dommageable et naissent avec un poids plus faible que des souris +/- ou +/- avec une mortalité de l’ordre de 20% qui fait partie intégrante de la procédure et que les animaux seront euthanasié par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu (12 mois) ou avant en cas de point limite. Les interventions effectuées sur les souris seront : - Prises de poids régulières. La durée de cet acte est de l’ordre de moins de 1 minutes par souris, - Injections sous-cutanées. Les injections seront effectuées à J11 et J18 après la naissance puis tous les 15 jours jusqu’à la mort ou l’euthanasie de l’animal. Pour un animal atteignant l’âge de 12 mois, cela représente 25 injections. La durée de cet acte est optimisée, car la préparation des solutions à injecter est effectuée en amont et les seringues sont préparées dès que l’animal est pesé. La durée estimée pour cet acte, après la pesée, est de 1 minute.

Impact sur les animaux

Les nuisances que l'on peut attendre dans ce projet sont liées à la manipulation des souris lors de l'injection en sous-cutanée. La contention et la piqûre vont induire un stress à l'animal. L'utilisation des oligonucléotides en sous cutanée de manière répétée peut provoquer une inflammation locale qui peut être palliée en changeant le site de l’injection. Dans d’autres études avec des oligonucléotides, il a été observé une toxicité hépatique que nous n’avons pas retrouvé dans nos études précédentes. Les animaux -/- ont à la naissance un poids plus faible et peuvent ne pas prendre de poids durant leur croissance.

Devenir

A la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés afin d’effectuer une analyse des principaux organes (poumon, foie, reins, intestins, cœur, pancréas, testicules, ovaires).

Remplacement

Dans la pathologie de la mucoviscidose, les modèles les plus utilisés pour tester des molécules sont les lignées cellulaires et les cellules issues des patients. Ces modèles permettent de rendre compte des effets des molécules sur la toxicité et l’efficacité des molécules testées, mais ne peuvent rendre compte des effets dans un organe ou un tissu vivant. Avant de commencer ce projet, nous avons montré que notre molécule était active et pas toxique sur des lignées cellulaires, mais également sur des cellules issues de patients. Les souris porteuses de la mutation de la mucoviscidose possèdent des caractéristiques physiologiques similaires à celles des humains, en particulier en ce qui concerne les atteintes respiratoires et intestinales. Nous devons passer par un organisme vivant afin de valider notre approche thérapeutique pour les patients atteints de mucoviscidose. Le modèle murin est le modèle le plus souvent utilisé dans les recherches sur la maladie de la mucoviscidose. En utilisant le modèle murin, nous pouvons étudier les effets de la molécule à différents niveaux, allant de la biologie moléculaire à la physiologie des organes. Cela permet aux chercheurs de mieux comprendre la maladie et de développer de nouveaux traitements. Ce modèle se révèle incontournable pour étudier les effets d’une molécule pouvant traiter cette maladie.

Réduction

Nous utiliserons le minimum de souris qui nous permettra d’obtenir des données statistiques fiables et de valider ou non nos résultats obtenus sur des cellules isolées. Nous avons effectué des tests de puissance qui nous permettent d’évaluer le nombre de souris que nous devrons utiliser dans notre étude. Le nombre prévu est de 30 souris traitées, nous arrêterons le projet dès ce nombre atteint.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les conditions standard. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Une prise de poids régulière, mesuré 3 fois par semaine et une grille d’évaluation comportementale seront effectuées avant le début de la procédure expérimentale. Des croquettes humides ou l’utilisation d’un gel enrichi seront ajoutées dans les premières semaines, car les souris porteuses des deux mutations présentent une taille et un poids inférieur aux autres souris ce qui peut limiter l’accès à la nourriture et à l’eau. Afin d’évaluer les points limites une grille de score sera mise en place avec une pesé hebdomadaire après la phase critique post-sevrage. Une perte de 20% du poids des souris sera considérée comme problématique pour la poursuite de l’expérience entraînant l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Le modèle murin proposé pour cette étude est le modèle de référence dans le cadre de la pathologie de la mucoviscidose pour mimer au mieux ce qui est observé chez l’homme. Les autres modèles développés ne sont soient pas accessibles en France (modèle furet) soient pas pertinents (cochon qui meurt à la naissance ou rat qui n’a pas plus d’atteintes que la souris). Ce modèle murin est intéressant pour cette pathologie, car il mime les atteintes que l’on retrouve chez les patients qui ne sont pas traités. Nous retrouvons une atteinte qui va toucher de nombreux organes comme le système gastro-intestinal, les os, les organes reproducteurs ainsi que les dents. L’objectif de ce projet est de tester les effets d’une molécule sur le modèle murin sur ces différentes atteintes et de voir l’amélioration de la survie induite. Dans le cadre de notre étude, nous traiterons les souriceaux avant le sevrage qui est un passage critique pour les souris lorsqu’elles passent d’une alimentation liquide à une alimentation solide. Nous traiterons les souriceaux à J11 et J18 avec notre molécule afin de pouvoir passer ce point critique.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du pancréas ou développent une tumeur spontanée, puis des injections répétées de chimiothérapies et d'immunothérapie, avant une mise à mort pour prélever les organes. Le porteur indique que la tumeur pancréatique provoque perte de poids, perte de mobilité et cyphose dorsale, et fixe un score clinique au-delà duquel les souris sont tuées. Il juge le recours à l'animal "indispensable", estimant que les biopsies humaines sont trop rares et que les systèmes in vitro comme les organ-on-a-chip ne sont "pas encore au point".

Objectifs

L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), la forme la plus courante de cancer du pancréas, est l'un des cancers humains les plus meurtriers, avec une survie médiane de 6 mois après le diagnostic et un taux de survie relative à 5 ans de seulement 9%. Le PDAC se classe au quatrième rang des décès liés au cancer, et les projections pour 2030 le placent au deuxième rang après le cancer du poumon, car son incidence continue d'augmenter. Les patients sont souvent diagnostiqués tardivement en raison de l'absence de symptômes précoces, de sorte que moins de 20 % des patients ont des tumeurs localisées éligibles à une résection chirurgicale au moment du diagnostic. Malgré des avancées significatives dans la compréhension de la biologie de ce cancer, des progrès minimes ont été réalisés dans le traitement des patients atteints de PDAC avancé, dans lequel les combinaisons de thérapies cytotoxiques, telles que nab-paclitaxel plus gemcitabine ou FOLFIRINOX, n'apportent que de modestes améliorations des taux de survie. Ce fardeau renforce l'urgence de développer de nouvelles options thérapeutiques efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux connaître le métabolisme mitochondrial dans le PDAC, en tenant compte des événements intrinsèques aux cellules tumorales, à leur microenvironnement et au dialogue immunitaire entre le muscle squelettique et la tumeur via la circulation sanguine dans l'organisme entier. Les connaissances générées par cette étude intégrative seront utilisées à l'avenir pour des recherches translationnelles visant à améliorer les stratégies thérapeutiques innovantes multimodales, comprenant des soins de soutien à la qualité de vie tels que l'activité physique adaptée.

Procédures

1) Injection intrapéritonéale des cellules cancéreuses (1 injection unique par souris, durée quelques secondes) et injection intrapéritonéale de luciférine lors de l’imagerie pour le modèle d'allogreffes (1 injection à chaque expérience d’imagerie pour suivi longitudinal de la taille tumorale, 2 maximum par souris pour la tâche 1, 6 maximum par souris pour les tâches 2 à 4, chaque injection ne durant que quelques secondes). 2) Injections intrapéritonéales répétées des traitements antitumoraux pour les deux modèles : le Gemzar (Gemcitabine) sera injecté à une concentration de 120 mg/kg 2 fois par semaine, la Phenformine à 50 mg/kg 5 jours par semaine, la Perhexiline à 5 mg/kg 3 fois par semaine, et l’anticorps anti-PD-1 à 10 mg/kg 2 fois par semaine ; ces doses n’entrainent pas d’effet toxique systémique et chaque traitement ou combinaison de traitement durera un mois maximum (chaque injection ne dure que quelques secondes). 3) Prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire sous anesthésie juste avant le sacrifice pour nécropsie pour prélèvement des organes d'intérêt (donc 1 seul prélèvement par souris, qui dure 30 secondes au maximum).

Impact sur les animaux

Les nuisances sont relatives 1) au développement d’une tumeur pancréatique qui se signale principalement par une perte de poids corporel, perte de mobilité et cyphose dorsale, 2) aux actes de pesée du poids corporel régulière et de manipulation lors de l’anesthésie, et 3) aux injections intrapéritonéales répétées des traitements dans le cadre des tâches 2, 3 et 4. Les thérapies testées n’ont pas d’effet toxique systémique avec les doses utilisées, qui sont basées sur nos propres études publiées concernant la gemcitabine, la phenformine et la perhexiline, et la littérature concernant l’anticorps anti-PD-1.

Devenir

Le sort de tous les animaux sera l’euthanasie pour prélèvement d'organes en vue d'analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. D’une part, pour cette étude mécanistique, les données expérimentales devront être en grande partie obtenues sur des échantillons de tumeurs et organes corporels, et cette démarche est limitée chez l’homme. Les gestes de prélèvement de tissu pancréatique sont très invasifs en clinique ; une seule biopsie est faite par endoscopie au diagnostic de cancer du pancréas, et seuls les moins de 20% de patients montrant une tumeur localisée dans le pancréas sont éligibles pour une résection de la tumeur par chirurgie qui n’est faite qu’une seule fois. Ainsi nous ne disposons pas d’échantillon tumoral pour plus de 80% des patients et un suivi dynamique n’est possible chez aucun. D’autre part, les critères métaboliques et fonctionnels que nous allons étudier sont de types physiologiques, et ne sont donc pas reproductibles avec des cultures de cellules ou des systèmes alternatifs in vitro reproduisant la physiologie animale (tels les « organ-on-a-chip » dans lesquels plusieurs organes pourront dialoguer in vitro) qui sont en cours de développement mais pas encore au point. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 460 individus sur 5 années conformément à la règle de réduction. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

La mesure de la taille de la tumeur n’est pas fiable dans nos deux modèles (modèle KPC GEMM = détection d’une tumeur par échographie qui ne donne pas une mesure exacte de la taille ; modèle allogreffes orthotopiques = détection d’une tumeur par bioluminescence qui ne donne pas non plus une mesure exacte de la taille). C’est pourquoi nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal : un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (tableau de score fourni en annexe). Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 5 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort. De plus, les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage de 530 cm2) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation (en alternance, tiges de papier, pelotes de lanières de papier ou abri en carton). La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. Enfin, les injections intrapéritonéales de cellules cancéreuses et de luciférine pour le modèle d’allogreffes seront réalisées sous anesthésie.

Choix des espèces

Le projet nécessite une espèce de la classe des mammifères qui soit proche de l’humain pour sa physiopathologie de tumeur cancéreuse (utilisation de souris développant un adénocarcinome pancréatique). Les tumeurs pancréatiques qui se développent chez la souris génétiquement modifiée montrent de nombreuses similarités avec les tumeurs humaines, faisant de la souris un très bon modèle d’étude. De plus, il est connu que plus de 80% de protéines (séquences nucléiques codantes) sont homologues entre la souris et l'homme y compris au niveau immunitaire, ce qui renforce l'utilité du modèle pour ce projet qui concerne le système immunitaire. Pour toutes ces raisons, le choix de travailler chez la souris, qui présente l’avantage d’être de petite taille et facilement manipulable, est entièrement justifié. Les souris KPC GEMM seront étudiées à l’âge de 5-7 mois comme justifié dans le paragraphe 3.3.2.2. Dans ce modèle de tumeur spontanée, le développement tumoral est lent et le temps d’apparition d’une tumeur décelable est très hétérogène, entre 2,5 mois et 12 mois. Les souris doivent être suivies chaque semaine pour détecter la présence d’une tumeur par les signes cliniques caractéristiques pour sacrifier les souris avant le point limite éthique. Dans le cas du présent projet, nous faisons le choix de sacrifier les souris entre 5 et 7 mois d’âge pour celles qui seraient encore en vie à cet âge-là, ce qui permettra de récolter des résultats à différents stades de la tumorigenèse. Les souris KPC allogreffes seront implantées à l’âge de 6 à 10 semaines, ce qui est un âge classique pour ce type de modèle expérimental de tumeur induite par greffe de cellules cancéreuses.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles reçoivent une injection déclenchant une inflammation rénale, puis la pose d'un cathéter sous anesthésie profonde et une imagerie photoacoustique avec agent de contraste, avant d'être tuées pour prélever les reins. Le porteur indique que le produit inflammatoire peut provoquer une inflammation généralisée, une insuffisance rénale et des lésions de plusieurs organes pouvant mener à la mort, tout en affirmant avoir choisi une dose qui n'entraîne pas de mortalité. Il conclut que l'imagerie in vivo ne peut pas être remplacée par des méthodes sans animaux et qualifie ces procédures de "stricte nécessité", pour tester un nouvel agent de contraste.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de tester in vivo l'imagerie photoacoustique pour le diagnostic précoce de l'inflammation rénale en utilisant un nouvel agent de contraste ciblant certaines molécules d’adhésion. Celles-ci sont exprimées à la surface des cellules lors d’un épisode inflammatoire aigu ou chronique comme une inflammation systémique, une atteinte rénale ou une maladie rénale chronique. Une étude plus récente a d'ailleurs démontré dans un modèle murin d'atteinte rénale aiguë que cet agent de contraste est capable de cibler l'inflammation dans la moelle rénale. Des tests préliminaires sur ces microparticules en imagerie photoacoustique ont montré que ces microparticules possèdent une absorption et une fluorescence considérable dans la région des longueurs d'onde utilisées en imagerie photoacoustique (proche InfraRouge). L'utilisation de ce nouvel agent de contraste semble donc être un outil prometteur pour la détection en pré-clinique de l'inflammation rénale. Enfin, des études in vitro et in vivo ont montré les propriétés biocompatibles et biodégradables de ces microparticules et il a été également démontré que cette stratégie était efficace pour cibler les cellules endothéliales activées humaines, ouvrant la voie à une potentielle translation en clinique.

Bénéfices attendus

Il est attendu de la technique d'imagerie photoacoustique utilisant ce nouvel agent de contraste biocompatible qu'elle puisse permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation rénales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie photoacoustique avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).

Impact sur les animaux

D'après les études pilotes précédentes, les deux modèles présentés peuvent en effet induire des effets indésirables sur les animaux. Pour notre 1er modèle, l'injection du produit inflammatoire peut induire une inflammation généralisée, une insuffisance rénale et des lésions touchant plusieurs organes ce qui peut mener à la mort des animaux. Il est important de noter que la concentration choisie pour ce projet n'induit pas de mortalité chez les souris. Pour notre 2ème modèle, ce modèle d'inflammation différent du premier induit la mort des cellules rénales conduisant dans certains cas une insuffisance rénale aigue. Dans ces deux modèles, les animaux peuvent être en mal-être qui peut alors être repéré par un état d'épuisement, une inactivité dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids. Lors du protocole d'imagerie, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux (la "sonde veineuse" qui permet l'administration de l'agent de contraste) peut provoquer un bleu sur la queue des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux (reins), permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem (biodistribution, caractérisations immunohistologiques). De plus, les caractérisations histologiques sont très souvent demandées pour justifier les résultats obtenus lorsqu'une nouvelle technique d'imagerie pré-clinique est étudiée.

Remplacement

Des tests in vitro ont été réalisées sur des microparticules utilisées en imagerie photoacoustique et ont permis de montrer que ces microparticules possède une absorption et une fluorescence considérable dans la région des longueurs d'onde utilisées en photoacoustique (proche InfraRouge). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de ces microparticules pour les molécules d'adhésion exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et de détectabilité de ces microparticules en imagerie photoacoustique lorsqu'elles sont injectées dans un organisme. D'après les études pilotes, on sait que les microparticules utilisées ciblent efficacement l'inflammation rénale dans les deux modèles cités et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie photoacoustique. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets ayant utilisé les mêmes modèles animaux et les mêmes types de microparticules. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons.

Raffinement

Pendant les différents temps que dureront l'étude, la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie. De plus en amont de ce projet, pour limiter la douleur engendrée par l'injection de produit inflammatoire, nous avons choisi de n'utiliser qu'une dose, connue pour ne pas induire de mortalité chez les souris. Enfin, les animaux ne seront pas gardés pour des études sur le long terme pour ne pas les laisser en souffrance au-delà des 24 et 48 heures que durent les modèles.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies de type inflammatoire. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes (8 semaines), en rapport avec l’âge des animaux utilisés dans les études pilotes précédentes.

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles sont cousues deux à deux par chirurgie de parabiose sous anesthésie générale, pour partager leur système sanguin, puis subissent prélèvements et injections avant d'être tuées environ cinq semaines après l'opération. Le porteur reconnaît que la parabiose est classée sévère en raison de l'inconfort post-opératoire, prévoit une analgésie de 48 heures et fixe comme point limite une perte de poids supérieure à 20 % ou une détresse non soulagée au-delà de 24 heures. Il affirme que ce partage chirurgical du sang est la seule alternative pour identifier la source d'une cytokine dans le modèle murin de la sclérose en plaques.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie auto-immune qui se caractérise par l'infiltration du système nerveux central (CNS) par des cellules immunitaires conduisant à la destruction de la gaine de myéline qui est à l'origine des désordres moteurs chez les patients. Afin de développer des traitements plus ciblés, il est essentiel de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie. Nous avons identifié une nouvelle fonction pour une cytokine pro-inflammatoire, le GM-CSF, en mettant en évidence son rôle crucial dès les premières étapes de la maladie. Nous souhaitons dans ce projet identifier la source cellulaire de cette cytokine.

Bénéfices attendus

L'utilisation d'anticorps antagonistes bloquant le GM-CSF est une piste thérapeutique prometteuse et les premiers résultats testant l'inocuité du traitement chez les patients sont prometteurs. Notre projet permettra d'apporter un nouveau mécanisme d'action du GM-CSF en montrant que l'utilisation d'un anticorps monoclonal bloquant la cytokine agit non seulement au niveau du système nerveux central, mais aussi en périphérie au niveau des organes lymphoïdes secondaires dès les étapes les plus précoces de la maladie, renforçant ainsi la pertinence de son utilisation dans le traitement de la SEP.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie de parabiose sous anesthésie générale. Deux semaines après la chirurgie, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine mandibulaire sous anesthésie gazeuse. Quatre semaines après la chirurgie, les animaux recevront, sous anesthésie gazeuse, une injection sous-cutanée au niveau de la base de la queue ainsi qu'une injection intra-veineuse au niveau de la veine caudale. Les animaux seront euthanasiés aux alentours de 5 semaines après la parabiose.

Impact sur les animaux

Les expériences de parabiose sont des expériences classées sévères du fait de l'inconfort qu'elle crée en post-opératoire. Cependant, nous avons déjà réalisé ce type de chirurgie pour un autre projet, et dès 2-3 jours après la parabiose, les parabiontes se déplacent dans la cage et se suspendent à la grille.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront tous euthanasiés.

Remplacement

L'objectif de notre projet est d'identifier la source de GM-CSF et de distinguer si le GM-CSF est sécrété par une population cellulaire circulante ou une population résidente dans les tissus lors des premières étapes de la mise en place de la réponse inflammatoire mise en place lors d'une encéphalite auto-immune expérimentale, le modèle murin de la sclérose en plaques. C'est un processus complexe et intégré qui nécessite l'implication de plusieurs types cellulaires dans des organes distincts avec une cinétique précise. Ces étapes ne peuvent pas être mimées in vitro. De plus, les expériences de parabiose, à savoir le partage du système sanguin, sont les seules alternatives expérimentales afin de répondre à notre question.

Réduction

Nous avons calculé que le nombre minimum pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 7 souris/groupe et que les expériences seront reproduites 2 fois. Nous effectuerons le maximum d'analyse sur le même animal : analyse des tissus inflammés par histologie, analyse multiparamétrique en cytométrie en flux ...

Raffinement

Avant la procédure de parabiose, les futurs parabiontes seront isolées dans une cage enrichie (igloo/papier kraft pour nidification) pendant deux semaines afin qu'elles s'habituent l'une à l'autre. Lors de la procédure de parabiose, les souris seront anesthésiées avec un mélande de Kétamine 100 mg/kg/Xylazine 10mg/kg injecté en i.p (aiguille de 26G). A cette dose, l'anesthésie dure environ 60 min. Si les souris devaient se réveiller, une nouvelle injection en i.p. serait réalisée de kétamine seule (25 mg/kg) (aiguille de 26G). Nous nous assurerons de la perte de conscience des animaux avant la chirurgie par une absence de reflexe palpébral et du reflexe du retrait. Durant l'opération, un gel oculaire sera appliqué afin d'éviter tout dessèchement de la cornée. Après la chirurgie et jusqu'à leur réveil, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de limiter l'hypothermie. En post-opératoire, les animaux seront analgésiés pendant 48h, 2 fois/24h, par des injections souscutanées (aiguille de 26G) de Buprenorphine à 0.1 mg/kg. Durant 10 jours, les animaux recevront des antibiotiques sous forme d'un traitement dans l'eau de boisson. Nous nous assurerons aussi que les animaux aient une prise hydrique et alimentaire correcte en rajoutant dans la cage du gel d'hydratation ainsi que des croquettes sous forme de gel. Une attention particulière sera portée aux sutures cutanées pendant la première semaine. Les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement pour détecter des signes de douleur et de détresse (tremblement, léthargie, dos arqué, manque de toilettage...). Une perte de poids sévère (>20% du poids initial) ou des signes de douleur et de détresse >24h et non soulagé par le traitement analgésique constituent des points limites et la mise à mort des animaux. Pour réaliser l'immunisation, les animaux seront anesthésiés sous anesthésie gazeuse (Isoflurane 4%). La procédure n'entraîne pas de douleurs, ni de dommages aux animaux.

Choix des espèces

Du point de vue immunitaire, les souris présentent des caractéristiques proches de l'espèce humaine. Elles nous permettent d'étudier la physiopathologie des maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, avec son modèle murin l'EAE (encéphalite auto-immune expérimentale). Nous disposons aussi des modèles murins génétiquement modifiés qui nous permettront d'évaluer l'origine du GM-CSF dans la réponse mise de place da réponse immune encéphalitogène. Des souris adultes seront utilisées dans ce projet

250 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès l'âge de deux jours, les souriceaux sont gavés deux fois par jour pendant sept jours avec des staphylocoques, ce qui peut provoquer une inflammation digestive, des diarrhées, une infection généralisée avec fièvre et déshydratation. Le porteur prévoit la mise à mort par décapitation dès une perte de poids supérieure à 15 %, puis une analyse bactériologique des tissus. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de l'animal et retient le modèle néonatal parce que les infections humaines visées surviennent dans les premiers jours de vie.

Objectifs

Les bactériémies à Staphylocoques chez les nouveaux-nés peuvent-être médiées par le portage digestif. Lors d'une étude préliminaire, nous avons pu montrer une forte présence de Staphylocoques dans les selles des patients atteints de bactériémie. Nos travaux in-vitro se sont donc portés sur la colonisation de différentes espèces de Staphylocoque (aureus, capitis, haemolyticus) au niveau digestif. Nous avons réussi à déterminer que ces pathogènes parvenaient à passer à travers la barrière intestinale en utlisant des cellules appelées entérocytes et cellules M. Pour confirmer nos observations, un modèle in-vivo de souris néonatal nous permettra de (i) confirmer le passage intestinale de ces souches à travers l'épithélium intestinal. Nous pourrons également vérifier (ii) qu'une souche microbiotique (L. lactis) peut avoir un effet protecteur quant à l'implantation de souches pathogènes.

Bénéfices attendus

Nos résulats in-vitro valident nos hypothèses sur un modèle simple. Un modèle animal complexe permettrait de résoudre le mystère de la physiopathologie des Staphylocoques dans l'intestin.

Procédures

Les interventions seront des gavages répétés 2x/jour (20 secondes par gavage, donc 40 secondes par jour de gavage) pendant 7 jours chez des souriceaux âgés entre 2j et 9j. La pesée et le test du pli de la peau du dos prendront environ 30 secondes par jour. Au total, les souriceaux seront exposés à environ 1 minute de procédure par jour pendant 7 jours.

Impact sur les animaux

Le gavage sur souris adulte est une technique maitrisé dans le laboratoire, il faudra cependant adapter notre protocole à des souriceaux. Il est possible que la sonde de gavage puisse provoquer une légère irritation dans la gorge de l'animal. L'induction d'une forte charge bactérienne peut provoquer une inflammation du système digestif avec une apparition de diarrhées. La survenue d'une bactériemie peut provoquer un état infectieux général incluant de la fièvre et de la déshydratation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour une analyse bactériologique et inflammatoire des tissus.

Remplacement

Nous sommes limités par notre modèle simple in-vitro. Un modèle de récupération de cellules primaires de patients est envisagé mais restera circonscris à un modèle in-vitro. Il est impossible d'envisager de travailler sur un modèle in-vitro reproduisant la complexité d'un animal.

Réduction

Nous n'aurons pas besoin d'effectuer des génotypages et des sélections de génotypes puisque nous travaillerons sur des souris au génotype "sauvage" issus d'éleveurs agréés. Afin de minimiser le nombre d'individus nécessaires, un test statistique ANOVA a permis de défnir le nombre d'animaux nécessaire pour une puissance statistique significative.

Raffinement

Toutes les expérimentations sont réalisées dans une animalerie certifiée. Les souris seront manipulées une fois tous les jours pour être habituées à la présence et à l'odeur de l'expérimentateur. Cela évitera également que la mère délaisse ces petits après les manipulations de l'expérimentateur. Les petits resteront avec leur mère (il ne pourra donc n'y avoir qu'une condition par cage) pour éviter toute souffrance des bébés. Les bébés seront pesés 1 fois par jour avec une balance de précision pour détecter une perte de poids correspondant à l'installation de la maladie. Une perte de poids supérieure à 15% conduira au sacrifice de l'animal par décapitation. Les petits ne seront utilisés qu'à partir de l'âge de 2 jours, les recommandations demandent de laisser généralement la femelle et ses petits tranquilles pendant les premières 24h de vie. Les gants seront changés entre chaque cage, avec un frottage préalable avec de la litière avant de manipuler les petits. Les souriceaux seront manipulés sur une table chauffante (préalablement frottée avec de la litière de la cage) ou dans le creux des mains pour éviter une hypothermie. Les mères seront alimentées avec une nourriture enrichie pour reproducteurs. Les cages seront enrichis (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). L'eau et la nourriture pour les individus adultes seront mis à disposition "ad libitum". Chaque animal bénéficie d'une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d'assurer un bien-être optimal tout au long de l'étude. Les gavages seront effectués via une sonde flexible spécialement adapté aux souriceaux.

Choix des espèces

La souris est à l'heure actuelle l'animal le mieux adapté pour la modélisation de la colonisation intestinale à Staphylocoques. Il se trouve que cet animal peut-être naturellement colonisé par S. aureus. L'expérimentation sur des animaux de petites tailles permet d'apporter des élements dans un contexte physipathologique impossible à atteindre in-vtro ou en clinique humaine. Les animaux seront utilisés à H+48 par rapport à leur naissance. En effet, les bactériémies observées chez les nouveaux-nés humains se produisent dans les 5 jours suivant la naissance. Il est donc nécessaire de développer un modèle murin néonatal. Les souris adultes ne pourront pas être infectées par le gavage de leurs petits. En effet, les trois espèces bactériennes utilisées sont : - S. capitis pour lequel le risque d’infection est impossible pour une souris adulte en bonne santé (C’est avant tout un germe opportuniste qui profite de l’axenie des nouveau-nés pour s’implanter) - L. lactis qui est une souche commensale sans pouvoir pathogène - S. aureus pour lequel il pourrait exister une faible chance pour les souris adultes d’être inféctées. L’inoculum étant principalement localisé dans les souriceaux, un transfert suffisamment important de l’inoculum des souriceaux à la souris adulte est impossible. Une quantité très importante est généralement nécessaire pour induire un effet direct sur la souris adulte (en gavage direct ou sur une plaie profonde et maintenue induite par l’expérimentateur). Il est impossible que cette dose se retrouve par accident au contact des souris adultes.