Procédures sévères

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur injecte des cellules cancéreuses et des composés modifiant leur taux de plaquettes, avec chirurgie et suivi par imagerie sur plusieurs semaines, pour définir le rôle des plaquettes dans la formation de métastases. Le porteur indique que les métastases pulmonaires et hépatiques provoquent prostration, détresse respiratoire, troubles du comportement et agressivité, et que la pose d'une pompe peut entraîner une infection. Il affirme qu'aucune méthode in silico ou in vitro ne reproduit la complexité de la cascade métastatique, et met à mort toutes les souris pour les prélèvements.

Objectifs

Les plaquettes sanguines sont un des éléments essentiels de la voie de coagulation. Cependant de plus en plus de données de la littérature suggèrent une implication des plaquettes dans certains éléments clés de progression tumorale. Ce projet vise à définir le rôle des plaquettes sanguines dans la formation de métastases in vivo. Pour cela différentes lignées cellulaires cancéreuses luminescentes seront injectées à des souris chez lesquelles on aura diminué ou augmenté, à l’aide de composés chimiques ou de modèles génétiques, les taux de plaquettes, afin d'en évaluer l'impact sur l'agressivité cancéreuse. De plus ces expériences chercheront à identifier une nouvelle cible thérapeutique à la surface des plaquettes pour diminuer la formation de métastases.

Bénéfices attendus

A la fin de ces expériences, nous espérons pouvoir démontrer l’implication des plaquettes dans la formation des métastases et qu'inhiber les interactions plaquette/cellules tumorales pourraient être potentiellement de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Prélèvement sanguin, durée 1mn/souris, 2 fois. Injection des composés chimiques sur souris anesthésiées, durée 1mn/souris, tous les 4 jours pendant 14 à 28 jours. Chirurgie sous cutanée sur souris anesthésiées, durée 20mn/souris, 1 fois. Injection de cellules tumorales sur animaux vigiles, durée 1mn/souris, 1 fois. Imagerie en bioluminescence fluorescence sur des souris anesthésiées, durée 30 secondes à 5mn/souris. 2 à 3x/semaine pendant 14 à 28 jours.

Impact sur les animaux

La majorité des effets délétères attendus seront dû à la formation de métastases pulmonaires et/ou hépatiques donc avec des signes cliniques comme prostration, troubles du comportement, agressivité, détresse respiratoire, troubles métaboliques. Les souris qui subiront la pose d'une pompe osmotique sont susceptibles de développer une inflammation locale voir une infection. Ces aspects sont considérés dans l’établissement des points limites.

Devenir

Les animaux ayant subi ces interventions seront tous mis à mort pour prélèvements et analyses ultérieures. Ils ne pourront donc pas servir pour d'autres expérimentations.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour remplacer le présent projet. Les études in silico et in vitro 2D ou 3D ne permettant pas de reproduire les conditions permettant de récapituler la complexité de la cascade métastatique. Le modèle animal est donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisamment pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente. De plus il utilise un système d’imagerie du petit animal qui permet un suivi longitudinal d’un même animal donc une réduction du nombre total nécessaire. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier une équipe réalisant des expériences similaires.

Raffinement

Le protocole expérimental prend en compte l’impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Les souris sont maintenues en groupe de 5 par cage pour maintenir une interaction sociale entre individus. L’environnement d’élevage est enrichi à l’aide de nids et de carrés de cellulose pour garnir ces nids. Les souris ont accès ad libitum à une nourriture de type normal et à de l'eau filtrée. Si une souris présentait des symptômes traduisant l’apparition de douleurs (réduction de la réactivité, difficulté de locomotion, fourrure non entretenue, tendance à l'isolement) un traitement par un antalgique sera effectué. Des points limites ont été établis pour anticiper toute souffrance animale.

Choix des espèces

LLa souris est l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude pour les raisons suivantes : • Nombreux protocoles bien établis pour cette espèce • possibilité d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés • modèles mimant très bien les cancers mammaires et de mélanomes humain, car ils récapitulent toute la cascade métastatique en peu de temps et ont déjà fait l'objet de nombreuses publications dans le domaine. Ce seront des animaux adultes de 8 semaines minimum qui seront utilisés car les potentielles applications thérapeutiques s'adresseront à une population humaine adulte.

2 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Menées par un prestataire de services en recherche préclinique, elles associent greffe de tumeur dans la rate, ablation de la rate et hépatectomie partielle, le porteur reconnaissant que la douleur liée à cet acte est sévère, surtout du fait de l'hépatectomie. Les animaux reçoivent ensuite des composés à tester par de multiples voies, avec irradiation et imagerie, pour cribler des candidats médicaments contre le cancer colorectal. Le porteur prévoit jusqu'à 30 % d'animaux excédentaires, affirme qu'aucune méthode ne remplace l'essai in vivo, et met à mort tous les animaux devenus porteurs de tumeurs.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Ils seront identifiés par implantation d’un transpondeur ou clips aux oreilles ou tatouage, sous anesthésie (moins de 1 minute). Les animaux seront irradiés après un court transport (durée totale moins de 30 minutes, les animaux restant dans leur cage de stabulation). La greffe tumorale sera une procédure chirurgicale d’une trentaine de minutes environ et sera réalisée sous anesthésie et analgésie pré- et post-opératoire.. Les animaux pourront recevoir des traitements par voie intramusculaire (IM) ou intradermique (ID) sous anesthésie et analgesie (1 minute). Les animaux vigiles et sous contention pourront recevoir des traitements par voies intra-péritonéale (IP), intra-veineuse (IV), sous-cutanée (SC), intra-nasale (IN), intra-trachéale (IT) ou orale (1 minute) Des prélèvements sanguins pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. Si un suivi par une technique d’imagerie est envisagé, il sera réalisé sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure.

Impact sur les animaux

Pour ces modèles, la greffe (injection de suspension de cellules) de la tumeur est réalisée dans la rate, suivie d’une splénectomie. Une hépatectomie partielle est également réalisée afin de favoriser la prise tumorale hépatique (modèle orthotopique). La douleur liée à cet acte est sévère en particulier du fait de l’hépatectomie. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement afin de détecter tout signe de mal être. Les animaux recevront des traitements par voie IM, ID, IN, IT, SC, IP, orale. Ces actes entraineront un stress léger. Dans le cas des administrations par injection, la douleur sera limitée à celle de la piqure d’une aiguille (pour IM et ID cela sera permis par l’administration préalable d’un antalgique opiacé). Le jour du démarrage de l’étude, les animaux seront randomisés (sur la base du poids et/ou du volume tumoral) et donc potentiellement mis en présence de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress pendant 1 à 2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Les procédures d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Dans certain cas, l’imagerie impliquera un transport, de même que l’irradiation ce qui pourrait engendrer un léger stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Jusqu’à 30% d’animaux excédentaires pourront être inclus initialement (avant randomisation) afin de plus facilement constituer des groupes homogènes au moment de la randomisation. Si de la mortalité est constatée au moment de la chirurgie de greffe lors de la première étude, le nombre d’animaux excédentaires pourra augmenter du pourcentage de décès à la chirurgie. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.

Raffinement

La greffe de tumeur sera réalisée en condition aseptique sous anesthésie et analgésie pour limiter la douleur induite par cette chirurgie. Les animaux bénéficieront d’un suivi et de soins post-opératoires pour limiter la douleur et le stress (réveil sous tapis chauffant pour limiter l’hypothermie, poursuite de l’analgésie tant que nécessaire). La réorganisation liée à la randomisation induira un stress léger, limité par l’enrichissement de l’environnement des animaux. Le suivi des poids des animaux induira un stress léger. Les injections IM et ID, entrainant une douleur modérée, seront réalisées avec analgésie préalable. Les actes moins stressants (autres administrations/ et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (administrations IV, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible spécifiquement l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. L’euthanasie des animaux est programmée à un jour fixe, identifié spécifiquement pour chaque modèle. Pour le raffinement, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives (imagerie) chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum).

895 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules de lymphome, par voie intraveineuse ou par chirurgie de la rate, puis une injection de bactéries provoquant un sepsis, avec un suivi tumoral hebdomadaire par imagerie, pour étudier comment une infection grave modifie la croissance d'un cancer du sang. Le porteur indique que le lymphome et l'infection abdominale peuvent affaiblir les animaux, avec perte de poids, léthargie et dos voûté. Il affirme que ce modèle n'est pas reproductible in vitro et que le recours aux souris est "indispensable", puis euthanasie tous les animaux pour prélever la rate, le foie, les reins, les poumons, les ganglions et la moelle osseuse.

Objectifs

Les patients hospitalisés en réanimation pour choc septique sont caractérisés par une immunosuppression se traduisant par l’acquisition d’infections ainsi que la persistance d’une dysfonction d’organes à l’origine d’une augmentation de la durée de séjour et de la mortalité. Les modifications immunologiques acquises au cours du choc septique vont exposer les patients à ces complications via des modifications profondes de l’immunité. Parmi les patients hospitalisés pour choc septique, de nombreux patients sont déjà porteurs d’une dysfonction immunitaire qui les expose ainsi aux infections graves. En effet, les patients hospitalisés pour un lymphome B sont particulièrement à risque. Le traitement actuel du lymphome B repose sur une chimiothérapie très immunosuppressive, exposant les patients à des complications infectieuses, dont la sévérité nécessite une prise en charge en soins intensifs. L’arrêt du traitement anti-tumoral pendant le séjour en réanimation doit probablement impacter le pronostic de ces patients. Aussi, la fragilité associée à une dénutrition induite par la réanimation est probablement à l’origine de la non reprise du traitement dans les semaines suivantes. De plus, les effets de l’infection sur le système immunitaire pourraient avoir une influence sur la masse tumorale car celle-ci dépend en partie de son microenvironnement cellulaire. C’est pourquoi ce projet de recherche représente l’étape indispensable avant de pouvoir rapidement développer une étude clinique. En effet, ce projet a pour objectif d’étudier l’impact d’un évènement fréquent (infection) au cours de la prise en charge d’une pathologie fréquente (lymphome B). L’aspect innovant de ce projet est l’étude de la combinaison de deux phénomènes (tumoral et infectieux) ayant des bases immunologiques communes. Cette étude pourrait ainsi permettre le développement de thérapeutiques adjuvantes.

Bénéfices attendus

Nos travaux devraient déboucher sur une meilleure compréhension des liens entre infection et cancer dans le cadre des lymphomes B.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à une injection de cellules tumorales en intraveineuse via la veine caudale durant environ 1 minute pour induire le développement tumoral. L’injection en intrasplénique des cellules tumorales nécessitera une intervention chirurgicale sous anesthésie gazeuse d’environ 10min. Les animaux recevront au préalable une injection d’analgésique en sous cutané, cette injection durera moins d’une minute. Une fois par semaine, les animaux vigiles seront soumis à une injection en intrapéritonéale d’une solution de luciférine suivie d’une anesthésie gazeuse d'environ 5 minutes afin de suivre le développement tumoral. Un prélèvement sanguin sur animaux vigiles aura lieu une fois toutes les deux semaines afin d'évaluer leur état de santé général, ce geste durera moins d'une minute. Les animaux vigiles recevront une injection unique d’une suspension bactérienne en intrapéritonéale qui induira un sepsis, geste réalisé en moins d'une minute. L’immunonutrition sera réalisée sur animal vigile à l’aide d’une canule pour gavage, ce geste est réalisé en moins d’une minute. Afin de traiter le lymphome les animaux vigiles recevront une injection en intrapéritonéale d’un anticorps anti-mCD20, ce geste sera réalisé en moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Le développement tumoral ainsi que l’infection abdominale peuvent engendrer un affaiblissement de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter l'apparition de signes de lymphome (perte de poids, léthargie, dos courbé...).

Devenir

Le développement d'un lymphome suivi d'une infection intra-abdominale ne permet pas la réutilisation, le replacement ou l'adoption des animaux. De plus la nécessité d'accéder aux organes d'intérêts (rate, foie, reins, poumons, ganglions lymphatiques et moelle osseuse) ne nous permet pas de garder les animaux en vie, ils seront donc euthanasiés à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

L'évaluation de l'impact du sepsis sur la croissance tumorale du lymphome nécessite l’accès aux organes d’intérêt pour évaluer les conséquences de cette infection sur l’organisme dans sa globalité. Ceci n’est absolument pas reproductible in vitro car le développement d’un lymphome et/ou l’induction d’un sepsis engendre des modifications cellulaires dans différents organes tels que le foie, la rate, les poumons, mais également le sang périphérique. C’est pourquoi le recours à des animaux est indispensable pour le développement de ce type de modèle.

Réduction

Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, le laboratoire possède déjà une expertise à la fois sur le développement d'infections abdominales et sur le développement de modèle murin de lymphome, ce qui nous permettra d'utiliser moins d'animaux pour la mise en place de cette étude.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées : locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum, maximum 5 animaux/cage et aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. L'utilisation d’analgésiques permettra d’éviter toute souffrance aux animaux. De plus, l’évaluation régulière du score de grimace des animaux et le suivi de leur poids et de leur comportement permettra d’avoir un contrôle continu sur leur état de santé. Enfin, la technique de suivi non-invasif par imagerie bioluminescente nous permettra de réaliser une caractérisation en cinétique de notre modèle de façon non douloureuse tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaire à cette caractérisation.

Choix des espèces

Ce modèle murin permettra de développer un lymphome suivi d'une dysfonction immunitaire induite par un sepsis. Ce modèle nous permettra ainsi de caractériser et de traiter cette dysfonction immunitaire. Le développement d'un lymphome suivi d’une immunodépression post-infectieuse n'est pas reproductible in vitro car il touche le système immunitaire dans son ensemble. L’étude de mesures thérapeutiques afin de diminuer cette immunodépression et ses conséquences infectieuses explique pourquoi le recours à des animaux est indispensable pour le développement de ce type de projet de recherche. De plus, le modèle murin de lymphome par injection de cellules tumorales murines A20 est un modèle animal connu et bien caractérisé et le développement d'infections abdominales est actuellement en cours de caractérisation au sein de notre laboratoire. La très grande majorité des travaux scientifiques réalisés utilise des souris de 7-9 semaines.

176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance sévère. Elles sont infectées par un virus influenza H1N1 par voie nasale, subissent des écouvillons buccaux, et servent notamment à déterminer une dose létale 50, c'est-à-dire la dose de virus qui tue la moitié des souris. Le porteur reconnaît une perte de poids pouvant dépasser 20 %, une détresse respiratoire sévère et une léthargie jusqu'aux points limites, et renvoie l'étude des mécanismes à des projets futurs. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe, les modèles in vitro n'ayant pas selon lui la complexité d'une infection touchant plusieurs organes.

Objectifs

Les populations virales sont confrontées à des goulots d'étranglement (événements réduisant la taille de la population virale et, par conséquent, sa diversité génétique) qui peuvent être divisés en deux catégories : les goulots d'étranglement de transmission et les goulots d'étranglement au sein de l'hôte. Des travaux menés par notre équipe sur les virus influenza aviaires, et par d’autres équipes sur les virus influenza humains, ont suggéré que la réponse immunitaire innée imposait un goulot d’étranglement majeur, prévenant l’émergence des variants minoritaires. Pourtant, ceci n’a jamais été formellement démontré expérimentalement. Pour le faire, nous souhaitons utiliser comme virus modèle un virus influenza WSN H1N1, typiquement utilisé en laboratoire. A partir de ce virus, nous avons obtenu trois mutants, possédant un avantage sélectif moindre en culture cellulaire : en comparaison à la souche sauvage, ils se répliquent de manière moins efficace in vitro. Nous avons ainsi un virus adapté aux mammifères (la souche sauvage, que nous souhaiterions utiliser comme variant minoritaire) et plusieurs virus avec un désavantage sélectif, à utiliser comme variants majoritaires. Nous souhaitons ainsi reproduire le phénomène suivant : un mammifère est infecté par un virus aviaire (donc peu adapté aux mammifères) ; au cours de la réplication de ce virus, un variant possédant une mutation d’adaptation aux mammifères apparaît. Ce variant est donc minoritaire par rapport au virus initial : pour que son émergence soit réussie, il doit devenir majoritaire et ainsi échapper au goulot d’étranglement imposé par la réponse immunitaire. Les caractéristiques phénotypiques d’un virus peuvent être différentes entre les modèles in vivo et in vitro : une mutation peut conférer un avantage sélectif à un virus lorsqu’il infecte un tapis cellulaire, sans que cette mutation ait d’impact sur la physiopathologie d’une infection in vivo. Des expériences sont nécessaires pour caractériser in vivo le virus sauvage et ses variants, et répondre aux objectif suivants : - Confirmer que le virus sauvage a un avantage sélectif par rapport aux virus mutés. - Déterminer les doses létales 50 (cet indicateur mesure la dose de virus causant la mort de 50 % d'une population animale donnée dans des conditions d'expérimentation précises) - Déterminer les organes dans lesquels les virus se répliquent préférentiellement.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d'identifier un ou plusieurs marqueurs d'adaptation aux mammifères du virus H1N1 étudié dans le modèle souris : nous confirmerons ou non que les mutations identifiées in vitro ont un impact in vivo. Si cela était bien le cas, nos mutants causeront moins de mortalité et se répliqueront moins efficacement chez la souris. Les mécanismes conférant les avantages sélectifs apportés par ces mutations seront étudiés dans les projets futurs, afin de mieux comprendre les déterminants moléculaires de l'adaptation des virus influenza aux mammifères.

Procédures

Les animaux seront infectés par inoculation intranasale du virus après sédation préalable. Les seuls prélèvements effectués sur des animaux vivants seront les écouvillons oropharyngés : il s'agit d'un prélèvement rapide, simple et indolore, où un écouvillon en coton vient frotter l'intérieur de la bouche pour prélever de la salive.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables suivants peuvent être observés jusqu'à atteinte des points limites préalablement définis : perte de poids supérieure ou égale à 20 %, dyspnée sévère, réduction de la mobilité, léthargie.

Devenir

Certains animaux seront euthanasiés pour que leurs organes soient récoltés. Les animaux survivant pour lesquels une autopsie n'est pas nécessaire ne pourront pas être adoptés, ayant été infectés par des virus influenza. Leur réutilisation ne sera pas possible, car les animaux auront développé une réponse immunitaire vis à vis des virus que nous étudions.

Remplacement

Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier les interactions entre variants dans différents tissus et l’impact de la réponse immunitaire innée. Les méthodes in vitro et ex vivo n’ont malheureusement pas la complexité d’une infection multiviscérale.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à pouvoir évaluer par des tests statistiques les différences entre les groupes d’animaux : selon les données étudiées, des groupes de 5 ou 6 animaux sont suffisants.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, les mesures suivantes sont appliquées : - Les souris seront hébergées par groupes de 6 dans la première procédure et par groupe de 5 dans la seconde (les cages que nous possédons, de la marque Allentown, permettent d’héberger jusqu’à 6 animaux). - Application de conditions d’ambiance en accord avec l’âge et l’espèce (température, éclairage, hygrométrie). - Fourniture d’eau et d’aliment (adapté aux besoins d’entretien ou de croissance des souris) sans restriction et avec enrichissement (abris en cellulose, tunnels en plexiglass, cylindres en coton). - Manipulation des souris et contrôle de l’état des souris deux fois par jour par du personnel qualifié : cette surveillance permettra notamment afin d'identifier les animaux pour lesquels une mise à mort est humainement nécessaire (les points limites définis pour chacune des procédures ayant été atteints). - Inoculation intranasale du virus réalisée après anesthésie intrapéritonéale.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour évaluer la réplication des virus influenza. De nombreux réactifs sont également disponibles pour moduler la réponse immunitaire, ce qui n’est pas le cas des autres modèles animaux utilisés pour l’étude de ces virus. Souris Balb/c âgées de 4 à 6 semaines : il s’agit de la souche la plus utilisée pour les infections par les virus influenza et l’âge est bien adapté car les souris âgées de 4 à 6 semaines ont déjà un système immunitaire fonctionnel.

190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne, suivi d'une IRM, de prélèvements de sang, de l'injection d'un anticorps et de tests comportementaux de récupération dont le détail n'est pas précisé, avant la mise à mort pour analyses au microscope. Le porteur reconnaît des douleurs après la chirurgie et un affaiblissement de la patte avant gauche correspondant à la zone du cerveau lésée. Il situe une éventuelle nouvelle stratégie thérapeutique au conditionnel et affirme que les méthodes de remplacement n'apporteraient pas le même niveau d'information.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique d’origine vasculaire. Il s’agit d’un déficit aigu soudain qui survient à la suite de l’occlusion ou de la rupture d’un vaisseau cérébral. Nous allons baser notre étude sur ALCAM (Activated Leukocytes Cell Adhesion Molecule). En effet, en contact avec des molécules inflammatoires, les monocytes et lymphocytes circulants dans le sang expriment ALCAM à leur surface, facilitant ainsi leur infiltration à travers la paroi des vaisseaux sanguins. De plus, la concentration d’ALCAM dans le sang des patients est positivement corrélée à la gravité d’un AVC. Les objectifs de ce projet sont les suivants : 1) développer l’IRM ciblant la molécule ALCAM et tester sa sensibilité dans la détection de l’inflammation dans un modèle murin d’AVC; 2) caractériser le rôle d’ALCAM dans la pathologie de l’AVC et 3) évaluer l’efficacité du blocage d’ALCAM dans la récupération des animaux soumis à un modèle d’AVC.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de l'implication de la protéine ALCAM dans les AVC et pourrait conduire à l'élaboration d'une nouvelle stratégie thérapeutique plus efficace dans la prise en charge des patients touchés par un AVC.

Procédures

-Phase 1: Développement de l’IRM moléculaire ciblant ALCAM. Un modèle d'ischémie cérébrale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne et l'IRM de l'inflammation seront réalisés. -Phase 2: Étude de l’implication de ALCAM dans la physiopathologie des AVC. Un modèle d'ischémie cérébrale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne ainsi qu'un prélèvement sanguin seront réalisés. -Phase 3: Test de l’efficacité d’un anticorps bloquant l’interaction d’ALCAM avec ses ligands dans un modèle d’AVC chez la souris. Un modèle d'ischémie thromboembolique cérébrale par injection de thrombine dans l'artère cérébrale moyenne sera utilisé. Une injection intraveineuse d'anticorps anti ALCAM, d'isotype control ou de médicament thrombolytique sera réalisée, suivie par la réalisation de tests comportementaux de mesure de la récuperation fonctionelle.

Impact sur les animaux

Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) peut être observé, mais ce dernier disparaît généralement dans la première semaine après l'AVC. De plus, l'injection intraveineuse d'anticorps bloquant ou de radiotraceur IRM nécessite la pose d'un cathéter sur la veine caudale, pouvant occasionner une douleur considérée comme modérée.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses de microscopie.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la vascularisation cérébrale de la souris sont bien connus et sont semblables à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le rôle d'ALCAM dans les AVC. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.

Les alphavirus étudiés n'infectant pas les souris, l'équipe les rend d'abord immunodéprimées, sous anesthésie, par l'injection d'un anticorps qui supprime pour un temps leur immunité innée. 1 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un ou deux jours plus tard, une partie est infectée par le Chikungunya, le Mayaro ou l'O'nyong-nyong, d'autres reçoivent du sérum de convalescent, et certaines sont réinfectées par un alphavirus pour mesurer l'immunité croisée. Le résumé ne décrit pas ce que l'infection leur fait subir, alors qu'il prévoit un analgésique pour les souris en "altération sévère de l'état général" et la mise à mort des survivantes à la fin de chaque procédure. Ces résultats serviront d'abord, écrit le porteur, à "mettre au point des expériences chez le primate non humains".

Objectifs

Les alphavirus causent des pathologies aiguës et chroniques chez l'homme, incluant des formes persistantes et débilitantes dans le cas du virus Chikungunya (CHIKV) qui s’est récemment répandu en Amérique et affecte des millions de personnes dans le monde. CHIKV est un virus qui co-circule avec des alphavirus autochtones antigèniquement proches, notamment le virus Mayaro (MAYV) en Amérique Latine et le virus O’nyong nyong (ONNV) en Afrique. Les connaissances sur les relations immunitaires liant ces alphavirus sont actuellement limitées mais pourtant nécessaires à la mise en place de programmes vaccinaux. Ce projet permettra, à travers l’utilisation de modèles murins d’infections maîtrisées, d’obtenir des données sur l’immunité croisée entre ces alphavirus.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet amélioreront profondément la compréhension de l’immunité croisée entre ces alphavirus. Ils seront dans un premier temps utilisés pour mettre au point des expériences chez le primate non humains et, à plus large échelle, seront précieux pour la mise en place et la sécurité des futurs programmes de vaccination contre ces menaces émergentes pour la santé humaine.

Procédures

Les animaux, anesthésiés au préalable, seront immunodéprimés transitoirement grâce à l’injection d’un anticorps. Cette intervention durera en moyenne 3 minutes pour chaque animal (anesthésie + injection de l’anticorps). 24 ou 48h plus tard, les animaux anesthésiés seront soit infectés par un alphavirus (Chikungunya, Mayaro ou O’nyong-nyong) soit injectés par du sérum convalescent. Dans les deux cas, cette intervention durera en moyenne 3 minutes pour chaque animal (anesthésie + injection virus ou sérum). Dans certains cas, les animaux seront de nouveau infectés par un alphavirus à distance de la première infection (ou de l’injection de sérum), selon les mêmes modalités techniques et temporelles. Enfin, certains animaux seront anesthésiés afin de réaliser un prélèvement sanguin, qui durera en moyenne 4 minutes (anesthésie + prélèvement). Sur chaque animal, au total 2 prélèvements sanguins seront réalisés à un jour d’intervalle (1 seul prélèvement par jour).

Impact sur les animaux

Les alphavirus CHIKV, MAYV et ONNV utilisés dans cette étude n’infectent pas naturellement les rongeurs. Les souris immunocompétentes ne développent pas de symptomes lors d’une injection de ces virus. Ainsi, l’injection d’anticorps anti recepteurs de l’Interféron (IFNAR1) qui entraine une suppression transitoire de l’immunité innée.

Devenir

Les manipulations s'effectuant avec un virus infectieux, l'ensemble des animaux survivants sont mis à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les études sur la protection immunitaire, notamment dans le cadre de la production de vaccins, necessitent de recueillir des sérums immuns pour étudier l’immunité contre certains virus. Ainsi l’utilisation d’êtres vivants (animaux de laboratoires) est indispensable à ce type d’études. Ils permettent de reproduire l’infection naturelle par un virus et d’évaluer l’immunité croisée induite par celle-ci chez un animal vivant notamment via la réalisation d’expériences de challenge.

Réduction

Les effectifs ont été calculés grâce au logiciel de statistiques, ainsi nous avons déterminé les effectifs suivants : - 4 souris par lot pour les groupes non infectés - 6 souris par lot pour les groupes infectés - 8 souris par lot pour les groupes infectés par deux virus pour les expériences de challenge

Raffinement

Pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse, les animaux seront anesthésiés avant toute inoculation de virus, administration d’anticorps ou prélèvement sanguin. D’autre part, un traitement analgésique (buprénorphine) sera administré chez les souris présentant une altération sévère de l’état général (évaluée grâce à une grille de score). Par ailleurs des points limites adaptés ont été choisis afin de détecter précocement ce type d’atteinte. Après une période d’acclimatation de 6 jours, les animaux seront hébergés en cage enrichie par un « aspen brick » et des « paper shaving » et ne seront soumis à aucune privation de nourriture ou d’eau. Ils seront surveillés cliniquement et pesés quotidiennement durant la période d’expérimentation.

Choix des espèces

Au vu de l’état de l’art rapporté dans la littérature, Mus musculus est le modèle de référence pour l’étude des alphavirus (via l’utilisation d’anticorps anti recepteurs de l’Interféron). Les expériences seront réalisées sur des souris adultes pour minimiser la variabilité due à l’immaturité du système immunitaires des jeunes animaux. Les souris seront reçues entre 6 et 8 semaines de vie.

735 bars européens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les poissons sont infectés par la bactérie Vibrio au moyen d'une injection intrapéritonéale sous anesthésie, l'infection provoquant une mort rapide des individus les plus sensibles en 24 à 72 heures, puis les survivants sont étourdis, saignés et tués pour prélever les organes. Le porteur teste des bactéries marines comme probiotiques pour améliorer la survie des bars face à cette infection d'élevage. Il présente le projet comme le développement d'un aliment enrichi pour l'aquaculture intensive.

Objectifs

L'objectif de ces travaux est de mettre sur le marché une nouvelle génération d’aliments à destination des principales espèces aquacoles marines (daurades royales, bars européens, maigres), utilisable de la larve au stade adulte, qui sera composé de bactéries marines encapsulées dans un support issu de ressources marines locales (algues, rebus de coquillages, ...), dans une logique d’économie circulaire « de la mer à la mer ». L’objectif de cet essai est l’évaluation de l’efficacité des probiotiques pour améliorer la survie de bars européens face à une infection bactérienne rencontrée en élevage.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer des probiotiques adaptés pour les élevages de poissons marins avec l'objectif d'améliorer les taux de survie des stades larvaires, la croissance des animaux et leur capacité de défense à des infections ou à d'autres stress qui peuvent survenir en élevages intensifs.

Procédures

Des prélèvements de sang seront réalisés après étourdissement et avant mise à mort sur 40 poissons par condition dans les bacs dédiés aux prélèvements. La durée des prélèvements de sang n’excède pas 5 minutes par poisson. Une fois le prélèvement terminé, la mise à mort sera effectuée avant prélèvements des organes (branchies, mucus cutané, intestin, foie et rate).

Impact sur les animaux

Le stress infligé par les conditions expérimentales est limité en formant des lots de biomasse optimale pour que les poissons expriment les comportements alimentaires et natatoires attendus des espèces étudiées et en effectuant les séances d'observation quotidiennement. La phase de supplémentation se fait via la voie orale, au travers d'un aliment enrichi. Aucun effet néfaste des souches probiotiques aux concentrations utilisées n'a été observé dans le cadre des essais déjà menés. L’infection expérimentale à Vibrio nécessite une anesthésie afin de réaliser une injection intrapéritonéale. L’infection provoque une mort rapide des animaux les plus sensibles, en général dans les 24 à 72h post-injection.

Devenir

Les animaux ayant été infectés expérimentalement, il n'est pas possible de les garder en vie au terme de la procédure.

Remplacement

Le potentiel de ces souches marines comme probiotiques ayant des activités antagonistes contre des pathogènes aquacoles a été mis en évidence par des essais in vitro et par l’analyse de leurs génomes (identification de gènes codant pour des protéines antimicrobiennes , absence de gènes codant pour une résistance à un antibiotique ou un biocide, …). Afin de valider ce potentiel, des essais In vivo sur des espèces cibles tel que le bar commun sont nécessaires afin d’obtenir une autorisation de commercialisation de ces probiotiques pour la pisciculture auprès de l’Agence Européenne de Sécurité Alimentaire (EFSA).

Réduction

Cette procédure expérimentale sera menée en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une pertinence scientifique et statistique. Le nombre d’animaux nécessaire a été déterminé en se basant sur les tests traditionnels de comparaison de proportions binomiales ; le test de Fisher ou le test du Khi2, en prenant en compte la variabilité fréquemment observée (qui nécessite de réaliser les essais à minima en triplicat), les prélèvements à effectuer en cinétique (qui réduisent le nombre de poissons / bac) et les mortalités induites par l'agent pathogène lors de l'épreuve infectieuse (environ 50%) ainsi que les densités. La détermination de la souche pathogène et la concentration bactérienne permettant d'atteindre une mortalité d'environ 50% sera évaluée sur un maximum de 105 animaux. L'épreuve infectieuse avec la souche pathogène choisie sera ensuite menée sur 210 poissons supplémentés par condition, chiffre permettant de suivre la mortalité générée et de réaliser des prélèvements. Le nombre total de bars européens utilisés sera donc de 735 poissons.

Raffinement

Les mesures de raffinement viseront à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux, à savoir, un volume d'eau adapté en circuit ouvert avec une oxygénation suffisante en fonction de la biomasse, un rythme jour/nuit naturel, la présence de suffisamment de congénères pour exprimer un répertoire comportemental riche, une distribution d’aliment deux fois par jour adaptée à leur stade de développement et l'intégration de couvercles sur une partie des bassins pour générer des zones d'ombres. Une importance particulière sera donnée à l’observation des animaux, 2 fois par jour, pour identifier les animaux en détresse et réaliser, si nécessaire, une mise à mort compassionnelle. Les infections à Vibrio peuvent provoquer une mort rapide sans qu'il soit possible d'observer des symptômes cliniques. Pour éviter toute souffrance, les animaux présentant un comportement de nage anormal marqué avec des périodes sur le flanc / sur le ventre et/ou des signes de détresse respiratoire avancée et/ou des hémorragies faciales / au niveau des flancs et/ou des signes nerveux seront mis à mort de manière compassionnelle à l'Eugénol.

Choix des espèces

Le bar Européen (ou bar commun, Dicentrarchus labrax) est l'une des espèces marines la plus produite en France et, plus globalement, en Europe. Bien que la production en écloseries soit maîtrisée, les taux de survie des stades larvaires restent relativement bas (de l'ordre de 35 à 40%) et cette espèce est menacée, tout au long de sa vie, par une large variété de pathogènes bactériens ou viraux. Il s’agit de juvéniles de Bar européens supplémentés depuis 3 mois en probiotiques et présentant un poids moyen actuel de l'ordre de 33 g. Ces animaux ont été réceptionnés au sein de nos installations (en sortie de pré-grossissement du fournisseur) à un poids moyen de 5 g.

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie, une laparotomie au cours de laquelle une thrombose de la veine cave inférieure est provoquée, puis une perfusion mortelle de fixateur pour prélever les organes. Le porteur indique que ces actes peuvent provoquer douleur, durcissement de la zone opérée et occlusion intestinale, ce qui justifie la gravité sévère. Il présente le projet comme la recherche de nouveaux mécanismes de la maladie thromboembolique, les traitements adjuvants espérés étant renvoyés au moyen terme.

Objectifs

La maladie veineuse thromboembolique (MVTE) est la conséquence de la formation d'un caillot sanguin (thrombus), obstruant partiellement ou totalement une veine. Les deux principales présentations cliniques de la MVTE sont l’embolie pulmonaire et la thrombose veineuse profonde ou phlébite. La MVTE constitue un problème de santé publique majeur en raison de sa fréquence et de sa gravité. Cependant, chez la moitié des patients aucun facteur de risque n’est identifié, excluant ainsi tout pronostic d’évolution de la pathologie. De ce fait, afin de prévenir une éventuelle récidive, les patients sont traités à vie avec des anticoagulants. Or, ces traitements sont associés à un risque d’hémorragie non négligeable et ne préviendront de potentielles récidives que chez 30% des malades. Il est donc nécessaire de lever le voile sur les mécanismes physiopathologiques de cette maladie. Nos travaux de recherche menés chez des patients et sur des cellules en culture, ont permis de mettre en lumière deux acteurs potentiellement impliqués dans ce phénomène. Ces cibles se situent à l’interface du système immunitaire et du système sanguin. Elles jouent un rôle majeur dans la réponse inflammatoire du système immunitaire et pourraient en conditions pathologiques conduire à la survenue de la thrombose. Il est à présent bien établi que le phénomène nommé thrombo-inflammation joue un rôle important dans la survenue de la thrombose. Il reste encore à en définir tous les acteurs et à identifier leur rôle. Notre demande d’autorisation de projet a pour objectif d’étudier le rôle de deux acteurs du système immunitaire dans la survenue d’un thrombus. Dans la poursuite des travaux in vitro que nous avons menés, nous souhaitons à présent étudier l’impact de ces molécules sur la formation d’un thrombus in vivo. Ces travaux nécessitent l’utilisation de modèles murins chez qui nous induirons une thrombose veineuse.

Bénéfices attendus

Le traitement de la maladie veineuse thromboembolique repose sur les anticoagulants qui présentent un risque hémorragique important et que les patients doivent le plus souvent prendre à vie. Le but de ce projet est de mettre en évidence de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires qui permettront à moyen terme le développement de traitements adjuvants aux anticoagulants et donc une prise en charge plus personnalisée des patients.

Procédures

Toutes les souris (520 animaux) seront soumises à une thrombose de la veine cave inférieure induite de façon chirurgicale. Elles seront opérées une seule fois (durée intervention 1h30) sous anesthésie générale. Elles seront analgésiées 30 minutes avant. Nous assurerons un suivi post-chirurgical renforcé pendant 48 heures (Analgésie et scoring clinique systématique). 30 souris seront soumises à deux administrations : la première juste avant la chirurgie et l’autre le lendemain matin. Elles seront anesthésiées et analgésiées, l’intervention aura une durée de 10 minutes. A l'issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront soumis à une perfusion de serum physiologique suivi d'un fixateur en vue d'utilisation des organes pour des expériences d'histologie. Ils seront sous anesthésie gazeuse et auront reçu au préalable un analgésique.

Impact sur les animaux

Toutes les souris de la procédure subissent une chirurgie. Nous réalisons une laparotomie puis nous dégageons le tube digestif et nous induisons une thrombose au niveau de la veine cave inférieure (1). Les organes sont ensuite remis en place (2), la paroi musculaire et la peau sont suturées (3). Les nuisances possibles suite à ces actes chirurgicaux sont les suivants : (1) Douleur, durcissement de la zone de chirurgie, sensation de chaleur au niveau de la veine cave inférieure, (2) Occlusion intestinale, (3) Douleur au niveau de la zone suturée. Par conséquence, nous avons attribué une gravité prospective sévère à la procédure. Concernant les 30 souris recevant une administration intrapéritonéale, nous estimons comme nuisance possible une douleur liée à l’injection. La molécule administrée ne présente aucun toxicité. Concernant la perfusion intra-cardiaque ante-mortem, elle conduira à la mort de l’animal.

Devenir

Afin de réaliser des analyses histologiques et de cytométrie en flux, des prélèvements d’organes vitaux et de sang seront effectués sur les souris. C’est pourquoi, les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure.

Remplacement

Concernant le remplacement, nous avons eu recours à des expériences in vitro (culture cellulaire) et aux études cliniques (analyses de cohortes de patients) qui nous ont permis d’élaborer ce projet de recherche. Toutefois ces études ont des limites. En effet, la maladie veineuse thromboembolique est une maladie multifactorielle impliquant le système vasculaire, les cellules circulantes (plaquettes, globules rouges et cellules immunitaires) et les organes lymphoïdes secondaires. L’étude des mécanismes qui provoquent ou contribuent à la thrombose veineuse nécessite la mise en place de protocoles in vivo pour que toutes les composantes nécessaires soient présentes. Il n’est aujourd’hui pas possible de reproduire la thrombose veineuse par l’utilisation de modèles in vitro ou ex silico.

Réduction

Afin de réaliser une étude statistique robuste sur nos cohortes d’animaux, des groupes de 12-15 animaux sont nécessaires. Toutefois, nous ferons systématiquement un point lorsque nous aurons 8 animaux par groupe, nous réaliserons une étude statistique avant de poursuive ou non les inclusions d’animaux. Nous avons optimisé nos tests de sorties afin qu’au terme de la procédure expérimentale, le sang et différents organes soient prélevés sur un même animal et puissent servir à diverses analyses. L’utilisation de l’échographie-doppler 48h après l’induction de la thrombose a pour but d’inclure dans nos procédures uniquement les animaux qui ont thrombosé, limitant ainsi la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

Tous les animaux utilisés dans le projet sont sains et ne présentent aucune pathologie. Au cours de la procédure expérimentale, tous les animaux seront pris en charge par les responsables du projet qui s’assureront de leur bien-être. Ils recevront une analgésie et une anesthésie adaptées ainsi que du sérum physiologique pour pallier à une éventuelle déshydratation. Ils seront déposés sur un tapis chauffant à 37°C et nous déposerons du gel ophtalmique sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. Concernant la prise en charge de la douleur opératoire, nous utiliserons de façon systématique une analgésie adaptée. En post-opératoire, nous disposerons dans la cage des animaux du gel d’hydratation. Ce gel sera supplémenté en analgésique la nuit suivant la chirurgie. Afin de rendre le gel plus appétant, il sera supplémenté avec l'équivalent d'une noisette de pâte à tartiner commerciale au chocolat. Nous habituerons les animaux à ce gel dans les 7 jours avant la chirurgie. Dans les 48h après la chirurgie, la douleur et le site de suture des animaux seront évalués selon des grilles d’observation et chaque animal ayant atteint les points limites sera pris en charge immédiatement.

Choix des espèces

L'utilisation de souris comme modèle d'étude de la maladie thromboembolique est pertinente car : - Les modèles de thrombose veineuse utilisés dans ce projet chez la souris sont très bien caractérisés dans la littérature, fiables et reconnus par nos pairs. - Nous maîtrisons les techniques chirurgicales nécessaires à la mise en place de ce modèle. - Nous utiliserons deux lignées de souris transgéniques, ces souris sont déficientes pour nos protéines d’intérêts. En comparant les résultats obtenus avec un groupe contrôle nous pourrons déterminer comment la thrombose est modulée par l’absence de ces protéines impliquées dans l’inflammation. La maladie thromboembolique veineuse touche les adultes, tous les animaux que nous utiliserons serons âgés de 7 à 10 semaines. L'utilisation de jeunes adultes, dont le poids variera entre 20-30g, facilitera la chirurgie.