Procédures sévères

2520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un sepsis leur est provoqué par chirurgie, certaines subissent en plus une section du nerf vague, puis des tests comportementaux d'anxiété et de mémoire que le porteur ne nomme pas précisément et des prélèvements sanguins, avant la mise à mort et le prélèvement de plusieurs organes. Le porteur décrit un "comportement maladie" avec baisse d'activité, poil hérissé et diarrhées, et un suivi longitudinal sur neuf mois. Il affirme qu'un "organisme entier" est nécessaire et renvoie à des immunothérapies et biomarqueurs seulement espérés.

Objectifs

Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30-50% des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétal majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la gestion et le pronostic des patients atteints de sepsis. Le vieillissement de la population et la prise en charge fréquente en réanimation de patients ayant des critères de fragilité, en particulier neurocognitif, rendent pertinent et nécessaire la réalisation d’une telle recherche.

Bénéfices attendus

Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle des interactions neuro-immunes dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigües et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la gestion et le pronostic des patients atteints de sepsis. Le vieillissement de la population et la prise en charge fréquente en réanimation de patients ayant des critères de fragilité, en particulier neurocognitif, rendent pertinent et nécessaire la réalisation d’une telle recherche.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les différentes séries de gestes réalisés sur les souris pourront être au choix selon les questions scientifiques : 1-Induction chirurgicale d’un sepsis sous anesthésie et analgésie avec traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) + Tests de comportement sur animal vigile pour évaluer le degré d'axiété, la mémoire spatiale à court terme et à long terme (3 tests, durée environ 2h par animal sur 2 jours, 1 à 3 fois sur une période de 9 mois) + Prélèvement sanguin sous anesthésie (2-3 minutes/animal, 1 à 3 prélèvements selon les groupes) et euthanasie selon une méthode réglementaire pour analyse. 2-Modulation de la réponse immunitaire (par injection intraveineuse ou intrapéritonéale soit d’anticorps soit de petite molécules diminuant spécifiquement des populations de cellule immunitaire) + Induction chirurgicale d’un sepsis sous anesthésie et analgésie avec traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) + Tests de comportement sur animal vigile pour évaluer le degré d'axiété, la mémoire spatiale à court terme et à long terme (3 tests, durée environ 2h par animal sur 2 jours, 1 à 3 fois sur une période de 9 mois) + Prélèvement sanguin sous anesthésie (2-3 minutes/animal, 1 à 3 prélèvements selon les groupes) et euthanasie selon une méthode réglementaire pour analyse. 3-Section chirurgicale du nerf vague (vagotomie) sous anesthésie et analgésie (durée 20-30mn/ animal 1 fois) + Induction chirurgicale d’un sepsis sous anesthésie et analgésie avec traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) + Tests de comportement sur animal vigile pour évaluer le degré d'axiété, la mémoire spatiale à court terme et à long terme (3 tests, durée environ 2h par animal sur 2 jours, 1 à 3 fois sur une période de 9 mois s) + Prélèvement sanguin sous anesthésie (2-3 minutes/animal, 1 à 3 prélèvements selon les groupes) et euthanasie selon une méthode réglementaire pour analyse. Chaque point représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.

Impact sur les animaux

Concernant les modèles de sepsis, ils peuvent potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associées à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 heures. Concernant les procédures chirurgicales, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Les tests comportementaux et prélèvement sanguin pourront également entrainer un léger stress/inconfort lors de leur réalisation.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales pour prélèvement multi-organes et analyses afin de répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Un système vivant intégré est nécessaire pour étudier l’interaction physiopathologique entre les acteurs mis en jeu dans le développement des troubles cognitifs associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico. Pour répondre à des questions mécanistiques et pour extrapoler nous résultats à d’autres conditions inflammatoires nous utiliserons des expériences in vitro à partir de culture de cellules primaires afin de ne pas avoir recours à un nombre excessif d’animaux.

Réduction

La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée, considérés comme le standard dans le domaine de recherche. - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes (plutôt que stratégie de comparaison multi-groupe) de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les souris seront utilisées pour différents types d’analyses pour exploiter au maximum chaque individu afin de répondre à la question scientifique. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer (les différents types de tests comportementaux donnant des résultats soit qualitatifs, soit quantitatifs). - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé pour limiter les variations du au fond génétique. Cependant, de nombreux facteurs influencent les résultats des expériences individuelles, notamment les micro-organismes colonisateurs (microbiome intestinal), le sexe, etc. En répétant les expériences, nous réduirons la possibilité de publier des résultats erronés. De plus, comme les humains atteints de sepsis sont très variables, nous pensons que pour être pleinement pertinents sur le plan clinique, nos résultats doivent être capables de résister à certaines des légères variations de conditions qui peuvent survenir entre les expériences individuelles. Nous utiliserons un maximum de 2520 animaux sur la durée du projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, traitement antibiotique, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (suivi longitudinal de score de sévérité clinique pour les expériences de sepsis, point limite justifiant euthanasie) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, traitement antibiotique, etc.) assurés par un personnel qualifié et formé en continue. Les animaux sont hébergés dans les conditions conformes à la réglementation avec alimentation et abreuvement à volonté. Un enrichissement de l’environnement est assuré en continue.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : La souris Mus musculus est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons: - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Disponibilité des éléments d’exploration cognitifs (plateforme d’exploration comportemental et cognitive) - Large disponibilité des réactifs adaptés dans le commerce - Expérience des investigateurs sur ce modèle. Nous utiliserons des souris commerciales et plusieurs modèles transgéniques disponibles en interne développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu entre 6 à 12 semaines. En effet, avant l’âge adulte le système immunitaire est considéré comme immature et la validité des résultats obtenus. Au-delà de 20 semaines, les souches génétiquement modifiées que nous utilisons peuvent déjà présenter spontanément des signes de déclin cognitif. Aussi souhaitant étudier l’impact de la réponse immuno-inflammatoire d’un sepsis chez l’adulte à la phase préclinique de troubles cognitifs le sepsis sera induit chez des animaux jeunes adultes (6-12 semaines). En fonction de la question scientifique, nous analyserons les animaux à 3 temps : 3 jours après l’induction du sepsis, à 6 mois ou 9 mois d’âge. Ces 3 temps sont nécessaires car ils explorent différents stades de la maladie, correspondant à des profils d’activation immunitaires potentiellement distincts. Justification du sexe : Nous suivrons également les recommandations internationales d'utiliser des mâles et des femelles pour les études sur les animaux. Pour les études dans lesquelles nous n'observons pas de différences de résultats entre les souris mâles et femelles, nous effectuerons un total de 2 analyses. Pour les études dans lesquelles il existe des différences substantielles entre les résultats des souris mâles et femelles, nous effectuerons l'expérience deux fois dans chaque sexe.

1430 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Durant leurs cinq premiers jours de vie, les souriceaux reçoivent deux fois par jour des injections d'une molécule inflammatoire, ce qui provoque déshydratation, retard de croissance et, dans 5 à 10 % des cas, une hémorragie interne ou la mort, pour modéliser les lésions cérébrales de la grande prématurité. Le porteur reconnaît un stress lié à la séparation d'avec la mère et une mortalité intégrée au calcul des effectifs. Il justifie l'euthanasie des animaux à divers âges par le prélèvement du cerveau et du sang, et affirme que l'étude "n'est envisageable qu'in vivo".

Objectifs

La prématurité définit les naissances ayant lieu avant 37 semaines d'aménorrhée et est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Un lien causal entre infection materno-foetale (par exemple, les infections urinaires ou vaginales) et naissance prématurée a été mis en évidence, avec une incidence 2 à 4 fois plus élevée d’infections materno-fœtale liées à une naissance prématurée. L’infection induit une inflammation systémique pouvant se transmettre au fœtus, atteindre sa circulation sanguine puis son cerveau et entraîner des lésions cérébrales. Ces lésions chez le prématuré peuvent mener à des troubles du développement, en particulier les troubles autistiques. La compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de ces lésions est nécessaire pour développer des traitements qui pourraient protéger le cerveau. Le but de ce projet est de comprendre le rôle des astrocytes, des cellules du cerveau, et leurs liens avec le système immunitaire, dans les lésions du cerveau observées chez les nouveau-nés prématurés. Comme la naissance prématurée est fréquemment causée par une infection entraînant l'inflammation, nous injecterons une molécule inflammatoire chez des souriceaux, et analyserons leur cerveau et les cellules immunitaires dans le sang.

Bénéfices attendus

Ce projet peut permettre de mieux comprendre comment l’inflammation dans le cerveau et dans le sang peut entraîner un développement cérébral anormal. La cause la plus fréquente de prématurité est l’infection maternelle (25 à 40% des cas) qui peut induire un syndrome inflammatoire fœtal ou néonatal pouvant causer des lésions cérébrales. L'infection maternelle peut avoir différentes causes (infections uro-génitales pendant la grossesse par exemple) et être associée à différentes situations à l'origine d'une inflammation périnatale (ventilation mécanique, dispositifs médicaux invasifs, effets indésirables liés à la prise de médicaments...). Le modèle murin utilisé reproduit les lésions cérébrales observées chez les prématurés. L’induction de l’inflammation pendant la première semaine de vie des souriceaux mime le syndrome inflammatoire sans intervention in utero chez la mère. La première semaine correspond à une période critique car elle est équivalente d’un point de vue neurodéveloppemental au 3ème trimestre de grossesse chez l’humain. D’où la pertinence de ce modèle dans l’étude des lésions des nouveaux nés prématurés. Les résultats obtenus pourraient donner des pistes sur de nouveaux traitements visant à protéger le cerveau immature des nouveau-nés prématurés, par exemple en agissant sur les cellules immunitaires dans le sang.

Procédures

Nous injecterons de l’Interleukine-1 beta (IL-1β qui est une molécule qui induit l’inflammation) ou un liquide contrôle (sans conséquences) à des souriceaux pendant leurs 5 premiers jours de vie. Il s’agira d’une injection intrapéritonéale (dans le péritoine, membrane qui recouvre la cavité abdominale). L'injection est rapide (quelques secondes) et effectuée par une personne compétente. Cela va induire une réaction inflammatoire qui mime celle des nouveaux nés prématurés. Ces injections auront lieu matin et après-midi les 4 premiers jours et une fois le matin le 5ème jour. Les animaux seront surveillés quotidiennement et utilisés aux stades d’intérêt pour les analyses, les animaux seront gardés au maximum pendant 2 mois. Les analyses seront effectuées au 3ème et 5ème jour après la naissance, lors du pic d'inflammation. Puis au 8ème et 15ème jour, correspondant à des phases importantes de maturation du cerveau. Enfin, à 60 jours après la naissance, correspondant au stade jeune adulte, pour des analyses sur le long-terme.

Impact sur les animaux

Pour les souriceaux durant la première semaine de vie, les injections peuvent causer une douleur transitoire et locale. Les injections induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent présenter des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ 2 semaines. Les injections peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie interne dans l’abdomen, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Bien que les injections durant les premiers jours de vie soient des gestes très rapides, ils peuvent induire un stress lié à la séparation avec la mère pendant ce laps de temps.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt (Jour 3, 5, 8, 15 et 60 après leur naissance) pour les analyses. Les prélèvement de cerveaux permettront d'étudier de manière approfondie un type cellulaire particulier dans le cerveau appelé, les astrocytes, crucial dans les mécanismes liés à l’inflammation et au développement du cerveau. Les prélèvemets de sang permettront d'étudier les cellules immunitaires, impliquées dans la défense de l'organisme lors des infections. Les résultats des analyses cérébrales et sanguines seront mis en lien afin de comprendre les interactions cerveau/cellules immunitaires et de trouver des pistes thérapeutiques pour la protection du cerveau en développement.

Remplacement

L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral et sanguin requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance de l’activité cellulaire, comme la synthèse ou la dégradation de protéines. Il est important de maintenir l’activité de l’organisme et des mécanismes physiologiques dans un état dynamique (c'est à dire en mouvement et fonctionnel) dans le cadre d’une étude temporelle à plusieurs stades de développement. Ainsi, nous pourrions comprendre les dysfonctionnements dans un contexte anormal ou morbide suite à une perturbation, comme l'inflammation par exemple. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.

Réduction

Un nombre minimum d’animaux est nécessaire pour réaliser des tests statistiques fiables. Dans ce projet, il y a 4 groupes expérimentaux. Pour chaque groupe expérimental, 6 souris sont prévues avec 10% d’animaux supplémentaires compte-tenu de la mortalité probable induite par l’inflammation.

Raffinement

Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies avec de l'essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles gestantes proviennent d’une souche possédant d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux lors des injections. Pour les souris conservées jusqu’à 2 mois, le sevrage est effectué à la 3ème semaine de vie avec un maximum de 6 animaux par cage. Des grilles de scoring adaptées à l’âge des animaux permettent la surveillance, et l’atteinte de points limites : pendant le pic d'inflammation, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance régulière de la prise de poids, de l’absence de troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.

Choix des espèces

Ce modèle de souris a été choisi car il présente des lésions du cerveau et des troubles du comportement similaires à ceux observés chez les enfants prématurés atteints de troubles du développement cérébral. Il a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré de moins de 28 semaines, car un souriceau à 1 jour de vie correspond à un prématuré de 28 jours, par ailleurs, cette correspondance a l’avantage de ne pas impliquer d’intervention in utero. L’inflammation sera provoquée chez le souriceau entre le 1er et le 5ème jour de vie, stade correspondant au 3ème trimestre de grossesse chez l’homme. Cette stimulation mime ainsi le syndrome inflammatoire des nouveaux nés prématurés lors de cette période de développement critique. Pour les analyses, les animaux seront utilisés pour des prélèvements post-mortem au 3ème et 5ème jour de vie, qui correspondent au pic de l’inflammation dans le cerveau. Puis, une autre partie des animaux sera utilisée au 8ème et 15ème jour, qui correspondent à une phase importante de maturation du cerveau. Enfin, une partie des animaux sera utilisée au bout de deux mois (60 jours après la naissance) qui correspond au stade jeune adulte.

336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Modèles d'une forme avancée de la maladie de Huntington, elles reçoivent des injections sous-cutanées quotidiennes puis des mini-pompes implantées chirurgicalement, et subissent des tests moteurs dont un test de "clasping", tandis que la maladie leur fait perdre jusqu'à 30 % de leur poids et raccourcit leur vie à quinze semaines. Le porteur justifie leur mise à mort par le "besoin" de prélever les tissus cérébraux pour l'analyse histologique. Il retient la souris pour l'étude de la huntingtine dans un "organisme entier" et présente le projet comme répondant à un "besoin médical non pourvu".

Objectifs

A la suite d’une étude sur un système cellulaire permettant l’analyse du trafic intracellulaire des neurones, une molécule s’est révélée capable de restaurer la dynamique intracellulaire déficiente dans la maladie de Huntington, révélant également un fort intérêt thérapeutique dans un modèle souris de la maladie. L’objectif de ce projet est maintenant de confirmer l’efficacité du traitement dans un modèle de souris avec des symptômes moteurs sévères, classiquement utilisé dans le monde pharmaceutique, afin de se rapprocher de la réalité des patients. Ces nouveaux résultats permettront ainsi de comparer l’efficacité du candidat médicament et de ses dérivés actifs avec les molécules concurrentes actuellement en phases cliniques et atteindre ainsi un niveau de preuve supplémentaire pour aboutir à son développement préclinique.

Bénéfices attendus

La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Elle se caractérise par l’apparition de symptômes moteurs, mentaux et psychiques conduisant à une altération de l’état général des patients (perte de poids, fonte musculaire, fatigue, douleurs et déformations articulaires puis inexorablement à leur décès. La maladie est causée par une mutation du gène de la huntingtine, elle-même à l’origine d’un défaut d’un facteur de survie neuronal essentiel. Le projet présenté a pour objectif de confirmer l’intérêt thérapeutique du candidat médicament identifié et de ses dérivés actifs par des approches comportementales. Très concrètement, les résultats du projet permettront de, premièrement, valider que l’administration du médicament possède un intérêt thérapeutique dans un modèle de souris aux symptômes moteurs sévères et deuxièmement, d’évaluer si le traitement peut empêcher l’apparition des symptômes, ou les ralentir. Ces résultats permettront le développement clinique de la première molécule ciblant les causes de la maladie de Huntington avec pour objectif de répondre à une forte attente des patients et de combler un besoin médical non pourvu.

Procédures

Un acte expérimental impliquera d’éventuelles nuisances mineures à l'animal : lors de notre étude de l'efficacité du traitement sur les animaux modèles de la maladie de Huntington, le traitement des animaux sera réalisé par voie sous-cutanée. Durant les 3 premières semaines du traitement, la molécule sera quotidiennement administrée par injection sous cutanée dans l’espace interscapulaire de l’animal vigile. Puis, durant les 4 semaines suivantes, les injections quotidiennes prendront fin et la molécule sera délivrée grâce à des petites pompes implantées sous la peau de l’animal. Ces pompes sont spécialement fabriquées pour l’usage animal et permettent de perfuser le médicament de façon continu . Les animaux seront opérés sous anesthésie générale (procédure courte de 15-20 minutes par animal). Du fait du caractère superficiel de cette chirurgie cutanée, une douleur légère de courte durée sans incidence sur le bien-être ou l’état général de l’animal est attendue. Cette douleur sera prise en charge par injection d’analgésique (Carprofène, 5mg/kg, sous-cutané) en post-opératoire, associée à une surveillance accrue de l’animal sur 24h. Une reprise du traitement par injection sous-cutanée, une fois la mini-pompe vide, sera conditionnée au bon état général des animaux alors. Enfin, des tests comportementaux destinés à apprécier les fonctions corticospinales, neuromusculaires et locomotrices des animaux seront réalisés à 10 semaines d’âge (soit 5 semaines après le début du traitement). A ces fins, trois tests comportementaux sont envisagés, deux se feront sur une journée chacun, un sur trois jours. Au total, l’ensemble de ces tests comportementaux s’étalera sur dix jours. De plus, un test de clasping sera réalisé en complément des tests comportementaux toutes les 2 semaines à partir de 7 semaines d’âge, en raison de la nature non invasive de la manipulation, et ceci afin d'évaluer l'évolution des symptômes cognitifs.

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé dans la procédure est un modèle largement utilisé dans lequel les manifestations de la maladie (= phénotype) sont cliniquement observables. Le phénotype de ces souris s’accentue progressivement avec l’âge et est considéré comme dommageable entre 9 et 11 semaines d’âge. Les premiers symptômes moteurs apparaissent à l’âge de 5-6 semaines et les symptômes mentaux dès 3 semaines. Ces souris récapitulent les caractéristiques de la maladie humaine avec des mouvements désynchronisés, involontaires et répétés (stéréotypie), des tremblements et une démarche irrégulière. Tout comme chez les patients Huntington, l’histoire naturelle de la maladie dans ce modèle entraine une perte de poids constante, progressive – et indépendante de la prise alimentaire – entre 9 semaines d’âge et jusqu’à la mort de l’animal attendue entre 12 et 15, pouvant aller jusqu’à 30%. Hormis ce phénotype, nous pouvons attendre une gêne supplémentaire de nature interventionnelle : induction d'une légère inflammation due à la mise en place d'une mini-pompe.

Devenir

La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux en vue des études histologiques approfondies et biochimiques qui nous permettrons de comprendre les mécanismes du traitement.

Remplacement

Il a précédemment été démontré sur un modèle cellulaire que le candidat médicament permettait de restaurer les défauts de transports neuronaux, caractéristiques de la maladie de Huntington. Ces résultats nous ont permis de démontrer le potentiel thérapeutique de notre molécule. La seconde étape consiste donc à démontrer que ces restaurations du transport neuronal se traduisent en amélioration des symptômes de la maladie de Huntington. Pour cela, nous devons obligatoirement passer par une étude animale car aucun modèle cellulaire ne permet actuellement de mimer fidèlement les traits comportementaux de la maladie et de reproduire la complexité d’un organisme vivant. Notre projet correspond ainsi à un travail de préclinique visant à mettre au point des études cliniques qui seront conduites chez les patients atteints de la maladie de Huntington.

Réduction

Pour notre procédure, afin de caractériser le candidat médicament, nous utilisons le minimum d'animaux nécessaire pour assurer des analyses quantifiables et reproductibles.

Raffinement

Lors de la pose de mini-pompes sous-cutanées, la chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur est prévue pendant et après l’opération. Un supplément d'alimentation hypercalorique et hydratée fourni par l'animalerie sera ajouté lors du temps de récupération. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude et particulièrement dans les heures suivant la chirurgie ou le traitement par le personnel compétent, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. Des points limites suffisamment précoces et adaptés aux procédures expérimentales ainsi que des critères d'arrêt des souffrances sont mis en place. Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement.

Choix des espèces

Compte tenu de la similarité de son anatomie avec celle de l’Homme, la souris est un modèle de choix pour l’étude de la huntingtine au sein d’un organisme. Le modèle souris choisi permet de comprendre le rôle de la huntingtine et de ses interactions au niveau d’un organisme entier. Ce modèle de souris de la maladie de Huntington mime les formes avancées de maladie qui présentent de graves symptômes. En effet, les animaux se développent normalement mais ont une espérance de vie drastiquement raccourcie par rapport à des souris non malades (de l’ordre de 15 semaines pour le modèle Huntington contre 96 semaines pour des souris non malades) en raison de l’apparition de symptômes dès l’âge de 5 semaines . Les troubles sont d’ordres mentaux et moteurs et s’intensifient progressivement au fur et à mesure que la maladie progresse. Par conséquent, afin d’observer des effets bénéfiques de nos médicaments, les animaux seront traités dès l’âge de 5 semaines, âge auxquels les atteintes pathologiques sont peu importantes et réversibles.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent le virus de l'herpès HSV-1 par une injection dans la lèvre supérieure, puis sont tuées pour analyser la présence du virus dans leur cerveau. Le porteur indique que la phase aiguë peut provoquer des lésions oculaires, une perte de poids et une léthargie, et rappelle qu'un modèle proche tue 30 % des souris par infection mortelle. Il justifie cette étude pilote comme une étape vers de futurs modèles transgéniques de la maladie d'Alzheimer, et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'infection dans l'"organisme entier".

Objectifs

Environ 80% des sujets âgés sont porteurs du virus de l'herpès simplex de type 1 (HSV-1). Des études épidémiologiques suggèrent fortement que le virus HSV1 est impliqué dans l'apparition de la maladie d’Alzheimer (MA) et que ce même virus peut déclencher expérimentalement l'accumulation dans le cerveau des protéines anormales impliquées dans la maladie d'Alzheimer. De plus, une étude récente a montré que les médicaments anti-herpès réduisent de 15% la survenue de la MA. Chez l’humain, la première infection par le virus HSV-1 est asymptomatique (pas de symptômes observés) dans 94% des cas. Elle survient dans et autour de la bouche et du nez. En quelques heures, le virus se réplique au niveau du site d’infection puis infecte les neurones d’un certain type de ganglions où il entre en latence (le virus reste dormant pendant cette phase de latence). Le phénomène de multiplication du virus s'arrête, mais le matériel génétique viral persiste toute la vie dans l’organisme infecté. La réactivation du virus, à partir de cet état dormant, peut survenir lorsqu'une personne subit divers facteurs de stress (fatigue, fièvre, déficit immunitaire, etc.). Cette réactivation génère de nouvelles particules virales qui migrent via les nerfs infectés et infectent ainsi différents sites de l’organisme dont le cerveau. Notre objectif à long terme est d'évaluer les interactions entre l'infection par le virus de l’herpès HSV1 et les lésions (conséquentes à l’accumulation de protéines anormales tau et Aβ) de la maladie d'Alzheimer chez des souris transgéniques modèles de la maladie d'Alzheimer. Cette étude permettra de valider le virus de l’herpès comme un facteur de risque dans le développement de la MA Il a été établi un modèle murin, le modèle BALB/c, qui reproduit fidèlement l’histoire naturelle de l’infection par HSV1. Malheureusement, les souris transgéniques modèles de la maladie d'Alzheimer qui sont parmi les plus utilisées au monde et qui seront utilisées pour le projet sur l’étude de l’interaction HSV1 et la maladie d'Alzheimer sont établies sur un fond génétique C57BL/6, présentant des caractéristiques génétiques différentes des souris BALB/c. Les objectifs de ce projet seront donc : d’établir et de caractériser dans un premier temps la sensibilité des souris C57BL/6 à l'infection par HSV1; et dans un second temps, d’étudier l’effet de l’infection par HSV1 dans des souris modèles de la MA ayant un fond génétique C57BL/6.

Bénéfices attendus

Cette étude pilote est une étape importante vers la création de nouveaux modèles murins transgéniques qui permettront d'évaluer les interactions entre le virus de l’herpès HSV1 et le développement de la maladie d'Alzheimer. Cette étude permettra d’établir si un lien de causalité entre l’infection par le virus HSV1 et la MA existe.

Procédures

Infection par le virus HSV1 réalisée suite à une inoculation dans la lèvre supérieure par voie sous-cutanée. Cette intervention dure environ 10 minutes. 40 animaux. Une seule intervention par animal.

Impact sur les animaux

L’infection par le virus de l’herpès a des conséquences cliniques dans le modèle murin d'infection à HSV1 lors de la phase aigüe de la maladie (jusqu'à 15 jours post infection). Elle s’exprime par des modifications physiques (changement d’apparence du pelage, lésions oculaires, perte de poids), mais également du comportement (agitation ou léthargie). Chez les souris BALB/c, 30% des animaux développent une infection mortelle.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet pour étudier la présence d'HSV1 dans leur cerveau. Cette analyse (étude de la pathologie cérébrale par histologie et biochimie) ne peut être réalisée qu'en post-mortem.

Remplacement

La pathologie liée à HSV1 dépend de l'interaction entre HSV1 et le système immunitaire de l'hôte lors d'une infection par le HSV1 dans la lèvre, puis des interactions ultérieures qui se produisent dans les ganglions ciblés par l’infection. Il n'y a actuellement aucun modèle disponible pour reproduire les différentes composantes de cette infection au niveau de l’organisme entier.

Réduction

Les expériences vont être réalisées sur des groupes de cinq animaux. Chaque expérience sera interprétée avant de décider si une nouvelle dose de virus ou un nouveau temps post-inoculation est utile ou pas. Le nombre de 5 animaux par groupe, permet d'avoir un nombre minimal qui permet d'être représentatif d'une populations "générale". L'objectif de notre étude est de déterminer le niveau d'infection à HSV1 chez les souris. Nous considérons que le nombre de 5 souris donnera une information sur la variabilité interindividuelle, tout en étant le plus petit nombre de souris permettant de produire une information robuste. Nous pensons que ce nombre de souris est le plus adapté à la loi des 3R.

Raffinement

Pendant toute l'étude, les animaux sont hébergés dans environnement à température contrôlée, avec cycle jour-nuit de 12h optimisés pour l’hébergement des souris. Eau et nourriture seront fournies autant que nécessaire. L'environnement est enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire. Les animaux seront hébergés par groupes. Ils seront examinés quotidiennement par les techniciens animaliers, sous la supervision d'un vétérinaire. L'administration du virus HSV1 est réalisée sous anesthésie générale à l’aide d’aiguilles adaptées. Cela garantit que des doses de virus très précises sont délivrées aux souris. La prise en charge des symptômes liés à l’infection consiste à l’administration d'un anti-inflammatoire non stéroïdien au cours de la phase aiguë d’infection (15 premiers jours). Toutes les souris qui présentent des signes précoces d'une infection létale seront euthanasiées.

Choix des espèces

Les humains sont le seul hôte naturel du HSV-1. Les souris sont des petits mammifères et sont idéales comme modèle pour étudier comment les interactions entre le système immunitaire des mammifères et le HSV-1 influencent l'histoire naturelle de la maladie. Des souris âgées de 5 semaines seront utilisées dans ce projet car c'est à cet âge qu'elles sont sensibles à HSV1.

242 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des chirurgies d'implantation de pastilles et de minipompes, des injections intracérébrales et un traitement chronique à la corticostérone qui reproduit un état dépressif, puis des tests comportementaux de suspension par la queue et de nourriture enfouie. Le porteur teste pour un partenaire privé des ingrédients olfactifs qu'il présente comme bénéfiques pour l'état émotionnel et la mémoire, et tue les souris pour prélever leurs organes. Il affirme qu'étudier des comportements de type anxio-dépressif impose un modèle animal, et présente le projet comme devant améliorer les conditions d'élevage.

Objectifs

La première partie de ce projet visera à tester différents ingrédients olfactifs (fournis par un partenaire privé) sur les performances cognitives des souris ainsi que leur état émotionnel à l’aide d’une batterie de tests comportementaux adaptés. Une protéine fluorescente sera exprimée dans plusieurs aires cérébrales chez l'animal afin d’observer post-mortem la morphologie des neurones et leurs niveaux de connexions synaptiques. Les animaux seront ensuite mis à mort afin d’étudier l’activation de l’axe du stress, les modifications morphologiques des neurones des régions du cerveau sensibles aux odeurs et les effets sur l'appareil digestif. La deuxième partie de ce projet aura pour but de démontrer le rôle de l’olfaction dans les effets bénéfiques potentiels des ingrédients testés. Pour cela, nous proposons d'utiliser une approche génétique pour bloquer la transmission de l'olfaction dans le cerveau.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude préclinique est de mettre en évidence les effets bénéfiques des odeurs via l’olfaction sur le bien-être animal (états émotionnels, capacité mnésique) et sur la physiologie intestinale et d’émettre des hypothèses sur le lien cerveau intestin.

Procédures

Deux implantations d’un pellet (chirurgie : 10min, 2 interventions ; durée de traitement 12 à 14 semaines), injection intracérébrale (1h, 2 interventions), perfusion intra-cardiaque (10 minutes, sans réveil), implantation de minipompe (chirurgie : 15 minutes, 1 intervention ; durée de traitement 12 à 14 semaines), tests comportementaux (test de suspension caudale, test de nourriture enfouie).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables peuvent être dus aux chirurgies et/ ou aux traitements, Ils peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : hyperactivité puis isolement et indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire, perte de poids.

Devenir

Mort de tous les animaux à l'issue de chaque procédure dans le but de prélever des organes pour pouvoir faire des études sur ces tissus.

Remplacement

L’objectif du projet étant l’étude de comportements complexes, les symptômes de type anxio-dépressif, il est indispensable de travailler sur un modèle animal. Il s’agit de valider des stratégies thérapeutiques dans un modèle préclinique en vue d'améliorer le mode de vie des animaux de rente.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante des tests réalisés pour les comparaisons intergroupes : 12 animaux seront utilisés pour à la fois faire des études comportementales et pour les études post-mortem (dont 6 souris permettront de regarder l'activation de du noyau paraventriculaire due à un stress aigu et 6 souris qui permettront de regarder la morphologie des neurones).

Raffinement

En ce qui concerne la douleur, la souffrance ou l’angoisse, nous avons identifié quatre risques principaux. Les chirurgies pour observer la morphologie des neurones et leurs connectivités et pout induire une anosmie transitoire chez les souris, le traitement chronique par la corticostérone et le traitement au méthimazole. En cas d’altération de l’état de l’animal, un suivi quotidien sera réalisé à l’aide d'une grille de scoring. Les actions de soin prévues par cette grille seront appliquées en accord avec le vétérinaire. Par exemple, pour la douleur, des AINS (anti-inflammatoires non stéroïdiens) pourront être administrés. De plus, s’il y a une plaie suite à des bagarres ou aux chirurgies, une pommade cicatrisante pourra y être appliquée. Enfin, en cas de perte de poids, de la nourriture sera déposée dans la cage afin que la nourriture soit plus facilement accessible.

Choix des espèces

Le modèle de corticosterone chronique est bien validé chez la souris. Il permet de reproduire un certain nombre des symtômes dépressif observés chez l'homme et répond aux antidépresseurs utilisés en clinique. Il s’agit d’un modèle de stress chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux de 10 semaines.

840 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un gavage quotidien d'antibiotiques pendant vingt-huit à cinquante-six jours pour détruire leur microbiote intestinal, un hébergement individuel, des prises de sang mensuelles et un test d'activité, avant une ponction du cœur sous anesthésie. Le porteur décrit une dysbiose provoquant constipation, perte de poids, troubles cognitifs et anxiété, aggravée par un isolement qu'il reconnaît lui-même comme source d'anxiété. Il teste pour un partenaire privé un composé à base de Queuine contre les maladies neurodégénératives, et affirme le modèle in vivo nécessaire là où l'in vitro ne suffit pas.

Objectifs

Actuellement, de nombreuses preuves tendent à indiquer qu’une défaillance du microbiome intestinal altérerait le fonctionnement du système nerveux central et pourrait être liée à l’origine de pathologies neurodégénératives les plus répandues dans le monde telles que les maladies de Parkinson ou d’Alzheimer. Les bactéries présentes dans la flore intestinale jouent un rôle important dans la production de plusieurs molécules essentielles dans le maintien de l’homéostasie de l’organisme. En effet, une fois synthétisées au sein du microbiote, ces molécules sont ensuite distribuées vers plusieurs organes tels que le cerveau. Ces observations ont donc mis en évidence des voies de communication entre les intestins et le cerveau. Parmi ces molécules, la Queuine, une base azotée uniquement synthétisée par le microbiote intestinal et/ou fournie par l’alimentation, jouerait un rôle prépondérant dans l’apparition de pathologies du système nerveux central (SNC). Afin d’étudier l’effet de molécules telles que la Queuine sur le SNC, ce projet a pour objectif de tester l’efficacité d’un composé à base de Queuine ou d'autres molécules similaires sur un modèle in vivo de dysbiose chez la souris C57Bl6 également soumises à une alimentation spécifique. Pour cela, les souris suivront une antibiothérapie quotidienne, par voie orale, visant à détruire le microbiote intestinal qui sera associé à un régime alimentaire spécifique sur une durée de 1 ou 2 mois. Une partie de ces souris seront administrée par voie orale avec un composée supplémenté en Queuine ou autres molécules. Les souris subiront une analyse comportementale à partir du test de l’open field (OFT) mesurant l’activité locomotrice spontanée et estimant indirectement les comportements associés à l’anxiété. Des prélèvements de sang mensuels et terminaux seront effectués pour mesurer la biodisponibilité des molécules d'intérêts libérées par le microbiote intestinal et/ou des candidats médicaments dans le plasma. De même, la présence de bactéries sera contrôlée suite à des prélèvements mensuels de fèces afin d’évaluer l’efficacité de l’antibiothérapie sur la destruction du microbiote intestinal. À la fin du protocole, après une ponction intracardiaque de sang, ces mêmes souris subiront un prélèvement de l’intestin, du foie et de l'encéphale afin de comparer les effets du candidat médicament sur les caractéristiques histologiques et moléculaires principales de la dysbiose et de certaines pathologies neurodégénératives.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter plusieurs informations sur l’effet de la dysbiose sur le SNC et notamment le rôle joué par la Queuine, molécule issue du microbiote intestinal et/ou de l’alimentation, sur 1) les troubles de la locomation et des troubles associés à l'anxiété 2) sur les caractéristiques cérébrales histologiques et moléculaires associées à certaines maladies neurodégénératives. Ce projet permet également de tester l’efficacité d’un candidat médicament sur les troubles du comportement associés à la dysbiose, et sur les caractérisques histologiques et moléculaires de plusieurs organes.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux subissent un maximum de 4 interventions distinctes en fonction des groupes expérimentaux. Durant la 1ère intervention du protocole, des souris mâles (âge : 15 semaines) sont soumises à une administration quotidienne sur 28 ou 56 jours, par gavage oral, d’un mix de 4 antibiotiques et d’1 antifongique solubilisés dans l’eau stérile afin d’induire une dysbiose intestinale (durée de l’acte de gavage : 1min/souris). Pour certains de ces animaux, le composé médicament, mélangé avec la solution contenant l’antibiothérapie, est également administré quotidiennement par gavage durant 28 jours. Après le début de l'antibiotérapie, les souris sont disposées de manière individuelle par cage pour la reste du protocole (i.e., 28 ou 56 jours). La seconde intervention consiste à des prélèvements de sang (50-100 μl) mensuels (environs 1-2min/souris) sur souris vigiles au niveau de la veine submandibulaire (à J0 uniquement et/ou à J28 selon le groupe expérimental) ainsi qu’à des prélèvements de fèces mensuels (à J0, J28 et J56 selon le groupe expérimental) pour lequel les souris sont placées dans une cage propre durant une courte durée (environs 20 min). La 3ème intervention consiste à effectuer l'évaluation comportementale des souris, mesurant l'activité locomotrice spontanée et les comportements associés à de l’anxiété à partir du test de l'open field à J28 et J56 (durée d’intervention : 20min environ). Finalement au cours de la dernière intervention, un prélèvement sanguin terminal intracardiaque est réalisé sous anesthésie gazeuse à isoflurane (induction 4%, entretien 4% mix air et oxygène) avant la mise à mort des animaux (durée de l’intervention de l’anesthésie à la mort : 10min).

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du candidat médicament du sponsor. Le personnel est formé et entrainé aux voies d’administration classiques pour réduire tout risque. Cependant, un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul. L’antibiothérapie permettant d’induire la destruction de la flore intestinale ainsi que l’administration quotidienne du composé se réalisent par gavage oral et peuvent générer du stress et des dommages au niveau du tube digestif. Par ailleurs, la dysbiose provoque un ralentissement de la prise de poids mais également ralentis les mécanismes moteurs de la digestion induisant ainsi de la constipation. L’antibiothérapie prolongée est également associée à des troubles cognitifs et de l’humeur et est source d’anxiété. L'isolement des souris est également une source importante d'anxiété. La perte de poids s’occasionne surtout durant les 4-5 premiers jours après le début de l’antibiothérapie. Cette dernière peut également conduire à la diminution de l’efficacité du système immunitaire augmentant les risques d’infections. Tout au long du protocole, les animaux sont mensuellement soumis à des prélèvements sanguins par ponction au niveau de la veine submandibulaire pouvant provoquer un écoulement sanguin persistant après le prélèvement. De plus, à la suite du prélèvement sanguin, les animaux sont isolés dans une cage propre durant 15 à 20 min afin de pouvoir récolter les fèces ce qui peut à nouveau être à l’origine de stress. En fin de protocole, l'animal est de nouveau anesthésié afin de subir un prélèvement sanguin intracardiaque avant d'être mise à mort pour récupérer le cerveau, les intestins et le foie.

Devenir

Pour tous les animaux de la procédure, le protocole se termine par un prélèvement de sang terminal par ponction intracardiaque (1ml) sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (4% induction et maintien) soit à J28 soit à J56 entrainant la mort par exsanguination suivi par une dislocation cervicale pour confirmer la mort afin de prélever les organes.

Remplacement

Des études précédentes ont montré que l’effet de la Queuine synthétique augmentait la survie de neurones dopaminergiques et corticaux dans des modèles in vitro des maladies de Parkinson et d’Alzheimer. Il est nécessaire maintenant de confirmer ces effets sur un modèle in vivo. En effet, le modèle in vitro ne permet pas d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de maladies neurodégénératives dont l’origine provient d’une altération du microbiote intestinal, ainsi que d’en étudier les répercussions histologiques et comportementales associées. Il n’est donc pas possible de tester par la suite, l’effet d’un candidat médicament sur l’ensemble de ces mécanismes. De plus, le modèle in vivo de rongeur permet de moduler différentes variables impliquées dans l’altération du microbiote intestinal, à savoir le régime ou les compléments alimentaires.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu par groupe (n=12) pour le projet est basé sur une estimation prenant en compte des études précédentes (n=8-10) utilisant un protocole d’antibiothérapie similaire au notre à l’exception de la fréquence de gavage qui est plus faible dans ce projet (1 par jour contre 2 par jour) sur demande du sponsor. Or un seul gavage quotidien d’antibiotiques semble diminuer l’efficacité de l’antibiothérapie pour détruire le microbiote ce qui pourrait augmenter l’hétérogénéité du modèle entre les souris. Par ailleurs, le taux de mortalité de ce modèle étant très peu reporté dans la littérature, il est difficile d’estimer réellement la mortalité de ce modèle. Ainsi, le faible recul de ce modèle au sein de l'entreprise nous pousse donc à choisir un N = 12 incluant 2 animaux de sécurité. Cependant, le nombre d’animaux pour les groupes ne subissant pas d’antibiothérapie pourrait être réduit car la variabilité attendue sur les différentes analyses pourrait être plus faible. Ainsi cela représente 12 animaux par groupe expérimental (7 au maximum) avec 2 lots par an sur 5 ans, cela donne un total de 840 animaux au total (12 x 7 x 2 x 5).

Raffinement

Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entraîné. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites et d’arrêts sont fixés avant le début des expérimentations selon une grille d’évaluation cliniques. Les animaux sont familiarisés avec l'ensemble des outils de mesures ainsi qu'aux nouveaux environnements. Le matériel utilisé est adapté à l’espèce. Les administrations et prélèvements sont réalisées dans une pièce attenante aux pièces d’hébergement. Pour l'administration de l’antibiothérapie : - les administrations se font par gavage pour limiter la déshydration des animaux liée à une aversion pour le goût des antibiotiques. Ce type d’administration permet de limiter la perte de poids. Afin de monitorer la perte de poids des animaux, les souris sont pesées toutes les semaines. Au cours de l’administration, le comportement et la déglutition de la souris sont surveillés avant que celle-ci ne soit remise dans sa cage et à nouveau surveillée. L’amphotéricine B est administrée pour prévenir de l’apparition d’infections opportunistes. Pour les prélèvements sanguins au niveau de la veine submandibulaire, le site de prélèvement est alterné entre la gauche et droite pour limiter la souffrance et le saignement est estompé par une pression sur la joue avec une compresse pour limite la perte de sang. Les prélèvements sanguins intracardiaques sont effectués sous anesthésie gazeuse et analgésie (30min avant l'acte). Si un des points limites et/ou d’arrêts sont atteints, les animaux sont soumis à une prise en charge adaptée ou mis à mort respectivement. Par ailleurs, trois sortes d'enrichissement seront mises en place dans les cages afin de limiter le mal être de la souris lié à l'isolement. De plus, les souris seront disposées dans des cages transparentes mises côtes à côtes pour qu'elles puissent se sentir et s'observer.

Choix des espèces

La souris, et particulièrement la souche C57Bl6, est l’espèce de référence dans l’étude des maladies du microbiote intestinal et permet d’établir de nombreux points de comparaison dans la littérature sur ce sujet. En effet, la souris est un mammifère omnivore possédant de grandes similarités avec l’Homme en termes d’anatomie et de physiologie du système digestif et intestinal. En outre, l'utilisation spécifique de souris permet de tirer avantage de nombreuses lignées transgéniques ouvrant de nombreuses possibilités pour la suite du projet pour le sponsor. Pour ce projet, nous utilisons des jeunes souris adultes (15 semaines) car la grande majorité des résultats observés dans la littérature concernant les études sur les pathologies liées à la dysbiose intestinale sont obtenus chez des souris jeunes adultes (>3-6 mois).

8 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales avec ablation d'une partie de la rate sous anesthésie, puis développent une tumeur et des métastases au foie, suivies six semaines par imagerie et prises de sang hebdomadaires, sous administration quotidienne de composés jusqu'à quarante-deux jours. Le porteur indique que la maladie provoque une perte de poids et une baisse d'activité, et tue les animaux pour analyser leurs organes. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la progression tumorale et l'échappement aux traitements, et conclut à la nécessité du recours in vivo.

Objectifs

Les cancers font partie des maladies les plus complexes à traiter. Notre projet propose de trouver de nouvelles thérapies anticancéreuses et permettra de comprendre pourquoi on observe un échappement de la maladie lors de traitement à base d’anticorps ou de molécules pharmaceutique mais également de proposer des stratégies pour rendre ces thérapies plus efficaces.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels ne permettent pas de traiter 100% des patients atteint d’un cancer et l’on observe de plus en plus d’échappement aux thérapies déjà existantes à cause de la formation de métastases hépatiques. Ces études permettront à la fois d’expliquer le mécanisme d’échappement à ces traitements mais aussi d’expliquer le mécanisme d’action de certains traitements. Ces résultats seront comparés à ceux obtenus in vitro au préalable mais également avec les résultats que l’on attend des différents traitements observés lors des phases clinique chez l’homme. De plus, ces études permettront de tester de nouvelles thérapies plus innovantes et donc de proposer de nouveaux traitements plus efficaces aux patients atteints de cancer.

Procédures

1) Injection de cellules tumorales et ablation d’une partie de la rate sous anesthésie une seule fois dans l'étude, 2) l'imagerie de la tumeur une fois par semaine pendant 6 semaines se fera sous anesthésie pendant 5 min après une injection de sonde bioluminescente, 3) Prélèvements sanguins une fois par semaine pendant 6 semaines: prélèvement en moins d'une minute avec anesthésie ou intraveineux sans anesthésie en moins d'une minute, 4) Administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d'une minute par animal, une à deux fois par jour pendant un maximum de 42 jours

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l’implantation des cellules en intra-splénique ainsi que l’injection en sous cutané de cellules tumorales chez la souris va induire le développement d’une tumeur et d’une métastase hépatique qui vont grossir au fur et à mesure. Les effets indésirables attendus chez la souris sont dans un premier temps une perte de poids, une diminution de l’activité. Les animaux seront également manipulés délicatement mais rapidement afin d'éviter au maximum le stress de la manipulation, des administrations et du gavage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la progression d’une tumeur, la formation de métastases ou encore son échappement à une thérapie. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'études in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments. Afin de réduire au maximum le nombre d’étude et donc le nombre d’animaux utilisés, les différentes stratégies antitumorales seront préalablement testées in vitro.

Réduction

Pour respecter le principe des 3R, nous veillerons à ce que toutes les expériences qui pourront être réalisées in vitro le soient et que ne soient testés, in vivo, que les meilleures molécules ou anticorps obtenus in vitro. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. L’utilisation de l’imagerie bioluminescente et de cellules tumorales exprimant la luciférase permettront un suivi longitudinal des animaux et donc diminuera le nombre d’animaux utilisés dans les études. Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation de 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu et relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations. Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d'étude. La bonne connaissance des études permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort éthique. Pour cela, un programme d'analgésie ainsi qu'une grille de score, l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel et de critère d'arrêt de souffrance sont mis en place.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour ce type de modèle et donc le plus décrit. Son utilisation permettra de bénéficier de toute la littérature scientifique déjà parue sur ce modèle utilisant cette espèce. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie cardiaque sous anesthésie provoquant un infarctus par ligature d'une artère coronaire, trois échographies sous anesthésie et l'administration répétée d'une protéine pendant quatre semaines, avant d'être tué pour analyser ses tissus. Le porteur indique que l'insuffisance cardiaque induite peut entraîner des difficultés respiratoires et une perte de poids, la mise à mort étant déclenchée au-delà de 20 % de perte de poids ou en cas de prostration. Il présente l'objectif comme une preuve de concept d'un traitement contre l'insuffisance cardiaque, les bénéfices pour les patients restant lointains.

Objectifs

L’objectif du projet présenté ici est d’étudier les effets cardioprotecteurs d’une protéine anti-inflammatoire contre la défaillance cardiaque suite à un infarctus. Dans un travail précédent, nous avons mis en évidence le rôle cardioprotecteur de cette protéine produite dans l’organisme pour se protéger en cas de lésions d’un organe. Administrer cette protéine anti-inflammatoire permet de réduire la taille de l'infarctus sur le court-terme . L’objectif de notre projet est d’évaluer si cette substance peut avoir un effet protecteur contre l’insuffisance cardiaque sur le long-terme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’obtenir une preuve de concept de l’utilisation de cette protéine anti-inflammatoire comme traitement protecteur contre le remodelage ventriculaire post-infarctus qui conduit à l’insuffisance cardiaque, pathologie chronique invalidante. Ce traitement aura un impact sur la santé publique car il devrait permettre de diminuer les taux de mortalité post-infarctus et les coûts que cela engendre pour la société (coûts directs de maladie pour la sécurité sociale, d’hospitalisations à répétitions et couts indirects d’arrêt de travail). Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité dans le monde. De plus, la morbidité par insuffisance cardiaque continue à croitre car, de plus en plus de patients sont pris en charge rapidement pour leur infarctus et donc ont la vie sauvée. L’insuffisance cardiaque génère des coûts sociétaux directs (hospitalisations à répétition) et indirects (arrêt de travail). Cette maladie a un impact significatif sur la qualité de vie des patients, comme l'a récemment montré l'enquête "Handicap-Santé". Plus de la moitié des patients atteints d'insuffisance cardiaque avaient de fortes difficultés à réaliser les activités habituelles (hygiène et habillage) en raison d'un " trouble de la santé ". Les conséquences sur l'emploi sont également notables pour les patients âgés de 25 à 60 ans, avec un taux de population active réduit à 56,6% pour les patients coronariens, et à 38,8% pour les patients atteints d'insuffisance cardiaque (contre 78% dans la population sans maladie cardiovasculaire). L'insuffisance cardiaque, causée à 90% par l'infarctus du myocarde, le diabète et l'hypertension artérielle, représente 1 million de patients avec des coûts médicaux estimés à 2,5% des dépenses totales de santé publique.

Procédures

Les animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale durant 1 heure (seuls la peau et les muscles entre deux côtes seront incisés) ainsi que trois échographies sous anesthésie gazeuse (durant chacune 30 minutes maximum). De plus le traitement par la protéine cardioprotectice sera administrée quotidiennement pendant 3 jours, puis tous les deux jours pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir des nuisances suite aux injections que ce soit d'anesthésie pour le protocole chirurgical ou pour la mise à mort mais également pour l’administration de la protéine anti-inflammatoire. Les animaux seront soumis à deux types d’anesthésie : une générale pour la chirurgie et une gazeuse pour les trois echocardiographies prévues dans le projet. Des effets indésirables peuvent apparaitre dans la phase de réveil : somnolence, douleur, déshydratation. L'insuffisance cardiaque qui doit apparaitre suite à la ligature de la coronaire peut engendrer des nuisances telles que des difficultés respiratoires (essoufflement) ou une perte d'appétit conduisant à une perte de poids. Pour éviter tous ces effets indésirables, les souris feront donc l’objet d’une surveillance accrue par l’expérimentateur afin de contrôler que les nuisances n'atteignent pas les points limites nécessitant une mise à mort. Les points limites suivants seront considérés pour un arrêt du protocole : perte de poids supérieure à 20%, isolement et prostration signe de souffrance, difficultés respiratoires et complication sévère de la cicatrice .

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de réaliser des examens sur tissus post-mortem.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle in vivo car l’évaluation de la substance cardioprotectrice doit maintenant être réalisée dans une véritable étude pré-clinique long-terme permettant de mimer ce qui se passe chez l’homme (l’évaluation des effets court-termes de la protéine ayant déjà été réalisée dans nos études antérieures in vitro). Le protocole proposé ici est le seul protocole disponible permettant d’étudier la pathologie chronique de la défaillance cardiaque.

Réduction

Pour une étude sur le long-terme, condition mimant les patients qui survivent, plusieurs mesures seront réalisées et répétées dans le temps afin de récolter le maximum d’informations sur les effets du traitement tout en limitant le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux à inclure dans les groupes de traitement ont été définis à priori par un calcul statistique. Des comparaisons statistiques seront également réalisées sur les résultats obtenus. Pour limiter le nombre d’animaux, plusieurs mesures seront réalisées sur le même animal et des examens seront pratiqués en utilisant l’animal comme contrôle interne. Les tests d’évaluation seront combinés afin de limiter le nombre d’animaux : échocardiographie non-invasive, analyse de sang.

Raffinement

Conditions d’hébergement: Les souris seront stabulées dans l’animalerie au moins 1 semaine après la livraison et avant le début de l’expérimentation. Elles seront plusieurs par cage avec un milieu enrichi (maisons en carton) pour éviter le stress de l’isolement. Protocole : -Les échographies sous anesthésie générale sont pratiquées avant toute chirurgie afin que chaque animal soit son propre contrôle. - L’administration d’une pré-médication permet de limiter le stress de la chirurgie. - La douleur engendrée par la chirurgie sera limitée au maximum en diminuant la taille des incisions. Après la chirurgie et la phase de réveil en unité de soins intensifs, les souris seront regroupées dans les cages avec milieu enrichi. Ceci permettra également de les stimuler dans la phase post-opératoire. Elles seront ensuite surveillées quotidiennement afin de dépister tout signe de souffrance, de complications post-opératoires et d’angoisse.. Cependant, si aucune solution n'est possible,et que les points limites sont atteints, l'expérience sera arrêtée le plus rapidement possible.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour développer les modèles d’étude de l’équipe car l’Homme et la souris possèdent 99% de gènes homologues. - la souche choisie est celle qui est reconnue internationalement et qui sera utilisée pour les études règlementaires pré-cliniques futures (toxicité, pharmacologie...) - Les conditions d’hébergement sont compatibles avec celles proposées par l’Institut où seront réalisées les expériences - les animaux sont de petite taille et les coûts engendrés faibles Jeunes adultes mâles de 7 – 8 semaines : les animaux ont un poids standard à cet âge, ils ont moins de tissu adipeux donc cela est plus facile à gérer pour les protocoles d’anesthésie. La taille de la trachée est également compatible avec l’utilisation de la sonde oro-trachéale de notre appareil d'assistance respiratoire.

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour développer une drépanocytose, elles présentent anémie, atteintes du foie, des reins et de la rate et troubles respiratoires liés aux crises douloureuses, et reçoivent des prélèvements sanguins répétés ainsi qu'une injection d'hémine dans le sinus de l'œil sous anesthésie, avant d'être tuées. Le porteur indique que la fréquence, la durée et la voie d'administration des composés testés dépendent de la demande d'un "sponsor". Il conclut que le remplacement par culture cellulaire est impossible et que le recours à ce modèle est "indispensable".

Objectifs

Il est aujourd’hui estimé qu’il naît chaque année dans le monde, plus de 300 000 enfants atteints de drépanocytose. La drépanocytose (parfois appelée « anémie falciforme ») est une maladie génétique qui touche l’hémoglobine, la protéine contenue dans les globules rouges qui sert à transporter l’oxygène à travers le corps. Dans la drépanocytose, la forme anormale adoptée par cette protéine engendre des déformations des globules rouges qui deviennent fragiles, rigides et qui bouchent les capillaires sanguins. Ces anomalies favorisent l’anémie, les crises vaso-occlusives douloureuses causées par une mauvaise circulation sanguine et un risque accru d’infections. La complication la plus grave de ces crises est la survenue d’un syndrome thoracique aigu dans environ 20 % des cas, se manifestant par des douleurs thoraciques pouvant aboutir rapidement à une situation de détresse respiratoire. Le caractère imprévisible des crises vaso-occlusives et les dommages tissulaires sévères rendent extrêmement difficile l'établissement d'un traitement efficace, expliquant pourquoi, à ce jour, il n'existe encore aucun traitement curatif applicable à l'ensemble de la population drépanocytaire. La complexité de cette maladie nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme intégré comme l’animal. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de nouvelles molécules contre les crises vaso-occlusives dans un modèle murin transgénique développant la maladie (modèle Townes). Ce travail permettra également de comparer les candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagées afin de couvrir au mieux les potentiels effets recherchés sur la sévérité et la progression de cette maladie dans le modèle murin utilisé.

Bénéfices attendus

La crises vaso-occlusive étant la première cause de consultations aux urgences et d’hospitalisation des patients atteints de drépanocytose, ce projet propose d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge des patients drépanocytaires. Ce projet permettra également de comparer de futurs candidats médicaments aux traitements actuels. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression des manifestations cliniques de la drépanocytose telles que les crises vaso-occlusives.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins suivant une cinétique de prélèvement définis par le sponsor (en sachant qu'un prélèvement sanguin de 7,5% du volume total nécessite une semaine de récupération). Les animaux recevront l'administration des composés à tester. La fréquence, la durée et la voie d'administration des composés dépendra de la demande du sponsor. Sur animal anesthésié à l'isoflurane 3%, une injection intraveineuse d'hémine au niveau du sinus rétro-orbital sera réalisée. Enfin, un prélèvement en point final de sang sera effectué puis un prélèvement d'organes (selon la demande du sponsor) aura lieu après mise à mort de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex- vivo.

Impact sur les animaux

Les effets indésiréables attendus sont ceux induits par le phénotype drépanocytaire spontanné des souris transgéniques Townes. Les souris Townes présentent une anémie, une demi-vie érythrocytaire raccourcie, une atteinte hépatique, rénale et splénique, une augmentation de l'érythropoïèse et des troubles respiratoires induits par les crises vaso-occlusives. Ces souris présentent un phénotype drépanocytaire dont l’ensemble des manifestations cliniques de la maladie serviront de paramètres d’évaluation d’efficacité de l’ensemble des composés pharmacologiques à tester. Ce projet étant classé à un stade sévère, il fera l'objet d'une évaluation rétrospective.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure 1 et des prélèvements sont réalisés pour étudier l'effet des composés testés.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la drépanocytose. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la maladie sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents (modèle Townes) pour permettre une recherche fondamentale et appliquée tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante (test non-paramétriques de Mann-Whitney et Kruskal Wallis) pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience, tout en prenant en compte la disponibilité et la fragilité du modèle transgénique Townes.

Raffinement

Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 6 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leur sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement en accord avec le comité de suivi du bien-être animal de notre établissement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera la mise à mort de l'animal. Ce projet étant classé à un grade sévère, la Structure en charge du Bien-Etre Animal sera impliquée dans le bon déroulé de l'expérience et ce projet fera l'objet d'une évaluation rétrospective.

Choix des espèces

Dans ce projet, les expériences in vivo sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance des composés mais également leur efficacité sur les manifestations les plus fréquentes de la drépanocytoses telles que les crises vaso-occlusives. La modèle murin Townes a été choisi car il reproduit au mieux génétiquement et cliniquement la pathologie drépanocytose. Les souris utilisées auront entre 7-12 semaines au début de la procédure afin d'avoir des souris adultes avec un système immunitaire mature et ayant développé la pathologie.