Procédures sévères

580 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une résection étendue de l'intestin sous anesthésie, puis des injections et des gavages de matières fécales, avec pour conséquences déclarées une perte de poids, une diarrhée pouvant être sévère et des carences. Le porteur cherche des bactéries améliorant le traitement d'une maladie rare de l'intestin. Il affirme mimer "en tous points" la pathologie humaine et reconnaît que son modèle d'organoïdes ne peut être fabriqué qu'à partir d'animaux.

Objectifs

Le syndrome du grêle court (SGC), est une maladie rare qui touche 7 à 10 patients par an par million d’habitants. Il résulte d’une importante réduction de l’intestin qui conduit à un intestin restant de moins de 150-200 cm qui ne peut pas assurer une absorption des aliments pour satisfaire les besoins nutritionnels des patients. Une nutrition par voie veineuse est alors mise en place et peut entraîner de nombreuses complications dont l’une est un dysfonctionnement majeur du foie dont les causes restent à identifier. L’évolution des problèmes de foie est rapide et conduit parfois à une dégradation sévère de ses fonctions dont le seul traitement efficace est la double transplantation foie-intestin. Une alternative thérapeutique est un traitement médicamenteux dont le coût actuel est exorbitant et qui présente une grande variabilité de réponses chez les patients. Les patients souffrant du SGC ont une composition particulière de bactéries intestinales appelée lactobiote. Caractériser ce lactobiote nous semble pertinent pour identifier des espèces bactériennes particulières qui aideraient au développement de nouvelles stratégies de traitement des patients. Un modèle de rat mimant au plus près les caractéristiques de la pathologie SGC humaine, sera utilisé. L’objectif du projet est de comprendre comment ce lactobiote en absence ou en présence du traitement médicamenteux actuel participe à l’amélioration de l’état général du rat grêle court et, de rechercher d’autres causes des dysfonctionnements du foie liée l’importante réduction de l’intestin. Les buts ultimes sont : 1°) de développer des stratégies et des approches thérapeutiques pour les patients qui souffrent d’une sévère malabsorption intestinale dans la perspective de réduire la nutrition par voie veineuse, source de nombreuses complications et, 2°) d’identifier d’autres causes des dysfonctionnements du foie lié à l’importante réduction de l’intestin afin d’optimiser la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Les résultats devraient permettre: i) de développer de nouvelles stratégies pour des approches thérapeutiques adaptées pour les programmes de rééducation intestinale des patients souffrant d’une importante réduction d'absorption des aliments dans la perspective de réduire la dépendance à la nutrition par voie veineuse de substances nutritives ; ii) de découvrir d’autres causes et/ou mécanismes conduisant aux dysfonctionnements du foie ( fabrication de la bile, détoxification de produits alimentaires ingérés etc… …).

Procédures

Les animaux auront une chirurgie, d'une durée d'environ 35 min, consistant en une importante réduction de l'intestin sous anesthésie générale et analgésie. Les conséquences de cette réduction intestinale sont la perte de poids et la diarrhée. Les animaux évéillés auront des injections intraperitonéales d'antibiotiques (geste sans anesthésie d'une durée de 10 secondes maximum) et de substances chimiques dans l'abdomen 1 fois tous les 2 jours pendant 2-3 semaines apres la chirurgie et des gavages (geste sans anesthésie d'une durée de 30 secondes maximum) de fèces (1 fois par semaine) pour la transplantation de microbiote fécal (TMF), pendant 3 semaines apres la chirurgie

Impact sur les animaux

Ces chirurgies qui portent sur une importante réduction de l’intestin entrainent une perte de poids, une diarrhée qui peut être sévère conduisant à une malabsorption avec des carences nutritionnelles.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure puis l'estomac, l'intestin, le foie, le cerveau sont préléves pour des analyses .

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux, nous mettrons en place un modèle simplifié de l’intestin dans un tube à essai, (organoïdes) qui sera produit à partir de cryptes (contenant les cellules souches) des fragments intestinaux des différents groupes d’animaux utilisés. Ce modele de l'intestin simplifié ne peut cependant etre créer qu'en utilsant des animaux. Une partie de ces organoïdes sera congelée, conservée pour être utilisée dans d'autres études. A terme ce modèle simplifié de l'intestin en tubes à essai, pourra etre utilisé en lieu et place des animaux..

Réduction

Nous limitons le nombre par groupe au nombre nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement fiables. Cependant, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables ne permettant pas de tirer de conclusions des données. Ce nombre de rats par groupe a été calculé pour pouvoir mettre en évidence une récupération. En outre, les animaux témoins dans les différents groupes pourront être utilisés pour les analyses de plusieurs groupes d’expérience, permettant ainsi une réduction substantielle du nombre d’animaux.

Raffinement

L'ensemble des procédures de ce projet se fera dans le respect du bien-être animal. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur, conforme à celle réalisée chez les patients opérés. Nous avons inclus dans toutes les procédures des grilles de suivi : la pesée journalière pour le suivi du poids, la mesure de la prise alimentaire avant et après l’opération, une grille d'évaluation de la douleur avec des points limites précis et adaptés. Après les opérations chirurgicales, les animaux sont placés dans des cages séparées pour suivre leur prise alimentaire individuelle et la reprise du transit intestinal indispensables à leur surveillance individuelle. Les cages sont alors enrichies avec des tubes en polycarbonate. Les animaux seront donc suivis sur le plan hygiénique tous les jours par un personnel expérimenté afin de respecter le bien-être animal. Afin de limiter leur isolement, ils seront transférés ensuite dans des cages séparées par une grille et enrichies avec des tubes en polycarbonate.

Choix des espèces

Nous utiliserons le/la rat.e adulte car il/elle dispose d'un microbiote intestinal plus diversifié et proche de celui de l’homme. En outre, nous avons développé et caractérisé un modèle de résection intestinale étendue (rat syndrome de grêle court) qui mime « en tous points » la pathologie humaine du syndrome de grêle court.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent neuf gavages, dont cinq en deux heures pour vider leur microbiote, un geste que le porteur qualifie lui-même de stress sévère, puis une coupe de la queue et un prélèvement de sang avant mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur étudie le lien entre microbiote intestinal et attrait pour les régimes gras et sucrés, un enjeu qu'il présente comme majeur. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces relations entre intestin, cerveau et comportement.

Objectifs

L’augmentation de la consommation alimentaire liée au plaisir à manger est un facteur clé dans l’augmentation de la prévalence du surpoids et de l’obésité. La compréhension des dérégulations de ce système du plaisir à manger est un enjeu scientifique et médical majeur. Parmi les nouveaux acteurs de la régulation du comportement alimentaire, le microbiote intestinal est de plus en plus étudié . Des données préliminaires pointent son rôle potentiel dans la régulation du comportement du plaisir à manger dans le cadre d’alternance entre des régimes normaux et régimes gras/sucrés. Ce type de comportement est largement répandu dans la population en général et dans les stratégies nutritionnelles pour la perte de poids, qui sont généralement peu efficaces en termes de perte de poids sur le long terme. Ce travail pourra permetre de mettre en évidence le rôle de certaines bactéries en particulier et leurs cibles au niveau de certaines régions du cerveau impliquées dans la régulation de la prise de nourriture. Des modifications du comportement alimentaire et notamment du plaisir alimentaire qui entraine une augmentation de la prise alimentaire ont été mises en évidence chez des souris lorsqu'elles sont exposées plusieurs fois (effet YOYO) à un régime gras/sucré. En parallèle des modifications du microbiote intestinal et une prise poids plus importante ont été observées chez ces souris YOYO en comparaison avec des souris maintenues en permanence sous un régime gras/sucré. Ceci mettant en évidence l’aspect détrimentaire de l’alternance des régimes alimentaires. L’objectif de ce projet est de mettre en évidence un éventuel lien de cause à effet entre les modifications du microbiote intestinal et le comportement alimentaire. Pour cela, le microbiote caecal de souris YOYO (ayant été exposées plusieurs fois au régime gras sucré) ou pas sera transféré à des souris receveuses naives n’ayant jamais consommé de régime gras/sucré. L'objectif de ce travail est d’une part d'analyser le comportement des souris receveuses et d'autre part de mettre en évidence les aires cérébrales activées par les microbiotes YOYO. Pour cela, des analyses de biologie moléculaire ou des immunohistochimies dirigées contre des gènes impliqués dans le comportement alimentaire et des protéines marqueurs de la neuroinflammation seront réalisées sur les cerveaux des souris receveuses.

Bénéfices attendus

L’augmentation de la consommation alimentaire liée au plaisir à manger est un facteur clé dans l’augmentation de la prévalence du surpoids et de l’obésité. La compréhension des dérégulations de ce système du plaisir à manger est un enjeu scientifique et médical majeur. Parmi les nouveaux acteurs de la régulation du comportement alimentaire, le microbiote intestinal est de plus en plus étudié. Des données préliminaires pointent son rôle potentiel dans la régulation du comportement du plaisir à manger dans le cadre d’alternance entre des régimes normaux et régimes gras/sucrés. Ce type de comportement est largement répandu dans la population en général mais également dans les stratégies nutritionnelles mise en œuvre pour la perte de poids, qui sont généralement peu efficaces en terme de perte de poids sur le long terme. Ce travail pourra permettre de mettre en évidence le rôle de certaines bactéries en particulier et leurs cibles au niveau du cerveau afin, à long terme, d’envisager des développmenents thérapeutiques utilisant les bacteries indentifiées pour moduler la prise alimentaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à une contention nécessaire lors des 9 gavages (quelques secondes) réalisés lors de la déplétion du microbiote (5 gavages en 2h), le transfert du nouveau microbiote (3 gavages en 48h) et au cours du test de tolérance au glucose (un gavage à la fin des 8 semaines). Pour ce test les souris subiront une petite coupure à l’extrémité de la queue (incision : 1 seconde) et massage de la queue pour récupérer la goutte de sang (quelques secondes). Un prélèvement de sang à la veine submandibulaire sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 10-15 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à un stress de par leur placement en cage individuelle tout au long de la procédure. Lors de la déplétion du microbiote, les gavages au polyéthylène glycol (PEG), d’une durée de 10 secondes, constituent un stress sévère compte tenu de leur fréquence (5 gavages en 2h). Lors du transfert de microbiote, les gavages d’une durée de 10 secondes, constituent un stress modéré car ils sont espacés de 24h. Une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'expérimentateur lors du premier prélèvement du test.

Devenir

Les 72 souris seront euthanasiées pour prélever les cerveaux.

Remplacement

Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler les relations entre le microbiote intestinal, le système nerveux central et le comportement alimentaire d’un individu. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur la composition et l’abondance du microbiote intestinal et des données phénotypiques et comportementales obtenues sur les mêmes animaux.

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 24 souris par groupe expérimental et nous avons 3 groupes expérimentaux. Chaque groupe sera divisé en deux sous-groupes de 12 animaux qui seront respectivement dédiés à l’analyse de l’expression de gènes ou au marquage de protéines. D’après les études déjà menées au laboratoire, nous estimons que 12 animaux par sous-groupe sont nécessaires afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier de nidification et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris respectivement de faire un nid et de se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Afin de palier au stress dû à l'isolement des animaux , les cages seront en plexiglass transparentes et mises côte à côte pour permettre les interactions visuelles et sonores entre les animaux. Ces enrichissements permettent d'assouvir au mieux les comportements naturels de l'animal. Les animaux seront surveillés chaque jour (surveillance visuelle) au moment de la prise alimentaire (mesurée par pesée de l’aliment). Un score clinique sera établi lors de la surveillance quotidienne. Une perte de poids dépassant 20 % du poids initial de l’animal sera considérée comme un point limite majeur. Des points limites spécifiques lors des gavages seront également mis en place.

Choix des espèces

Des souris C57BL6 mâles adultes (agés de 12 semaines au début de la procédure) seront utilisés. Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Des données préliminaires sur ce modèle animal sont de plus disponibles notamment sur les souris donneuses dont sont issus les microbiotes qui seront transférés. Il est donc indispensable d’utiliser des animaux de la même espèce, du même âge et du même sexe que les souris donneuses de microbiote. Nous avons choisi de travailler sur des animaux de 12 semaines d’âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé.

740 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent plusieurs modèles de douleur provoquée, incision de la patte, ligature du nerf sciatique, douleur cancéreuse et pose d'une pompe, avec des atteintes déclarées allant de la paralysie à une perte de poids de plus de 15 %. Le porteur teste des nanoparticules censées prolonger l'action d'analgésiques naturels, une validation renvoyée à un stade préclinique. Il affirme qu'il n'existe "pas de méthode alternative" et que le recours à l'animal est un "impératif" avant la clinique.

Objectifs

Les opioïdes sont des médicaments importants dans le traitement de la douleur chez l'être humain. Les agents comme la morphine sont les plus utilisés en clinique humaine. Malheureusement, cette catégorie de produits est également associée à des effets indésirables, que l’on ne peut pas éviter si on doit traiter la douleur. L'une des pistes pour éviter ces effets indésirables est d'utiliser des opioïdes existant naturellement dans le corps humain, tels que les enképhalines. La Leu-enképhaline est un candidat intéressant, mais sa durée d'action est très courte, rendant impossible son utilisation en simple injection. Un moyen potentiel pour en conserver les propriétés tout en allongeant sa durée d'action est de pouvoir la diriger directement dans les lieux de la douleur. Ceci a été réalisé dans un laboratoire qui a pu, dans une précédente expérience de synthétiser des nanoparticules de Leu-enképhaline, ce qui a permet de les orienter directement dans les lieux de la douleur et pourrait permettre de prolonger leur durée d'action jusqu'à obtenir un effet cliniquement utilisable, sans agir sur le système nerveux central donc sans les effets indésirables les plus néfastes des opioïdes. Notre équipe a démontré chez le rat que l’opiorphine (un médicament qui bloque la dégradation des enképhalines) agit également contre la douleur sur plusieurs modèles de douleur reproduisant les différents types de douleur chez l’homme. L’objectif de ce travail sera : 1) Évaluer les propriétés antidouleurs des nanoparticules de leu-enképhaline et de l’opiorphine ou leur combinaison dans différents modèles de douleur. En effet, il existe différents types de douleur (mécanique, inflammatoire, neuropathique, cancéreuse) qui ne présentent pas les mêmes caractéristiques et qui réagissent spécifiquement aux différentes familles de médicaments contre la douleur. 2) Réaliser des études à l’échelon cellulaire pour comprendre le mécanisme d’action impliqué dans leur efficacité contre la douleur. La compréhension de ces mécanismes pourrait permettre de mieux anticiper ses modalités d’utilisation chez l’homme et d’appréhender d’éventuels effets indésirables. 3)Déterminer la voie d’administration la plus pertinente. 4) Évaluer les effets indésirables potentiels de ces molécules.

Bénéfices attendus

Le projet s’inscrit donc dans la recherche de nouvelles formes thérapeutiques. En effet, le développement de stratégies ciblées dans le domaine de la douleur est devenu une option incontournable pour faire avancer la recherche médicale et améliorer les traitements des patients. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité antinociceptive de ces nanoparticules dans différents modèles expérimentaux de la douleur. Le résultat attendu sera donc la validation in vivo de l’efficacité de ces nanoparticules dans le traitement de la douleur.

Procédures

5 interventions: Une incision plantaire qui dure 5 minutes. Une ligature du nerf sciatique (L5-L6) qui dure 30 minutes par rat .Une douleur carcinologique qui dure 30 minutes par rat. La pose d'une pompe osmotique qui dure 1 heure par rat. Douleur inflammatoire à la carragénine qui dure 5 minutes.

Impact sur les animaux

Désunion de la cicatrice, hémorragie ou infection du site opératoire suite à l’implantation des pompes. Perte de poids supérieure à 15 %. Paralysie. Apparition d’une tumeur extériorisée à la peau. Agitation excessive. Position anormale (dos vouté, couché sur le Côté). Vocalisation ou réduction de la mobilité.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les tissus qui seront analysé par la suite  

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer l’expérimentation animale dans ce type d’étude. Il n’y a pas de méthodes alternatives possibles. Le recours à l’animal est donc nécessaire et constitue un impératif avant toutes entrée en phase clinique. Les analyses in vitro ou in silico ne suffisent pas en ce qui concerne l’étude de la douleur. Le modèle d’injection intraplantaire de carragénine dans la patte postérieure du rat et le modèle d’incision plantaire de Brennan et le modèle de la ligature sciatique sont des modèles validés pour étudier l'inflammation et la douleur chez les rats L’effet antinociceptif des molécules étudiés doit être validé par une expérimentation animale in vivo qui ne peut être remplacée par d’autre études.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux nécessaires fera intervenir une analyse statistique optimale après un calcul de puissance. Nous avons estimé le nombre d’animaux nécessaire de 740 au maximum.

Raffinement

Nous avons aussi attaché une grande importance au raffinement : les expériences sur la douleur nécessitent que les animaux ne subissent pas un stress supplémentaire, aussi les conditions d’hébergement seront adaptées au mieux et la durée des expériences réduite au strict nécessaire. La surveillance sera rapprochée et des points limites spécifiques sont prévus.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est l’espèce de référence pour l’étude de la douleur et la plupart des études l’utilisent car il est calme, facile à manipuler et s’acclimate progressivement à l’expérimentateur. Ceci permet donc de diminuer le stress induit par la présence de l’examinateur et ne perturbe pas la réponse aux tests comportementaux. Rats âgés de 5 semaines environ, poids 250g, considérés comme adultes.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une thoracotomie provoquant une ischémie-reperfusion du coeur, avec un risque déclaré de douleurs post-opératoires, de saignements et d'hypothermie, avant que le coeur infarci ne soit prélevé. Le porteur cherche à identifier des récepteurs impliqués dans le remodelage cardiaque, en vue de "biomédicaments" dont il rappelle qu'ils sont une spécialité de son université. Il affirme que seul l'animal entier permet d'observer ces interactions, hors de portée des cellules en culture.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires dont le chef de file est l’infarctus du myocarde constituent à l’heure actuelle la première cause de mortalité dans les pays développés et ont une progression continuellement croissante dans les pays en voie de développement. Dans ces maladies, une part importante de la physiopathologie est liée à l’ischémie-reperfusion (l’ischémie est définie par la réduction ou l’interruption du débit sanguin dans un territoire vasculaire donné ; la reperfusion correspond à la restauration du flux sanguin). Même si leur prise en charge s’est beaucoup améliorée ces dernières années, certainescomposantes restent pour l’instant non ciblées par les thérapeutiques actuelles, qu’il s’agisse des lésions de reperfusion ou de la réponse immuno-inflammatoire à l’ischémie-reperfusion . La séquence ischémie-reperfusion myocardique, observée lors d’un infarctus du myocarde reperfusé, est associée à la libération de signaux de danger, parmi lesquels l’Adénosine Tri-Phosphate (ATP) et autres nucléotides extracellulaires. L’ATP et ses dérivés se fixent sur des récepteurs particuliers, les récepteurs purinergiques, entrainant des signaux extra et intracellulaires par cascades : la signalisation purinergique. Les récepteurs purinergiques sont communs aux cellules de l’immunité innée, aux cardiomyocytes et aux cardiofibroblastes. L'hypothèse de notre travail est que la modulation des récepteurs purinergiques pourrait permettre de diminuer l’impact de l’ischémie-reperfusion myocardique en diminuant les tailles d’infarctus. Dans ce nouveau projet, nous souhaitons réaliser une cartographie de l’expression des récepteurs purinergiques activés en contexte d’infarctus du myocarde chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’identifier les principaux récepteurs purinergiques impliqués dans le remodelage ventriculaire après infarctus du myocarde. A moyen terme, cette étape nous permettra d’identifier des biomédicaments cardioprotecteurs dont la production est une spécialité reconnue de notre université.

Procédures

Ischémie-reperfusion coronarienne sous anesthésie générale : sur 300 souris, 1 fois/animal, pendant moins d’1h30. Prélèvement sanguin dans la veine caudale sous anesthésie générale : sur 300 souris, 1 fois/animal, pendant moins de 10 minutes.

Impact sur les animaux

La chirurgie par thoracotomie peut générer des douleurs postopératoires, surtout dans les premières heures après le réveil. La prise de sang peut également engendrer un hématome. La contention peut stresser les animaux. Enfin, la période périopératoire est à risque de saignements, d’hypothermie, voire de deshydratation. Tous les moyens seront mis en œuvre pour prévenir ces différentes nuisances/complications.

Devenir

Mise à mort. Le protocole d'étude prévoit in fine l'étude du coeur infarci explanté. La survie sans coeur n'est pas invisageable.

Remplacement

Des études sur cellules cardiaques en culture suggèrent l’implication de certains récepteurs purinergiques dans la survie de ces cellules en condition d’ischémie-reperfusion. Seul le modèle animal permet de voir cette implication sur un tissu entier où des interactions cellulaires sont à l’œuvre.

Réduction

L’outil statistique permet de réduire au minimum le nombre d’animaux indispensable à l’obtention de résultats interprétables. D’après l’analyse des résultats préliminaires, le nombre de souris nécessaire dans chaque groupe pour obtenir des résultats interprétables est de 8 par groupe. Tenant compte dans notre expérience d’une mortalité périopératoire de 25%, le chiffre de 10 par groupe nous parait raisonnable pour respecter au mieux la règle des 3R. L’étude est réalisée en plusieurs étapes successives, ce qui permet de cibler les récepteurs les plus pertinents et de réduire d’autant le nombre de substances testées et d’animaux opérés.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, un effectif maximal de 5 souris par cage de 800cm3 est prévu avant les manipulations. Les animaux seront anesthésiés. La cicatrice de thoracotomie sera infiltrée en postopératoire immédiat avec une injection sous-cutanée d'anti-inflammatoire et d'anesthésique. Une analgésie post-opératoire sera réalisée. En cas de symptômes douloureux marqués, l’analgésie sera complétée. Le point limite est la présence d’une douleur sévère réfractaire au traitement antalgique. Pour le confort des animaux, durant la chirurgie, l’animal sera placé sur une table chauffante afin d’éviter les problèmes d’hypothermie liés à l’anesthésie et le réveil des animaux sera suivi par les personnels impliqués dans le protocole. Une ambiance sonore calme sera respectée. Après la chirurgie les animaux sont placés en cage individuelle pendant 12h. Après 12h, si la mobilité est satisfaisante et en l’absence de signes de douleur marquée, la souris opérée est remise en collectivité. La durée de la convalescence est estimée à 24h avec observations pluriquotidiennes (3x/jour).

Choix des espèces

La souris est une espèce reconnue pour l'étude des mécanismes immunitaires. De plus dans cette espèce, des animaux délétés génétiquement sont disponibles pour étudier l'implication de la réponse immune sur les lésions d’ischémie-reperfusion. Souris adultes de 6 semaines. L’âge est un facteur de risque cardiovasculaire.

103 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une infection pulmonaire à Pseudomonas aeruginosa par instillation intranasale sous anesthésie, avec une surmortalité d'environ 20 % attendue, avant euthanasie pour mesurer la charge bactérienne et la réaction immunitaire. Le porteur cherche à savoir si une enzyme bactérienne peut servir de cible thérapeutique face à l'antibiorésistance. Le développement d'inhibiteurs et de nouvelles thérapies est renvoyé au long terme.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie de l’environnement induisant des infections respiratoires chez les sujets fragilisés comme ceux se trouvant en réanimation, ceux atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive ou encore ceux atteints de mucoviscidose. L’émergence de souches de P. aeruginosa de plus en plus résistantes aux antibiotiques est observée partout dans le monde. La resistance aux antibiotiques est un problème car cela risque d’entraîner des impasses thérapeutiques pour les patients. L’objectif est d’étudier si une enzyme protégeant P. aeruginosa contre la défense de l’hôte peut servir de cible thérapeutique alternative ou adjuvante aux antibiotiques pour traiter les infections à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques : ce projet scientifique a pour objectif (i) de déterminant les charges bactériennes dans les poumons infectés par les bactéries hyperexprimant ou non la proteine, (ii) d’étudier l’impact de l’infection sur la destruction de l’architecture du poumon et sur la réaction immunitaire.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de caractériser plus précisement la virulence accrue au niveau pulmonaire induite par l’enzyme d’intérêt chez la bactérie P. aeruginosa résistante aux antibiotiques utilisés couramment en médecine humaine. Cette caractérisation est indispensable pour affirmer l’implication de cette enzyme dans la différence de survie observée chez les souris dans nos travaux précédents et elle est nécessaire pour expliquer le mécanisme global de la virulence augmentée de ces souches. Cette enzyme participe à la virulence à la bactérie. Elle constitue donc une cible potentielle pour le développement à plus long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les infections pulmonaires à P. aeruginosa résistants à de nombreux antibiotiques. Le développement d’inhibiteurs de cette enzyme peut être envisagé pour constituer une thérapeutique alternative et adjuvante aux antibiotiques en médecine humaine. Son inhibition pendant l’infection respiratoire permettrait de limiter la prolifération de P. aeruginosa en le rendant sensible à la réponse de l’hôte.

Procédures

Pour chaque animal, il sera réalisé : - Une infection respiratoire par instillation intra-nasale : geste réalisé sous anesthésie générale. - Une administration d’un antidouleur par injection intrapéritonéale à 6h post infection puis 1 fois par jour pendant 5 jours. - L’euthanasie post infection pour prélévement et analyse des poumons (étude charge bactérienne et réaction immunitaire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont ceux résultants de l’infection pulmonaire bactérienne. Il pourra être observé des signes d’infections respiratoires : dyspnée, mobilité réduite, dos vouté et poil hirissé. Une possible sur-mortalité d’environ 20% lors de l’instillation intranasale est également attendue.

Devenir

Les animaux seront mis à mort au cours ou à la fin de la procédure afin de réaliser le dénombrement de la charge bactérienne pulmonaire, les analyses d’histologie et cytologiques sur les prélèvements pulmonaires.

Remplacement

Ce projet requérant un modèle murin a été considéré après une étude in vitro préalable. En effet, la première partie de notre projet, qui a permis la mise en évidence de la virulence augmentée de la souche résistante aux antibiotique et le rôle d’une enzyme d’intérêt, a été réalisée sur un modèle in vitro d’épithélium respiratoire humain. Cependant, malgré son utilité, ce modèle reste très limité car il ne permet pas d’étudier la virulence bactérienne à l’échelle du poumon dans son ensemble et il ne prend pas en compte la réponse immunitaire globale de l’hôte vis-à-vis de P. aeruginosa. Au contraire, dans le modèle murin de pneumonie aiguë, la réponse globale de l’hôte au niveau pulmonaire est assurée et cette étape in vivo est essentielle à la validation du rôle la protéine d’intérêt dans l’infection à P. aeruginosa résistant aux antibiotiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé pour répondre à l’objectif scientifique selon le nombre d’expériences prévues, les besoins en données selon les analyses statistiques envisagées et les données de la littérature. Une réflexion biostastistique a été réalisée afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Les groupes ont donc été réduits à la taille minimum nécessaire à l’interprétation des résultats. Pour essayer de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous allons effectuer les expériences de manière séquentielle dont certaines ne seront réalisées qu’en fonction des résultats obtenus avec les premières.

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être de l’animal, plusieurs mesures seront réalisées : - l’anesthésie générale lors de l’instillation intra-nasale de l’inoculum bacterien, avec l’utilisation d’un dispositif chauffant lors de l’anesthésie des souris pour éviter l’hypothermie - une surveillance rapprochée pendant toute la durée de la procédure. Cette surveillance permet le suivi des animaux et la vérification des points limites, requérant l’euthanasie - l’administration d’un antidouleur à 6h post-infection puis 1 fois par jour jusqu’à la fin de la procédure pour limiter la douleur et la dyspnée chez l’animal - un enrichissement des cages et le regroupement des souris dans les cages pour préserver les interactions sociales.

Choix des espèces

La souris est une espèce pour laquelle de nombreux protocoles de pneumonie aiguë d’étiologie bactérienne ont été optimisés et validés. Le modèle murin utilise des souris adultes et permet d’étudier la pathogénicité bactérienne lors de l’infection pulmonaire aiguë (i) en établissant les courbes de survie (se basant sur l’atteinte des points limites), (ii) en réalisant des coupes histologiques pulmonaires et (iii) en déterminant la charge bactérienne infectante dans les poumons.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité sévère. Elles reçoivent un traitement antibiotique pendant neuf jours, puis une transplantation de microbiote fécal par gavage et des tests de course sur tapis roulant, pour établir un lien de cause à effet entre type de flore intestinale et endurance. Le porteur indique que le gavage, les tests physiques et l'antibiotique à large spectre génèrent stress et inconfort intestinal, et héberge chaque animal en cage individuelle. La mise à mort est présentée comme "indispensable" pour accéder aux organes.

Objectifs

Le microbiote intestinal représente tous les microorganismes, bactéries, champignons et virus vivant le long du tractus gastro-intestinal d’un hôte. Ces différents microorganismes et plus particulièrement les bactéries vivent en homéostasie au sein de l’intestin, c’est-à-dire qu’il existe un équilibre entre les bactéries commensales (i.e. bactéries non néfastes et contribuant au bon fonctionnement de l’hôte), les bactéries parasites et les pathogènes permettant un état d’eubiose de la flore intestinale. Au cours de la dernière décennie, un certain nombre d’études scientifiques ont été conduites pour établir le lien qu’il existe entre ce microbiote intestinal et la performance sportive. Certains travaux scientifiques, et notamment ceux conduits au laboratoire M2S, ont ainsi mis en évidence un lien direct entre le microbiote intestinal et le muscle squelettique, organe central dans la performance sportive. Récemment, nous avons en effet conduit une étude clinique pilote chez l'humain pour caractériser la composition du microbiote intestinal en fonction du profil glucido-lipidique à l'exercice. Nous avons montré que des sujets utilisant principalement des lipides à l'exercice présentent en très grande majorité un entérotype bactérien dominé par le genre Prevotella (espèce de bactérie). A l'inverse, les individus n'utilisant pas ou peu de lipides présentent un entérotype dominé par le genre Bacteroides (autre espèce de bactérie). En réalisant une transfection fécale des deux entéroypes chez des souris, l'objectif de ce projet vise à déterminer si un lien de cause à effet existe entre le type d'entérotype bactérien et les capacités d'endurance à l'exercice.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude permettront de déterminer si une relation de cause à effet existe entre un entérotype bactérien retrouvé chez les populations sportives et la performance en endurance. Sur le plan de la santé, ils permettront de déterminer si un entérotype bactérien peut être bénéfique pour oxyder préférentiellement les lipides dans la fourniture d'énergie, caractéristique bien reconnu comme étant associé à un meilleur état de santé métabolique.

Procédures

Aucune intervention chirurgicale n'est prévue. Les 3 groupes expérimentaux auront un traitement antibiotique pendant 9 jours dans l'eau du biberon. Puis 2 groupes expérimentaux seront assujettis à une transfection fécale par gavage soit 3 doses (1 dose/j la première semaine) puis 1 dose par semaine pendant 4 semaines. La durée de manipulation pour réaliser le gavage est de moins d'une minute. Ils effectueront également, avant et pendant la durée de l'étude, des tests de course sur tapis roulant pour évaluer leurs capacités fonctionnels. Un des tests mesurant la vitesse de course maximale durera environ 20min alors que l'autre test mesurant la capacité d'endurance durera environ 1h. Des prélèvements fécaux non-invasifs seront réalisés chez les animaux (durée de la manipulation : moins d'une minute).

Impact sur les animaux

Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles. Les procédures de gavage et les tests physiques peuvent engendrer du stress pour les animaux. Le traitement antiobiotique à large spectre peut générer un inconfort intestinal durant les 9 jours de traitement. Toutefois, ces approches expérimentales sont communément utilisées pour les protocoles de transfection fécale chez l'animal.

Devenir

A la fin de ces protocoles expérimentaux, les animaux seront euthanasiés. La mise à mort des animaux est indispensable à l’étude pour avoir accès aux différents organes. L’objectif sera entre autres de réaliser des analyses moléculaires sur ces tissus.

Remplacement

Les résultats que nous avons obtenus sur la cohorte d'individu sains démontrent que les profils oxydant préférentiellement des lipides à l'exercice sont associés à un entérotype Prevotella dominant chez l'homme. L’étude de la causalité (soit l'effet de l’entérotype sur le métabolisme), ne peut se faire qu’à travers une étude chez le rongeur. Il n'existe pas d'alternative in vitro, ou ex-vivo, pour évaluer de manière efficace l’impact d’un entérotype bactérien sur le métabolisme et les capacités fonctionnelles.

Réduction

La cohorte constituée de 36 souris sera répartie en 3 groupes expérimentaux (12 animaux/groupe) afin d'obtenir les effets des différents entérotypes sur les capacités fonctionnelles.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet nécessitent un hébergement en cage individuelle car il est indispensable d'éviter le transfert du profil microbiote et il est nécessaire de mesurer la consommation quotidienne de nourriture et d'eau. Mais des précautions sont prises. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles, côte à côte et enrichies avec de jouets et un tunnel ce qui permet de limiter l'isolement social et le stress. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel. Un questionnaire pour mesurer le niveau de souffrance des rongeurs est mis à disposition et disponible dans les locaux de l’animalerie. Le questionnaire fait ressortir les signes visibles de douleur et d’inconfort chez le rongeur (vocalisation, agressivité, retrait d’un membre, autres). En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procéderons à la sortie la souris du protocole.

Choix des espèces

Les souris constituent une espèce qui très facile à manipuler et à faire courir sur des tapis. Le matériel que nous avons à disposition est également optimisé pour évaluer les performances physiques chez la souris. Par ailleurs, la nécessité d'avoir une population la plus homogène possible place la souris comme un modèle de choix pour cette expérimentation. Nous disposons par ailleurs de précédentes expériences validant l'usage d'un traitement antibiotique à large spectre chez cette espèce. Les animaux seront âgés de 7 semaines au début de l'expérimentation pour étudier de l'effet de la flore intestinale sur les capacités fonctionnelles et le métabolisme énergétique. Il faut disposer d'animaux adultes dont le métabolisme énergétique est stabilisé.

10 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection intracérébrale d'acide kaïnique pour induire une épilepsie, puis subissent une chirurgie stéréotaxique d'implantation d'électrodes suivie de dix jours d'enregistrements, avant d'être euthanasiées pour étude histologique. Le porteur décrit un projet pilote destiné à mettre au point une technique d'enregistrement pour de futurs projets, les bénéfices en connaissance des maladies du cerveau étant renvoyés au long terme. Sur le remplacement, il affirme que le cerveau ne se laisse pas encore modéliser en boîte de Pétri ou sur ordinateur et qu'il faut donc recourir à des modèles animaux.

Objectifs

Le cerveau est organisé en réseau susceptible d’être modifiée en cas d’épilepsie. Les progrès de la technologie des microélectrodes ou polytrodes à base de silicium offrent de nouvelles possibilités d'investigations. Les enregistrements à haute densité des champs électriques chez la souris fournissent désormais une couverture spatiale et une résolution sans précédent permettant de déceler des processus élémentaires permettant une compréhension plus approfondie des maladies du cerveau. Pour cela, il est necessaire d’identifier les différentes phases aboutissant à une chirurgie implantatoire optimale et d’évaluer les critères de qualité des enregistrements chez la souris dans un contexte normal (souris WT) ou épileptique (modèle KA). Le modèle KA reproduit les symptômes électrophysiologiques et morphologiques de l’épilepsie du lobe temporal mésial tels que : 1/une mort neuronale accompagnée par une gliose autour du site d'injection 2/ qu'une apparition retardée de crises focales après 3-6 semaines. L’objectif de ce projet est : - de mettre au point les enresgistrement à polytrodes. - de devopper une stratégie chirurgicale la moins insavive et la plus précise possible - d’anticiper les contraintes technologiques (qualité du signal, propriétés des électrodes) et techniques de ce type d’enregistrements pour des futurs projets sur la souris - d’étudier les modifications de connectivités chez le modèle KA apposant les caractéristiques électrophysiologies d’activité anormale et anomale.

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront à court terme : - le developpement d’une nouvelle technique dans une thématique expérimentale précise - Une meilleure formation des futurs expérimentateurs amenés à utiliser ce type d’enregistrement. A long terme : - Une meilleur connaissance pathophysiologique des maladies du cerveau. - Un partage des meilleures méthodes à la communauté scientifique

Procédures

Les 10 animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Deux procédures sous anesthésie générale et sous analgésie Acte 1) 1heure Administration aiguë intra cérébrale par injection stéréotaxique de KA sur souris anesthésiées Acte 2) 1heure chirurgie stéréotaxique: implantation d'electrode et Suivi post op= contention et injection sous cutanéé quotidien pendant 48 heure minimum Acte 3)Pendant 10 jours, un max de 2 contentions par jours pour le branchement pendant un maximum de 10 jours /Enregistrement 2 h par jours x 10 jours Les animaux Acte 4) Euthanasie : Sédation de l’animal puis injection d’un agent euthanasiant. La mort est confirmée par l'arrêt cardio respiratoire.

Impact sur les animaux

Les nuisances sont: l'isolement de l'animal, risque infectieux/problème de cicatrisation,baisse de la qualité du signal enregistré.

Devenir

La procédure est divisé en 3 phases à l'issue de la dernière phase (enregsitrement électrophysiologique) les animaux seront euthanasiés pour l'étude histologique sera effectué pour observer la localisation d'implantation des microélectrodes.

Remplacement

Certaines questions d’intérêt scientifique nécessitent des expériences sur les animaux. Bien que de nombreuses procédures alternatives existent, il n’est pas possible dans notre contexte d’utiliser autres choses que ces animaux étant donné l’interêt porté. En effet, cette étude vise à developper, standardiser une procédure dans le but d’étudier la connectivité cérébrale dans le cerveau. Le cerveau est un organe dont le fonctionnement est extrêmement complexe, qu’on ne sait pas encore complètement modéliser dans une boite de pétri ou sur ordinateur. Donc, nous devons faire appel à des modèles animaux.

Réduction

Nous sommes sensibles au besoin d’utiliser le moins d’animaux possible et de diminuer la souffrance animale tout en respectant la rigueur scientifique. C’est dans cet objectif que nous conduisons cette étude pilote afin d’établir les paramètres idéaux pour l’implantation de multielectrode avant le démarrage de projets plus conscéquents. Le nombre d’animaux utilisés est de 10 et sera réduit au minimum nécessaire pour produire une conclusion scientifique et statistique tenable.

Raffinement

Une semaine d'acclimatation minimum à la zone d’hébergement est respectée après la livraison des animaux. De façon à réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront maintenus au sein de groupes sociaux de plusieurs individus le plus longtemps possibles c’est-à-dire jusqu’à l’implantation des électrodes. Les animaux bénéficieront alors de nourriture et d’eau à volonté ainsi que d’un environnement enrichi à l’aide de maisons et netslets. Les conditions d’hébergement, incluant température, éclairage et espace (tableau 1.1, directive européenne 2010/63/UE) ainsi que les conditions d’enrichissement de l’environnement, l’alimentation et soins si nécessaires, seront adaptées aux animaux et à leur âge. Un soin particulier sera apporté à la réduction de l’inconfort, de la douleur ou du stress des animaux. Un protocole d’intervention sera mis en place pour chaque indicateur de souffrance (modification de comportement, signes identifiables de douleur ou d’inconfort, perte de poids, difficultés d’alimentation).Après une acclimatation de 30 minutes et un examen clinique, un analgésique sera injectée minimum 30 minutes avant la chirurgie puis renouveler après 12h00 jusqu’à 48h minimum après l’intervention. L’animal sera placé dans une cage d’induction préalablement pendant 4 minutes et l’anesthésie maintenue en diffusion au masque facial. Un anesthésique local est injectée au niveau de la zone d’incision et appliqué au niveau du contact avec les barres d’oreilles. Du gel oculaire sera appliqué et de l’eau physiologique sera injectée par voie sous-cutanée. Les lieux d’incisions et de chirurgie seront préalablement aseptisie par une succession de 3 lavages et l’application de vétédine. Après la chirurgie, l’animal sera surveillé et sa température régulée jusqu’à son réveil dans une cage de réveil à 37°C, il sera ensuite transféré dans sa cage.

Choix des espèces

Notre projet s’integre dans l’optimisation d’une procédure expérimentale qui sera à posteriori intégrée à d’autres projets scientifiques. Nous avons choisi la souris adulte car c’est l’espece la plus utilisée dans la modélisation de pathologie neurologique Il s’agit ici d’un projet pilote de mise au point qui se realisera sur la souris adulte. Le modele KA est induit et se developpe chez la souris adulte

1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une greffe de tumeur cérébrale par chirurgie intracrânienne, suivie d'une résection puis de traitements, pour reproduire un glioblastome humain et évaluer des composés après opération. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer des troubles neurologiques comme des convulsions, une incapacité à boire ou manger et une apathie, ces signes ou une perte de poids déclenchant un point limite de mise à mort. Il affirme que les méthodes alternatives "ne permettent pas" de prévoir l'efficacité in vivo des candidats-médicaments et que les reconstructions de tumeurs en 3D restent "marginales".

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Les gliomes de haut grade restent à ce jour un cancer pour lequel la prise en charge a peu évolué depuis 20 ans, avec une survie médiane après traitement à ce jour de 24 mois environ. Le développement de nouvelles thérapies est de ce fait critique afin d’améliorer la survie et la rémission des patients. L’objectif de ce projet est de reproduire un modèle de glioblastome orthotopique chez les rongeurs (rats) décrit dans la littérature car il s’agit d’un modèle prédictif reflétant la pathologie cancéreuse. Ce modèle implique le développement d’un glioblastome, puis sa résection, puis un traitement. Il permet donc d’évaluer spécifiquement l’efficacité thérapeutique des composés d’intérêt dans le contexte de la présence de cellules cancéreuses résiduelles suite à une chirurgie de résection de glioblastome, chez l’homme. En d’autres termes, les études couvertes par ce projet permettront, avant les essais cliniques chez l’homme, d’évaluer l’efficacité de composés destinés à traiter les tissus cancéreux résiduels de glioblastome chez l’homme. Une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Pour certaines applications thérapeutiques, de nouveaux modèles précliniques plus prédictifs doivent être établis afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. L’animal représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Les animaux seront irradiés après un court transport (durée totale moins de 30 minutes hors transport, les animaux restant dans leur cage de stabulation). La greffe tumorale intra cérébrale, ainsi que sa résection seront des procédures chirurgicales d’une trentaine de minutes environ et seront réalisées sous anesthésie et analgésie pré-, per et post-opératoire. Les animaux vigiles et sous contention pourront recevoir des traitements par voies intra-péritonéale (IP), intra-veineuse (IV), sous-cutanée (SC), (1 minute) Des prélèvements sanguins pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. Si un suivi par une technique d’imagerie est envisagé, il sera réalisé sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure. Au moment de l’euthanasie, lorsque le prélèvement des organes nécessitera un flush préalable par perfusion afin d’obtenir des organes avec des vaisseaux sanguins ne contenant pas de sang, les animaux seront profondément anesthésiés et analgésiés.

Impact sur les animaux

Pour ces modèles la greffe de la tumeur (implantation de fragment) est réalisée dans le cortex cérébral pariétal. Compte tenu de l’analgésie, la douleur opératoire et post-opératoire sera de niveau modéré. L’évolution du volume tumoral, la résection et le traitement topique pourront entrainer des troubles tels que des troubles neurologiques (diminution de la mobilité, convulsions, incapacité de boire ou manger, apathie etc) ou une perte de poids qui constitueront un point limite. Les animaux recevront des traitements par injection. Ces actes entraineront un stress léger. Dans le cas des administrations par injection, la douleur sera limitée à celle de la piqure d’une aiguille. Le jour du démarrage de l’étude, les animaux seront répartis en groupes homogènes et donc potentiellement mis en présence de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger pendant 1 à 2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation. Les procédures d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Dans certain cas, les animaux seront irradiés, nécessitant un transport, ce qui pourrait engendrer un léger stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure. Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Le nombre minimal d’animaux surnuméraires sera utilisé afin de plus facilement constituer des groupes homogènes au moment de l’initiation de l’étude. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.

Raffinement

La greffe de tumeur sera réalisée de façon aseptique sous anesthésie et analgésie pour limiter la douleur induite par cette chirurgie. Les animaux bénéficieront d’un suivi et de soins post-opératoires pour limiter la douleur et le stress (réveil sous tapis chauffant pour limiter l’hypothermie, poursuite de l’analgésie tant que nécessaire). La chirurgie de la tumeur sera réalisée dans les mêmes conditions que la greffe. La réorganisation liée à la randomisation induira un stress léger, limité par l’enrichissement de l’environnement des animaux. Le suivi des poids des animaux induira un stress léger. Les injections seront réalisées sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (administrations intraveineux dans certains cas, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible spécifiquement l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Une système d’alerte (grille de scoring) est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Le scoring et la pesée sont réalisés quotidiennement à partir du jour de l’implantation de la tumeur. Une grille de scoring clinique servira à évaluer de manière complète l’état des animaux Pour le raffinement, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives (imagerie) chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum). Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter la greffe des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets de la chirurgie, les effets secondaires des composés à tester et les effets du développement tumoral

Pour comprendre comment les perturbateurs endocriniens contribuent au déclin des amphibiens, 4 640 xénopes tropicalis vont être utilisés sur trois générations, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. 1 500 têtards sont exposés pendant une dizaine de mois, jusqu'à l'âge adulte, à un mélange de six polluants dont le tributylétain et le triclosan, et 1 500 autres forment le groupe témoin. Pour les tests de glycémie, 400 xénopes sont piqués au doigt toutes les heures pendant six heures, 200 sont tués trente minutes après une injection de glucose, et les mâles stimulés aux hormones pour la reproduction sont tués deux heures après la seconde injection. Le porteur écrit que l'exposition peut entraîner "une surmortalité ou des malformations", et qu'"il n'est pas possible d'évaluer le degré de souffrance" qu'elle engendre. Les données doivent selon lui aider les décideurs à protéger les amphibiens sauvages, et chaque xénope des trois générations est mis à mort.

Objectifs

Des études récentes suggèrent que les effets métaboliques transgénérationnels induits par les perturbateurs endocriniens (PE) sont des facteurs impliqués dans le déclin des populations d’amphibiens en altérant leur capacité à se reproduire. Cependant, plusieurs questions se posent : Comment les PE agissent chez les amphibiens ? Quelles sont leurs effets sur les autres axes endocriniens ? Quel parent transmet l’effet à la descendance ? Quels sont les mécanismes responsables de la transmission des effets sur plusieurs générations ? Ce projet répondra à ces questions en étudiant les effets d’une mixture de 6 PE à concentrations environnementales sur 3 générations de X. tropicalis (F0 directement exposée, F1/F2 non exposées). Les effets seront évalués à chaque génération par l’étude du développement, des effets reproducteurs, thyroïdiens et neuro-développementaux, des perturbations métaboliques et de la transmission des effets entre générations.

Bénéfices attendus

D'un point de vue scientifique, la recherche générera de nouvelles connaissances et technologies dans les domaines de la physiologie animale, de la perturbation endocrinienne, de la transmission des effets au cours des générations et de l'écotoxicologie. Les informations sur l'impact transgénérationnel des PE chez les vertébrés font défaut et les méthodologies d'exposition des animaux à de faibles concentrations de polluants tout au long de leur vie doivent être testées. Ce projet permettra de comprendre quel sexe transmet les effets des PE à la descendance. D'un point global, la protection de la biodiversité et de la santé humaine est essentielle. Les amphibiens représentent une proportion élevée de la diversité des espèces mondiales et sont largement répandus. Plusieurs études ont démontré que plus la biodiversité des amphibiens est grande dans les zones humides, plus l'écosystème est protégé contre les maladies, y compris celles qui touchent les humains. En fournissant des résultats sur les effets transgénérationnels métaboliques des PE, les données obtenues peuvent être appliquées non seulement aux amphibiens mais aussi aux vertébrés supérieurs, y compris les humains. Comme le modèle xénope partage de nombreuses voies métaboliques avec l'homme, il est de fait un bon prédicteur des effets des PE chez l'homme. Toutes les données générées par ce projet multidisciplinaire seront disponibles pour les organisations qui gèrent la biodiversité ou sont impliquées dans l'évaluation des risques chimiques (OFB, ANSES) et aideront les décideurs à protéger la qualité de l'environnement naturel et à améliorer la santé des écosystèmes. Un objectif important est d'identifier des biomarqueurs précoces potentiels de perturbations métaboliques qui seront applicables à différentes espèces d'amphibiens vivant dans des écosystèmes pollués. La recherche proposée soutiendra l'élaboration de politiques et de lignes directrices qui guideront la conservation des populations d'amphibiens et la gestion des PE.

Procédures

Les xénopes de la génération F0 seront exposés à un mélange de perturbateurs endocriniens (tributylétain, di-2-éthylhexyl phthalate, polybromodiphényle éther 47, triclosan, benzo[a]pyrene, et 4,4’-dichlorodiphényldichloroéthylène) du stade têtard (stade 10 de Nieuwkoop et Faber) au stade adulte pendant une génération (F0) (~10 mois). Au total 1500 têtards seront exposés aux PE et 1500 serviront de contrôles. Pour les tests de tolérance au glucose et de résistance à l’insuline, des injections sont effectuées sur animaux vigiles dans le ventre (intrapéritonéale) ou dans les sacs lymphatiques dorsaux. A la suite de ces injections des dosages de glycémie sont effectués par prélèvements digitaux toutes les heures pendant 6 heures (2 lots d’animaux, exposés et témoins, pour la génération F0 et 4 lots pour les générations F1 et F2 soit un total de 400 animaux (80 F0, 160 F1 et 160 F2). Pour les tests de sécrétion d’insuline, les xénopes subissent une injection intrapéritonéale de glucose 1mg par gramme (20 µl de volume) à T0 et sont euthanasiés 30 minutes après. 10 mâles et 10 femelles par condition seront utilisés pour les tests de de sécrétion d’insuline après injection de glucose à chaque génération soit un total de 200 animaux (40 F0, 80 F1 et 80 F2). Pour la fécondation in vitro, les animaux reçoivent deux injections dans les sacs lymphatiques dorsaux d’hCG à 20 heures d’intervalle. A la suite de la seconde injection, les femelles sont laissées tranquilles dans des aquariums pour attendre la ponte qui se fait de manière naturelle environ deux heures après. Les mâles sont euthanasiés deux heures après la deuxième stimulation. Les femelles sont euthanasiées à la fin de la période de ponte. 15 mâles et 15 femelles par condition (traités et non traités pour F0 et les 4 conditions issues des 4 modalités d’accouplement pour F1 et F2) seront utilisés à chaque génération pour les accouplements en vue d’obtenir la génération suivante. Le nombre total d’animaux sera de 300 (60 pour F0, 120 pour F1 et 120 pour F2).

Impact sur les animaux

Les concentrations utilisées sont celles des normes de qualité environnementales. Elles ne sont pas senser induire de souffrance chez les animaux. Il se peut cependant que les effets des PE puissent entrainer une surmortalité ou des malformations mais il n’est pas possible d’évaluer le degré de souffrance engendré par l’exposition. Les prises de sang digitales pour les tests de tolérances au glucose ou de résistance à l’insuline et les injections intrapéritonéales de glucose ou d’insuline dans les sacs lymphatiques sont susceptibles d’entrainer des douleurs légères. Au stade têtard des déformations de la colonne vertébrale sont décrite comme pouvant survenir lors d’un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements d’organes ou des tests métaboliques.

Remplacement

Les manipulations réalisées sur ces animaux ne peuvent pas être substituées par des manipulations sur cultures cellulaires car les effets observés sont le jeu d’actions et d’interactions entre différents organes et systèmes. Le modèle xénope pour évaluer l’effet des PE en milieu aquatique permet le « Remplacement » du modèle rongeur classiquement utilisé en toxicologie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal pour ne pas mettre en péril les manipulations et avoir des résultats significatifs statistiquement (plan d’expérience élaboré avec des statisticiens). Chaque animal est utilisé pour plusieurs types de manipulation et l’utilisation des différents lots n’est justifié que par la petite taille des organes et des volumes possibles de prélèvements sanguins qui limitent le nombre de manipulations possible sur un même échantillon.

Raffinement

Les protocoles d’exposition mis en œuvre permettent de mimer les conditions du milieu (exposition par l’eau) pour confirmer et transposer les résultats obtenus à court terme sur le terrain. Ce genre d’exposition n’entraine pas de souffrance chez l’animal contrairement à l’injection de polluant par voie intrapéritonéale classiquement utilisée en toxicologie. Des points limites ont été définis et adaptés au modèle xénope

Choix des espèces

Le choix de l’espèce xénope tropicalis est justifiée par deux raisons majeures : 1) son temps de génération court pour un amphibien (~10 mois du stade œuf à adulte mature) permet l’étude de l’effet des polluants sur plusieurs générations et 2) c’est une espèce dont le génome est entièrement séquencé et diploïde permettant ainsi des études transcriptomiques ou épigénétiques. C’est un modèle dont nous maitrisons l’élevage au laboratoire (certificat de capacité obtenu) et pour lequel nous avons déjà réalisé des études multigénérationnelles. Les animaux seront utilisés du stade gastrula au stade adulte mature sexuellement. Les PE agissent sur de nombreuses cibles au stade larvaire et durant tout le cycle de développement jusqu'au stade adulte mature sexuellement. Il est donc important de regarder les impacts de ces polluants à différents stades du développement des animaux.