Procédures sévères

2 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une cinquantaine en gravité sévère. Des femelles sont infectées par Escherichia coli au moyen d'un cathéter posé dans la vessie sous anesthésie, puis reçoivent des antibiotiques en sous-cutané toutes les deux à douze heures, avant d'être tuées pour prélever vessie et reins. Le porteur indique que la plupart ne montrent pas de signe extérieur mais que des souches virulentes peuvent provoquer perte de poids et mortalité, une phase préliminaire de test de nouvelles souches pouvant entraîner une mortalité importante. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi des bactéries persistent malgré un traitement jugé efficace en laboratoire, un modèle que le porteur qualifie d'"indispensable".

Objectifs

Les infections urinaires sont parmi les infections bactériennes les plus fréquentes chez l’Homme (150 millions d’épisodes par an dans le monde). La bactérie responsable dans 80% des cas est nommée Escherichia coli (E.coli). On distingue les infections urinaires hautes qui touchent les reins (pyélonéphrite), provoquent de la fièvre voire une infection sévère pouvant nécessiter une hospitalisation, des infections urinaires basses ne touchant que la vessie (cystite). Les cystites sont extrêmement communes chez la femme puisqu’on considère qu’une femme sur deux souffrira d’une cystite au cours de sa vie. Dans un tiers des cas, ces cystites récidivent malgré un traitement antibiotique adapté et cela est à l’origine d’une altération importante de la qualité de vie des femmes atteintes. De plus, ces infections sont à l’origine d’une consommation importante d’antibiotiques, facteur favorisant l’apparition de bactéries multi résistantes (résistantes à de nombreux voire à tous les antibiotiques disponibles). La lutte contre la résistance aux antibiotiques un problème majeur de santé publique est l’un des volets prioritaires définis par l’Organisation Mondiale de la Santé. Une meilleure compréhension des infections urinaires est donc indispensable pour l’amélioration de la qualité de vie de millions de femmes autant que pour la diminution de la consommation d’antibiotiques au sein de la population générale. La résistance aux antibiotiques n’est pas la seule responsable du caractère récidivant des infections urinaires et des données expérimentales tendent à montrer que des bactéries survivent dans la vessie malgré le traitement antibiotique. Ces bactéries sont dormantes, comme en hibernation et tolèrent la présence de l’antibiotique sans être tuées. L’objectif de notre projet est de comprendre la discordance entre la non-réponse aux antibiotiques (persistance de bactéries dans les vessies) et la supposée sensibilité à l’antibiotique dans les tests habituellement réalisés en laboratoire de ville (examen bactériologique des urines). Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d’infection urinaire à E.coli de souris provoquant une infection de la vessie (cystite) et des reins (pyélonéphrite).

Bénéfices attendus

La discordance entre les tests habituellement réalisés en laboratoire de ville et l’évolution des symptômes de la maladie est fréquente dans les infections urinaires. La récidive de ces infections pose un problème d’altération de la qualité de vie des malades et de santé publique par la consommation d’antibiotiques qu’elle engendre. Cependant, les causes d’échec du traitement ne sont pas clairement identifiés et probablement multifactoriels. Nous pensons que l’analyse directe de ce phénomène chez l’animal nous permettra d’améliorer le traitement en l’adaptant au mieux au comportement de la bactérie dans le site infecté.

Procédures

-L’infection est réalisée en plaçant un cathéter (une petite sonde) au niveau de l’orifice par lequel s’écoulent les urines de la souris et jusque dans la vessie et en injectant doucement 50 microlitres de bactéries qui vont infecter la vessie et remonter jusque dans les reins . Ce geste est réalisé sous anesthésie générale. Cette étape d'infection dure environ 3 minutes par animal. -Le traitement antibiotique est réalisé par des injections sous cutanées d’antibiotiques sur un animal vigile (durée du geste d'environ 15 secondes). La fréquence (toutes les 2 à 12 heures) dépend de l’antibiotique ainsi que la durée du traitement (24 à 48 heures). -Les urines sont recueillies au cours d’une miction spontanée ou par pression abdominale douce. -La vessie et les reins sont ensuite prélevés stérilement après euthanasie. -La durée de l'infection est variable de 60 heures à 17 jours.

Impact sur les animaux

Les souris ne présentent pas de signe extérieur d’infection dans l'immense majorité des cas. Leur comportement est normal. Elles urinent de manière normale sans signe extérieur évoquant de la douleur au moment de la miction. Dans d'exceptionnels cas, si la souche utilisée est particulièrement virulente (agressive), les souris peuvent présenter des signes d'infection : diminution de la mobilité, perte de poids. La mortalité des suites de l’infection urinaire est exceptionnelle dans ce modèle de l’ordre de 3%. Une étude préliminaire sera réalisée sur 48 heures si une nouvelle souche est utilisée dont l'agressivité n'est pas connue. Elle va permettre de ne pas utiliser des souches trop agressives dans la suite du projet, mais dans cette procédure une mortalité importante pourrait être observée. Les souches agressives ne seront pas utilsées par la suite. Les produits administrés ne sont pas douloureux. Les administrations répétées d’antibiotique pourront avoir un impact sur le bien-être animal et provoquer un stress auquel nous serons particulièrement attentifs.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de prélever stérilement leurs organes (vessie, reins) après la mort pour analyser les bactéries qui s'y trouvent.

Remplacement

L’accessibilité aux organes touchés par l’infection urinaire (reins et vessies) en dehors des urines reste très limitée chez l’Homme. Or l’étude simple des urines ne permet pas d’expliquer la récidive de l’infection urinaire. L’analyse des bactéries dans les reins et les vessies est donc nécessaire et impossible sans modèle animal. L’étude des bactéries et de la réponse à l’antibiotique dans les tubes à essais est trop simpliste et ne rend pas compte des facteurs multiples qui sont impliqués dans un organisme entier.

Réduction

Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Les contrôles ayant été infectés par la même souche seront comptabilisés dans les analyses des différentes procédures ce qui pourra permettre de diminuer le nombre de contrôles dans une procédure ultérieure. De nombreuses analyses dans les tubes à essais seront réalisées en amont pour choisir les bactéries, les antibiotiques et les conditions les plus pertinentes afin de réduire les animaux utilisés. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentataion. Un suivi quotidien sera réalisé. L’infection urinaire est réalisée sur une souris anesthésiée. Les souris seront euthanasiées si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie quotidiennement.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection urinaire chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Les souris utilisées seront des souris femelles car les infections urinaires sont plus fréquentes chez la femme. Ces souris seront des souris adultes de 8 semaines car l'infection urinaire survient le plus fréquemment chez la femme adulte jeune.

688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, une majorité en gravité sévère. On leur injecte des cellules de mélanome dans le cœur sous anesthésie, puis des traitements en intrapéritonéal tous les deux jours pendant quatre à huit semaines, pour étudier les récepteurs impliqués dans les métastases cérébrales. Le porteur indique que les métastases, notamment au cerveau, peuvent être invalidantes et que les animaux sont tués une fois les tumeurs développées. Sur le remplacement, il affirme que seul un animal vivant et "entier" permet d'étudier ce processus et conclut à la "nécessité" du modèle animal.

Objectifs

Le mélanome est une tumeur qui se développe à partir de cellules épidermiques appelées mélanocytes. Bien qu’il ne représente qu’environ 1% des cancers cutanés, le mélanome est responsable de 75% des décès dus aux cancers de la peau. L’agressivité du mélanome est liée à son très fort potentiel métastatique et à la capacité de ces cellules cancéreuses à proliférer dans les organes vitaux, notamment le cerveau. Il est donc crucial de comprendre quels sont les mécanismes qui gouvernent le développement des métastases, pour envisager des traitements qui bloqueront ou ralentiront la progression tumorale dans les organes vitaux. Dans le but d’étudier ces mécanismes, nous avons mis en place une méthode qui nous a permis d’identifier des gènes impliqués dans le développement des métastases pulmonaires et nous souhaitons maintenant étendre cette méthode aux métastases intracrâniennes. Les mélanomes utilisent des signaux produits localement dans chaque organe pour stimuler leur croissance. Empêcher les mélanomes de percevoir ces signaux devrait en théorie prévenir leur croissance. Dans le but de tester cette hypothèse, nous avons mis au point un système qui permet d’éteindre individuellement l’expression d’une sélection de gènes impliqués dans la réception des signaux stimulant la croissance des mélanomes. Grace à cette méthode, nous avons pu déterminer quels sont les récepteurs qui sont responsables de la croissance des mélanomes dans les poumons. Nous souhaitons maintenant étendre notre étude, au cerveau car le mélanome est le type de cancer qui conduit le plus fréquemment à des métastases dans cet organe. Nous avons choisi le modèle souris pour ce projet car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome ainsi que la réponse anti-tumorale. Le modèle cellulaire choisi (B16F10) récapitule fidèlement l'évolution du mélanome retrouvée chez l'homme avec les mêmes mutations et le même processus métastasique chez les souris C57BL6 .Pour respecter les exigences de raffinement, les animaux sont observés tous les jours. Si un signe de douleur est observé (prostration, agressivité), un anti-douleur pourra être administré et un enrichisement supplémentaire ou différent pourra être ajouté dans la cage. Pour réduire le nombre d'animaux, une étude statistique préliminaire a été réalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier précisément quels récepteurs sont utilisés lors de la colonisation spécifique de la cavité intracrânienne. Cela permet donc d’envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques pour limiter la progression tumorale chez les patients ayant un mélanome avancé mais n’ayant pas de métastases détectables au moment de l’exérèse de la tumeur primaire. En effet, chez la plupart de ces patients, les métastases ne sont détectables que plusieurs années après la chirurgie. Outre les retombées médicales envisageables, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de la progression tumorale des mélanomes cutanés.

Procédures

Injection unique de cellules en intracardiaque par souris sous anesthésie, durée maximale 15 min. Injections intrapéritonéales : 1 fois tous les deux jours en intrapéritonéal après anesthésie locale (Lidocaïne) pendant 4 à 8 semaines, durée 1 minute.

Impact sur les animaux

L'apparition de métastases notamment au cerveau peut être invalidante. Les tumeurs implantées en sous-cutanées peuvent provoquer une gêne modérée. L'injection unique de cellule dans le oeur sous anesthésie provoque peu de nuisances. Les injections répétées en intrapéritonéale provoque une nuisance du fait de la contenttion répétée pendant une durée d'un à deux mois.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures car ils développeront des tumeurs et des métastases.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité le développement des métastases du mélanome dans les organes distants. Enfin, notre projet offre une opportunité thérapeutique qui justifie la nécessité du modèle animal pour valider les expériences in vivo avant leur application chez l'homme.

Réduction

Concernant l'analyse des critères d'évaluation de l'efficicacité anti-tumorale, les nombres d'animaux ont été déterminés par des calculs statistiques (puissance). Afin de limiter le nombre d'animaux utilisé, les doses d'antagonistes seront calibrées en fonction des données de la littérature et des résultats obtenus in vitro. De même, une période de retrait (avec examen clinique vétérinaire de bonne santé) sera observée entre l'injection de deux doses lors de l'évaluation de la dose maximale tolérée , ce qui permettra l'utilisation continue des animaux, pour en réduire le nombre.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale, les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un traitement adapté. Ils seront pesés tous les 2 jours. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale pour limiter la douleur et le stress des animaux. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. Les animaux seront hébergés en groupe dès leur réveil et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous avons choisi d'utiliser le modèle de la souris pour étudier les mécanismes de développement de métastases de mélanome dans un contexte immunitaire complet, avec un système immunitaire proche de celui de l'être humain. Ce modèle nous a déjà permis d'identifier des gènes impliqués dans la croissance métastique du mélanome dans les poumons et dans le foie. D'une part, le modèle cellulaire choisis récapitule fidèlement l'évolution du mélanome retrouvée chez l'homme avec les mêmes mutations et le même processus métastasique. D'autre part, ces gènes identifiés chez les souris sont totalement conservés chez l'homme. Nous souhaitons utiliser les souris à maturité sexuelle, adulte, de 6 à 7 semaines. En effet le développement de la souris entraine des variations d'expression géniques, hormonaux, des changements physiologiques qui peuvent avoir des effets sur l'expression des GPCR et donc biaiser nos résultats. Nous souhaitons limiter les variations de ceux-ci et pouvoir standardiser au maximum la physiologie des souris. Pas de justification scientifique pour les utiliser à un âge précoce ou tardif.

456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent un gavage unique ou répété cinq jours par semaine pendant six semaines, avant une ponction de sang dans le cœur sous anesthésie puis la mise à mort pour prélever les organes digestifs. Le porteur reconnaît que le gavage peut atteindre la dose létale et provoquer une prostration, et que le gavage chronique peut causer des microlésions de l'œsophage avec saignement. L'objectif est de tester l'innocuité de solvants destinés à améliorer l'absorption orale de médicaments, une démonstration que le porteur qualifie d'"indispensable" avant tout usage.

Objectifs

La voie orale est la plus courante et la plus pratique des voies d'administration des médicaments mais elle impose le passage du médicament au travers de l’intestin. On peut améliorer le passage au niveau de l’intestin de certains médicaments en jouant sur la composition du médicament c’est-à-dire la formulation. Récemment, l’utilisation de solvants eutectiques profonds permet d’y contribuer. Néanmoins, une démonstration sans ambiguïté́ de leur innocuité́ lorsqu’ils sont donnés par voie orale est indispensable. Les études de toxicité réalisées in vitro ont permis d’éliminer certains solvants eutectiques profonds fortement toxiques (Remplacement). Notamment, la toxicité́ de différents solvants eutectiques profonds a été étudiée in vitro sur un modèle cellulaire (toxicité́ aiguë). Ainsi, 14 solvants eutectiques profonds non toxiques ont été sélectionnés et des doses non toxiques pourront ainsi être utilisées pour une administration par voie orale. De plus, certains solvants eutectiques profonds ont une activité́ antibactérienne, il faut donc analyser leur impact sur les bactéries du microbiote intestinal après administration orale. Le projet actuel évaluera la toxicité́ éventuelle des solvants eutectiques profonds sur tous les organes du système digestif et sur le microbiote intestinal. Nous récupérerons également d’autres organes non impliqués directement lors de la digestion (réduction). Nous utiliserons des tunnels en plastique pour éviter les tunnels en carton qui sont grignotés par les souris et qui perturbent l’étude (Raffinement). L’ensemble de ce projet nécessitera l’utilisation de 456 souris.

Bénéfices attendus

Un grand nombre de médicaments ne sont pas commercialisés car leurs conditions d’utilisation sont inadaptées à une utilisation au quotidien. Les formulations développées au cours de ce projet pourraient permettre de surmonter ce problème pour certains médicaments. Cependant, leur toxicité́, en particulier par voie orale n’est à ce jour que très peu documentée. Il est donc essentiel de s’assurer de l’absence de toxicité. A l’issu de ce projet, nous pourrons ainsi éliminer ceux ayant une toxicité́ immédiate et évaluer la toxicité de certaines formulations après administration pendant plusieurs semaines. Suite à ce projet, l’albendazole, un médicament antiparasitaire, sera ajouté dans les formulations non toxiques afin de traiter des infections parasitaires.

Procédures

360 souris seront soumises à un gavage unique dont la durée est estimée à 30 secondes. 96 souris seront soumises à un gavage chronique (5 gavages/semaine pendant 6 semaines), gavage dont la durée est estimée à 30 secondes. Au total, 456 souris seront euthanasiées. 456 souris recevront une dose d’anesthésique permettant un endormissement rapide et profond. Un prélèvement intracardiaque de sang dont la durée est de moins de 1minute est effectué sur les 456 souris lors de l’anesthésie puis les souris sont euthanasiées.

Impact sur les animaux

Toutes les souris sont soumises à un gavage oral. Ce geste est effectué sur des animaux vigiles et peut donc conduire à une situation de stress chez la souris. Des canules de gavage souples sont utilisées pour limiter les douleurs lors du gavage. Lors de l’étude de la toxicité aiguë, il y a la possibilité d’atteindre la dose létale, ce qui peut induire à une souffrance menant à la prostration de l’animal. Lors de l’étude de la toxicité chronique, les gavages seront chroniques, 5 fois / semaine durant 6 semaines et peuvent engendrer des microlésions de l’œsophage entraînant un saignement.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, toutes les souris seront euthanasiées pour permettre le prélèvements des organes.

Remplacement

L’administration de médicaments nécessite l’utilisation de formulations dans notre projet. Les formulations testées dans ce projet ont passé́ les tests d’innocuité́ suite à des études in vitro et in vivo en application cutanée. Cependant, l’innocuité́ de ces formulations doit être prouvée pour une administration par voie orale à court terme et pour les non toxiques sur une utilisation à long terme. L’administration par voie orale de médicaments impliquent leur contact avec le système digestif notamment le microbiote intestinal. Le seul modèle auquel nous pouvons avoir recours pour étudier simultanément les effets sur les différents organes du système digestif est donc l’animal.

Réduction

Notre critère de jugement principal est la modulation des transaminases. Pour mettre en évidence une telle différence, 10 souris par groupe seront nécessaires. Pour ces expériences, les résultats obtenus seront comparés en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris seront 5 par cage. L’enrichissement classique en cellulose, ayant un impact sur le microbiote intestinal, sera remplacé par un enrichissement plastique et la quantité de sciure augmentée pour favoriser l’enfouissement dès l’arrivée des souris dans l’animalerie. Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Néanmoins, le gavage administré aux souris nécessitera leur manipulation par un ingénieur, formé à cette technique. Le jour de l’euthanasie, les souris seront manipulées dans un local diffèrent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes de contact avec la molécule dans le système digestif et les voies d’élimination des xénobiotiques sont proches de ceux observés chez l’Homme. Les souris seront utilisées à l’âge adulte à l’âge de 8 semaines afin de travailler avec des souris dont les systèmes immunitaires et hormonaux sont matures et fonctionnels.

1600 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures à la souffrance déclarée modérée pour 500 et sévère pour 1100, les 500 témoins étant proposés à l'adoption et les 1100 exposés tués. Ils sont plongés 96 heures dans des concentrations croissantes d'un produit chimique industriel pour déterminer la dose qui tue la moitié des poissons, sous jeûne pendant toute la durée. Le porteur décrit des pertes d'équilibre, des difficultés respiratoires, des lésions cutanées et des déformations du corps, la gravité des signes pouvant entraîner la mise à mort. Il indique proposer d'abord au client des méthodes de calcul ou l'usage d'œufs mais juge le poisson juvénile "parfois nécessaire", au service de l'étiquetage réglementaire des produits.

Objectifs

L'évaluation des composés chimiques sur l'environnement (selon réglementations) nécessite des données de toxicité sur le compartiment aquatique. Pour cela, des essais sont à mener sur les différents niveaux de la chaine alimentaire (des algues aux poissons en passant par les zooplanctons). Ce projet a pour but d'évaluer les effets de produits chimiques en déterminant une concentration induisant 50% de mortalité sur les poissons (Danio rerio).

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus grâce à ces essais permettent d'approfondir la connaissance de la toxicité des produits chimiques. Evaluer ainsi la toxicité de ces produits utilisés industriellement permet d'appréhender leurs potentiels impacts environementaux s'ils sont amenés à se retrouver dans le milieu naturel. Cela permet également d'aider le fabricant à s'orienter vers la fabrication de produits moins nocifs pour l'Homme et l'Environnement, et à reformuler leur produit si nécessaire. Ces données peuvent aussi servir à l'étiquetage des produits et à la détermination des pictogrammes de danger.

Procédures

Les poissons seront pêchés à l'épuisette un à un et transférés immédiatement (durée de transfert d'environ 5 secondes) de l'aquarium aux récipients d'essai au début de l'essai, de l'ancien au nouveau récipient d'essai après 24h, 48h, 72h, et du récipient d'essai à l'aquarium de stabulation ou au bain d'euthanasie à la fin de l'essai après 96h (ou au cours de l'essai si l'individu atteint des points limites). Les poissons seront exposés à différentes concentrations du produit à tester (solubilisé dans l'eau) durant les 96h de l'essai.

Impact sur les animaux

S'agissant d'essais écotoxicologiques sur de nouveaux produits, les effets indésirables sont inconnus. Cependant, un essai peut potentiellement entrainer la manifestation de signes cliniques pouvant modifier l'état de santé des poissons, concernant notamment : - certains signes comportementaux (perte d'équilibre, difficulté respiratoire, attitude inhabituelle, et agressivité) - l'aspect physique (perte de poids, décoloration pigmentaire, déformations du corps et lésions cutanées). L'accumulation et/ou la gravité des effets visibles chez un poisson peut entrainer sa mise à mort. La norme demande une mise à jeun des poissons 24 heures avant l'essai et pendant toute la durée de l'essai (96h), entrainant une sensation de faim chez le poisson.

Devenir

Les poissons ayant servis en tant que témoins négatifs sont récupérés et donnés à l'adoption. Les poissons ayant été exposés à des concentrations en produit chimique sont mis à mort à la fin de la procédure. Leur réutilisation engendrerait un potentiel biais dans les futures analyses étant donné qu'ils ont déjà été exposés à des substances chimiques leur ayant laissé de potentielles séquelles au niveau physiologique et cellulaire.

Remplacement

Préalablement à la mise en place de ce projet, il est systématiquement proposé au client des méthodes alternatives : - une alternative basée sur une approche mathématique - une alternative basée sur le regroupement de substances et références croisées - une alternative basée sur l'utilisation des oeufs de poissons. Cette dernière implique l'utilisation des poissons au stade embryonnaire et non juvénile/adulte, mais il est précisé que cela ne permet pas de mettre en évidence les déchets pouvant être plus toxiques que le composé initial, ou encore que les molécules de certains produits ne peuvent pas atteindre l'embryon à cause de la paroi de l'oeuf qui forme une barrière. L'utilisation du modèle Danio rerio est donc parfois nécessaire pour déterminer l'effet de la métabolisation des produits.

Réduction

En amont du projet, une bibliographie sur le produit chimique est effectuée afin de vérifier l'absence de données correspondant au projet et donc d'éviter un essai non indispensable. S'il s'agit d'un produit appartenant à la même famille d'un autre produit précédemment testé, il peut être judiceux de s'affranchir d'un essai préliminaire pour réduire le nombre de poissons utilisés. La ligne directrice préconise : "Un minimum de sept poissons doit être utilisé à chaque concentration expérimentale et dans le(s) témoin(s). Les poissons doivent être répartis au hasard dans les différents groupes de traitement. Aucune répétition inutile des cuves expérimentales n'est requise." Notre projet privilégie un mode opératoire séquentiel : une série de concentrations du produit doit être testé, mais seules les concentrations les plus faibles sont testées dans un premier temps. Si aucun effet n'est observé, alors les concentrations plus élevées sont testées. Cela permet d'éviter d'exposer inutilement des poissons à des concentrations trop élevées. Selon la toxicité des produits testés, différents scénarii d'analyses sont possibles. Dans le cas où 50% des produits testés ne présentent pas de toxicité, alors, sur l'ensemble des essais réalisés, nous observerons une réduction d'effectif de 27%. Les résultats sont ensuite analysés statistiquement grâce à des modèles permettant l'obtention d'une valeur indiquant la concentration en produit qui engendre la mort de 50% des poissons. Il se peut que les produits à tester ne soient pas solubles, or, la tendance actuelle lors de la réalisation des essais d'écotoxicologie est de s'affranchir de l'utilisation de solvant en optimisant les méthodologies de mise en solution d'un composé peu soluble . Par conséquent, le nombre de poissons utilisés lors d'un projet sera réduit.

Raffinement

Les béchers accueillant les poissons lors de la procédure sont entourés d'un poster reproduisant le milieu naturel des poissons. Le milieu dans lequel se trouvent les poissons est renouvellé tous les jours. La température, l'oxygène dissous et le pH sont contrôlés quotidiennement. Tout au long d'un essai, l'apparition de points limites précoces est surveillée. L'observation et l'enregistrement de ces signes doit se faire au minimum deux fois dans les premières 24 heures avec au moins 3 heures d'intervalle entre deux observations (exemple : 2h, 5h, et 24h après le début de l'exposition). Cette observation doit ensuite se faire deux fois par jour (matin et soir de préférence) et les points limites sont évalués dans la grille de score. Les poissons atteignant un score témoignant d'une douleur, d'une souffrance ou d'une angoisse intense sont retirés de l'essai et mis à mort . Les poissons non exposés (témoins) sont récupérés et placés dans un aquarium de stabulation afin d'être conservés jusqu'à leur adoption.

Choix des espèces

Les poissons sont des organismes qui intègrent les données de l'environnement dans lequel ils évoluent car ils se situent en haut de la chaine trophique et représentent un bon indicateur de leur environnement. L'utilisation des poissons permet de mettre en évidence la potentielle toxicité des déchets qu'ils rejettent après avoir dégradé le produit initalement présent dans le milieu. Cet impact ne peut pas être mis en évidence par les oeufs ou les larves de poissons qui ne dégradent pas ou moins les produits. Les poissons utilisés sont de l'espèce Danio rerio comme préconisé par la ligne directrice suivie lors de cette procédure. Leur taille varie entre 1 et 2 cm de longueur (juvéniles) pour respecter les critères de taille indiqués. Le Danio rerio est un modèle scientifique très étudié et utilisé, de part sa facilité d'élevage, d'entretien, et de reproduction, avec des conditions environnemenales de bien-être peu exigeantes et facile à mettre en place. Selon la norme OCDE les poissons utilisés seront des juvéniles de 1 à 2 cm (poissons n'ayant pas atteint la maturité sexuelle).

380 souris, dont de très jeunes non sevrées, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures à la souffrance déclarée modérée pour 30 et sévère pour 350. Elles sont chauffées près d'une source de chaleur jusqu'à provoquer des convulsions fébriles, jusqu'à quatre fois pour les modèles génétiques, avec administration de candidats médicaments et tests moteurs. Le porteur indique qu'une crise tonique, jugée possible, entraîne la mise à mort, et signale des effets d'hypothermie et de sédation liés aux produits. Il décrit des modèles murins des syndromes de Dravet et d'Angelman et présente le recours à l'animal comme "indispensable" pour démontrer l'efficacité avant mise sur le marché.

Objectifs

L'objectif du projet consiste à évaluer de nouveaux candidats médicaments pour inhiber les crises fébriles chez le jeune enfant. Les convulsions fébriles sont des contractions musculaires involontaires, saccadées, observées lors d'un épisode de fièvre, le plus souvent dû à une infection virale. Elles peuvent survenir chez les nourrissons ou les enfants (jusqu'à l'âge de 5 ans) en bonne santé (n'ayant pas de maladie neurologique connue ou d'infection cérébrale sévère). Ces crises peuvent aussi parfois être le premier signe de certains troubles neurologiques. Par exemple, le syndrome de Dravet est une épilepsie grave de l’enfant, d’origine génétique, qui débute avant l’âge d’un an par des crises convulsives souvent déclenchées par de la fièvre. Par la suite, les enfants ont des crises d’épilepsie de divers types, un retard de développement, des difficultés de langage, une mauvaise coordination des mouvements et des troubles du comportement. Les convulsions fébriles peuvent également être les premières manifestations épileptiques du syndrome d'Angelman, caractérisé par une déficience mentale, une apparence et un comportement caractéristiques, et souvent accompagnés d'autres signes tels qu'une épilepsie de gravité variable. Un modèle d'étude des convulsions fébriles chez la souris sera développé dans ce projet, permettant de tester dessus des candidats traitements pour ces crises.

Bénéfices attendus

Les modèles de crises fébriles permettent de tester l’efficacité de nouveaux médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour traiter les convulsions fébriles complexes qui nécessitent un traitement préventif, une fois le risque de récidive identifié chez le nourisson (il est estimé qu'environ 30% des nourrissons ayant présenté un épisode de crise fébrile récidivera). Ces traitements peuvent également être développés pour soulager les symptômes associés aux différents syndromes comprenant des crises épileptiques, et pour lesquels aucun traitement n'existe à l'heure actuelle (la prise en charge actuelle incluant, en fonction des besoins, à la fois une rééducation psychomotrice, cognitive, orthophonique, comportementale, mais aussi des traitements médicamenteux contre les troubles du sommeil, les crises épileptiques, voire des tranquilisants).

Procédures

L'hyperthermie sera induite en plaçant l'animal proche d'une source de chaleur (temps estimé maximum 35 minutes) pour élever sa température corprorelle jusqu'à un seuil maximum tolérable. La température de ces animaux sera suivie tout au long du test et le test sera arrêté dès l'atteinte du seuil ou tout signe decrise fébrile. Dans le cadre de procédures modélisant la crise fébrile du nourrisson, ce test ne sera réalisé qu'une fois. Dans le cadre de modèles de syndromes génétiques, ce test pourra être réalisé 2 à 4 fois en veillant à la bonne récupération des animaux entre chaque session. Dans les modèles de syndromes complexes, des tests comportementaux pourront être envisagés pour évaluer les potentiels déficits moteurs (durée de quelques minutes à maximum 40 minutes, fréquence maximum 1 fois par semaine). Des prélèvements sanguins (en cours d'étude : prélèvements sub-mandibulaires, 1 fois/semaine maximum, durée du prélèvement : quelques secondes) peuvent également être envisagés pour compléter les données in vivo par des données biochimiques. Concernant l'administration des candidats traitements, les administrations par bolus rapide (voies orale, intraveineuse, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire, intracranienne) durent quelques secondes; l'administration par perfusion lente (intraveineuse) peut durer quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours, en fonction des spécificités du candidat traitement. Les administrations seront réalisées selon les bonnes pratiques vétérinaires.

Impact sur les animaux

Le protocole décrit dans ce projet peut conduire à l'apparition de convulsions. Dès l'observation de tout signe de convulsion, l'animal est retiré de la source de chaleur pour stopper la crise et tout le nécessaire sera mis en œuvre pour faire revenir la température corporelle de l'animal à sa normale. Bien qu'inattendue, l'apparition de crise tonique demeure possible. Dans ce cas, l'animal sera euthanasié. De par notre expérience, il n'est pas prévu de rejet par la mère suite aux administrations des animaux non-sevrés. Les principaux effets indésirables relatifs aux administrations de candidats médicaments sont une potentielle hypothermie et des effets sédatifs. Ils seront monitorés au cours de l'étude. Dans le cas de modèles de syndromes complexes, les animaux seront surveillés pour déterminer s'ils présentent des fonctions motrices altérées. L'évaluation de l'activité locomotrice n'induit pas de douleur et reste un test peu stressant pour les souris (stress principalement lié à la nouveauté ; dans le cas de l’évaluation de la coordination motrice, la hauteur du dispositif est suffisamment basse pour éviter toute blessure en cas de chute).

Devenir

Tous les animaux auront été soumis à une hyperthermie susceptible d'induire des convulsions. Ces procédures ne sont pas compatibles avec un maintien en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Dans le cadre du développement pharmaceutique, ce projet fait suite à l'évaluation de nouveaux candidats médicaments sur des modèles in silico et ex-vivo, exemple de modèles de cultures primaires de neurones ou de tranches cérébrales. Ces modèles sont utilisés afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (crises induites par hyperthermie et modèles animaux de syndromes génétiques) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Dans la procédure 2 (tests de candidats médicaments), le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement par rapport à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison). Les tests statistiques seront adaptés en fonction de la normalité des données obtenues. Pour les données quantitatives (e.g. température) il est prévu d'appliquer des tests paramétriques (e.g. : Student, ANOVA...) ou non-paramétrique (Mann-Whitney) et pour les données qualitatives (fréquence de réponse), le test exact de Fisher sera utilisé. Aussi, lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminaux) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer des données sur la cinétique d'action de la molécule testée sans utiliser un plus grand nombre d'animaux.

Raffinement

Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites spécifiques à ce projet permettant d’euthanasier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général et un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et fréquemment manipulés par des techniciens formés et attentifs. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Dans ce cadre, plusieurs méthodes seront testées pour la mesure de température corporelle (transmission sans contact via puce RFID ou prise de température rectale). Si les mesures par une puce RFID ne sont pas satisfaisantes, une sonde rectale sera utilisée, avec utilisation de vaseline pour limiter la douleur. Les animaux seront retirés de la source chaude dès l'apparition de convulsions ou que le seuil défini de température corporelle est atteint. S'ils doivent être gardés (modèles de syndromes complexes), les animaux seront surveillés et réhydratés avec une injection sous-cutanée ou intrapéritonéale de sérum physiologique à la fin du test. Si l'état des animuax le nécessite, des injections supplémentaires de sérum physiologique peuvent être réalisées si ces derniers ne s'hydratent pas suffisamment. Les animaux seront euthanasiés si ces derniers n'ont pas récupéré après quelques minutes (maximum 1 minute après bain tiède pour l'arrêt des convulsions, maximum 30 minutes pour retrouver un état comportemental normal). Pour les animaux n'ayant pas convulsé, ces derniers pourront être gardés et réhydratés, juste après le test (par accès au biberon ou injection).

Choix des espèces

Les substances anti-épileptiques mises sur le marché ont été découvertes en utilisant des modèles pré-cliniques chez le rongeur. Les études de crises fébriles sont effectuées chez la souris car ce modèle est translationnel et permet l'étude de modèles animaux de syndrome d'origine génétique observés chez l'Homme (e.g. modèles murins présentant une mutation du gène Scn1a pour modéliser le syndrome de Dravet, ou modèle murin présentant une mutation du gène ube3a pour le syndrome d'Angelman...). Les souris sont testés quelques jours après leur naissance jusqu'à 8 semaines. Les crises fébriles sont observées chez le nouveau-né, des souris jeunes sont donc utilisées pour ce type de protocole, comme décrit dans la bibliographie scientifique.

26930 animaux non-humains, dont 16500 souris et 10000 cobayes, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures à la souffrance déclarée modérée à sévère, 2500 souris étant classées en gravité sévère. Ils servent à former et requalifier des techniciens de contrôle qualité aux prélèvements sanguins, aux injections par de multiples voies et aux mises à mort par dislocation cervicale ou section des carotides. Le porteur affirme n'attendre aucun signe clinique et indique commencer par des mannequins en plastique et des cadavres avant de recourir aux animaux vivants. Il présente cette formation comme "indispensable" et "incontournable", liée au contrôle qualité des vaccins imposé par les pharmacopées.

Objectifs

Le projet consiste en la formation du personnel aux techniques standards de prélèvements de sang, d’injections de substances et d’euthanasie chez la souris/souriceaux, le rat/raton, le cobaye, le lapin, et le furet. La formation concerne tout nouveau personnel, toute personne ayant à réaliser une nouvelle technique, toute personne ayant à réaliser la requalification périodique et toute personne nécessitant une nouvelle formation suite à une déqualification. D’autre part une absence de plus de 6 mois d’un technicien nécessite la réévaluation par son manager du besoin de requalification aux gestes techniques, une absence de plus de 12 mois rend obligatoire sa requalification complète. Le programme de formation est établi en fonction de la mission de chacun au sein du Contrôle Qualité et de son niveau d’expérience et de technicité. Le programme est développé en lien avec les responsables d’équipes, les responsables de la mise en œuvre du projet, le responsable de la formation et les vétérinaires.

Bénéfices attendus

La formation du personnel est nécessaire et obligatoire dans le cadre de nos activités de contrôle qualité des vaccins qui requièrent des tests in vivo, imposés par les différentes pharmacopées. Cette formation ne peut pas être effectuée sans le recours à l’animal de laboratoire. Ce projet a pour objectif d’encadrer la formation des nouveaux techniciens animaliers et les réévaluations régulières des personnes déjà formées aux manipulations « in vivo » standards sur les souris/souriceaux, les rats/ratons, les cobayes, les lapins, et les furets, sous la responsabilité de manipulateurs référents expérimentés (système de compagnonnage). Ce système de formation permet aux personnes en charge des gestes techniques d’être parfaitement formées et compétentes et de travailler de façon harmonisée.

Procédures

Le projet consiste en la formation du personnel aux techniques standards de prélèvements de sang et d’injections de substances chez la souris/souriceaux, le rat/raton, le cobaye, le lapin, et le furet. Le programme de formation d’un collaborateur est établi de façon individuelle en tenant compte de sa mission ainsi que de son niveau d’expérience et sa technicité. Les techniques comprises dans ce projet sont les suivantes : - Injections intrapéritonéales, sous-cutanée, intradermique, intramusculaire, intraveineuse, intracardiaque (sous anesthésie), intracérébrales (sous anesthésie), - Prélèvements sanguins à la veine submandibulaire, à la veine jugulaire, à la veine saphène, à la veine marginale de l’oreille, à la veine caudale latérale, par ponction intracardiaque (sous anesthésie). - Méthodes liées à la mise à mort des animaux telles que la dislocation cervicale et la section des carotides et jugulaires sous anesthésie chez le rat et la souris. Les animaux peuvent être réutilisés pour une procédure du présent projet uniquement si la procédure initiale était de degré au maximum modéré et après évaluation par un vétérinaire et avec un maximum d’une seule réutilisation par animal. Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés pour ce projet, un même animal peut servir à l’acquisition de plusieurs gestes, par exemple : anesthésie par injection intramusculaire, puis injection intrapéritonéale d’un produit non irritant, prélèvement de sang par ponction cardiaque puis euthanasie par injection intracardiaque. Cette rationalisation se fait en concertation avec le vétérinaire.

Impact sur les animaux

Aucun signe clinique n’est attendu dans le cadre de ce projet. Dans le cas où un animal présenterait des signes cliniques suite à une mauvaise manipulation, l’animal sera immédiatement pris en charge par un vétérinaire. Les contraintes appliquées sur les animaux dépendent de chacun des gestes techniques appliqués. En particulier, chacun des gestes techniques décrits nécessite une contention (d’une durée inférieure à 30 secondes) suivie d’une effraction cutanée (afin de réaliser une injection ou un prélèvement). Le degré de gravité des procédures est évalué de léger à sévère selon les critères suivants : - LEGER : Contention et effraction cutanée évaluée légère pour prélèvement ou injection sur animal vigil ou anesthésié par une personne en formation => les gestes concernés sont le prélèvement à la veine submandibulaire sur souris (avec anesthésie), et les injections intra-musculaires, intra-péritonéales, intraveineuses (avec anesthésie pour la veine submandibulaire, la saphène, la jugulaire et veine cave crâniale et sans anesthésie pour la veine caudale), intradermiques et intranasales sur toutes les espèces - MODERE : Contention et effraction cutanée évaluée modérée pour prélèvement ou injection par une personne en formation => les gestes concernés sont la ponction cardiaque, la section des carotides et jugulaires, l’intracérébrale sous anesthésie et la dislocation cervicale pour souris sans anesthésie - SEVERE : Contention et effraction cutanée évaluée modérée pour prélèvement ou injection par une personne en formation => le seul geste concerné est l’injection intra-cérébrale sans anesthésie sur souriceaux.

Devenir

A l’issue des procédures décrites dans le projet, les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

La formation théorique à l’aide de photos ou vidéos est toujours réalisée en première intention. Pour certaines espèces, des modèles d’imitation en plastique sont utilisés pour les premières étapes de formation pratique aux injections. L’usage de cadavres est possible lorsque ceux-ci sont disponibles et afin d’appréhender le geste pour une personne novice (formation initiale au geste). Lorsqu’il est incontournable d’utiliser des animaux vivants, le nombre est minimisé au maximum afin de garantir la maîtrise du geste par le technicien. Tous les gestes techniques ont été revus et sont approuvés par la SBEA. Un travail de veille (via la bibliographie et la participation aux congrès) est réalisé afin de faire évoluer les techniques et intégrer des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dépend : - du nombre de personnes à former, - de l’expérience préalable de ces personnes, - du nombre de techniques à apprendre, - de leur difficulté technique, - du nombre de techniques réalisables sur un même animal et sur la base des expériences terrain comme étant le minimum pour s’assurer que la personne formée maîtrise les gestes techniques. Dans la mesure du possible, des animaux supplémentaires issus d’autres procédures ou des animaux classées en catégories légère ou modérée pourront être utilisés pour ces formations. De plus, dès que possible, la réévaluation ou la qualification aux gestes techniques s’effectue directement lors du test afin d’éviter de commander des animaux spécifiquement pour la formation. Pour les souris et les cobayes : Un strict minimum de 15 animaux est nécessaire afin de maîtriser le geste et assurer sa reproductibilité pour les tests de contrôle qualité pour une personne en formation initiale. Un minimum de 5 animaux est nécessaire afin d’assurer la requalification du personnel à la fréquence définie par le laboratoire (tous les ans à tous les 3 ans en fonction des techniques).

Raffinement

Des moyens sont entrepris au niveau du projet ou des procédures pour réduire le stress et le niveau de souffrance : anesthésies raisonnées pour certaines techniques, choix des techniques en fonction de l’avantage expérimental procuré par rapport à la souffrance occasionnée. Un programme d’enrichissement est en place pour toutes les espèces. De plus, des techniques additionnelles telles que l’imagerie permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés via la visualisation quasi simultanée du site d’injection.

Choix des espèces

Il est indispensable d’utiliser des animaux vivants afin de se former (et maintenir ces qualifications) aux techniques d’injections et de prélèvements et ainsi, pouvoir s’assurer qu’aucun impact clinique et ou scientifique n’est constaté suite à la réalisation des gestes techniques. Certains gestes peuvent être pratiqués sur des animaux morts après (euthanasie des animaux de fin de test) ou sur des modèles d’imitation en matière plastique. Les formations sont indispensables pour s’assurer de la compétence technique et de la connaissance des bonnes pratiques des expérimentateurs avant de réaliser les tests en autonomie. Les études peuvent comporter un grand nombre d’animaux et il est indispensable d’utiliser des animaux en formation pour vérifier la maitrise et la répétabilité du geste afin d’éviter une mauvaise technicité qui conduirait à une interruption ou une répétition des tests sur animaux. D’autre part une absence de plus de 6 mois d’un technicien nécessite la réévaluation par son manager du besoin de requalification aux gestes techniques, une absence de plus de 12 mois rend obligatoire sa requalification complète