Procédures sévères

Installés sur une chaise pour primates jusqu'à trois heures par jour, cinq jours sur sept pendant deux ans, deux macaques à longue queue effectuent une tâche de vigilance, puis sont rendus parkinsoniens par des injections d'une toxine, suivies chacune de 72 heures d'isolement. Jusqu'à 4 macaques vont être utilisés, dont 2 seulement en cas d'exclusion des premiers, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, et les deux premiers portent déjà un matériel d'enregistrement implanté dans un projet en cours. Ils subissent aussi des enregistrements cérébraux sous anesthésie et une stimulation électrique profonde du cerveau, réglée à 20 % sous le voltage qui provoque des effets secondaires. Le porteur écrit que le stress de la tâche est "rapidement dissipé" et que le syndrome induit est "progressif et maitrisé". Tous sont tués à la fin du projet, pour vérifier sur leur cerveau la position de l'électrode de stimulation.

Objectifs

Les troubles du sommeil sont très fréquents dans la maladie de Parkinson où environ 70% des patients sont affectés. Ces troubles induisent une mauvaise qualité de l’éveil et du sommeil, ils altèrent fortement la qualité de vie des sujets atteints car ils empêchent la réalisation d’activités quotidiennes comme la conduite automobile. Seulement ces troubles sont mal pris en charge par les traitements actuels et il est important de trouver un traitement efficace. Il est établi que l’activité du cortex cérébral nous aide à déterminer les différents états de veille/sommeil. Ainsi, l’étude de l’activité du cortex et de sa modulation par la stimulation électrique de régions cérébrales profondes sont fondamentales pour mieux traiter ces troubles. Le macaque est un modèle de choix pour étudier les troubles du sommeil. Il présente des structures cérébrales et un comportement de veille/sommeil identique à celui de l’humain. Ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui sont des animaux nocturnes. Il est également impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Nous avons pour objectif de rétablir un comportement de veille/sommeil normal chez le singe parkinsonien. D’abord nous étudierons les états de sommeil du macaque sain et parkinsonien. Puis nous étudierons l’effet de la stimulation électrique d’une zone profonde du cerveau dans le but de restaurer un sommeil normal chez le singe parkinsonien. Le dispositif utilisé dans cette étude est déjà utilisé chez l’être humain. Cette étude permettra d’élargir son utilisation au traitement des troubles du sommeil. La plupart des expériences seront réalisées dans la cage d’hébergement des singes, ce qui diminue l’inconfort et le stress de l’animal. Leur état de santé sera surveillé tout au long des expériences. Ce qui permet d’intervenir immédiatement et de manière appropriée au moindre signe de souffrance. Cette étude nécessitera 2 animaux pour obtenir des résultats exploitables, mais deux autres animaux pourront être inclus dans cette étude si nécessaire. Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum mais est suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences.

Bénéfices attendus

D’après la littérature, environ 70% des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent aussi de troubles du sommeil. Donc, si il est possible de réguler les troubles du sommeil par la stimulation cérébrale profonde (SCP) du noyau sous-thalamique (NST), ce projet aboutirait à une meilleure prise en charge des troubles du comportement de veille/sommeil (V/S) chez les patients atteints de cette pathologie. Mais ceci permettrait aussi d’améliorer grandement leur qualité de vie car ces troubles empêchent la réalisation de tâches du quotidien qui demandent de l’attention comme la conduite automobile par exemple. Les bénéfices attendus de ce projet au niveau de la santé sont donc importants. Surtout que d’après la littérature, les troubles du sommeil semblent être des facteurs aggravants des maladies neurodégénératives. Au niveau scientifique ce projet va permettre de caractériser l’activité du noyau sous-thalamique (NST) dans les différents états de vigilance. Ceci permettrait une meilleure compréhension du comportement de veille/sommeil (V/S) au niveau cérébral. De plus. Des retombées technologiques sont aussi attendues de ce projet. En effet, de nouveaux paramètres de stimulation du NST par la SCP sont attendus afin de réguler le comportement de V/S..

Procédures

La phase 1 du projet est la chirurgie d’implantation, celle-ci sera réalisée uniquement si les deux animaux implantés dans un projet autorisé en cours sont sortis de l’étude. Des enregistrements télémétriques de longue durée (24h) de l’activité du cortex et du noyau sous-thalamique se dérouleront sur 2 ans et seront effectués à raison de 10 fois par condition. C’est-à-dire 10 fois chez l’animal sain, 10 fois chez l’animal ayant reçu une stimulation thérapeutique et sain, 10 fois chez l’animal parkinsonien et 10 fois chez l’animal parkinsonien ayant reçu une stimulation thérapeutique. Les enregistrements se feront chez les 2 animaux implantés et à l’état vigile. Ils seront effectués dans la volière d’hébergement de l’animal sans manipulation. La tâche comportementale de vigilance sera réalisée au maximum 3h par jour, à heure fixe et 5j/7 pendant 2 ans. Elle se déroulera sur les 2 animaux implantés, à l’état vigile et sur une chaise pour primates. Les animaux seront progressivement entrainés à réaliser cette tâche et chaque progrès ou bonne réponse sera récompensée. Le test itératif de la latence d’endormissement (TILE) sera réalisé chez les 2 animaux. Ce test sera réalisé 14 fois par conditions décrites précédemment. Pour déterminer les paramètres de la stimulation thérapeutique, des enregistrements sous anesthésie générale et en état vigile seront réalisés pour une durée maximale de 1h. Les enregistrements seront effectués de 5x1h en état vigile dans la volière d’hébergement. Puis des gammes de stimulation seront effectuées de façon à pouvoir tester le voltage maximal à utiliser à fréquence fixe de 130Hz (fréquence de stimulation utilisée en clinique). Le voltage utilisé est de 20% en dessous du voltage laissant apparaitre des effets secondaires. Les enregistrements couplés à la stimulation seront effectués sous anesthésie générale et vigile à raison de 5x1h par condition, ces enregistrements détermineront la fréquence de stimulation à utiliser. Les paramètres de stimulation permettront ensuite de stimuler le singe durant toute une nuit. Les 2 animaux seront ensuite rendus parkinsoniens par des injections d'un produit chimique induisant la pathologie. Après chaque injection les animaux seront isolés pendant 72h jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modérément sévère et stable. Cette phase dure 4 mois.

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation peut induire des douleurs au niveau du matériel implanté jusqu’à maximum une semaine après l’implantation. Elle sera réalisée uniquement si les deux animaux implantés dans un projet autorisé en cours sont sortis de l’étude.. Mais, au moindre signe de douleur un accompagnement de l’animal et un traitement médicamenteux est prévu pour réduire au maximum la douleur. La tâche de vigilance peut induire du stress chez l’animal mais celui-ci est rapidement dissipé par un apprentissage progressif à réaliser la tâche. De plus l’entrainement et la réalisation de la tâche sont couplé à un renforcement positif récompensant l’animal. Le test itératif de la latence d’endormissement ainsi que les enregistrements télémétriques de longue durée n’induisent pas d’effets indésirables chez les animaux car ils sont réalisés dans la volière d’hébergement des animaux. Ces derniers sont vigiles, libres de leur mouvement et aucune manipulation n’est effectuée sur ces derniers. Enfin l’induction du syndrome parkinsonien induira chez ces derniers un symptôme parkinsonien progressif et maitrisé. Ce syndrome induira des troubles moteurs semblables à la maladie de parkinson. Les animaux seront suivis et accompagnés durant cette procédure.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour vérifier le bon positionnement de l’électrode de stimulation profonde.

Remplacement

Le singe Macaque fascicularis, qui ne constitue pas une espèce menacée d’extinction, est un animal qui présente une neuroanatomie, notamment du cortex et du noyau sous-thalamique, très proche de celle de l'humain. Il présente aussi un comportement de veille/sommeil similaire à celui des humains. De plus ce modèle animal a permis l’élaboration de la stimulation cérébrale profonde du noyau sous-thalamique ainsi que son transfert aux patients. Enfin, c’est un modèle de choix validé par la littérature pour l’étude neurophysiologique et comportementale de la maladie de Parkinson induite par injection de neurotoxine. C'est donc pour toutes ces raisons que le Macaque fascicularis est un modèle de choix pour l'étude de l’efficacité de la stimulation cérébrale profonde sur le comportement de veille/sommeil dans la maladie de Parkinson. Cette étude préclinique sur le comportement de veille/sommeil nécessite des animaux ayant de fortes similitudes avec l’humain, il nous est donc impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle rongeur qui est un animal nocturne, un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le recours à ces animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un traitement chirurgical applicable à l’humain.

Réduction

Le nombre de d’animaux a été déterminé avec un test statistique appliqué pour l’étude. Il permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Les animaux seront leur propre contrôle car les tests seront effectués sur les animaux sains puis rendus parkinsoniens. Pour que cette étude soit exploitable il faut enregistrer des signaux de courte durée (au moins 1h) et de longue durée (au moins 24h) à raison de 10 fois chez un seul animal. Ces durées permettent d’obtenir des données statistiquement exploitables. Les analyses spectrales de ces signaux seront comparées à l’aide de tests statistiques adaptés. Dans la définition du nombre d’animaux prévus, nous prenons en compte le risque de rupture de vaisseaux pouvant créer une hémorragie silencieuse pendant la chirurgie, mais s’aggravant en post opératoire ; la mauvaise implantation car le noyau ciblé est très petit. Ceci nous conduit à inclure 100% d’'animaux en plus, soit 2 animaux supplémentaires qui seront opérés uniquement en cas d’exclusion des premiers, ce qui fait un total de 4 animaux maximum pour cette étude. Une étude préliminaire a permis d’enregistrer les signaux corticaux et du NST d’un animal pendant les différents états de veille/sommeil ainsi que de valider la faisabilité des enregistrements. 2 animaux impliqués dans cette étude sur lesquels les expérimentations sont réalisées sont issus d’un projet autorisé en cours de réalisation ce qui réduit le nombre de nouveaux animaux impliqués dans cette étude de moitié.

Raffinement

Des actions sont mises en place pour limiter les risques chirurgicaux : l’imagerie anatomique préopératoire, la ventriculographie et une vérification électrophysiologie per opératoire sont prévues. De plus, des analgésiques, des anesthésiques et des antibiotiques seront administrés aux animaux avant et pendant l’opération chirurgicale afin de supprimer les douleurs et de diminuer les risques d’infections. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques et des antibiotiques afin de réduire au maximum les douleurs et les risques d’infections. Afin de diminuer le stress des animaux soumis à ce contexte expérimental un programme d’habituation aux conditions expérimentales (tâche de vigilance) est mis en place dans l’animalerie. Ces entrainements se font selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée. Un tableau de progression est utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assurent par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Durant la phase 5, étant donné que l’administration du produit induisant la pathologie se fera en même temps pour les deux animaux dans une pièce adaptée, ils ne seront donc pas séparés car l’isolement des animaux est généralement un standard dans le protocole d’administration de ce produit. Deux animaux sont réutilisés pour cette étude et ont reçu une implantation de matériel d’enregistrement, ce matériel sera utilisé pendant cette étude ce qui dispense cet animal de la chirurgie d’implantation.

Choix des espèces

Le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) qui ne constitue pas une espèce de primate menacée d’extinction et qui sont issus d’élevage fait partie des mammifères les plus proches de l’espèce humaine. Son anatomie cérébrale est très proche de celle du cerveau humain, notamment au niveau des structures impliquées dans le comportement de veille/sommeil, ce qui permet de mettre en place la stimulation cérébrale profonde dans les mêmes conditions que chez l’humain, chose impossible à faire avec des animaux plus petits tels que les rongeurs. Ils permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil. Ce modèle animal est d’autant plus pertinent que le comportement de veille/sommeil de ce dernier est très similaire à celui de l’être humain. Aussi, la complexité du comportement de veille/sommeil ainsi que l’impact de la stimulation cérébrale profonde sur ce dernier rend impossible le remplacement de ce modèle animal par un modèle cellulaire ou par une simulation informatique. Des adultes seront utilisés dans cette étude car les traitements à développer à la suite visent des patients adultes.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Issues d'une lignée qui développe spontanément une maladie proche du lupus, elles subissent une lymphoprolifération, une insuffisance rénale et des lésions cutanées, puis reçoivent des prélèvements sanguins et une injection de molécules candidates sous anesthésie. Le porteur indique que toutes les souris sont mises à mort à treize semaines au plus tard pour des analyses biochimiques, la souffrance sévère venant de la maladie que la lignée développe d'elle-même. Il affirme qu'étudier un "organisme entier" est "nécessaire", qu'il n'existe "pas d'alternative" non animale et que la souris est la "meilleure et seule stratégie" disponible.

Objectifs

Le lupus érythémateux disséminé est une maladie auto-immune. Dans cette maladie, le système immunitaire qui en principe protège contre les microbes ou les substances étrangères à l'organisme, se dérègle et se retourne contre les propres cellules de l'organisme. L'inflammation chronique qui se produit dans le lupus peut virtuellement affecter de nombreux organes (articulations, peau, sang, cœur, vaisseaux sanguins, tractus gastro-intestinal, cerveau, poumons, etc.), ce qui rend ce syndrome parfois difficile à diagnostiquer et surtout à traiter. Il n'existe à ce jour aucun traitement du lupus. Les traitements disponibles ne traitent que les symptômes et pas les causes. En plus, leur administration provoque souvent des effets secondaires indésirables à moyen ou long terme (infections à répétition, troubles cardiaques, cancer). Il y a quelques années, une molécule a été découverte qui se comporte comme un puissant régulateur bénéfique de la réponse auto-immune dans le lupus. Cette molécule présente une activité protectrice chez des souris-modèles qui développent une maladie qui miment la maladie lupique. Ce candidat-médicament a montré des effets bénéfiques dans des essais cliniques chez des patients atteints de lupus. Son mécanisme d’action a été identifié au laboratoire. Ce n’est pas une molécule immunosuppressive qui réduit sans discernement toutes les réponses immunitaires. Il n’empèche pas l’organisme de développer une réponse immunitaire normale contre un pathogène, par exemple un virus. Il réduit seulement et très précisemment la réponse autoimmune. L'objectif de cette étude est d'identifier de nouvelles molécules capables, comme ce premier candidat, de modifier l'évolution de la maladie de manière bénéfique et non immunosuppressive. Ces molécules que l’on espère plus puissantes et administrables par des voies naturelles (peau, muqueuses, voie orale), sont préalablement sélectionnées dans des tests cellulaires. Leur non-toxicité cellulaire est testée avant de les injecter à des souris modèles.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet auront un impact scientifique et clinique pour les patients touchés par le lupus. La découverte de nouveaux moyens d'intervention thérapeutique pour traiter une maladie incurable comme le LED améliorerait considérablement la qualité de vie et la durée de vie des patients en réduisant les effets secondaires causés par les médicaments symptomatiques (non ciblés sur un mécanisme moléculaire comme dans notre cas), les seuls disponibles à l'heure actuelle.

Procédures

Les souris recrutées pour l'étude pharmacologique subiront : - deux prélèvements de sang, avant le traitement et à jour 5, sous anesthésie gazeuse (durée 3 minutes) - une unique injection du traitement contrôle ou des molécules candidates ou de NaCl sous anesthésie gazeuse (durée 3 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle murin MRL/lpr développe une maladie auto-immune ressemblant au LED en raison d'une mutation du gène lpr. Généralement après l'âge de 11-12 semaines, les souris femelles et mâles commencent à développer progressivement une lymphoprolifération, une insuffisance rénale, une lymphadénopathie et des lésions cutanées. Ces effets associés à la maladie du lupus ont un impact sur le bien-être des souris. Les effets secondaires dus au prélèvement sanguin et à l'injection intraveineuse sont exceptionnels (œdème, inflammation, rougeur).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'âge de 13 semaines maximum pour analyse biochimiques et moléculaires.

Remplacement

L'utilisation de modèles de souris dans ce projet est cruciale car l'hypothèse selon laquelle le Lupus Erythémateux Diffus est une maladie multi systémique est plus que bien établie. Afin de comprendre le rôle joué par les différents organes, tissus et compartiments de l'organisme et les mécanismes qui sous-tendent leur communication au cours de la détermination et de la progression de la maladie, il est nécessaire d'étudier un organisme entier, une étude intégrée qu’il n'est évidemment pas possible de réaliser en utilisant des systèmes cellulaires (cellules isolées en culture ou organoïdes). Parmi les modèles animaux de LED disponibles, le modèle spontané de MRL/lpr, représente le modèle le plus utilisé en raison de l'apparition rapide de la maladie et de ses multiples manifestations voisines de celles déclarées chez les patients. Ce modèle murin est considéré aujourd’hui comme un modèle préclinique pertinent pour établir la preuve de concept de nouvelles thérapies. Il n'y a pas d'alternative disponible à un modèle non-animal qui puisse répondre à nos questions. Le modèle de la souris représente la meilleure et seule stratégie actuellement disponible pour générer des données qui peuvent avoir un impact translationnel futur pour les humains.

Réduction

Le nombre d'animaux dans le projet est estimé selon les calculs de puissance considérant la nécessité de réduire l'utilisation d'animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude. La taille de chaque groupe d'animaux est de n=10 souris/groupe et elle a été calculée en utilisant un logiciel. Les triplicats sont envisagés pour assurer la validation statistique des données. Si les résultats sont homogènes, ou tout à fait négatifs après un duplicat, un triplicat ne sera pas effectué, ceci afin de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans un groupe social, pendant l'accouplement (1 mâle et 2 femelles) et pendant le traitement dans un groupe (5 souris/ cage). Les cages seront enrichies avec matériaux de nidation et tubes. Nous avons défini des points critiques de souffrance pour l'animal. Toutes les opérations invasives (injections et saignées) seront réalisées sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux de LED disponibles, le modèle spontané MRL/lpr représente le modèle le plus utilisé en raison de l'apparition rapide de la maladie et de ses multiples manifestations voisines de celles déclarées chez les patients. Ce modèle murin est considéré aujourd’hui comme un modèle préclinique pertinent pour établir la preuve de concept de nouvelles thérapies. D’autres modèles existent mais ils sont beaucoup plus lents à se développer et rendent les études de tests de médicaments très allongées (1 an-1,5 an en moyenne). Les animaux pour la reproduction seront recrutés à l'âge de 6-7 semaines (maturité sexuelle). Les animaux destinés à l'essai du médicament seront recrutés à l'âge de 11-12 semaines (souris adultes). A cet âge, la maladie a débuté mais les souris ne sont pas encore à un stade où leur système immunitaire est gravement altéré.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies retirant les cinq sixièmes du rein, puis dix semaines de régime plus ou moins riche en phosphate et des passages en cage métabolique, avec un risque d'anurie, d'hypothermie, de perte de poids et de douleurs gastriques. Le porteur présente cette étude pilote comme un moyen de fixer le sexe et le nombre d'animaux d'une étude ultérieure sur des souris génétiquement modifiées. Il affirme que seul un modèle in vivo permet d'étudier la relation entre rein, intestin et vaisseaux.

Objectifs

La mortalité cardiovasculaire est la principale cause de décès dans l'insuffisance rénale chronique (IRC) à cause du développement de calcifications vasculaires (CV), facteur prédictif important de la mortalité. Lors de cette pathologie, la diminution de la fonction rénale induit la réduction de l’élimination du phosphate (Pi) (sel minéral présent dans le corps humain), cela conduit à une accumulation de cet élément dans le corps au niveau sérique. Ce phénomène est la principale cause de développement de CV. Chez un individu sain, la concentration sérique de Pi est maintenue dans la plage normale par l'équilibre entre un phénomène d’entrée au niveau intestinal et de sortie au niveau rénal, ce dernier étant donc déficient lors de l’IRC. Dans notre étude, nous nous intéressons essentiellement aux mécanismes d’entrée du Pi via le processus d’absorption intestinale et spécifiquement à celui du passage du Pi entre les cellules intestinales. De plus, malgré l’augmentation du taux sériques de Pi, le processus d’entrée reste anormalement activé, cela suggère que la détection et/ou le transport du Pi intestinal sont défectueux dans cette pathologie. Nous souhaitons donc étudier les médiateurs impliqués dans l’absorption du Pi de façon à identifier, dans le futur, des cibles thérapeutiques pour diminuer la concentration sérique de phosphate via la réduction de l’entrée de ce sel dans l’organisme. Ceci permettrait de limiter le développement de CV et donc de réduire la mortalité des patients atteints d’IRC. Nous avons récemment découvert que des souris modifiées génétiquement pour une certaine protéine : la sialoprotéine osseuse (BSP) présentent une absorption intestinale de Pi réduite, ce qui en fait un modèle intéressant pour tester le rôle de ce défaut dans le développement des CV au cours de l'IRC. Dans le futur ces souris seront étudiées et donc rendues malades via une opération d’ablation de 5/6ème des reins (néphrectomie (Nx)-laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place). De plus ces souris recevront une alimentation avec des taux de Pi normaux ou très élevés durant 10 semaines. Cependant, la présente demande concerne la mise en place d’une étude pilote préalable. Ici, nous chercherons uniquement à caractériser la réponse en termes de CV de souris contrôle néphrectomisées, en fonction de leur régime (plus ou moins riche en phosphate) et de leur sexe.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, cette étude pilote nous permettra de savoir si les souris contrôles tolèrent bien la néphrectomie, si elles sont capables de développer des CV sous régime riche en phosphate et également si le sexe des animaux impacte leur réponse. Les résultats de cette étude pilote nous permettront d’ajuster le nombre et le sexe des animaux pour la prochaine étude.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une néphrectomie des 5/6ème (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place), il s’agit de deux procédures chirurgicales à 1 semaine d’intervalle, et chaque chirurgie dure environ 30 minutes. Les animaux auront eu une analgésie préalable ainsi qu’une anesthésie locale et gazeuse lors des procédures : buprénorphine (injection sous cutanée de 5 secondes, 30 minutes avant le début de la chirurgie et 4 heures post-op) ; xylocaine (injection sous cutanée de 5 secondes sur le site de l'opération - 5 minutes avant la chirurgie). La couverture analgésique post-opératoire est également prévue et sera en continue et adaptée en fonction de l’étude des signes cliniques (buprénorphine avec respect du délai d'administration - délai de 4 à 8 heures). Les animaux seront ensuite placés pendant 10 semaines sous régime ± riches en phosphate. Pendant cette période, les animaux seront placés 2 fois pendant 24 heures en cage métabolique pour collecter les urines et les fèces. 6 et 2 jours avant le prélèvement sanguin terminal, les animaux recevront une injection en IP de tétracycline (marqueur de formation osseuse). Ces injections seront effectuées rapidement sur animal vigile par contention (5 seconde/animal). A la fin de l’étude, un acte de prélèvement de sang sur cœur battant va être réaliser via une ponction cardiaque (sur des animaux anesthésiés (injection en intrapéritonéale de 5 secondes- mélange de Kétamine et Xylazine)), les animaux seront ensuite euthanasiés à l’aide d’une injection d’un produit pharmaceutique (Euthasol, injection en intrapéritonéale de 5 secondes) , pour ensuite collecter les organes nécessaires aux analyses de l’étude.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut être source de douleur, mais également la modification du régime alimentaire, les injections et le passage en cage métabolique. Les effets possibles sont : l’anurie, la perte de poids, l’hypothermie, des modifications comportementales (prostration, hypoactivité), une zone d’incision douloureuse, des douleurs gastriques (dos vouté, diarrhée). Anurie : durée post-chirurgical (environ 3h), Hypothermie : pendant chirurgie et réveil : environ 2h, Modifications comportementales : peut se déclencher pendant les 11 semaines post chirurgie, Zone d’incision douloureuse : pendant la cicatrisation post – chirurgie, Douleurs gastriques : peut arriver pendant les 10 semaines de régime.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissu biologique et de sang.

Remplacement

Nous souhaitons investiguer la relation entre divers organes : le rein (néphrectomie), l’intestin (via l’absorption paracellulaire) et l’arche aortique/carotides (développement de CV). La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme minéral et surtout celui du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.

Réduction

De façon à optimiser le nombre d’animaux et notamment à réduire au juste nécessaire, cette étude pilote est proposée. Ces résultats vont nous permettre de choisir le sexe des animaux utilisés pour les prochaines études (non présentées dans cette demande), et d’adapter le nombre au taux de mortalité observer ici. Après étude statistique ; il faut inclure au moins 8 animaux par groupe, mais en prenant en compte un taux de mortalité inférieur à 10% 12 semaines après néphrectomie, un nombre de 12 animaux par groupe a été jugé suffisant pour obtenir une puissance statistique robuste. Les études de cages métaboliques seront réalisées sur les mêmes animaux avant et après de façon à ce que l’animal soit son propre contrôle et donc diminuer la variabilité inter-individus.

Raffinement

Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. La procédure expérimentale implique la réalisation d’une néphrectomie pour induire une insuffisance rénale chronique, ce qui engendre de la douleur pour les animaux. Pour limiter le stress des autres animaux dans la salle d’hébergement, tous les animaux ayant subi l’intervention seront placés dans une autre salle d’isolement. Avant l’expérience, les animaux seront déjà placés dans cette salle pour les habituer. De plus, les souris seront entrainées à être changées via un passage dans un tube pour ne pas avoir à toucher leur dos/queue lors des changes après néphrectomie car la zone pourrait être douloureuse. Ce tube sera toujours dans la cage et constituera également un enrichissement physique. Une grille de scoring sera proposée pour évaluer le bien-être des animaux, et cette évaluation sera effectuée régulièrement. Les actes douloureux comme la chirurgie seront effectués sous anesthésie, et la couverture analgésique sera continue et suffisante durant toute l’étude. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de Nx, ce point permettra de réduire le taux de mortalité. Les animaux seront sous surveillance accrue à compter de leur chirurgie. Concernant les injections en fin de protocole de tétracycline (IP ; 30mg/kg), elles seront effectuées par un expérimentateur habilité et formé. Les animaux seront habitués à la contention 48h avant les injections pour diminuer leur stress et également pour vérifier que la contention ne génère pas de douleur au niveau des cicatrices, bien que les cicatrices soient loin de la zone d’injection. De plus, il n’y a aucun risque de toxicité car la concentration utilisée (30mg/kg) est largement en dessous de la DL50 décrite pour ce produit. L’acte de ponction cardiaque sera réalisé sous anesthésie lourde, la mise à mort sera rapide et sans douleur via l’injection d’un produit euthanasiant.

Choix des espèces

Ici, l'étude pilote est proposée sur des souris contrôles. Dans le futur (si les résultats de cette étude pilote sont concluants), une seconde étude sur des souris génétiquement modifiées sera réalisée pour une meilleure compréhension de la pathologie. Ces études sont la suite de projets portant sur l'étude du métabolisme et menées dans le laboratoire. De ce fait, nous souhaitons continuer ce nouveau projet sur le même modèle que les souris utilisées précédemment au laboratoire et nous disposons de ces modèles de souris à l'animalerie. Cette étude pilote est donc proposée sur la souris. L’induction de l’insuffisance rénale chronique via une néphrectomie des 5/6ème (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place) est connue et maîtrisée chez la souris (plus de 200 animaux opérés, et un taux de mortalité global post opératoire faible). L’étude pilote sera menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population.

180 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque poisson subit deux tests de nage forcée à contre-courant, jusqu'à trois heures, la répétition sur les mêmes individus justifiant la gravité sévère déclarée. Le porteur indique que l'objectif premier relève d'un "enjeu agronomique et économique", diminuer par sélection génomique le muscle rouge qui gêne la vente de truite fumée, et présente comme bénéfice annexe la vérification que cette baisse ne nuit pas à la capacité de nage. Il conclut que la question impose des tests sur animaux vivants.

Objectifs

La production de truite arc en ciel en France s’oriente de plus en plus vers des poissons de grande taille destinés à la fumaison et vendus sous forme de tranches fines. La présence du muscle rouge, facilement repérable par sa couleur brune est fortement préjudiciable pour la vente. En effet, outre l’aspect visuel, le muscle rouge riche en lipides s’oxyde rapidement conduisant à des défauts de flaveur. C’est pourquoi certains cahiers des charges imposent aux transformateurs d’éliminer ce muscle. Ce niveau de parage élevé (élimination du muscle rouge) entraîne une perte en matière première et donc une perte économique pour les producteurs et les transformateurs. Il y a donc un enjeu agronomique et économique à maîtriser la croissance de ce muscle. C’est pourquoi les professionnels étudient la possibilité de diminuer la proportion de muscle rouge par sélection génomique. La musculature des poissons est très majoritairement (>90%) constituée d’un muscle blanc à contraction rapide et d’un muscle rouge à contraction lente. D’après la littérature, le muscle blanc avec un métabolisme anaérobie est surtout sollicité par le poisson pour la nage rapide alors que le muscle rouge avec un métabolisme aérobie est principalement sollicité pour la nage lente. Alors que les études sur la croissance du muscle blanc sont nombreuses et que l’impact des facteurs externes est bien connu, les facteurs qui influencent la proportion de muscle rouge chez les poissons sont très mal connus. Parmi les différents facteurs d’élevage, l’exercice modéré semble stimuler la croissance du muscle rouge sans modifier significativement la taille des fibres lentes . Cependant, l’impact de l’exercice sur la taille des fibres du muscle rouge de truite reste controversé puisque certaines études rapportent une augmentation de 25 % du diamètre moyen des fibres , alors qu’une autre n’observe aucun effet . Un des objectifs du projet est de déterminer s'il existe une relation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Plus spécifiquement, l'objectif de cette expérimentation est de déterminer si la mesure de capacité de nage est répétable entre 2 tests et s'il y a une relation entre capacité de nage et proportion de muscle rouge au sein de la même base génétique. Ce projet comporte une seule procédure expérimentale de test de nage classée sévère.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer s'il existe une corrélation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage du poisson. Il s'agit notamment de vérifier si une proportion faible de muscle rouge n’entraîne pas de défauts dans la capacité de nage ce qui pourrait nuire au bien-être de l’animal. Étant donné que le muscle rouge est décrit comme étant principalement sollicité pour la nage lente, il s'agit de vérifier si les poissons avec une faible proportion de muscle rouge n’ont pas une capacité de nage limité ce qui pourrait nuire à leur bien-être. Par ailleurs, il s'agira de déterminer si la capacité de nage d'un poisson est comparable entre 2 tests séparés de 3 semaines pour permettre une récupération complète. De plus, il s'agira de déterminer s'il existe une relation entre les capacités de nage et la proportion de muscle rouge ou la morphologie au sein d'une même base génétique.

Procédures

Les animaux seront soumis à un test de nage qui consiste à exposer les poissons à un courant de plus en plus fort dans un bassin expérimental. Le débit sera progressivement augmenté par paliers de 10-20min pour atteindre 90cm/s. Le test doit durer 160 minutes. Au cas où un animal n’aurait pas décroché, le test de nage sera arrêté au bout de 3 heures. Le test sera répété 2ème fois sur les mêmes animaux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les poissons utilisés dans ce projet sont celles générés par un test de nage répété 2 fois (phase 1 et 2) sur les mêmes individus et qui va durer au maximum 3h. Cette nuisance est sévère car répétée 2 fois sur les mêmes individus. Ces tests de nage nécessitent également une émersion des animaux pour les transférer de leur bassin d’élevage jusqu’au dispositif de test de nage qui ne durera pas plus de 5 secondes. Cette émersion des animaux génère un stress de courte durée est considéré comme léger. Enfin, les animaux seront exposés à des phases d’habituation à un environnement nouveau lié au regroupement 3 à 4 semaines avant les tests, et au changement de bassin lorsqu’ils seront transférés du bassin d’élevage au bassin de test induisant un stress modéré. Les animaux seront également mis à jeun la veille du test. Ces mises à jeun, bien supportées par l’espèce, sont léger.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort par une personne compétente désignée par les responsables de projet ou par les responsables du projet eux-mêmes. Les responsables du bien-être des animaux sont bien sûr informés. Tous les éléments justifiant leur mise à mort sont conservés et transmis à la SBEA de l'établissement et au vétérinaire référent de l'établissement, ainsi qu’au responsable du projet.

Remplacement

Les objectifs du projet étant de déterminer s'il existe une relation entre la proportion de muscle rouge et les capacités de nage des poissons, cela implique nécessairement de réaliser des tests sur animaux vivants.

Réduction

En prenant en compte la variabilité de la réponse au test de nage et de la proportion de muscle rouge, nous avons pu diminuer le nombre d'animaux utilisés à 180 truites. Cet effectif nous permettra d’avoir une puissance statistique suffisante et de mettre en évidence une relation entre la proportion du muscle rouge et les performances de nage.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l'espèces (photopériode, qualité d'eau, densité, nourriture). Pour limiter le stress, les groupes de poissons seront constitués en même temps que le marquage par pit-tag entre 3 et 4 semaines avant le test de nage et placés dans un bac d’élevage proche du bassin de test afin de limiter au minimum le stress du transfert. Pour cela, les poissons seront pêchés dans leur bassin d’élevage avec une épuisette, puis disposés dans un bac d’anesthésie avec de la tricaïne MS-222 + bicarbonate de soude pour tamponner le milieu et éviter un stress d’acidité. Lors du marquage, les poissons seront déposés sur une serpillère humide pour éviter la déperdition de mucus. Le corps et les yeux des poissons seront recouvert de cette serpillière pour les isoler de l’environnement ambiant. Après injection de la marque, les poissons sont mis dans un bac de réveil, avant d’être regroupés pour constituer les lots destinés aux tests de nage. Toutes les manipulations sont réalisées sous anesthésie par du personnel compétent le plus rapidement possible pour limiter le temps d’émersion des animaux qui ne durera pas plus de 10 secondes. Ils seront également mis à jeun avant le test afin d'éviter qu'ils ne soient malades et transférés avec une épuisette dans le bassin de test la veille pour s’habituer à ce bassin qui sera disposé dans une pièce isolée et ne servant qu’aux tests de nage afin de limiter le stress. Pendant la procédure, la manipulation des animaux sera réduite au maximum et une surveillance du comportement des animaux sera effectuée pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse subies. Cette surveillance du comportement des poissons se fait en continu dès lors que les poissons sont pêchés dans leur bassin d’élevage pour être introduit dans le dispositif de test de nage. Une à deux personnes seront en permanence prêtes à intervenir dès l’atteinte des points limites pendant le test, Notre expérience, nous indique que les poissons bien épuisés récupèrent tous après un test de nage. Par ailleurs, à l'issue de la phase 2, les poissons sont mis à mort dès qu'ils ne sont plus en capacité de nager (cf § 4.2 Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés.

Choix des espèces

L'étude s'effectue sur la truite arc en ciel car c'est l'espèce piscicole utilisée pour le projet. C'est une espèce robuste dont l’élevage et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. De plus, il s’agit d’un poisson d’intérêt économique dans le monde entier, et qui représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement étudié dans la communauté scientifique. Nous allons réaliser les tests sur des animaux de 200g qui correspond à la taille où l’on peut mesurer le plus précisément la proportion de muscle rouge ainsi que les capacités de nage.

10 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit quatre brûlures profondes du second degré, huit renouvellements de pansement, trois prises de sang et quatre biopsies cutanées, avant d'être tué pour prélever la peau brûlée. Le porteur décrit une douleur liée aux brûlures et aux biopsies, un stress dû aux pansements et à l'hébergement individuel, et un risque d'infection des plaies. Il affirme que les essais réglementaires imposent le modèle animal avant tout essai clinique et que les tests cutanés en laboratoire "génèrent peu de données", pour évaluer un pansement destiné aux brûlures humaines.

Objectifs

Le pansement que nous voulons tester est un dispositif médical innovant à 2 composantes : une composante physique et une composante biologique. Celui-ci est destiné au traitement des brûlures profondes chez l'homme. Les 2 composantes physique et biologique ont par ailleurs été testées séparément en laboratoire et sur des brûlures cutanées de mini-pigs. Les objectifs de ce projet sont de tester le pansement dans sa forme finale (composantes combinées) sur les brûlures de second degré profond du mini-pig, en évaluant plusieurs critères : - La tolérance du pansement. - Sa protection contre les contaminations bactériennes. - Le maintien de son intégrité au cours du temps. - La réduction de l’inflammation locale et systémique. - L’impact sur la vitesse et la qualité de cicatrisation. La pertinence de cette étude repose sur la forte ressemblance entre le mini-pig et l’homme à l’échelle de la peau, ce qui est rend les données générées robustes pour une translation vers des études cliniques.

Bénéfices attendus

Les brûlures constituent un problème de santé publique majeur, avec près de 11 millions de personnes dans le monde subissant annuellement des brûlures suffisamment graves pour nécessiter des soins médicaux. Ce problème touche particulièrement les enfants qui représentent près de 50 % des brûlés, et pour lesquels la stratégie thérapeutique la plus souvent choisie est d'effectuer une autogreffe de peau. Le pansement que nous voulons tester est un dispositif médical régénératif innovant, destiné au traitement des brûlures du second degré profond chez l’homme, dans le but d'éviter, lorsque c'est possible, les autogreffes, et de restaurer rapidement l'intégrité du tissu tout en minimisant les infections, la douleur et la cicatrice résiduelle. Son intérêt est aussi d'améliorer la vitesse et la qualité de cicatrisation par rapport aux pansements traditionnels.

Procédures

Les interventions réalisées comprennent 9 jours de manipulation au total (20 à 30 minutes par animal et par jour), sous anesthésie générale : -4 brûlures de second degré profond au total par animal, réalisés le premier jour (10 minutes). -8 renouvellements de traitement et pansements des brûlures (15-20 minutes). -3 prises de sang (6mL) au total par animal (1 minute). -4 biopsies de peau rondes de 8mm au total par plaie et par animal (5-10 minutes).

Impact sur les animaux

-Douleur due aux brûlures et aux biopsies. -Stress et gêne dus à la présence de plusieurs pansements sur le dos de l’animal. -Stress dû à la manipulation fréquente et à l’hébergement individuel. -Risque d’effets secondaires liés à l’anesthésie fréquente (mais de courte durée) et/ou à l’administration fréquente d’analgésiques. -Risque d’infection des plaies.

Devenir

Le sort des 10 animaux inclus dans cette étude est l’euthanasie à la fin du protocole, pour cause de prélèvement d'organes post-mortem, notamment la peau au niveau des différentes brûlures pour analyses des tissus cutanés.

Remplacement

Les études de tolérance et d’efficacité d’un dispositif médical doivent être réglementairement réalisées sur des modèles animaux avant tout essai clinique chez l’homme. Les tests cutanés qu’il est possible de faire en laboratoire ont été appliqués avant d’envisager le modèle animal mais ceux-ci génèrent peu de données ; la peau est en effet un tissu complexe et la cicatrisation un mécanisme auquel participent une multitude de cellules et de facteurs, qui ne peut être reproduit dans un laboratoire.

Réduction

Le protocole a été testé et validé sur 4 mini-pigs dans le cadre de 2 études préliminaires différentes pour ainsi optimiser le protocole et la logistique de l’étude avant de passer à un plus grand nombre d’animaux. Le nombre d’animaux inclus dans cette étude a été validé par une méthodologiste statisticienne et assure un nombre optimal d’individus pour générer des résultats robustes et exploitables. D’autre part, les 4 brûlures seront réduites à 3 brûlures par animal lorsque possible, et sans porter atteinte à la qualité de l’étude et des données générées.

Raffinement

Dans la conception de ce projet, l’ensemble des procédures ont été́ bien étudiées afin de générer des données robustes et exploitables tout en respectant les critères du bien-être animal et en limitant sa douleur et son stress. Les animaux disposent de nourriture adaptée, diversifiée et enrichie quotidiennement (fruits et/ou légumes), d’eau en accès libre et d’un programme hebdomadaire de jeux et activités. Toutes les manipulations citées dans l’étude seront par ailleurs réalisées sous anesthésie générale, suivies d’un traitement approprié contre la douleur. Les animaux seront surveillés 3 à 6 fois par jour pour noter le moindre signe clinique apparent et lancer une prise en charge adaptée ; un suivi des points limites stricts et spécifiques au projet est donc réalisé tout au long de la procédure.

Choix des espèces

Les nombreuses similitudes entre l’homme et le porc en termes d’anatomie et de physiologie cutanée en font un excellent modèle animal pour l’étude de l’efficacité du pansement sur la cicatrisation des brûlures cutanées. Les animaux sont adultes. La croissance d’un jeune animal pourrait affecter et probablement améliorer la cicatrisation, ce qui introduirait un biais dans l’analyse.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue et toutes classées en souffrance sévère, dans des procédures impliquant une greffe de cellules cancéreuses dans la rate ou le foie sous anesthésie. Le porteur indique que ces souris sont identifiées dès l'âge de sept jours par coupure des phalanges, et que la chirurgie entraîne un stress et d'éventuelles douleurs, sutures comprises. La greffe vise à générer des métastases hépatiques pour tester un régime alimentaire et un médicament, la nitisinone, bloquant la dégradation de la tyrosine. Il affirme que le recours aux animaux est "absolument indispensable", les souris étant euthanasiées par dislocation cervicale pour autopsie.

Objectifs

Ce projet innovant a pour objectif de déterminer les changements métaboliques associés aux caractéristiques agressives et métastatiques du cancer pancréatique (ADKP). Pour répondre à cet objectif, nous avons défini et comparé le profil métabolique des métastases hépatiques (MH) associées à la tumeur pancréatique à celui de la tumeur pancréatique elle-même. Nous avons révélé que l’utilisation de l’acide aminé tyrosine est activée dans les MH par rapport à l’ADKP. Cette différence laisse envisager que l’utilisation de la tyrosine soutiendrait la survie des cellules cancéreuses au sein du tissu hépatique, lors du processus métastatique. A présent, nous souhaitons étudier le rôle de la tyrosine dans la progression métastatique de l’ADKP. Nous avons aussi démontré que les hépatocytes produisent des taux élevés de tyrosine. Cette donnée renforce l’hypothèse selon laquelle les cellules cancéreuses métastatiques s’adaptent au foie en sollicitant de manière importante l’utilisation de la tyrosine au sein du tissu hépatique pour en dériver différents composés qui lui seraient utiles. Le rôle de la tyrosine est jusqu’à présent très peu étudié dans les processus métastatiques mais représente un intérêt thérapeutique certain en laissant entrevoir son rôle dans la généralisation du cancer. Ce projet a pour but d’apporter à terme de nouvelles approches thérapeutiques aux patients à un stade avancé et métastatique de la maladie alors exclus du seul protocole curatif disponible en clinique : la chirurgie. C’est dans cette démarche préclinique que souhaitons valider notre hypothèse par l’utilisation de différents modèles de souris.

Bénéfices attendus

Ce projet par ces approches in vivo, nous permettra de valider le rôle de la voie de dégradation de la tyrosine dans le développement des métastases hépatiques associées à l’ADKP. L’inhibiteur pharmacologique de la dégradation de la tyrosine, la nitisinone, etant utilisé en clinique avec autorisation de mise sur le marché (AMM), nous souhaitons valider son utilisation dans le cadre du traitement du phénotype invasif du cancer du pancréas pour proposer un repositionnement de la nitisinone pour le développement d'une approche thérapeutique chez les patients atteints d'un cancer pancréatique métastatique. L'utilisation d'un régime pauvre en tyrosine sera une double validation de l'interêt clinique du ciblage du métabolisme de la tyrosine dans le cadre du cancer du pancréas métastatique. Ainsi, ce projet apportera à terme de nouvelles approches thérapeutiques aux patients à un stade avancé et métastatique de la maladie alors exclus du seul protocole curatif disponible en clinique : l’exérèse chirurgicale. C’est dans cette démarche préclinique que nous souhaitons valider notre hypothèse par l’utilisation de différents modèles de souris.

Procédures

Les souris sont soumises à une procédure chirurgicale de greffes de cellule stumorales dans la rate ou le foie, 1 procédure chirurgicale par souris sera effctuée. Cette procédure chirurgicale sera de 20 min maximum entre le temps d'endormissement et de réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux sont dues tout d’abord à leur identification, à l'âge de 7 jours, par coupures des phalanges. Certaines nuisances sont aussi dues à l’acte chirurgicale qui entraîne inévitablement un stress et éventuellement des douleurs chez la souris, même si tout est mis en oeuvre au moment de la chirurgie pour les réduire. Ces nuisances sont dues i/à l’anesthésie avant l’acte chirurgical, ii/à l’injection avec des cellules tumorales au niveau de la rate et du foie pour générer des métastases hépatiques, iii/ aux sutures qui peuvent aussi entraîner une gêne, démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et à former des plaies au site de fermeture de la cicatrice (cette gêne disparait généralement en quelques jours). Ces douleurs post-opératoires sont minorées par une antalgie. Les nuisances liées au développement de métastases hépatiques sont : douleur, perte de poids, mobilité réduite, apparences et/ou comportements anormaux, qui indiquent une progression métastatique avancée. Notre expertise nous permet de détecter quotidiennement tout signe de douleur, d’angoisse et de souffrance de l’animal. A ce-jour, aucun marqueur de dépistage précoce de la progression métastatique de la maladie ne peut être utilisé pour ce modèle et notre infrastructure n’est pas encore pourvue d’un échographe qui permettrait de diagnostiquer les métastases et de suivre leur évolution.

Devenir

Afin d'évaluer la prise métastatique au sein du foie et de la rate en fonction des traitements administrés aux animaux, ceux ci seront euthanasiés par dislocation cervicale et autopsiés.

Remplacement

Le recours à des animaux est absolument indispensable pour mener à bien ce projet qui vise à inhiber les échanges métaboliques au sein du foie, entre les cellules cancéreuses et les hépatocytes à proximité de la métastase, en utilisant un régime alimentaire spécifique, et à observer la progression/régression des métastases hépatiques. Ce projet fait suite à plusieurs validations in vitro et ex vivo (sur cultures primaires en 2 dimensions, en organoïdes) de la pertinence de cette inhibition du dialogue métabolique entre hépatocytes et cellules métastatiques pour limiter l’expansion métastatique. Ainsi, il est à présent nécessaire de démontrer au sein d’un hôte vigile, porteur de métastases et avec des fonctions hépatiques conservées, qu’un régime alimentaire dédié permettrait de réduire la progression métastatique et d’envisager une telle approche, par régimes alimentaires spéciaux, chez des patients atteints d’un cancer pancréatique métastatique, évitant/limitant ainsi une approche thérapeutique lourde. L’utilisation d’alternatives expérimentales ne faisant pas appel à l’utilisation d’animaux sera envisagée chaque fois que c’est possible (ex : caractérisation moléculaire des hépatocytes et des cellules métastatiques après inhibition des échanges métaboliques entre les 2 types cellulaires).

Réduction

Le nombre d’animaux/groupe expérimental et par procédure expérimentale nécessaire à l’obtention d’une significativité statistique a été défini à partir du site biostatgv en déterminant : - le test statistique à utiliser : T-test ou ANOVA et test post-hoc (Tukey) en fonction du nombre de groupes expérimentaux à comparer (deux ou plus de deux, respectivement). - l’effet biologique traduisant la progression tumorale et la prise métastatique et la dispersion escomptés, cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par le laboratoire - la puissance du test à 0.8 - le risque de 1ère espèce à 0.05. Ainsi, le nombre d’animaux/groupe expérimental, tel que défini au-dessus, est de : - 8 pour le groupe 1 (régime contrôle), 2 (régime nitisinone) et 3 (régime tyr-/Phe 0,25%)) des procédures 1 (greffes intraspléniques) et 2 (greffes intrahépatiques).

Raffinement

Une personne compétente (formations en expérimentation animale + chirurgie) réalisera l’implantation des cellules tumorales par chirurgie dans la rate et le foie en traitant les animaux opérés avec une injection d’antalgique (buprénorphine) en pré- et post-opératoire. Une observation quotidienne des animaux (poids, douleur/souffrance) sera faite et permettra de déceler des apparences/comportements anormaux, des signes physiologiques altérés : ces observations seront mesurées/quantifiées pour leur intensité/importance sur une échelle de 0 à 3, qui constituera un score que nous reporterons dans une grille (voir grille de score jointe). Les scores obtenus chez l’animal éveillé, après anesthésie ou au cours du développement métastatique nous conduiront à arrêter l’expérience si le score 3 a été atteint au moins une fois pour l’un des symptômes mentionnés dans cette grille. Un enrichissement matériel (twists, cocon ou nid) de l’environnement des animaux est mis en place dans toutes les cages afin qu’ils expriment un répertoire diversifié de comportements normaux.

Choix des espèces

Nous nous servirons de souris syngéniques ne développant ni tumeur primaire ni métastases de manière spontanée. Ce modèle nous permettra d’injecter en intra-splénique ou en intra-hépatique des cellules cancéreuses métastatiques syngéniques préalablement isolées du modèle murin de carcinogenèse pancréatique d’origine. Cette compatibilité immunologique entre les cellules greffées et l’hôte murin nous permettra de réaliser cette expérience dans un modèle murin immunocompétent nous évitant ainsi d’exclure la composante immunitaire requise au processus métastatique. Pour les protocoles 1 et 2, nous utiliserons des souris syngéniques de sexes indifférents, âgées d'environ 6 semaines : à cet âge les animaux sont sevrés, correspondent au stade de développement jeune adulte auquel les études de l’impact du métabolisme sur la progression métastatique ne sont pas impactées par une prise de poids ou tout autre facteur lié au vieillissement de l’animal.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue et toutes classées en souffrance sévère, dans des procédures impliquant la pose chirurgicale d'une fenêtre crânienne. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par obstruction transitoire de l'artère cérébrale moyenne, suivi d'une injection d'anticorps et d'une imagerie du cerveau de deux heures sous anesthésie, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le porteur justifie l'impossibilité de garder les animaux en vie par la nature même de l'expérience, un thrombus occlusif étant provoqué. Il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité de la désagrégation plaquettaire et que les plaquettes, cellules anucléées, ne peuvent être cultivées.

Objectifs

Lors d'un saignement les plaquettes s'accumulent au niveau de la lésion formant un clou hémostatique qui stoppe l’hémorragie. Un processus similaire peut survenir dans un vaisseau malade et mener à la formation d'un thrombus entrainant l’occlusion du vaisseau, responsable de maladies graves comme l’accident vasculaire cérébral (AVC) ou l’infarctus du myocarde, qui représentent la première cause de mortalité dans le monde. Une étude clinique très récente indique qu'un nouveau candidat médicament divise la mortalité par 3 de patients qui présentent un AVC ischémique aigu. Le mécanisme d’action de cet agent reste obscur étant donné que l’effet protecteur n’est pas lié à une meilleure recanalisation mais un risque hémorragique diminué, suggérant un impact lors de la reperfusion de la zone du cerveau ayant subit une privation d'oxygène. Ce projet vise à déterminer le mécanisme d’action de cet agent lors d’AVC ischémique chez la souris justifiant ainsi l’utilisation de cet agent pour un futur essai clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet portent sur la possible utilisation d'un nouveau candidat médicament pour de nouvelles indications et d’essais cliniques

Procédures

Tous les animaux subiront : •Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale permettant la pose d’une fenêtre cranienne afin de pouvoir imager le cortex cérébral. 1 fois 45 minutes •Une induction d’un AVC par obstruction transitoire de l’artère cérébrale moyenne du cerveau sous anesthésie générale ainsi qu’une injection par voie veineuse d’un anticorps 4 semaines après la pose de la fenêtre. 1 fois 15 minutes •Imagerie du cerveau par microscopie multiphotonique sous anesthésie générale 1 fois 2h •Mise à mort pas dislocation cervicale

Impact sur les animaux

Lors de l’expérimentation nous pouvons nous attendre à une baisse de la fréquence cardiaque, respiratoire ainsi qu’une baisse de température dû à l’anesthésie de l’animal. Ces paramètres seront surveillés, la concentration d’anesthésique sera ajustée si nécessaire et l’animal sera réchauffé tout au long des procédures. La procédure expérimentale comprenant une chirurgie au niveau du crâne ainsi que du cou de la souris sera réalisée par un personnel expérimenté disposant de la formation requise pour réaliser ce type d’expérimentation limitant ainsi au strict minimum les effets indésirables. De plus les souris seront anesthésiées tout au long des procédures expérimentales et et leur état de santé sera étroitement surveillé. Après la pose de la fenêtre cranienne, nous pouvons nous attendre à une légère perte de poids des animaux qui ne devrait pas excéder 3 jours. Nous nous attendons pas a des effets indésirables après l’induction de l’AVC de plus les animaux seront conservés seulement 24h et seront encore sous traitement analgésique.

Devenir

Le projet porte sur l’étude de l'effet d'un anti-thrombotique dans le cas d'un thrombus occlusif au niveau de l'artère carotide, en conséquence les animaux ne peuvent pas être garder en vie à l'issu de l'expérimentation.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’effet d’inhibiteurs dans un processus complexe et intégré qu’est la désagrégation plaquettaire. Les modèles in vitro n’étant pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus, un modèle in vivo sera utilisé. De plus, les plaquettes sont des cellules anucléées qui ne peuvent être cultivées, empêchant tout modèle reposant sur la culture cellulaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum. Pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs les effectifs de chaque groupe ont été calculés suivant les tests statistiques en respectant la distribution selon une loi normale. Nous utiliserons des statistiques pour la comparaison de 2 groupes.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un antalgique sera administré au niveau de la zone de chirurgie. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel qualifié.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répendus et maitrisés. Les techniques de mutagenèse ont permis de générer des souris sur un même fond génétique : •Exprimant la Glicoprotéine VI humaine permettant de tester des anticorps humains chez la souris. •N’exprimant pas la protéine Glicoprotéine VI permettant d’évaluer l’importance de la glicoprotéine dans la formation de thrombus occlusif. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constituent des outils originaux et uniques. L’expression de la Gliprotéine VI humaine n’induit pas d’effet indésirable notable chez les souris. Ces souris seront utilisées en comparaison de souris contrôles sauvages. Les animaux seront utilisés au stade adulte entre 8 et 24 semaines. Cet âge correspond à la période permettant l’utilisation de souris pubères et ne présentant pas encore syndrome de vieillissement. Nous réaliserons des groupes homogènes en âge.