Procédures sévères

4 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, puis proposés à l'adoption une fois réformés. Ils reçoivent onze injections de venin de vipère additionné d'adjuvant sur 147 jours, puis des prélèvements sanguins répétés par cycles jusqu'à la baisse de leur taux d'anticorps, pour produire le plasma servant à fabriquer un antivenin. Le porteur décrit des masses inflammatoires et des abcès aux points d'injection, parfois des plaies avec écoulement, et une gêne de la mobilité de l'encolure. Il affirme qu'aucun antivenin ne peut être produit sans animal et présente les anticorps polyclonaux du cheval comme les plus efficaces.

Objectifs

Chaque année dans le monde, de nombreuses personnes décèdent où souffrent de lésions irréversibles suite à une morsure de serpent venimeux. C’est également le cas en Europe où les vipères d’Europe enveniment à des degrés divers environ 1000 personnes. Dans le cadre de la production de spécialités antivenimeuses ciblant les envenimations de Vipères d’Europe, l’obtention d’anticorps spécifiques est indispensable. Afin de produire ces anticorps, des chevaux sont immunisés de manière répétée dans le but d’obtenir une quantité élevée d’anticorps dans leur sang. L’immunisation est réalisée par des injections d’antigènes constitués de venins et d’adjuvants. A l’issue de la phase d’immunisation, des prélèvements sanguins sont réalisés sur les chevaux.

Bénéfices attendus

Le bénéfice escompté est de s’assurer de la fourniture de Viperfav qui est la seule spécialité antivenimeuse avec autorisation de mise sur le marché (AMM) en France. Ce produit est plus largement utilisé en Europe, en fonction des besoins. Il n’existe aucune spécialité antivenimeuse ne faisant pas appel à l’animal pour la production d’immunoglobulines, les anticorps polyclonaux sont très efficaces pour la lutte contre les envenimations.

Procédures

4 chevaux reçoivent des injections de venin à dose croissante afin de solliciter leur réponse immunitaire. Ils sont ensuite prélevés régulièrement (production de plasma). Leur immunité est conservée par injections de solution de venin, entre chaque cycle de prélèvement. Hyper immunisation: Cette phase se déroule durant 147 jours. Les chevaux reçoivent 11 injections à J0, J50, J71, J85, J97, J104, J111, J118, J132, J139, J147 de solution de venins de serpent, additionnée, lors des 3 premières injections, d’un excipient huileux minéral (EHM). Ces injections durent 15 seconde chacune Production : Cette phase débute juste après la phase d’hyper-immunisation. Les chevaux sont prélevés et immunisés sur un cycle de 4 semaines qui se répète jusqu’à la réforme du cheval. Les chevaux « anti-vipères d’Europe » produisent uniquement durant 7 cycles car le titre en anticorps baisse significativement au-delà. Chaque prélèvement dure 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus sont la formation de masses inflammatoires au point d’injection pouvant entrainer des abcès froids qui peuvent se résorber sans plaie, mais qui occasionnent parfois des plaies avec écoulement séreux ou purulent. Dans ce cas, des soins locaux sont dispensés. Plus rarement, on observe une gêne transitoire de la mobilité de l’encolure des animaux, dans ce cas, le vétérinaire décrit la conduite à tenir et peut suspendre un protocole provisoirement ou définitivement. Quel que soit le protocole, si un animal présente des signes cliniques non attendus, un examen clinique est réalisé par un vétérinaire. Celui-ci peut décider de réformer l’animal.

Devenir

A l’issue de la production, les chevaux réformés sont proposés à l’adoption. Une évaluation vétérinaire est toujours associée à cette décision.

Remplacement

L’état de la science ne permet pas aujourd’hui de produire des antivenimeux autrement que par le recours à l’animal. L’effet polyclonal est largement plébiscité car il agit avec un très large spectre face aux nombreuses protéines nocives des venins.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à un minimum grâce à une optimisation des volumes de plasma prélevés par animal. Les demandes commerciales et les titres des plasmas déterminent le niveau de production et par conséquent le nombre de chevaux producteurs.

Raffinement

Les chevaux sont hébergés en groupe. Les manipulations (injection ou prélèvement de sang) sont réalisées en présence de chevaux du même groupe, dans des installations spécifiques adaptées. Du sang total prélevé sont extraits les globules rouges. Lors des prélèvements sanguins des points limites sont mis en place afin de limiter les effets de l’hypovolémie en fonction du suivi du taux d’hématocrite de bilirubine sérique chez les chevaux producteurs. Ainsi, pour un taux d’hématocrite compris entre 40% et 20% les globules rouges peuvent être réinjectés En deçà de 30% pour le taux d’hématocrite et 35% pour le taux d’albumine des injections de vitamines B12 et de fer, des traitements hépato-protecteurs, ainsi que l’arrêt des prélèvements sont également mis en place. De plus, les pertes de plasmas sont compensées par une mise à disposition d’abreuvement à volonté.

Choix des espèces

Espèce 1 : Chevaux, ânes et croisements (Equidae) Les équidés représentent l’espèce de choix car leur gabarit leur confère un volume sanguin circulant élevé. Les volumes prélevés sont élevés, proportionnellement à ce volume sanguin, et leur capacité rapide à reconstituer ce stock en fait l’espèce de choix. C’est une espèce qui collabore bien avec l’homme et sensible au renforcement positif permettant d’améliorer cette collaboration. D’autre part, il n’existe que peu de zoonoses qui touchent les équidés sur le territoire français. Les animaux sont âgés d’au moins 3 ans. Il est nécessaire qu’ils aient achevé leur croissance et que leur système immunitaire soit mature.

Une diarrhée parfois hémorragique, des pertes de poids marquées, jusqu'à 22 semaines de colite pour les lignées qui la développent spontanément : 8 000 souris et 2 000 rats, soit 10 000 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. La colite est provoquée par du dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, par du TNBS administré par voie rectale après douze à seize heures de jeûne, par une bactérie, ou chez des souris immunodéficientes par un anticorps ou un transfert de cellules immunitaires, afin de tester des composés anti-inflammatoires. Le porteur retient les rongeurs parce que les études de toxicité de toute nouvelle molécule doivent porter au moins sur une espèce de rongeur. La mise à mort a pour but, selon le résumé, la récupération de "la peau et de grands volumes de sang", sans mention du côlon.

Objectifs

La colite inflammatoire se traduit par une diarrhée chronique consécutive à l’inflammation des parois de l’intestin. Elle peut être provoquée par des bactéries, des parasites, la prise de médicaments, le traitement par radiothérapie, la rectocolite hémorragique ou la maladie de Crohn. La rectocolite hémorragique est caractérisée par une inflammation de la muqueuse et sous-muqueuse du rectum et du colon. La maladie de Crohn entraîne plus de complications, car l’inflammation peut toucher le tube digestif entier, de la bouche jusqu’à l’anus, et créer une obstruction partielle de l’intestin. La colite post-radiothérapie s’observe surtout après irradiation dans la zone abdominale et pelvienne dans le cas de traitement anti-cancéreux. Les parasites et bactéries provoquent des colites spontanément résolutives, mais certains d’entre eux peuvent produire des lésions qui ressemblent à une maladie inflammatoire primitive. Ce projet a pour but de tester in vivo des composés chimiques ou biologiques dont le potentiel anti-inflammatoire aura été déterminé au préalable dans des tests in vitro. Pour cela, il est nécessaire de disposer d’un modèle rongeur où il est possible de créer un état inflammatoire du colon tel qu’on peut l’observer chez l’homme. Actuellement, l’arsenal thérapeutique disponible, notamment les anti-inflammatoires, ne permet pas de soigner correctement ces pathologies lourdes, et de multiples interventions chirurgicales sont nécessaires pour retirer au fur et à mesure les portions lésées de l’intestin. Malgré leur efficacité, les anti-TNF doivent être utilisés avec précaution dans ces pathologies car ils augmentent la survenue de maladies infectieuses. Il existe clairement un besoin thérapeutique pour soigner les colites inflammatoires. Pour réaliser ce projet, un travail important est réalisé au préalable in vitro sur des cellules humaines, ceci dans le but de sélectionner les meilleures molécules à progresser. Cependant, étant donnée la complexité des mécanismes impliqués dans les pathologies inflammatoires du colon, il est difficile de prédire le potentiel thérapeutique d’une molécule uniquement sur la base de résultats in vitro. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les différents aspects de ces maladies, afin de pouvoir évaluer in vivo les meilleurs composés identifiés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur plusieurs maladies inflammatoires digestives : maladie de Crohn, rectocolite hémorragique, colite ulcéreuse... A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour laquelle les options sont pour le moment limitées et imparfaites.

Procédures

Une colite pourra être induite par l’administration de Dextran sulfate sodium (DSS) dans l’eau de boisson des animaux soit pendant 7 jours, combiné ou non à des anticorps (2 injections par semaine, 5 minutes par injection). Ces études dureront au maximum 4 semaines. Il est aussi possible d’administrer le DSS dans l’eau de boisson trois fois 5 jours, avec 5 jours sans DSS entre les cycles. Ces études dureront au maximum 8 semaines. Le Trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) pourra aussi être administré 1 ou 2 fois par voie intra-rectale (sous anesthésie générale, acte d’1h), après 12 à 16h à jeun. Ces études dureront 2 semaines au maximum. Des bactéries Citrobacter Rodentium (administration durant 5 minutes) pourront être administrées. Ces études dureront au maximum 3 semaines. Chez des souris immunodéficientes, le modèle aigu de colite (sur 8 jours) est induit par administration d’un anticorps (injection unique, prenant 5 minutes). En utilisant les mêmes souris immunodéficientes, un modèle chronique de colite est inductible par injection de cellules immunitaires humaines ou murines (injection prenant 5 minutes). Les études dureront au maximum 16 semaines. Des modèles de souris développant spontanément une colite peuvent aussi être utilisés. Ces études dureront au maximum 22 semaines. Les animaux seront pesés deux fois par semaine avant induction, puis une fois par jour à partir de l’induction ou de l’apparition des signes cliniques dans les modèles spontanés (5 minutes). Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie : intranasale et intratrachéale (anesthésie, 1h), intramusculaire et intradermique (anesthésie, avec analgésie, 1h), orale sur animaux vigiles (1 minute), sous cutanée et intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute), ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (anesthésié 1 heure). Des prélèvements de sang ou d’urine ou de fécès pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie). Des biopsies de peau pourront éventuellement être réalisées, sous anesthésie générale avec analgésie (1h30). Des endoscopies digestives pourront être réalisées, après de 8h de mise à jeun, sous anesthésie générale (1h environ). Les animaux pourront aussi être mis à jeun avant et pendant l’administration puis la digestion de Dextran Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) afin de mesurer la perméabilité digestive (mise à jeun totale de 8h).

Impact sur les animaux

Dans ces modèles de maladies inflammatoires digestives, de la diarrhée, potentiellement hémorragique, est attendue. Des pertes de poids marquées sont attendues. Les animaux pourront recevoir des traitements par toutes voies et avec toutes les fréquences d’administrations possibles, dans le respect des recommandations vétérinaires. Des prélèvements de sang pourront être effectués dans le respect des recommandations de voies et de volume. Pour induire la colite, les animaux pourront recevoir du TNBS par voie intrarectale, une à deux fois, après mise à jeun 12 à 16H. Des endoscopies pourraient être réalisées, sous anesthésie générale, avec mise à jeun de 12h. Dans le cas où du Dextran FITC serait administré, les animaux seront mis à jeun 12h maximum.

Devenir

Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de la peau et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.

Réduction

Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. Dans tous ces modèles, il a été démontré que 8 à 11 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres, sauf dans les modèles spontanés sur souris transgéniques dans lesquels 10 à 12 animaux seront nécessaires. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévu pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.

Raffinement

La diarrhée et le sang dans les selles seront suivis quotidiennement à partir de l’induction. Dans les modèles spontanés, ils seront suivis deux fois par semaine jusqu’à apparition des signes cliniques puis une fois par jour. Le poids des animaux sera suivi deux fois par semaine jusqu’à l’induction puis une fois par jour. Dans les modèles spontanés, le poids sera suivi deux fois par semaine avant apparition de signes cliniques / pertes de poids puis une fois par jour dès l’induction. Les actes douloureux seront réalisés avec analgésie. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.

Choix des espèces

-L’administration du DSS ou du TNBS peut être réalisée sur des souris ou des rats, et est très bien documentée dans la littérature. -Pour créer un modèle de colite d’origine auto-immune, il faut utiliser des souris immuno-déficientes qui ne possèdent pas de lymphocytes T et B matures. -Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées à minima sur une espèce rongeur (rat ou souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles d’inflammation digestive d’intérêt sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.

690 seiches vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont exposées jusqu'à sept jours à des perturbateurs endocriniens par balnéation, ce qui peut altérer leur locomotion et leur camouflage, avant des tests comportementaux puis une mise à mort pour prélever leurs organes dont le cerveau. Le porteur présente le projet comme conforme aux 3R parce qu'il cherche des critères sublétaux chez un invertébré plutôt que la mort de 42 à 60 poissons du test réglementaire. Il n'en tue pas moins 690 seiches au niveau de gravité le plus élevé.

Objectifs

Ce projet vise à développer des biotests innovants répondant à la nécessité d’évaluer systématiquement les risques associés aux substances exogènes retrouvées en milieu naturel afin de réglementer leur utilisation. Une évaluation des dangers environnementaux et sanitaires associés en particulier aux perturbateurs endocriniens est décisive et considérée comme un axe de recherche de premier plan tant au niveau national qu’européen. A ce jour, le biotest le plus largement appliqué en environnement aquatique est un test de toxicité aigüe mené sur 42 à 60 poissons exposés à la substance d’essai avec la mort comme critère d’effet toxicologique (ligne directrice 203 de l’OCDE). Le projet RedPol priorise donc la recherche de critères toxicologiques subléthaux chez des invertébrés marins et le développement d’approches ex vivo/in vitro, une stratégie conforme au principe des 3R.

Bénéfices attendus

Une évaluation des dangers environnementaux et sanitaires associés en particulier aux perturbateurs endocriniens est décisive et considérée comme un axe de recherche de premier plan tant au niveau national qu’européen. Plusieurs centaines de substances exogènes sont à ce jour présumées ou suspectées de causer des perturbations endocriniennes et classées parmi les substances à évaluer selon l’UE. Les substances étudiées dans le cadre de ce projet ont été sélectionnées sur la base des critères suivants : la disponibilité de données scientifiques préliminaires, leur effet suspecté sur la faune marine et la possibilité d’aboutir à une régulation de l’utilisation de ces substances. A ce jour, le biotest le plus largement appliqué en environnement aquatique est un test de toxicité aigüe mené sur 42 à 60 poissons exposés à la substance d’essai avec la mort comme critère d’effet toxicologique (ligne directrice 203 de l’OCDE). Le projet RedPol priorise quant à lui la recherche de critères toxicologiques subléthaux chez des invertébrés marins et le développement d’approches ex vivo/in vitro, une stratégie conforme au principe des 3R.

Procédures

Les interventions de ce projet sont des expositions à des perturbateurs endocriniens et leurs conséquences. Ces expositions dureront un maximum de 7 jours, au terme desquels des texts comportementaux non-invasifs seront appliqués une fois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus de l'exposition par balnéation aux perturbateurs endocriniens potentiels sont des altérations légères à modérées des capacités de locomotion et de camouflage des seiches.

Devenir

Tous les animaux impliqués dans la procédure N°1 seront mis à mort à la fin des tests comportementaux, sans délai. Cela permettra de prélever leurs organes (notamment le cerveau) afin de quantifier d’une part le taux de contamination des animaux par les différents polluants, et d’autre part les divers neurotransmetteurs et hormones impliqués dans le contrôle des chromatophores.

Remplacement

Les perturbateurs endocriniens, de par leurs modes d’action divers et diffus, ont le potentiel d’impacter les grandes fonctions physiologiques d’un organisme dans son ensemble. Il est donc fondamental de travailler sur des animaux vivants. Toutefois, dans le cadre du développement de biotests ciblant des critères toxicologiques précis, les approches in vitro peuvent être pertinentes et doivent être encouragées. Dans le cas présent, l’analyse de l’activité des chromatophores sur échantillons de peau est une approche en cours de développement qui permettrait de tester plusieurs traitements (substances ou concentrations) sur des échantillons issus d’un même individu.

Réduction

Le choix des substances à tester représente un compromis entre la possibilité de mener une évaluation comparative et un criblage relativement large des effets toxicologiques, tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. (1) Trois concentrations seulement de chaque substance seront utilisées lors des expositions afin de limiter le nombre de lots et donc d’animaux. (2) Chaque animal sera utilisé pour un maximum d’analyses dans la mesure où cela ne génère pas d’interférence. (3) Les analyses statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques conçus pour des échantillons de faible effectif ou de modèles mixtes permettant l’utilisation de mêmes animaux pour des tests successifs.

Raffinement

Ce type de projet incluant une exposition par balnéation à des molécules limite les conditions de stabulation. Toutefois, (1) le maximum sera fait pour s’approcher le plus possible des conditions naturelles, notamment via l’utilisation de proies naturelles et locales (crevettes grises (Crangon crangon) ou crabes verts (Carcinus maenas) de taille adaptée aux animaux, récoltés aux abords de la station marine de Luc-sur-mer (CREC)), la régulation de la température de l’eau et de l’éclairage proche des variations naturelles ainsi que des manipulations limitées au minimum. (2) Les tests comportementaux sont non invasifs (basées sur la prise d’images et de vidéos) (3) Les animaux seront obtenus par prélèvement de pontes par des techniques faiblement invasives (relevé de casiers ou d'orins). L’impact de ce prélèvement sur les populations de seiches est minime puisqu’en milieu naturel, une faible fraction des jeunes arrive à maturité. (4) Les animaux seront suivis quotidiennement afin de prévenir un état de douleur, de souffrance ou d’angoisse avec comme points limites : une réduction ou un arrêt de la prise alimentaire, une altération du contrôle de la flottaison, l’apparition de lésions cutanées liées ou non à des réactions de stress (mouvements désordonnés de rétropropulsion, jet d’encre excessif). Le cas échant, et conformément aux “Guidelines for the care and welfare of cephalopods in research” (Fiorito et al. 2015), l'animal sera placée en quarantaine et, s'il n'y a pas d'amélioration (guérison des lésions cutanées et diminution du stress) ou de rétablissement complet après 48h (prise alimentaire et flottaison), euthanasié.

Choix des espèces

Les mollusques sont reconnus comme des espèces modèles de choix dans l’études des PE car ils sont particulièrement sensibles aux polluants organiques. Dans le cadre de la recherche de critères d’effets toxicologiques subléthaux, les céphalopodes offrent l’avantage supplémentaire de manifester des signes facilement analysables de leur État physiologique et de leurs chances de survie à long terme tels que leurs comportements de survie (locomotion, prédation, efficacité de leur camouflage). La seiche commune (Sepia officinalis) est une espèce modèle bien étudiée d’un point de vue neuroéthologique et physiologique. On dispose par conséquent d’une large gamme d’outils analytiques de son comportement et de son camouflage. Par ailleurs, l'établissement qui acceuillera ce projet est un des rares établissements en Europe possédant les infrastructures habilitées et les compétences reconnues pour héberger cette espèce. Premiers mois post-éclosion de l’animal, période couvrant les étapes clés du développement cérébral, comportemental et cognitif de la seiche

165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur provoque chez elles un état de mal épileptique et des crises, avec deux chirurgies dont une pose d'implants d'une heure et demie, avant prélèvement du cerveau. Il teste une thérapie génique visant des récepteurs de l'hippocampe, en vue de nouvelles cibles présentées comme lointaines. Il affirme que l'étude est impossible in vitro et in silico, faute de méthode alternative.

Objectifs

L'objectif principal de ce protocole et d'utiliser un modèle murin d'épilepsie afin de tester de nouvelles approches de thérapie génique par injection de vecteurs viraux exprimant des micro-RNA (acide ribonucleique). Des données récentes de la littérature indiquent en effet un rôle des récepteurs kaïnate de l'hippocampe dans l'épilepsie temporale. En particulier il a été démontré que l'inhibition des récepteurs kaïnate permettait de réduire significativement l'épilepsie temporale. Ce protocole vise à tester l’effet de l’inhibition de l’expression des récepteurs kaïnates sur le développement des crises d’épilepsie.

Bénéfices attendus

Le développement d’un protocole d'étude de l'épilepsie nous permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques de cette pathologie et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Induction du status epilepticus et des crises d’épilepsie (impossible de quantifier le nombre en amont). Opérations chirurgicales : tous les animaux sont soumis à deux procédures chirurgicale. La première chirurgie dure environ 20 mins. Au cours de la deuxième procédure des implants sont positionnés. Cette deuxième chirurgie dure environ 1h30. Prélèvements de tissus : tous les animaux sont soumis au prélèvement du cerveau après perfusion intracardiaque à la fin de l'expérimentation.

Impact sur les animaux

Les sources éventuelles de douleurs ou souffrance dans notre procédure : la chirurgie, les crises d’épilepsie ainsi que l'isolement des animaux en cage individuelle.

Devenir

Euthanasie de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau.

Remplacement

Nous étudierons l'effet de traitements innovants sur l'épilepsie chez des souris libres de leur mouvement afin de quantifier précisément l'occurrence des crises d'épilepsie et leur réduction après traitement. Par conséquent, il sera impossible de mener cette étude in vitro. Enfin, compte tenu de l’état actuel des connaissances, les questions que nous abordons ne peuvent être traitées in silico. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.

Réduction

Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 165 animaux pour la réalisation de ce protocole.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude de l'épilepsie. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.

360 sardines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 180 tuées pour prélever leurs tissus et 180 gardées vivantes pour observer une ponte. Chaque poisson subit douze biométries sous anesthésie et deux biopsies musculaires, puis des mesures de métabolisme et un test de fuite face à un prédateur, sous un régime pauvre en oméga-3 et une eau réchauffée. Le porteur étudie l'adaptation de l'espèce au changement climatique, en vue de modéliser l'état des stocks. Il affirme qu'il est "indispensable" d'expérimenter sur cette espèce, dont la physiologie serait mal connue.

Objectifs

L'étude vise à comprendre comment les fonctions physiologiques et comportementales d’une espèce de petit poisson pélagique, la sardine Sardina pilchardus, s’ajustent face aux conditions environnementales. En particulier, l’objectif est d’étudier comment sont impactées les performances physiologiques de cette espèce de fort intérêt écologique et halieutique en termes de croissance, taux métaboliques, et comportement anti-prédateur, face à un scénario futur couplant une baisse en oméga-3 dans l’alimentation et une hausse de température des océans.

Bénéfices attendus

Les données physiologiques et comportementales obtenues permettront de mieux comprendre les réponses physiologiques et comportementales de la sardine, espèce dont la physiologie est mal connue, dans un contexte de changement climatique. Aussi, les données obtenues au niveau de l’individu seront utilisées par la suite dans notre projet pour modéliser les réponses au niveau de la population. Ceci permettra à terme de mieux comprendre la répartition des stocks, mais aussi la qualité des stocks en termes d’oméga 3, dans un contexte de changement climatique.

Procédures

- Tout au long du conditionnement, nous suivrons le taux de croissance individuel à travers des biométries bimensuelles. Chaque poisson (n=360) subira donc 12 biométries d’environ 2 minutes chacune. - Tout au long du conditionnement, nous suivrons également la composition en acides gras individuellement sur les 360 individus par (1) une première biopsie réalisée au T0 du conditionnement sur le flanc gauche, au-dessus de la ligne latérale, (2) une seconde biopsie musculaire réalisée 2 mois après le début du conditionnement, cette fois sur le flanc droit, au-dessus de la ligne latérale. Chaque poisson (n=360) subira donc 2 biopsies, qui dure chacune environ 5 minutes. - Entre 4 et 6 mois après le début du conditionnement, les performances physiologiques et comportementales des individus seront évaluées: • A l’issue de 4 mois de conditionnement, les taux métaboliques des 360 individus, c’est à dire la quantité d’oxygène consommée par unité de poids et de temps, seront mesurés par respirométrie 4 fois par bassin, sur 24h (durée totale estimée pour tester les 12 bassins : environ 2 semaines). • A l’issue de 5 mois de conditionnement, les performances de fuite seront mesurées sur 180 individus, à raison de 5 individus à la fois, par analyse vidéo sur 24h, (durée totale estimée pour tester les 180 individus : environ 1 mois). La réponse de fuite mesurée en tant que telle ne dure que quelques secondes, mais les animaux seront gardés 24h en tout dans le bassin test. • Un prélèvement sanguin, durant environ 3 minutes, sera effectué à la suite des mesures de réponses de fuite, c’est-à-dire environ 6 mois après le début du conditionnement, sur ces mêmes 180 individus. - Des mises à jeun de 24h seront effectuées avant chaque biométrie, biopsie, mesure de respirométrie et mesure de réponse de fuite

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus concernent : (1) la biométrie qui nécessite une anesthésie puis une contention des animaux, et qui peut alors générer un stress léger durant environ 3 minutes par poisson, (2) les biopsies qui nécessitent une anesthésie, une contention, et une cicatrisation, et qui peuvent alors générer une douleur et un stress modéré pendant environ 5 minutes, (3) la respirométrie (mesure des taux métaboliques) peut générer un stress léger si le niveau d’oxygénation du bac descend en dessous du seuil de 75% d’oxygène, considéré comme la limite de la normoxie. Ce stress n’excèdera pas 15 minutes, qui est la durée durant laquelle la pompe permettant le renouvellement d’eau reste fermée pour permettre la mesure de consommation en oxygène des individus, (4) la réponse de fuite peut générer un stress modéré durant environ 5 minutes, lié au fait que nous stimulons les individus avec un stimulus expérimental mimant un prédateur, et cherchons à générer une réponse de fuite, (5) le prélèvement sanguin lié à l’anesthésie et à la contention peut générer un stress modéré et une douleur pendant environ 3 minutes, (6) le cumul des actes sur un même individu peut générer un stress sévère d’une dizaine de minutes, notamment du fait que les prises de sang seront effectuées juste après la mesure de réponse de fuite.

Devenir

A l’issue de la procédure, 180 animaux ayant subi le test de de fuite seront mis à mort pour prélever leurs différents tissus nécessaires à l'analyse des acides gras, à la mesure de l'expression de gènes (foie, muscle, cerveaux, yeux), ainsi qu'à la détermination de l’âge (otolithes). Les 180 autres seront gardés en vie et replacés dans un bassin commun pour voir si une ponte naturelle a lieu, puisque la période correspondra à une période de ponte en milieu naturel, et que des pontes spontanées ont déjà été obervées dans d'autres laboratoires à cette période.

Remplacement

Cette étude vise à caractériser les réponses physiologiques et comportementales de la sardine (croissance, synthèse des acides gras, taux métaboliques, évitement des prédateurs) face aux changements environnementaux. Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser le résultat d’interactions complexes entre différents tissus et fonctions, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. En effet, les processus étudiés s’appliquent à l’organisme vivant, dans son intégrité et toute sa complexité.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte-tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. L’estimation a été faite à partir de données de variabilités (notamment de croissance, de données d’expression de gènes, et de mesures d’acides gras) obtenues dans des expériences préalables sur d’autres espèces moins grégaires (prise en compte de la puissance des tests statistiques). Pour permettre d’utiliser un minimum d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les mesures de respirométrie et de réponses de fuite. Pour tester l’effet du conditionnement sur les variables étudiées, nous utiliserons des tests de comparaison de moyennes du type ANOVA à un facteur et ANOVA à mesures répétées.

Raffinement

Les mesures de raffinement tiennent compte des contraintes zootechniques et notamment de la densité minimale d’animaux requise pour permettre aux animaux d’exprimer les meilleurs répertoires physiologiques et comportementaux possibles. Lors des marquages, des biométries, des biopsies, et prises de sang, les poissons à jeun seront sédatés légèrement par injection directement dans leur bac d’origine d'un anesthésiant pour limiter leur stress et faciliter la pêche. Ils seront ensuite délicatement pêchés à l’aide d’un bécher opaque, pour limiter la manipulation des animaux et la perte des écailles (les sardines étant particulièrement sensibles aux manipulations), puis transvasés dans un seau d'anesthésiant. Ce bain d’anesthésiant contiendra également une solution à base d’aloé vera qui permet de former une petite pellicule sur la peau des poissons limitant ainsi la perte des écailles et les lésions dues à la manipulation. Afin de favoriser une récupération rapide de la biopsie, une incision superficielle de 5 mm de la peau au-dessus de la ligne latérale après asepsie permettra au punch à biopsie d’atteindre le muscle sans enlever de peau. A la suite de la biopsie, un antiseptique puis une goutte de colle chirurgicale recommandée par notre vétérinaire référent seront appliquées sur la zone incisée. Pour la mesure des taux métaboliques par respirométrie, l’ensemble du montage expérimental sera placé derrière un rideau, et le système mis en place directement dans les bassins permettra d’éviter aux individus le stress d’un transport, et de ressentir les modifications de changements cycliques du régime d’écoulement. Le niveau d’oxygénation du bassin sera contrôlé en permanence et ne descendra pas en dessous de 75% de saturation en oxygène, considéré comme la limite de la normoxie. Les animaux seront en surveillance permanente. Ils seront retirés de la procédure dès que le point limite sera atteint (les points limites sont décrits dans l’item prévu à cet effet). Pour le test de fuite, qui génère un stress qui est très souvent rencontré en milieu naturel, chaque individu ne sera testé qu'une seule fois. Le poisson sera complètement isolé de l’environnement extérieur, et son comportement sera observé en permanence par vidéo.

Choix des espèces

Le projet se focalise sur la sardine (Sardina pilchardus), petit poisson pélagique d'intérêt écologique et économique. L'étude vise à comprendre comment les fonctions physiologiques et comportementales de cette espèce de petit pélagique s’ajustent face aux conditions environnementales. Il est donc indispensable d'expérimenter sur cette espèce. Stade adulte de première année (20 g et 14 cm environ). Il s’agit du stade qui permet le meilleur taux de survie après la pêche en milieu naturel. Grâce à leurs sonars, les pêcheurs sont capables, avant même de jeter le filet à l’eau d’avoir une idée de la taille des individus du banc et donc de savoir s’ils correspondent à ceux que l’on cherche. Aussi, la période de juin nous assure de trouver des individus d’un an environ. L’âge exact des individus ne pourra toutefois être confirmé qu’après sacrifice et prélèvement des otolithes, à l’issue de l’expérience.

Une partie des souris est génétiquement modifiée pour que les neurones de la perception de la douleur puissent être supprimés, et d'autres subissent cette suppression par un traitement dès l'âge de trois ou quatre semaines. 1 808 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des pattes, de la moelle épinière et des ganglions rachidiens. Elles développent une arthrite ou une forme de sclérose en plaques provoquée par l'équipe, sans que le résumé décrive comment, et reçoivent jusqu'à 21 injections quotidiennes de TAFA4. La sclérose induite paralyse leurs membres arrière. Le porteur écrit qu'"aucun analgésique ne peut être utilisé" sans compromettre ses résultats, et promet dans le même texte un "soin particulier" pour éviter la souffrance.

Objectifs

De nombreuses études suggèrent que les neurones impliqués dans la perception de la douleur jouent un rôle important dans le développement des maladies inflammatoires. Notre projet a pour objectif de déterminer le rôle de ces neurones sur l’évolution de deux maladies inflammatoires : la polyarthrite rhumatoïde, causant une inflammation des articulations et la sclérose en plaque, causant une inflammation de la moelle épinière. Un objectif secondaire de ce projet sera également d’étudier le potentiel thérapeutique d’une molécule aux propriétés anti-inflammatoires.

Bénéfices attendus

A ce jour, peu d’études décrivent comment les neurones impliqués dans la perception de la douleur influencent l’apparition et l’évolution des maladies inflammatoires. Notre projet permettra donc à la fois de mieux comprendre comment ces neurones influencent ces maladies inflammatoires et permettra également d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques dans ces maladies chroniques, très invalidantes et nécessitantes de nouvelles thérapies.

Procédures

Outre l’induction de l’arthrite et du modèle de sclérose en plaque qui sont l’objet de notre étude, les animaux vont subir des injections quotidiennes de traitement. La durée de l'intervention (contention + injection intra péritonéale) est de moins d'environ 45 secondes par animal. Les injections de TAFA4 pourront durer jusqu'à 21 jours (une injection par jour soit 21 injections).

Impact sur les animaux

Nos expériences sont susceptibles de déclencher des douleurs chez les animaux. Compte tenu de la nature même du projet qui propose d’explorer l’effet des neurones impliqués dans la perception de la douleur, aucun analgésique ne peut être utilisé sans compromettre les résultats expérimentaux. Notre modèle de sclérose en plaque induit une paralysie des membres inférieurs entrainant une difficulté à accéder aux croquettes. Une nourriture gélifiée sera ajoutée systématiquement lors pour prévenir la dénutrition des souris.

Devenir

mise à mort des animaux à la fin des procédure. En effet, pour cette étude nous avons besoin de prélèver différents organes (pattes, moelle épinière, ganglions rachidiens) pour analyser leur composition immunitaire, le score histologique etc.. afin de comprendre les mécanismes de ces pathologies. Les prélèvements nécessitent une euthansie de l'animal.

Remplacement

Nous proposons que les neurones responsables du ressenti de la douleur joue un rôle dans le développement des maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde et sclérose en plaque. Seuls les modèles animaux mimant la complexité du système nerveux périphérique ainsi que de la réponse inflammatoire permettront de vérifier cette hypothèse. Ces interactions ne peuvent à ce jour pas être modélisées ni in vitro ni in silico. Cependant, pour la recherche du mécanisme de l’interaction neurone/cellule immunitaire nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques de remplacement.

Réduction

Le plan de nos expériences sera construit de sorte à limiter le nombre de souris. Le modèle d’arthrite a été choisi et optimisé afin d’obtenir une incidence proche de 100% et une variabilité minimale, permettant ainsi de réduire au minimum le nombre de souris nécessaire. Le modèle de sclérose en plaque est quant à lui le seul modèle murin mimant la pathologie humaine. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisé nous avons modélisé les tests statistiques en amont de nos expériences pour déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour répondre à chacune de nos hypothèses de travail.

Raffinement

Stratégie de réduction du stress : Pour réduire l’angoisse des animaux, un temps d’acclimatation d’au moins une semaine sera respecté avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons de souris en dôme de cellulose et fournies pour l'enrichissement environnemental. Les souris sont nourries et boivent ad libitum, et sont libres de leur déplacement. Stratégie de réduction du la souffrance : Une surveillance quotidienne est réalisée par des spécialistes animaliers permettant de subvenir aux besoins nécessaires au bien-être des animaux. Un soin particulier sera apporté pour éviter la souffrance des animaux par la surveillance de signes extérieurs de souffrance. L’atteinte d’un point limite entrainera la décision d’euthanasie de l’animal concerné. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage des animaux souffrant de sclérose en plaque pour assurer une alimentation suffisante.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle idéal pour notre étude dû au haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, l’état des connaissances actuelles, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de reproduction court. En particulier, la génération de souris génétiquement modifiées bien maitrisée dans notre laboratoire dans lesquelles les neurones sujets de notre étude peuvent être déplétés font de la souris un modèle non remplaçable. Des souris d’âge minimum de 6 semaines seront utilisées afin d’avoir un système immunitaire et sensitif mature. Pour les expériences utilisant une déplétion pharmacoloqique de ces neurones, nous utiliserons des souris âgées de 3-4 semaines. En effet, l’injection doit être effectuée le plus précocement possible lors du développement du système nerveux afin d’obtenir une déplétion optimale. La sclérose en plaque et l’arthrite seront ensuite induites à partir de 6 et 8 semaines, respectivement.

6195 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de cellules tumorales déclenchant des métastases, puis des administrations de substances jusqu'à quatre fois par jour, avec perte de poids, hypothermie et difficultés respiratoires déclarées. Le porteur développe ces modèles pour tester des anticancéreux pour "des clients du secteur industriel privé" comme pour la recherche publique. Il affirme que les métastases ne peuvent être reproduites in vitro.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé publique majeur et représente la deuxième cause de décès dans le monde. Les métastases correspondent à un processus de migration des cellules tumorales de la tumeur primaire vers des organes distants. Les métastases sont la principale cause de décès par cancer. Il reste ainsi nécessaire de disposer de modèles complexes et prédictifs pour évaluer la complexité du microenvironnement tumoral. Dans ce projet, des cellules issues de tumeurs seront injectées à des rongeurs selon différentes voies d’administration afin de permettre d’examiner de larges cohortes de tumeurs dont la croissance et la réponse aux médicaments pourront être évaluées. Les modèles de métastases chez l’animal sont complexes mais récapitulent l’effet de molécules sur le microenvironnement « normal » des métastases et reste prédictif de la réponse aux traitements en recherche. Dès lors l’utilisation d’animaux vivants est donc nécessaire afin de tester de nouvelles substances pharmacologiques. Les procédures décrites dans ce projet correspondent à la création de différents modèles de métastases chez le rongeur (souris ou rat). L’objectif est de mesurer différents critères (taille de la métastases, survie...) afin d’évaluer l'efficacité ou la toxicité de molécules aux propriétés anticancéreuses décrites ou potentielles.

Bénéfices attendus

Le projet consistera à développer des modèles de métastases chez le rongeur pour les différentes indications en oncologie, qui permettra de tester l'efficacité d'anticancéreux pour des clients du secteur industriel privé ou des laboratoires de recherche publique ou dans un contexte de recherche interne. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux pour des procédures de test dans un autre laboratoire dans le cas de collaboration.

Procédures

Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 à 30 minutes pour les phases de chirurgie ou d’injection. Toujours sous anesthésie, les animaux subiront une injection rapide (

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables inhérents au développement tumoral pourront apparaître pendant une étude : - Une perte de poids corporel - Un comportement amorphe marqué pendant les périodes de vigilance - Une hypothermie persistante - Une distension anormale de l’abdomen pouvant être le signe d’un épanchement - Des problèmes de respiration pour l’animal - Une incapacité de se nourrir ou boire L’ensemble de ces symptômes sera monitoré pendant l’étude afin d’appliquer des mesures pouvant amener à l'euthanasie de l’animal avant la fin de l’étude pour raison éthique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs et cela ne permet pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.

Remplacement

Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de métastases s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.

Réduction

Des analyses in-vitro pourront être réalisées en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.

Raffinement

Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, …), permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et de chirurgie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à posteriori la catégorie si nécessaire.

Choix des espèces

Les rongeurs rats et souris demeurent essentiel à étudier les tumeurs in vivo et à comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. En effet, les métastases présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale et une forte prolifération des cellules. Il n’est pas possible de reproduire ces éléments in vitro et nécessite une système complexe comme les modèles animaux. Les deux genres mâle et femelle seront utilisées car le cancer affecte aussi bien les hommes que les femmes. De plus, la nécessité d'utiliser les 2 genres est aussi due au type de cancer (exemple : femelle pour le cancer des ovaires, mâle pour le cancer de la prostate). Tous les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines de développement que ce soit des rats ou des souris. Dans certains cadres, les animaux pourront être utilisés avant sevrage dans des modèles génétiques ou de tumeurs pédiatriques.