Procédures sévères

80 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une injection de virus Ebola ou Nipah et des injections quotidiennes de molécules candidates, sous une douzaine d'anesthésies, pour évaluer l'efficacité antivirale de ces molécules. Le porteur indique que les hamsters témoins doivent développer les signes de l'infection, dont une perte de poids, des troubles respiratoires ou neurologiques et une possible mort. Il reconnaît l'existence de méthodes in vitro qu'il juge prometteuses mais trop localisées, et conclut à la nécessité du modèle animal.

Objectifs

Les virus Ebola (EBOV) et Nipah (NiV) sont des agents pathogènes viraux. Il n’existe pas, à l’heure actuelle, de contre-mesure efficace (vaccin, antiviraux, …) pour lutter contre les virus, à l’exception de quelques candidats vaccins dirigés contre le virus EBOV, utilisés en situation d’épidémies en Afrique. Ces virus peuvent être transmis par contamination interhumaine directe, et sont responsables de fièvres hémorragiques (EBOV) ou d’encéphalites sévères et/ou de syndromes respiratoires (NiV) chez l’humain, avec un taux de mortalité relativement élevé (jusqu’à 90% pour EBOV et 75% pour NiV, selon les souches et épidémies). Ces pathogènes constituent un problème de santé publique majeur, dont les maladies induites figurent sur la liste de l’Organisation Mondiale de la Santé des maladies prioritaires en matière de recherche et développement. L’émergence d’épidémies comme celle à virus Soudan ebolavirus actuellement observée en Ouganda souligne la nécéssité de disposer de moyens efficaces pour lutter contre ces virus. Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité antivirale de molécules préalablement sélectionnées in vitro, contre les virus EBOV et NiV.

Bénéfices attendus

Dans le contexte d’absence de traitement contre les virus Ebola et Nipah, le développement et l’évaluation de molécules antivirales permettraient d’identifier un ou plusieurs molécules à visée thérapeutique. Cette/ces molécule(s) pourront ensuite être potentiellement utilisées chez l’Homme en contexte de traitement chez les personnels de santé, les manipulateurs du virus ou la population à risque.

Procédures

La procédure expérimentale soumettra chacun des animaux, de la réception jusqu’à la fin du protocole à : des anesthésies gazeuses (au nombre de 12 prévues au protocole et d'une durée maximale de 10 minutes chacune), des administrations de molécules (10 injections, une par jour) et du virus (une injection unique) par voie intra-péritonéale (sur animal anesthésié), et enfin à mise à mort (animal anesthésié) pour réaliser les prélèvements de sang et des organes d’intérêt.

Impact sur les animaux

Les animaux contrôles devraient développer les signes cliniques caractéristiques d’une infection par le virus Nipah ou par le virus Ebola, tels qu’une perte de poids, une diminution de la locomotion et du toilettage, une perte de tonus ainsi que des troubles respiratoires et de potentiels signes neurologiques. Ces signes peuvent être accompagnés d’une mortalité avec peu de signes précurseurs : l’observation d'oreilles redressées, de troubles neurologiques et/ou respiratoires. Les animaux traités par une des molécules candidates devraient présenter moins ou pas de signes contrairement aux animaux non traités.

Devenir

L'étude implique que les organes puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux (n=80) puis analysés, ceux-ci étant répartis en 4 groupes expérimentaux pour chacun des deux virus. Par conséquent, seule la mise à mort des 80 individus de l'étude permettra d'obtenir des données virologiques suffisantes permettant de comparer l'efficacité des molécules comme possible stratégie thérapeutique antivirale.

Remplacement

Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro et ex vivo, dérivées de la culture cellulaire (classiquement utilisée depuis des décennies) ou de l’animal. Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement ou à maintenir les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans un organisme. En revanche, ces cultures in vitro ou ex vivo permettent de se focaliser sur un organe mais pas sur un organisme vivant (système immunitaire circulant, flux sanguin, circulation lymphatique). Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées. Afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces molécules, et suite aux divers tests in vitro, elles doivent désormais être testées dans un modèle plus complexe mimant l’infection par les virus Ebola et Nipah. Ces tests in vitro ne permettent pas actuellement de répondre à des questions globales telles que la mise en place de la malade et de ses symptômes, ou la mise en place des réactions immunitaires suite à une réponse à un traitement et à une épreuve virale.

Réduction

Concernant l’évaluation de thérapeutiques antivirales, en étudiant également l’effet de genre, nous avons déterminé l’effectif nécessaire comme étant de 10 hamsters par groupe expérimental, comportant chacun 5 mâles et 5 femelles. Nous nous sommes également basés sur les précédents projets réalisés par l’équipe et des collaborations de recherche à l’origine de ce projet. Les animaux inclus dans cette étude seront infectés par un stock déjà caractérisé à une dose permettant une observation de symptômes chez la totalité des individus.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par 2 ou 3 dans des cages adaptées au système d’hébergement. Chaque cage est équipée de litière (copeaux et rafle de maïs) et de matériel permettant la nidification (coton, mouchoirs, ...), ainsi que d’une maison/d’un abris en carton et d’une roue d’exercice. L’alimentation et la boisson sont en accès libre dans chaque cage. Les observations journalières seront réalisées afin d’évaluer l’état de chacun des animaux selon une matrice de score établie pour ce modèle, et selon le virus utilisé et les signes cliniques attendus. Un système de vidéosurveillance permettra de visualiser les animaux pendant les périodes où les membres de l’équipe ne seront pas présents en laboratoire.

Choix des espèces

Le hamster doré est le modèle de référence pour l’étude du virus Nipah. Il a été développé il y a quasiment 20 ans au laboratoire puis utilisé dans le cadre de divers projets collaboratifs. L’étude de ce modèle dans le contexte d’une infection par le virus Ebola sera réalisée par utilisation d’une souche de virus adaptée au hamster, développée par une des équipes collaboratrice lors de précédents projets de recherche (travaux non publiés). Les animaux seront âgés de 8 à 10 semaines selon la disponibilité. Ces âges correspondent aux stades de développement des hamsters utilisés par la communauté scientifique pour les études pré-cliniques portant sur les virus d’intérêt de ce projet.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection déclenchant une maladie proche de la sclérose en plaques, responsable d'une paralysie de la queue et des membres postérieurs, avant une imagerie de l'inflammation cérébrale. Le porteur indique suivre la douleur par une grille et un "grimace scale", et retirer les animaux perdant plus de 15 % de leur poids. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants n'apporterait le même niveau d'information et qu'il n'existe pas de modèle fiable sur des espèces jugées moins sensibles.

Objectifs

L’imagerie médicale est couramment utilisée en clinique dans le diagnostic et le suivi des patients atteints de pathologies cérébrales. L'objectif de ce projet est d'utiliser un nouveau type d'imagerie médicale afin de détecter de manière précise l'inflammation cérébrale. Notre laboratoire est spécialisé dans l’étude de l’inflammation du cerveau. Cettenouvelle technique d'imagerie consiste en l’injection intraveineuse d'un agent de contraste spécifique de la protéine vasculaire étudiée. Ici, les protéines étudiées sont celles impliquées dans l’infiltration des cellules immunitaires à travers la paroi des vaisseaux sanguins.

Bénéfices attendus

L'inflamamtion du cerveau est présente dans de nombreuse pathologies, comme la sclérose en plaques, les accidents vasculaires cérébraux et la maladie d'Alzheimer. Le développement de l'imagerie de l'inflammation cérébrale permettrait une meilleure prise en charge des patients atteints de ces différentes maladies.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions: (1) Induction d'un modèle de sclérose en plaques. (2) Imagerie de l'inflammation cérébrale.

Impact sur les animaux

L’induction du modèle de slcérose en plaques s’effectue via l’injection d’un cocktail induisant l’apparition d’une réaction auto-immune, responsable à terme d'une paralysie de la queue et des membres postérieurs. Un score clinique neurologique sera effectué tous les jours (dès le 1er jour jusqu’au jour de l’euthanasie) afin d’évaluer la douleur et l’atteinte neurologique des souris. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveillance du poids et retrait de l’étude si une perte de plus de 15% est observée par rapport au poids initial. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de douleur sont également le suivi basé sur le "grimace scale", une couverture analgésique suffisante en période pre et post induction, l'hébergement en petits groupes sociaux stables avec un enrichissement minimum (un carré de coton, dôme en carton, paillettes). Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température, hygrométrie, luminosité, et durée du cycle de lumière.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses de microscopie.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. En effet, la souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans la l'inflammation cérébrale, grâce à différents modèles bien caractérisés comme celui de la sclérose en plaques utilisée dans ce projet. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables de l'inflammation rencontrée chez les patients. Enfin, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera à volonté. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post induction et un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires desvaisseaux cérébraux sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l'efficacité de l'imagerie dans la détection de l'activation vasculaire dans les modèles d'inflamamtion cérébrale. Le stade de développement des animaux est de 2 à 3 mois. Il est classiquement décrit que le modèle de sclérose en plaques ne peut-être induit que dans cette fenêtre de temps, qui correspond à la pathologie humaine qui touche de jeunes adultes.

1 188 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après trois mois de régime enrichi en graisses, elles subissent une chirurgie provoquant un accident vasculaire cérébral, puis des tests de comportement et de l'imagerie, pour étudier la réparation cérébrale liée à l'âge et aux troubles métaboliques. Le porteur indique que le modèle induit une douleur peropératoire, une perte sensorimotrice, une prise de poids importante et une possible déshydratation. Les bénéfices pour l'être humain restent au conditionnel, tandis que le porteur affirme que l'étude ne s'envisage que dans un "organisme entier" et juge le passage à l'animal "indispensable".

Objectifs

Cette étude a pour objectif de caractériser le rôle de l’âge et des perturbations métaboliques qui font partie des facteurs de risque bien identifiés dans les pathologies cardiovasculaires, première cause de mortalité dans le monde dont l’accident vasculaire cérébral (AVC) fait partie. L’étude s’intéressera particulièrement à comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse et la réparation cérébrale et vasculaire suite à un AVC, en prenant en compte ces facteurs de risques. A terme, l’objectif est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour offrir des possibilités adaptées d’améliorer les résultats cliniques suite à un AVC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités). Il pourra en découler l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Après 3 mois d'alimentation enrichie en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (1 injection de glucose et prélèvement de 5 gouttes de sang pour mesure de la glycémie toutes les 30 min pendant 2h). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique en utilisant un modèle in vivo d'ischémie cérébrale (chirurgie sous analgésie et anesthésie gazeuse d'une durée de 15+5 min, suivie de 2 injections d'analgésiques 2 fois par jour pendant 3 jours). Les effets du régime sur la réponse à l’ischémie seront analysés 48h, 7 et 21 jours après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement (3 tests d'une durée de moins d'1 min par test) et de l’imagerie (méthode non invasive).

Impact sur les animaux

L’âge et le changement de l’alimentation induit une prise de poids qui est conséquente (animaux de 35 – 60g). La douleur induite par l’injection dans l'abdomen de glucose peut également être une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire une étude protéique, moléculaire et de tri cellulaire.

Remplacement

Le projet a pour but d’étudier l’ischémie cérébrale, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques dons le calcul de puissance est effectué en utilisant le logiciel in vivoStat. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu de vieillissement vasculaire et un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. De plus, le plus grand nombre de tissus et organes d’un animal mis à mort sera systématiquement prélevé et stocké pour l’utilisation de projets futurs sur les rôles de ces perturbations métaboliques.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique (buprénorphine) en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 72h. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse par isoflurane). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle murin pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Après une étude in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions angiogéniques et sécrétoires des cellules endothéliales, le projet a pour but maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale, représentant un enjeu majeur de santé publique, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il est donc indispensable de passer à des études chez l’animal. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC et du vieillissement vasculaire. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte avec des facteurs métaboliques aggravant comme le diabète, les animaux seront utilisés au stade adulte après un régime conduisant à des perturbations métaboliques systémiques en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime (âge nécessaire pour avoir un vaisseau mature et qui peut subir un vieillissement vasculaire semblable au vieillissement vasculaire humain).

6 192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un cancer de la cavité buccale leur est induit par un agent chimique, le 4NQO, puis elles reçoivent des injections quotidiennes de traitements, des pesées et des inspections sous isoflurane, avant une mise à mort par dislocation cervicale pour prélever la langue. Le porteur reconnaît des douleurs, une perte de poids et des difficultés à s'alimenter liées aux tumeurs buccales. Il présente des co-cultures cellulaires comme insuffisantes pour reproduire la complexité de l'organe, pour une recherche dont les retombées pour les patients restent hypothétiques.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d'étudier le rôle des cellules immunitaires appelées neutrophiles dans la progression tumorale du carcinome épithélial oral. Plus précisemment nous souhaitons étudier une des fonctions des neutrophiles : la formation de « Neutrophil Extracellular Traps » (NETs) dans le developpement cancéreux. Les NETs sont des filaments d’ADN recouverts de protéines qui sont libérés par les neutrophiles, afin de piéger et tuer les micro-organismes pathogènes lors d'une infection. Cependant des études ont montré que ces NETs ont également des propriétés pro-tumorales. Notre hypothèse est que les neutrophiles qui forment des NETs entrainent la progression du cancer via i) l’activation des fibroblastes (des cellules saines de soutien des tissus) et ainsi la mise en place d’un environnement riche en matrice extracellulaire qui est nécéssaire à la croissance des tumeurs ; ii) l’inhibition des lymphocytes T CD8 cytotoxiques (des cellules immunitaires normalement capables de tuer les cellules cancéreuses). En effet, cet environnement est indispensable au développement tumoral et à l’invasion du cancer. Plus spécifiquement, nos expériences de culture cellulaire montrent que les NETs activent les fibroblastes capables de remodeler la matrice extracellulaire, ce qui augmente les capacités tumorales et invasives des cellules cancéreuses. De plus, nous avons identifié i) la protéine PD-L1 présente sur les NETs qui inhibent les capacités cytotoxiques des lymphocytes T CD8 ; ii) que les NETs activent la molécule du TGFβ également connu pour inhiber les capacités cytotoxiques des lymphocytes T CD8. Il en découle un environnement propice au développement des cellules tumorales. Nous souhaitons confirmer nos résultats chez la souris en utilisant le modèle 4NQO de carcinome épithélial oral. Nous nous attendons à une diminution de la progression tumorale après avoir supprimé des neutrophiles et la formation des NETs. Le but est d'utiliser ce modèle pour confirmer le rôle des voies de signalisation impliquées dans le recrutement des neutrophiles, la formation de NETs, l’activation des fibroblastes et l’inhibition des lymphocytes T CD8 sur le développement tumoral des carcinomes épithéliaux.

Bénéfices attendus

Notre étude nécessite l’utilisation d’animaux mais pourrait déboucher sur la mise au point de nouveaux médicaments permettant d’améliorer les traitements pour les patients atteints de carcinome épithélial.

Procédures

Les animaux seront manipulés par contention classique quotidiennement pour inspecter leur état général et leur administrer par injection intrapéritonéales les différents traitements (piqures en bas de l'abdomen, quotidiennement pour les inhibiteurs et 3 fois par semaine pour les anticorps). La contention de chaque animal durera en moyenne 20 – 25 secondes et sera réduit autant que possible dès que les conditions le permettront afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Par ailleurs, chaque animal sera pesé 3 fois par semaine, ce qui nécessitera une manipulation de l’animal courte (environ 5 secondes) pour le déposer sur la balance et le remettre dans sa cage. Enfin, 1 fois par mois, les animaux seront sédatés avec de l'isoflurane pour les endormir, puis maintien au masque d'isoflurane (2-3 minutes maximum par souris) le temps d’inspecter l’aspect de la cavité buccale, et pouvoir suivre l’évolution du développement cancéreux. Les animaux se réveilleront dans leur cage posée sur un tapis chauffant et sous une lampe chauffante. Nous nous assurerons de leur réveil complet et normal à chaque fois.

Impact sur les animaux

Les signes cliniques attendus des animaux développant des tumeurs sont des signes de douleurs, une perte de poids (entre 5% et 10% du poids initial) dû à des difficultés à s’alimenter pour les animaux qui développent des tumeurs dans la bouche, et des signes de stress induit par l'injection répétée en intra-péritonéale des traitements.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience car nous aurons besoin de prélèver ensuite la langue des animaux pour analyser les lésions qui se seront développées en réponse au traitement cancérigène 4NQO.

Remplacement

Nos recherches ont décrit les cultures organotypiques comme une méthode de remplacement pour l’étude du développement métastatique. Nous avons déjà développé des modèles in vitro permettant de vérifier le rôle des NETs sur les capacités tumorales des CS (lignée de CS isolés à partir de souris DMBA/TPA). L’utilisation de co-cultures de cellules tumorales/neutrophiles/fibroblastes/lymphocytes in vitro, utilisées en routine au laboratoire, est envisagée aussi souvent que possible pour remplacer l’expérimentation animale, ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. Cependant ces cultures ne récapitulent pas la complexité de l’organe, nous avons donc recours aux animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour pouvoir détecter toute différence significative entre les groupes expérimentaux, avec un nombre de souris minimal. En effet, pour l’étude des lésions cancéreuses très avancée, il nous faudra suffisamment d’animaux par groupes ayant développé spontanément ces lésions avancées pour avoir des analyses statistiques fiables. Nos résultats générés in vitro et in vivo sous une précédante DAP nous ont permis de générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux dans toutes les procédures proposées. D'autre part, le fait que ce modèle soit largement utilisé et décrit par la communauté scientifique nous permettent de connaitre la cinétique de développement de la maladie. Ainsi nous avons générer une analyse statistique prévisionnelle permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dans le respect de la réglementation européenne, les animaux seront manipulés dans le calme, 4 souris par cages, avec un rythme jour/nuit de 12h, ainsi que de l'eau et de la nourriture à volonté. Chaque cage est enrichie (maison pour souris, carrés de coton, bâtons à ronger). Les cages sont séparées des élevages pour un suivi adapté. La période d'acclimatation à l'animalerie sera de 5 jours. De plus le bien-être animal sera évalué 3 fois par emaine de manière objective grâce à une fiche de score regroupant de nombreux critères permettant d’évaluer l’état de chaque animal sur toute la durée des expériences. Un score trop elevé, calculé selon les différents critères de cette fiche de score entrainera soit la mise en place de mesures antalgiques visant à réduire la souffrance animale, soit la mise à mort immédiate de l’animal (car atteinte d'un point limite du bien être animal). Cette fiche nous permettra de décider au cas par cas de la poursuite ou de l’arrêt de la procédure. De plus, le modèle 4NQO est largement utilisé par la communauté scientifique, ce qui nous permet de connaitre la cinétique de développement de la maladie et justifie les procédures proposées. Les souris seront mises à mort à 28 semaines après l’initiation du cancer par le 4NQO ou lorsqu’un point limite sera atteint, comme décrit précédement.

Choix des espèces

Nous souhaitons étudier le rôle des NETs dans le développement des CS. Le modèle murin est un excellent modèle pour élucider ces mécanismes car il présente de grandes similitudes génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. De plus, le modèle 4NQO a été bien caractérisé et est largement utilisé pour sa reproductibilité dans la communauté scientifique pour ce type d’étude. L’administration d’agents chimiques induisant la carcinogénèse sera réalisée sur des souris âgées de 8 à 10 semaines. Les prélèvements des tumeurs sur les souris se feront à 28 semaines après initiation au 4NQO, ce qui correspond à la formation de carcinomes squameux. Les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale avant prélèvement de la langue pour des analyses histologiques et biochimiques.

1 776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une épilepsie chronique leur est provoquée par des injections répétées, suivies d'une évaluation comportementale non précisée, d'une chirurgie d'injection intracérébrale, de l'implantation d'électrodes puis d'une perfusion terminale pour prélever l'encéphale, afin de tester une thérapie génique par vecteurs viraux. Le porteur décrit les crises comme "dommageables au bien-être animal" et prévoit une mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Les bénéfices annoncés pour les patients pharmacorésistants restent au stade de la preuve de concept préclinique.

Objectifs

L’épilepsie chronique représente une des causes majeures de troubles neurologiques dans le monde, dont le type le plus répandu est l’épilepsie du lobe temporal (ELT). Elle se caractérise par des crises récurrentes et spontanées provoquées par une hypersynchronie excessive et incontrôlée de l’activité neuronale. Les molécules pharmacologiques antiépileptiques actuellement utilisées visent essentiellement à soulager les symptômes associés à l'épilepsie chronique en réajustant l'équilibre entre excitation et inhibition de l'activité neuronale. Cependant, ces traitements n'agissent pas directement sur les processus sous-jacents responsables de la progression de la pathologie, dont l'origine provient souvent de gènes défaillants. Le projet a pour objectif de tester l'effet de nouveaux traitement basé sur la thérapie génique dans un modèle in vivo de souris reproduisant fidèlement les manifestations histologiques et comportementales d'ELT observés chez les patients. Le projet est focalisé sur l'une des structures du lobe temporal, l'hippocampe et/ou le cortex, qui jouent un rôle central dans la génération des crises d'épilepsie et les troubles du comportement associés. Ainsi, l'analyse des effets bénéfiques de la thérapie génique sur les souris épileptiques seront réalisés à partir d’analyse comportementales, électroencéphalographiques et histologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements basés sur la thérapie génique sur les troubles électroencéphalographiques, les troubles comportementaux associés et les altérations histologiques dans un modèle rongeur d'épilepsie du lobe temporal. Une fois la preuve de concept validée à partir de ces études pré-cliniques, ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être proposées pour des essais cliniques chez des patients pharmacorésistants souffrant d'épilepsie chronique.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux subissent 4 types d’intervention. Durant la 1ère intervention du protocole, les souris subissent une série d'injections (4-6) par voie intrapéritonéale de plusieurs molécules afin d'induire un état d'épilepsie chronique (durée de l'intervention: 2h30-3h30 environ). Les animaux sont ensuite immédiatement hébergés dans les cages enrichies de manière individuelle pour toute la durée du protocole expérimental (i.e. 4 mois). Après une période de 2 mois, la seconde intervention consiste à effectuer l'évaluation comportementale des souris par des tests simples, spontanés, non-invasifs et non associés à une privation d'eau ou de nourriture (durée d’intervention : 20 min environ). Une semaine après, durant la 3ème intervention, ces mêmes souris subissent une chirurgie dans le but de réaliser des injections intracérébrales du composé thérapeutique à tester. Deux à trois semaines plus tard, les souris sont implantées avec une électrode afin de réaliser des enregistrements électroencéphalographiques. A la dernière étape du protocole expérimental, l'animal est euthanasié par une anesthésie profonde terminale (par perfusion transcardiaque : durée de 30 à 60 min) afin de prélever l'encéphale.

Impact sur les animaux

L’ensemble des nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être résumés selon les points suivants: - Le maintien des souris de manière individuelle pour observation durant de 2h30 à 3h30 pouvant générer de l'inconfort et du stress – Des injections répétées en intrapéritonéal pouvant induire du stress et de la douleur ; afin de réduire la souffrance, la zone injectée est préalablement traitée en topique avec une crème anesthésiante de type emla® - L'expression de crises d'épilepsie, condition dommageable au bien-être animal - Des anesthésies et interventions chirurgicales (craniotomie) afin de réaliser des injections intracérébrales et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux – Les sutures de la peau du crâne pouvant provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation.

Devenir

Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.

Remplacement

L'objectif du projet étant de tester l'efficacité du candidat médicament sur une échelle multidimensionnelle et notamment sur les mécanismes pathologiques handicapants (crises, altérations du comportement) de l'épilepsie du lobe temporal afin d'améliorer la qualité de vie des patients ainsi que sur les caractéristiques histologiques, il n'est donc pas possible de substituer les souris par des modèles alternatifs (e.g. modèles in vitro). De plus, les rongeurs sont un excellent outil pour l'analyse comportementale (mesures des performances cognitives, de l'humeur et sensorimotrices), et sont un très bon modèle animal pour analyser les mécanismes physiopathologiques à la base de maladies neurologiques humaines, en l'occurrence l'épilepsie du lobe temporal. En ce qui concerne cette dernière pathologie, les rongeurs reproduisent fidèlement les caractéristiques cardinales de ce type d'épilepsie chez l'homme.

Réduction

Le protocole choisi pour induire une épilepsie chronique est basé sur une méthodologie récemment raffinée et publiée ayant permis une forte diminution du taux de mortalité lors de l’induction de la pathologie. Cela permet donc d'augmenter très significativement le taux de réussite et de limiter de façon importante le nombre d'animaux utilisé. Par ailleurs, chaque lot de souris utilisé pour ce projet subit toutes les étapes expérimentales à savoir l'induction de l'épilepsie chronique, l'évaluation comportementale, les injections intracérébrales, les enregistrements électroencéphalographiques, ainsi que les prélèvements de l'encéphale. Cela permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire et d'optimiser l'utilisation de chaque souris. Par ailleurs, le calcul du nombre de sujets nécessaires (calcul de N) est basé sur les données antérieures obtenues en prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Ainsi, l'utilisation d'un design expérimental optimisé incluant des analyses statistiques appropriées permette de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

La planification séquentielle du travail avec réévaluation constante de la stratégie en fonction des résultats. L’utilisation d’un nombre minimal d’animaux par groupe en s’appuyant sur des données statistiques. L’analgésie locale et anesthésie générale au moment des chirurgies et mesures particulières pour en minimiser l’impact (administration d’anti-douleurs, réveil sous source de chaleur, réhydratation, gel hyper-nourrissant mélangé avec des croquettes accessibles à hauteur de souris, pesée, enrichissement de l’environnement…). Après l’induction de la crise, l'état de récupération dans les jours qui suivent est étroitement surveillé (récupération sous source de chaleur, réhydratation, gel hyper-nourrissant mélangé avec des croquettes accessibles à hauteur de souris, pesée et récupération comportementale, enrichissement de l’environnement…). Les animaux ayant subi une chirurgie et/ou présentant une épilepsie chronique sont maintenus dans des cages individuelles enrichies afin de diminuer le risque de blessures inter individus et les souffrances associées. La formation continue du personnel scientifique et de soin permet de repérer immédiatement les premiers signes cliniques d’inconfort chez les animaux. La mise en place d’une grille de suivi, ainsi que la prévision d’actions spécifiques dès les premiers signes d’inconfort ou de douleur (voire l’euthanasie, selon leur gravité) complètent le dispositif. Les animaux sont conservés le minimum de temps nécessaire au projet et des points limites spécifiques à chaque procédure sont appliqués tout au long du projet.

Choix des espèces

Les souris modèles d'épilepsie manifestent des symptômes comparables à ceux des patients souffrant d'épilepsie du lobe temporal (génération de crises, troubles cognitifs et de l'humeur) mais reproduisent également des manifestations histologiques d'épilepsie du lobe temporal (mort neuronale, remodelage anormal du réseau, etc.). Ils sont donc un excellent modèle pour cette pathologie humaine. En outre, l'utilisation spécifique de souris permet de tirer avantage de nombreuses lignées transgéniques ouvrant de nombreuses possibilités pour la poursuite du projet.

100 chiens de grande taille vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la plupart tués à l'issue et jusqu'à trente jeunes adoptés par des associations. Prélevés de 200 à 250 ml de sang toutes les deux semaines pendant sept ans au maximum, sur animal vigile, ils fournissent le sang et le sérum servant à fabriquer un vaccin vétérinaire. Le porteur reconnaît que le confinement prolongé peut provoquer des troubles du comportement, stéréotypies, agressivité et craintes, et que l'âge des animaux à l'issue empêche leur réutilisation. Il justifie la mise à mort par la "sévérité" de la procédure et l'absence de méthode alternative de production.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de produire du sang et du sérum canins servant de base à la production d'un vaccin à usage vétérinaire. Le vaccin produit avec ces dérivés sanguins permet de protéger les animaux contre une maladie parasitaire pouvant être sévère, voire mortelle. La production annuelle (environ 150 litres de sérum et 100 litres de sang) est fonction des besoins estimés annuellement par le donneur d’ordre pour produire le vaccin à usage vétérinaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra la production d’un vaccin vétérinaire luttant contre une maladie parasitaire chez les animaux pouvant être sévère, voire mortelle.

Procédures

L’ensemble des chiens est soumis à des interventions de prélèvements sanguins sur animaux vigiles. Leur fréquence est d’un prélèvement de 200 ml toutes les 2 semaines environ. Occasionnellement et seulement pour les chiens les plus gros, le prélèvement pourrait être de 250 ml. Dans tous les cas, la fréquence respecte les périodes de repos nécessaires pour la pleine récupération de l’animal en fonction du volume prélevé selon les recommandations du Gircor. Chaque séance de prélèvement dure environ 1 heure, et le prélèvement en lui-même pour un animal prend quelques minutes. Lors d’une séance de prélèvement, le chien est amené avec quelques congénères dans la salle de prélèvement où ils restent une dizaine de minute avant de retourner dans leur box d’hébergement. Le prélèvement en lui-même ne prend que quelques minutes. Les animaux seront inclus dans ce projet pendant 7 ans maximum.

Impact sur les animaux

Au moment du prélèvement sanguin, les animaux subissent une nuisance limitée liée au stress de la contention et du prélèvement ainsi qu’une sensibilité légère et transitoire au point de prélèvement. Les animaux sont hébergés durant toute la durée du projet dans un environnement protégé en bâtiment clos. De par leur gabarit et leur comportement naturel, les enrichissements standards ne sont pas adaptés. La durée de confinement pour chaque chien peut entrainer des perturbations comportementales (dominance, stéréotypie, stress). Ils peuvent par exemple être plus craintifs à la vue de nouveaux éléments ou agressif envers leur congénère (dominance). Une réflexion spécifique sur l’enrichissement et la socialisation de ces animaux est prise en charge par la SBEA afin de limiter ces nuisances comportementales.

Devenir

En raison de la sévérité de la procédure et au vu de l’âge des animaux à l’issue de la procédure, la plupart des animaux seront mis à mort car ils ne pourront pas être réutilisés dans un autre projet. Au cas par cas, et sur avis vétérinaire, certains jeunes animaux pourront être adoptés par le biai d'associations spécialisées.

Remplacement

L'utilisation de chiens sur ce projet est justifiée car il n’existe pas de méthode alternative pour produire des dérivés sanguins permettant la fabrication du vaccin vétérinaire en question.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet correspond au minimum requis pour répondre au besoin en sang et sérum du producteur du vaccin. De plus, le choix d’un chien de grande taille permet de prélever des volumes sanguins importants tout en respectant son bien-être et ainsi optimiser le nombre d’animaux utilisés. De plus, le nombre de chiens dans ce projet est limité car les animaux inclus sont utilisés sur une longue période pouvant aller jusqu’à 7 ans. Cela représente le meilleur compromis entre le bien-être et le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La fréquence et le volume des prélèvements sanguins sont déterminés en fonction du respect du bien-être et de la santé des animaux et respectent les recommandations du Gircor. Les volumes prélevés sont adaptés aux besoins du laboratoire vétérinaire producteur du vaccin qui sont évalués chaque année. Le prélèvement est réalisé par des personnes formées et les techniques utilisées visent à limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Un suivi attentif des animaux est réalisé afin de détecter tout signe de douleur ou d’inconfort au cours du prélèvement. Des compléments vitaminés sont donnés aux animaux à l’issue de la séance de prélèvement afin d’optimiser leur récupération et des bilans hémato-biochimiques sont réalisés régulièrement pour détecter toute perturbation des paramètres sanguins le cas échéant. Pour minimiser la prise de poids des animaux sur le long terme, leur poids est suivi régulièrement et leur alimentation est de composition adaptée. Les animaux sont suivis quotidiennement, en cas d’observation d’un signe clinique anormal le vétérinaire sera informé et pourra mettre en place des soins appropriés après examen de l’animal. Une réflexion spécifique sur l’enrichissement et la socialisation de ces animaux est prise en charge par la SBEA, elle mettra en place régulièrement de nouvelles actions afin de limiter les nuisances comportementales (stress, dominance, stéréotypie).

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est de produire du sang et du sérum canins, donc à partir de prélèvements sanguins sur des chiens. En raison de la fréquence et du volume des prélèvements sanguins réalisés, les animaux utilisés sont des chiens adultes de grande taille (Golden retriever), avec un poids supérieur à 25 kg. Les animaux sont prélevés de l'âge de 12 mois à 8 ans maximum.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant une myopathie centronucléaire, elles développent une faiblesse musculaire et cardiaque, subissent des tests de force et de coordination (suspension, agrippement, rotarod), des mesures contractiles et une échographie cardiaque sous anesthésie, ainsi qu'un perçage d'oreille, avant le prélèvement d'organes. Le porteur indique que le phénotype cardiaque, progressif, deviendrait "potentiellement sévère" si les souris étaient maintenues en vie, ce qui motive leur mise à mort. Il vise une preuve de concept d'une stratégie de compensation génétique, conditionnée à des résultats hypothétiques.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires (CNM) sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints. Aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Récemment dans la littérature, il a été décrit que le gène X, présent au niveau du muscle et du coeur et codant pour une protéine X jouant un rôle clé dans la contraction musculaire, a été identifié comme étant responsable de certains cas de myopathies centronucléaires. Il a été montré également qu’une diminution de la quantité de la protéine Y améliore les signes cliniques musculaires chez la souris ayant un déficit en protéine X (X-déficiente). Cependant, l’amélioration de l’espérance de vie et des signes cliniques cardiaques restent limitée chez ces souris. L’objectif du projet consiste à valider une preuve de concept selon laquelle une augmentation de l'expression d’une autre protéine, protéine Z, pourrait restaurer les signes cliniques cardiaques de la souris X- déficiente. Cette stratégie de thérapie où la surexpression d’une protéine peut compenser les effets négatifs liés à une mutation d’une autre protéine a déjà montré son efficacité dans la littérature. Pour vérifier notre hypothèse, nous souhaitons réaliser des croisements génétiques de souris afin d'obtenir des souris déficientes en protéine X et surexprimant la protéine Z humaine. Si une amélioration des signes musculaires et cardiaques ainsi qu’une augmentation de l’espérance de vie sont observées, la mise en place d’une thérapie génique sera conduite par la suite dans le modèle de souris X-déficiente.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène X.

Procédures

Concernant les tests liés au phénotype musculaire : - Test de suspension : Mesure de la force du corps. -Test d’agrippement : Mesure de la force des pattes -Test de performance Rotarod : Mesure de la coordination motrice, l'équilibre, l'endurance et la résistance à la fatigue. -Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ (AURORA): Les souris seront totalement anesthésiées pour qu'il n'y ait pas de réponse à la stimulation tactile (injection intrapéritonéale, deux injections) pendant maximum 1 heure. Concernant les tests liés au phénotype cardiaque: Les animaux seront soumis à une anesthésie sans intervention chirurgicale d'une durée de 20 minutes pour réaliser l'échographie et l'électrocardiogramme.

Impact sur les animaux

Selon les travaux issus de la littérature, les souris X-déficientes présentent une faiblesse musculaire et cardiaque aux âges étudiés. Dans cette étude, un nouveau modèle de souris X-déficiente sera étudié et des tests seront effectués pour confirmer le même profil observé dans la littérature. Les nuisances ou effets indésirables attendus causés par le retrait de la protéine X dans le modèle de souris X-déficiente sont les suivants : - Les animaux X- déficientes vont avoir une diminution de la motilité à 6 semaines de vie ainsi qu'une diminution de la contractilité musculaire à 13 semaines de vie à cause de la faiblesse musculaire dû à une perte de fonction de la protéine X. Au niveau cardiaque, à 6 semaines, elles vont développer une anomalie cardiaque qui va entraîner comme conséquence une diminution de la fonction cardiaque. Une diminution de la taille de la souris ainsi que du poids seront observées dès la sixième semaine. Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests sont les suivants : -Pour le test de suspension et le test d'agrippement, la souris peut subir un léger stress. -Pour l’électrocardiographie, les souris peuvent avoir une bradycardie liée à l'anesthésie. La température sera contrôlée par une sonde rectale sur la plateforme de l'échographie tout au long de l'expérience. -Pour l'échographie, le thorax des souris sera rasé, et des électrodes seront insérées en sous cutané pendant l'électrocardiogramme, ce qui peut également entraîner un stress de courte durée -La mesure des propriétés contractiles musculaires est également réalisée sous anesthésie, pouvant provoquer une sécheresse oculaire au réveil. Concernant le perçage d'oreille des animaux à partir du 14ème jour après la naissance pour leur identification couplée au génotypage, ces animaux peuvent ressentir une douleur de courte durée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. Le phénotype cardiaque étudié est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.

Remplacement

Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part de mieux comprendre une activité essentielle de la protéine défectueuse dans cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype musulaire pathologique ne se développerait pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Un nombre minimum de souris sera également utilisé pour évaluer les dommages liés à cette lignée, à savoir 20 souris par groupe (mâles et femelles sauvages, mâles et femelles porteuses de la mutation). Les résultats obtenus des deux cohortes (souris sauvages et souris X-défcientes) seront utilisés pour deux procédures, ce qui permet une réduction du nombre de souris.

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée.

Choix des espèces

Afin d’évaluer et de mieux comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène X, nous avons besoin de réaliser des expériences physiologiques in vivo. De plus, cette nouvelle lignée mutante nous permettra de mieux comprendre un des rôles clé dans la maladie musculaire. Les symptômes de faiblesse musculaire et cardiaque liés à cette mutation apparaissent relativement tôt c'est à dire vers 6 semaines et d’autre part, nous souhaitons suivre l 'évolution de cette maladie. Les tests pour évaluer les signes musculaires et cardiaques ne peuvent pas ête réalisées sur d 'autres espèces évolutivement plus éloignées de l'Homme car la structure du muscle y serait trop différente. La souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser ces expériences.