Procédures sévères

6 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une thoracotomie et une résection d'une partie du poumon sous anesthésie, avec pose d'un drain, l'intervention durant une à trois heures, pour évaluer une colle chirurgicale censée réduire les fuites d'air après opération. Le porteur mentionne des risques de troubles du rythme respiratoire, d'hémorragie et de douleurs, et une mise à mort au septième jour pour examiner les poumons. Il qualifie les enjeux médico-économiques de "majeurs" et présente le porc comme un "modèle de référence" pour la chirurgie pulmonaire, irremplaçable in vitro.

Objectifs

Le cancer du poumon représente le cancer le plus meurtrier au monde avec 1,8 millions de décès en 2020. Le traitement indiqué pour cette pathologie est la résection du poumon. Toutefois celle-ci provoque des fuites d’air (aérostase) pulmonaires de manière systématique le long de la ligne de suture réalisée aujourd’hui par des agrafes. Un drain thoracique est ainsi systématiquement posé afin de prévenir d’un pneumothorax, nécessitant une hospitalisation en soins chirurgicaux intensifs d’une durée moyenne de 5 jours. Aussi, la prévention ou l'élimination des fuites d'air permettrait de limiter les complications post-opératoires, et par conséquent une décharge hospitalière plus rapide Un collage efficace permettrait de réaliser une étanchéification de la ligne d’agrafe (aérostase), et diminuer ainsi la durée du drainage thoracique. Des colles chirurgicales existent sur le marché mais leur efficacité pour cette application est controversé et les études. L’objectif de ce projet est d’évaluer une nouvelle colle permettant d’apporter un collage efficace de la ligne d’agrafe, afin de réaliser une aérostase de qualité, et ainsi diminuer les risques post-opératoires, la durée du drainage thoracique, et donc le temps d’hospitalisation.

Bénéfices attendus

Les résections pulmonaires en chirurgie thoracique entraînent des fuites aériennes inévitables qui se développent dans les zones de dissection ou le long de lignes de suture par agrafage. Lorsque ces fuites durent plus de 7 jours (FAP), elles sont liées à une morbidité et mortalité accrue des patients, et nécessitent d’autres interventions. Les enjeux médico-économiques liés à ce projet sont donc majeurs. Les bénéfices attendus sont l’amélioration de la qualité de vie du patient, la réduction du temps d’hospitalisation, la réduction drastique des coûts des soins.

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale, et sous antalgiques afin de réaliser une résection pulmonaire par thoracotmie. Un drain sera posé sur la plaie afin de prévenir les fuites d'air par la ligne de suture. L'intervention chirurgiale dure entre 1 et 3 heures. En post opératoire, les animaux seront maintenus en espace restreint tant que le drain sera en place afin de limiter les risques d'arrrachage du drain par l'animal. Les traitements médicamenteux permettront de réduire les risques de douleur, d'infetion et d'inflammation.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont : En per opératoire : La procédure opératoire se déroule entièrement sous anesthésie générale. • trouble du rythme respiratoire : celui-ci sera contrôlé tout au long de l’intervention et des antiarythmiques seront administrés si besoin • hémorragie, contrôlable par les moyens chirurgicaux disponibles (ligature chirurgicale, compression) ou incontrôlable par rupture d’un vaisseaux cervicales type carotide ou jugulaire. • Douleurs : Celles-ci seront maitrisées par administration préalable d’antalgiques locaux ou généraux • Toutes lésions accidentelles des tissus mous du site opératoire durant la chirurgie • En post opératoire : • Douleurs : Celles-ci seront soulagées par administration préalable d’antalgiques et d’anti-inflammatoire • Infections (pneumopathies, par administration quotidienne d’antibiotique pendant les 7 jours de la procédure. • Embolie pulmonaire, prévenue par administration d’anti-coagulant durant les 3 premiers jours post-opératoire • Stress lié à la restriction des mouvements en cage : nous habituerons préalablement les animaux à cet hébergement pendant la phase d’acclimatation. Ces troubles seront évalués lors du suivi quotidien des animaux, par l’observation du comportement, et les mesures des paramètres suivant : température, fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, saturation pulsée en oxygène (SpO2) et radio-thoracique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer les poumons et regarder macroscopiquement la qualité de la suture pulmonaire à J7.

Remplacement

Le modèle animal assure une expérimentation irréalisable chez l’homme. Notre projet vise à démontrer le potentiel d’une nouvelle colle permettant d’ apporter un collage efficace afin de réaliser une aérostase de qualité lors des sutures pulmonaires . Sa réalisation nécessite un environnement tissulaire, et fonctionnel complexe en conditions réelles de flux (sanguins et respiratoire), impossible à reproduire sur simulateur ou in vitro.ne pouvant être approché par des modèles numériques ou in vitro. Le choix d’un modèle animal possédant une anatomie et une physiologie proche de l’homme est essentiel.

Réduction

Cette étude est une étude préliminaire pour valider la faisabilité du modèle et du traitement, afin de dérisquer une étude future d’efficacité et de sécurité sur un plus grand nombre d’animaux. Cette étude préliminaire sera réalisée de façon séquentielle afin d’adapter si nécessaire certains gestes lors de la chirurgie ou du suivi. Le premier animal permettra d’évaluer le protocole sur un seul poumon traité, et les animaux suivant permettront d’évaluer la faisabilité de traiter les deux poumons simultanément, afin de réduire dans l’étude future le nombre d’animaux.

Raffinement

Les porcs arriveront sur place 7 jours minimum avant la procédure pour leur permettre de s’habituer aux lieux et aux manipulations (cage, pansement), et ainsi diminuer leur stress. Ils seront logés dans un box sur litière de paille (permettant d’exprimer leur comportement de fouissement) agrémenté de jouets. Avant la chirurgie, ils seront logés en groupe (sauf pendant les moments d’habituations aux pansements/drains/cage). Après la chirurgie ils seront logés seuls dans des espaces restreints (cages) tant que les fuites pulmonaires persisteront (attendu entre 3 et 5 jours, 7 jours maximum) afin de limiter les risques d’arrachage du drain ou des cathéters, puis à nouveau dans un box après retrait des drains. Des jeux seront également placés dans la cage. Un contact visuel et auditif sera maintenu entre les animaux tout au long des périodes d’isolement. Les animaux seront alimentés avec l’aliment de leur élevage d’origine afin de diminuer leur stress. La chirurgie se déroulera sous anesthésie générale (AG) et sous antalgiques. Pendant toute la durée de l'anesthésie, l'animal sera placé sur une couverture chauffante. Pendant les 7 jours post chirurgicaux, les animaux seront maintenus sous analgésie, sous anti-inflamatoire, et sous antibiotique pour limiter tout risque de douleur ou d’infection. Les animaux seront observés plusieurs fois par jour (au minimum deux fois par jour lorsqu’ils seront en box, et 4 fois par jour lorqu’ils seront en cage). Tous signes de mal-être ou de souffrance inhabituels seront immédiatement signalés au responsable de l’expérimentation. Les animaux qui présenteraient des signes de mal-être ou de souffrance seront soignés et si jugé nécessaire par le vétérinaire traitant retirés de l’essai.

Choix des espèces

La taille et la physiologie du système pulmonaire du porc sont assez proches de celui de l'homme. De plus, c’est un des modèles de référence pour les travaux chirurgicaux sur les poumons car les techniques générales de chirurgie pulmonaire peuvent être translatées. Les animaux auront un poids d’environ 40 kg et ils auront entre 2.5 mois et 4 mois.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié est suspendue par un dispositif empêchant les pattes arrière de toucher le sol pour créer une décharge mécanique chronique, toutes étant hébergées seules pendant sept semaines et soumises à des anesthésies, une imagerie osseuse et des injections quotidiennes, avant la mise à mort pour prélever tissus et organes. Le porteur décrit un stress lié à l'isolement, une perte de poids transitoire et une mobilité réduite. Il teste une molécule intestinale, le FGF19, contre la perte de muscle et d'os, et écarte l'étude chez l'homme et in vitro, présentant la souris comme le modèle "solide" faute d'alternative.

Objectifs

Avec ce projet nous voulons répondre à des questions scientifiques sur l’action d’une molécule produite par l’intestin, appelée « FGF19 », sur les os et les muscles. Cette molécule peut être aussi injectée dans un organisme pour étudier ses effets et son éventuel potentiel thérapeutique. L’ostéosarcopénie, qui est la perte de fonction du muscle et de l'os, est une condition fréquente dans la population âgée, mais elle touche aussi les patients alités sur des longues périodes ou fortement limités dans leur mobilité (après d’interventions chirurgicales, d’accidents ou de fractures, ou encore à la suite de certaines maladies). L’alitement et la mobilité réduite diminuent ce qu’on appelle la charge mécanique sur notre squelette, avec comme résultat des muscles plus faibles et des os plus fragiles. L’ostéosarcopénie manque à ce jour d’arsenal thérapeutique efficace. Notre recherche aidera non seulement à améliorer notre compréhension du fonctionnement du corps, et en particulier de l’os, mais aussi à orienter la recherche thérapeutique contre l’ostéosarcopénie. Plus précisément, nous voulons étudier les effets de la molécule FGF19 sur la perte osseuse liée à une décharge mécanique. Nous nous demandons : un traitement à l’FGF19, pourrait-il mitiger les effets délétères de la décharge mécanique ? quelles cellules de l'os répondent à l’FGF19 ? comment ? cette réponse, est-elle secondaire aux effets exercés sur le muscle ? quels sont les effets du traitement à l’FGF19 sur les autres organes ? Des études récentes ont montré un impact positif du FGF19 sur la fonctionnalité musculaire. Une expérience pilote dans notre laboratoire a montré que l'os a des "antennes" (récepteurs) pour capter et répondre à l'FGF19. En utilisant un modèle animal pertinent, nous souhaitons en particulier quantifier et qualifier les caractéristiques fonctionnelles des os (tibia et fémur) soumis à une décharge mécanique après traitement à l’FGF19. Nous utiliserons des méthodes d’imagerie non invasive en trois dimensions sur l’animal vivant (avec un véritable scanner pour le petit animal ; méthode aussi appelé micro-tomographie) et des analyses histologiques, biochimiques et biomoléculaires sur plusieurs échantillons tissulaires. Le but est de comparer le changement de plusieurs paramètres osseux entre souris traitées avec FGF19 et souris traitées avec placébo (contrôle).

Bénéfices attendus

Le grand âge, la sédentarité et la maladie peuvent amener à des périodes de grande limitation à la mobilité et même à l’alitement, avec une importante perte de charge mécanique pour le système musculo-squelettique. Le résultat est la perte de masse et force musculaire (sarcopénie) accompagnée par une fragilisation de l’os (ostéopénie), qui augmente le risque de fracture (ostéoporose) et limite ultérieurement la mobilité. Ainsi, un cercle vicieux d’affaiblissement musculaire et osseux s’instaure, qui est dur à rompre et qui limite la qualité et la durée de vie. L’ostéosarcopénie (sarcopénie+ostéopénie) est aussi observée chez les spationautes, après des séjours de longue durée en condition de microgravité. Le projet ici-proposé nous permettra à court terme de tester l'hypothèse que la molécule FGF19 peut agir comme agent anti-sarcopénique ET anti- ostéopénique dans un modèle préclinique validé de décharge mécanique du système musculo-squelettique. Ces objectifs s’inscrivent dans un programme de recherche nationale, à plus long terme nos résultats pourraient guider le développement de nouvelles thérapies pour lutter contre l’ostéosarcopénie de la personne âgée, du malade alité, du spationaute.

Procédures

Les interventions et gestes techniques réalisés incluent : - pesée bi-hebdomadaire à l’arrivée et pendant l’acclimatation, pesée journalière pendant le traitement - hébergement en individuel (7 semaines) - 3 anesthésies générales (2 anesthésies d’une durée de 45-50 minutes pour imagerie osseuse, espacées de 3 semaines, et 1 de courte durée pour endormir la souris avant la mise à mort) - 2 sessions d’imagerie osseuse au scanner (espacées de 3 semaines, sous-anesthésie générale) - rattachement au système de décharge mécanique pour garantir la décharge mécanique chronique (sous-anesthésie générale juste après la première session d'imagerie) (pour la moitié des animaux, pas pour les groupes contrôle) - 2 prélèvements d’une goutte de sang caudal pour test de glycémie (espacés de 3 semaines, sur animal vigil) - injections sous-cutanées du traitement ou du placébo (journalières, sur 3 semaines, sur animal vigil) - 2 injections de tétracycline pour marquer les fronts de formation osseuse (espacées de 5 jours, sur animal vigil)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux incluent : (a) Stress, lié aux conditions environnementales d’hébergement : les souris seront hébergées dans des cages spécialement aménagées pour ce type d’expérience, 1 animal par cage ; cela est nécessaire pour garantir une effective décharge mécanique des pattes postérieures. (b) Perte de poids transitoire (limitée et réversible) : nous nous attendons, sur la base d’expériences similaires précédemment menées au laboratoire, une petite perte de poids, réversible, sur les premiers jours de décharge. (c) Douleur/stress (légers), liés à des examens non invasifs (imagerie, sous anesthésie), aux injections journalières et, pour la moitié des animaux, à la mise en condition de décharge mécanique. (d) Mobilité réduite et nuisances liées à la décharge mécanique.

Devenir

Pour tous les animaux de chaque procédure, le sort prévu est la mise à mort pour prélèvement de tissus et organes pour ultérieurs analyses moléculaires, histologiques, biochimiques et physiologiques.

Remplacement

La réponse d’un organe à un traitement par une molécule telle que l’FGF19 pourrait à priori être étudiée chez l'homme ou in vitro. Pour le cas spécifique de nos questions, ces approches ne sont pas possibles ou pertinentes. - L'utilisation du FGF19 n'est pas autorisée pour l'homme. Un analogue est actuellement encore testé seulement dans les phases précoces d’essais cliniques. En plus, son utilisation est limitée par un brevet industriel. De toute façon, des études chez l’homme ne permettraient pas de répondre aux questions sur les mécanismes d'action, directes ou indirectes, du FGF19 sur le squelette. - Les études avec des cultures cellulaires (études in vitro) se limitent à évaluer l’impact du traitement à l’échelle cellulaire. Elles peuvent aider à comprendre certains mécanismes moléculaires/cellulaires sous-jacents à la réponse au traitement, mais elles ne peuvent pas prédire l’impact sur un tissu ou un organe complexe formé de plusieurs types cellulaires interagissant entre eux. Pour appréhender l’effet du FGF19, c’est l’interaction entre os, muscles et les autres organes impactés par le FGF19 (comme le foie), qui doit être étudiée. Les modifications des sécrétions hormonales influencent la cinétique de perte osseuse. Il faut donc prendre en compte les changements de régulation hormonale et l’influence de facteurs systémiques. Un modèle in vitro ne permettrait pas de détecter et étudier tous les effets indirects des injections de FGF19 sur le squelette (par exemple via d’autres hormones produites en réponse à l’FGF19). En résumé, les effets du traitement ne sont visibles qu'à l'échelle de l'organisme entier. Des cultures cellulaires, et même des co-cultures, ne pourraient donc pas nous donner ce type d’information. Pour toutes ces raisons, nous pouvons affirmer que la compréhension des effets du FGF19 sur l’os et, dans une optique de transfert de connaissance vers la clinique, l’évaluation de son potentiel comme agent anti-ostéosarcopénique nécessitent l’utilisation d’animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par groupe a été établi et validé sur le plan statistique à partir d’expérimentations précédentes du laboratoire, avec référence aussi à la littérature scientifique. Des analyses statistiques appropriées ont été utilisées, en tenant compte de la variabilité interindividuelle et de la reproductibilité des mesures. Plusieurs analyses histologiques, moléculaires et biochimiques sur les échantillons tissulaires sont nécessaires à arriver à des conclusions solides et valides scientifiquement. Les analyses sont prévues pour les deux sexes. Ainsi, nous aurons besoin de 30 animaux par groupe/sexe. Le n est calculé comme le minimum pour obtenir des résultats fiables. À noter en plus : - Le design rigoureux du plan expérimental (groupes contrôles, conditions identiques d’hébergement, suivi en longitudinal par imagerie) diminue la variabilité et les possibles facteurs de confusion. Tout cela nous a permis de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à bien répondre à nos questions. - Comme dans le passé, nous partageons avec de nombreux collègues d’autres universités les tissus et organes prélevés à la dissection, non nécessaires à notre projet, pour minimiser le besoin d’expérimentation animal de la communauté scientifique. - Ce protocole est un important avancement scientifique par rapport aux études du laboratoire et des publications scientifiques existantes : aucune publication présente, à ce jour, des résultats sur ce sujet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées à la suspension pour que les souris suspendues ne puissent pas poser leurs pattes arrière. L’enrichissement (paille et bout de bois) est ôté de la cage à mi-temps de l’acclimatation pour une adaptation progressive. Des ouates de cellulose sont prévues pour que la souris aille grignoter. Ceci va permettre d’augmenter le bien-être de la souris tout au long de l’expérimentation. Les souris sont surveillées au moins une fois par jour tout au long du protocole, deux après suspension, afin de s’assurer d’une consommation alimentaire et en eau de chaque souris ainsi que pour vérifier l’absence de signes de souffrance. Nous porterons une attention particulière à l’état du poil, au poids, au comportement locomoteur, à l’alimentation et au transit. Aucun signe de souffrance (agressivité, apathie, cris) au réveil n’a été observé dans des souris traitées de manière similaire dans des expériences précédentes. L’utilisation de nouvelles bandes adhésives, adoptées en cours du dernier protocole de suspension au laboratoire, empêche toute irritation au niveau de la queue. L'administration du FGF19 ou véhicule par voie sous-cutanée est classifiée comme nuisance légère, car elle implique l'injection d'un volume correspondant à un dixième du volume standard d'administration permis. Des points limites pertinents ont été clairement définis et les souris seront contrôlées vis-à-vis ceux-ci très régulièrement. L’arrivée d’un nouveau chercheur dans l’équipe, provenant d’un laboratoire travaillant aussi sur ce même modèle de suspension, nous permettra de nous confronter sur les petits gestes et astuces qui améliorent le bien-être animal et d’introduire d’éventuelles nouvelles mesures de raffinement.

Choix des espèces

Les modèles invertébrés (ex. insectes) ne sont pas adaptés à l'étude du système os-muscle : ils possèdent un exosquelette et pas un endosquelette. Entre les vertébrés, les rongeurs restent les meilleurs modèles et les moins exposés aux contraintes nécessaires. En particulier, la souris est un modèle solide pour l'étude du lien entre muscle, os et système endocrinien, qui permet d’analyser les mécanismes moléculaires spécifiques impliqués dans la physiopathologie de l’ostéosarcopénie à l'échelle de l'organisme entier. Plus spécifiquement pour le modèle préclinique de décharge mécanique ici utilisé, pour sa taille et son poids la souris est l’animal le moins impacté par les contraintes nécessaires. Elle est donc l’animal de choix, tout en permettant le suivi in vivo de la cinétique de perte osseuse par imagerie non invasive (scanner) et toutes les études sur les tissus et organes à mettre en place après la mise à mort des animaux et le prélèvement d’échantillons biologiques. Nous utiliserons des souris adultes, de quatre mois. Le choix de souris plus jeunes introduirait un fort biais de confusion dû à la superposition des effets du traitement sur la croissance de l’animal, avec des retombées directes et indirectes sur le squelette en particulier. De plus, le choix est dicté par le besoin d’utiliser des animaux matures sur le plan squelettique, pour que le modèle soit pertinent pour la perte osseuse et musculaire induite par la décharge mécanique, qui est observée chez l’homme dans le sujet adulte.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit trois chirurgies, dont la pose d'une prothèse crânienne et une craniotomie, puis une induction d'accident vasculaire cérébral sur animal éveillé, avec habituation à la contention et imagerie par IRM. Le porteur justifie ce modèle sur animal éveillé par la volonté de supprimer l'anesthésie, qu'il juge en partie responsable de l'échec des traitements testés chez l'humain. Il précise qu'aucun animal n'est gardé vivant, invoquant le risque d'infection et l'isolement en cage individuelle, et applique un point limite de perte de poids de 20 %.

Objectifs

L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie. Toutefois, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

L'objectif du projet étant de proposer un protocole de modélisation de l'ischémie plus pertinent et au plus près des conditions cliniques (patient éveillé lors de la survenue de l'AVC, de l'imagerie et du traitement), les bénéfices seraient de pouvoir progressivement remplacer les protocoles existants chez l'animal anesthésié par des protocoles chez l'animal vigile, ce qui augmenterait les chances de translation des résultats précliniques vers la clinique, sans pour autant déroger au respect de l'éthique de l'animal utilisé à des fins expérimentales. Le but ici est de proposer un protocole solide et reproductible, permettant d'obtenir des résultats fiables tant sur une stratégie de traitement fibrinolytique, ou neuroprotecteur. En supprimant l'anesthésie générale des prochaines études dont l'objectif serait de tester un traitement prometteur, il sera alors possible de tester les effets du traitement seul, et non plus du traitement couplé aux anesthésiques. Cela permettrait en cas d'échec chez le petit animal d'éviter de poursuivre ces études chez le gros animal ou chez le primate non humain (où l'anesthésie est de même utilisée contrairement à la clinique), dans un soucis de Réduction du nombre d'animaux. Le bénéfice attendu concernant la deuxième partie du projet serait d'exploiter ce modèle d'ischémie vigile pour caractériser et étudier les évènements vasculaires de manière très précoce, et ainsi comprendre les mécanismes physiopathologiques entrant en jeu selon la composition du caillot et des collatérales différentes. Le fait de mieux comprendre les évènements survenant lors d'un AVC et ce le plus tôt possible pourrait ensuite orienter les futures stratégies de prise en charge et/ou de traitement de l'AVC.

Procédures

Les animaux seront soumis : A 3 chirurgies : Une chirurgie de pose de prothèse crânienne sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 20 minutes. Une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 30 à 45 minutes. Une chirurgie d'induction de l'ischémie sans anesthésie générale, sous couverture analgésique et sous anesthésie locale. A 2 protocoles comportementaux : Un protocole d'habituation à la contention et à l'IRM vigiles par jour pendant 5 jours consécutifs, avec des cessions augmentant progressivement de 15 min jusqu'à 1h30 au total. Un protocole de récupération fonctionnelle sur 5 jours, avec des sessions durant moins de 5 minutes par souris au total. A 3 protocoles d'imagerie vigile : Une à 3 acquisitions à l'imagerie ultrasonore, où chaque acquisition dure 5 minutes avec une injection de produit de contraste lors de chaque acquisition. Une à 2 acquisitions à l'IRM où chaque acquisition dure 30 minutes. Une acquisition en microscopie biphotonique durant 10 minutes avec injection de produit de contraste.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'appraître chez les animaux seraient : Des douleurs post opératoires après la pose de prothèse, un ennui ou un stress dus à la solitude des animaux (placés 1 par cage afin d'éviter les arrachements de prothèse) , un stress lors des premières sessions d'habituation à la contention, une perte de masse corporelle après les anesthésies et l'induction de l'AVC,des douleurs post opératoires après la chirurgie d'accès à l'ACM, un stress dû à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, des déficits fonctionnels à la suite de l'AVC.

Devenir

Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (540) seront mis à mort. Il a été décidé de ne garder aucun animal en vie car il n'est pas concevable pour leur bien-être de réhabiliter ou réutiliser des souris ayant subit une procédure sévère telle qu'une ischémie. De plus, le risque d'infection au niveau de la prothèse crânienne et de la craniotomie sont trop importants pour garder les souris en vie. Enfin, ces souris vivent dans des cages individuelles, et il n'est pas souhaitable pour leur bien-être au quotidien de rester trop longtemps solitaires.

Remplacement

Dans ce projet, il n’est pas possible de remplacer le modèle animal, il s’agit d’étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires physiopathologiques associés, survenant lors d'un l'AVC. Les effets de molécules pharmacologiques sur le développement des lésions cérébrales ainsi que la récupération fonctionnelle ne peuvent être investigués autrement que via un modèle in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux a été determiné en reprenant les données d'études antérieures testant des molécules pharmacologiques sur le devenir des lésions ischémiques à la suite d'un AVC chez la souris, et ayant montré des résultats significatifs en réduisant le plus possible les effectifs. Au cours de ce projet, chaque animal faisant l'objet d'un suivi longitudinal est son propre contrôle, grâce à l'utilisation de l'imagerie. Cela permet de ne pas faire de groupes supplémentaires pour chaque étape du projet où il est nécessaire de caractériser l'ischémie cérébrale, en plus de renforcer la validité des résultats. Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires au projet à été réduit au maximum, en se basant sur les études déjà réalisées au sein du laboratoire et dans la littérature, ainsi que sur un calcul de puissance statistique, permettant d'avoir des résultats significatifs avec un minimum d'animaux. D'après les premières données obtenues sur l'ischémie vigile chez la souris, on observe une moyenne du volume de lésion lié à l'ischémie de 14 mm3 (+/- 9 mm3) dans le groupe contrôle, et de 5 mm3 dans le groupe traité. Pour un seuil de significativité à 95 % et une puissance de 80 % (beta = 20%), 16 animaux seraient nécessaires dans chaque groupe. Cependant, il peut arriver d'avoir de la mortalité ou des exclusions durant les nombreuses étapes de l'étude (arrachements de prothèse, perte de poids, stress trop intense lors des premières habituations ...). Le nombre d'animaux a donc été augmenté à 20 par groupe, sachant qu'il sera réduit à 16 si aucun incident ne survient au cours du protocole.

Raffinement

Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux auront le temps de s'acclimater à la nouvelle animalerie après leur réception auprès du fournisseur pendant une semaine, puis seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. Pour la partie nécessitant la pose d'une prothèse crânienne, les souris seront placées dans des cages individuelles afin de limiter les risques d'arrachement de la prothèse. Afin de palier au mieux à la solitude induite par la séparation, les cages seront enrichies (coton en quantité pour la fabrication d'un nid, ainsi que paillettes). Une période de récupération de 3 jours et prévue après la pose de la prothèse crânienne, durant laquelle les souris bénéficieront de croquettes humides dans une coupelle au sol afin de favoriser la prise de nourriture et l'hydratation. Le protocole d'habituation progressif à la contention permet de réduire le stress des souris lors de l'induction de l'AVC et de l'imagerie vigiles. Durant l'induction de l'AVC, les souris sont sous analgésie (buprénorphine, injection sous cutanée avec une aiguille de 25 G, minimum 20 min avant le début de la chirurgie afin d'atteindre le pic d'activité), et sous anesthésie locale au niveau de l'ACM à la Xylocaine (nébuliseur). Les yeux de la souris sont couverts afin de ne pas l'éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire, et des bouchons d'oreilles sont prévus pour l'IRM vigile, réduisant le bruit ambiant de 27 dB (selon les informations du fabricant). Après la chirurgie d'induction de l'AVC, les souris disposent de croquettes humides dans une coupelle au sol pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Concernant l'application des point limites, les animaux seront mis à mort (anesthésie profonde à l'Isoflurane suivie d'une dislocation cervicale) dans les 24 heures dans l'une des situations suivantes : - signes de douleur extérieure indexés sur le grimace-scale souris (NC3Rs) (Score >5 plus de 48h) ; - absence de réaction ; - animal inactif dans sa cage ; - complications chirurgicales inattendues (hémorragie impossible à stoper, détresse cadiorespiratoire, échec) ; - perte de poids >20%. - décollement de la prothèse crânienne

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences, et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’influence de l’anesthésie sur le devenir des lésions induites par un AVC ischémique. L'étude se déroulera sur deux souches de souris (Swiss et C57/BL6) présentant des profils de collatérales différentes, et des réponses physiologiques à l'ischémie différentes, comme observé chez l'humain. De plus, ces deux souches sont régulièrement utilisées pour la recherche, d'où l'intérêt de valider ce modèle sur ces dernières. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, entre 6 et 10 semaines (6 semaines lors du début du protocole, et 10 semaines arrivées à la fin du protocole). Le projet est réalisé avec des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC.

1 580 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un colorant chimique dans l'eau de boisson provoque une inflammation douloureuse du côlon, puis les souris subissent des distensions colorectales par une sonde introduite dans le rectum jusqu'à l'apparition de crampes, ainsi qu'un test de douleur de Von Frey. Le porteur teste des molécules de clients "dont il ne connaît ni la nature ni les effets secondaires possibles", ce qui l'empêche d'anticiper les nuisances. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la maladie et juge le recours à l'animal "incontournable".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur l’inflammation et la douleur dans un modèle de maladies chroniques de l’intestin (MICI) induit par le DSS (Dextran Sulfate Sodium) chez la souris.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI).

Procédures

Le modèle d’hypersensibilité viscérale induit par le Dextran Sulfate Sodium dans l’eau de boisson provoque des douleurs abdominales, une inflammation du colon provoquant une douleur importante pouvant s’accompagner d’une perte de poids, une diminution de l’état général et du comportement pouvant conduire à la mort de l’animal. Le test de Von Frey peut provoquer un stress du fait de la manipulation des animaux et une certaine douleur lors de l’application de filaments. Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux occasionnés par le traitement pharmacologique.Tous les animaux subiront au minimum deux séances de distensions colorectales (1 séance dure environ 1H entre le temps d’introduction du ballon et du système d’enregistrement et la distension en elle-même). Ceci consiste à introduire une sonde dans le colon de l’animal via le rectum et à appliquer des pressions croissantes par palier jusqu’à l’obtention d’un comportement douloureux chez l’animal (observation de crampe abdominale). Un système de sonde d’enregistrement des pressions intra-coliques est également introduit dans le colon via le rectum. Selon les souhaits des clients, des prélèvements sanguins sur animal vigile ou anesthésié pourront être réalisés (environ 5-10 min par prélèvement). Les animaux seront pesés fréquemment et la consistance de leur fèces sera observée et évaluée (méthode non invasive pour l’animal qui va durer environ 5-10 min). Les candidats médicaments étant définis par le(s) client(s), la fréquence, la voie et le volume des administrations seront variables (compter environ 5 min par administration maximum). Les animaux subiront également un test de Von Frey qui est un test de sensibilité à un stimulus douloureux (application de filaments de forces croissantes et observation de la réaction de l’animal, habituation au set up de 30 min environ puis le test en lui-même dure 15-30 min selon le nombre d’animaux, sachant que pour chaque animal cela va durer 5 min maximum).

Impact sur les animaux

Nous savons que le DSS va induire une inflammation du colon provoquant chez les animaux des diarrhées, des ulcérations et autres phénomènes inflammatoires du colon avec tous les problèmes digestifs et douloureux qui en découlent. Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront soit gardés en vie pour suivre une autre procédure, soit sacrifiés à la fin de l’expérimentation car des prélèvements tissulaires (colon par exemple) seront réalisés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Actuellement, aucun modèle in vitro ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. 10 animaux/groupe est le minimum nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs dû à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés 5 /cage maximum pour respecter l’espace de chaque animal dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux (igloo, carré de coton, aspen brick…). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Ce modèle est bien décrit dans la littérature chez la souris. Classiquement les animaux utilisés seront au moins âgés de 6 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines. Toutefois, selon des demandes particulières des clients, l’âge des animaux pourrait être différent.

Anesthésiées à l'isoflurane, 394 souris reçoivent une ou deux injections intraveineuses de quatre secondes, dont des siRNA dirigés contre l'antithrombine ou la protéine C qui déclenchent une thrombose "spontanée". Celles qui reçoivent ces siRNA peuvent ensuite perdre du poids, devenir léthargiques et hypothermes, ne plus répondre aux stimuli, et présenter une exophtalmie, des hémorragies dans et autour de l'œil, des gonflements de la mâchoire et des hémorragies sous la peau et dans les muscles. Le protocole comprend aussi des déplétions en plaquettes, neutrophiles ou macrophages et des infections bactériennes. Le porteur classe le projet au niveau de souffrance sévère et parle de "douleur sévère" pour la thrombose, tout en écrivant que les contraintes "subites par les animaux sont faibles". Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou atteignent un score de 5 sont mises à mort, les autres finissent par une ponction cardiaque sous anesthésie et sont tuées pour la récupération de leur sang et de leurs tissus.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre quels sont les conséquences du rôle inflammatoire plaquettaire dans la maladie thromboembolique veineuse (MTEV).

Bénéfices attendus

Les plaquettes semblent pouvoir jouer un rôle clé dans cette situation : elles sont connues comme impliquées à la fois dans la survenue d’un épisode thrombotique, et aussi comme facteurs intervenant dans la réponse inflammatoire. Les plaquettes régulent directement la réponse immunitaire par l’expression et la sécrétion de molécules inflammatoires. De plus, elles sont capables de fixer des micro-organismes. Enfin, les plaquettes interagissent avec les cellules immunitaires, notamment les neutrophiles et les macrophages. On pense maintenant que les plaquettes pourraient agir comme des cellules sentinelles du système immunitaire.

Procédures

Les souris vont subir de 1 à 2 injections intrvaveineuses d'une durée de 4 secondes chacune, sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

La thrombose induite pas ces approches expérimentales ne met pas la vie des souris en danger. La thrombose spontanée, induite par injection intraveineuse des siRNA, est considérées comme "douleur sévère" infligée aux animaux. Suite à l’induction de la thrombose après l’injection des siRNA contre les protéines (antithrombine/protéine C), on peut observer une perte de poids, une léthargie, une absence de réponse aux stimuli et une hypothermie. Des lésions unilatérales impliquant l'œil (exophtalmie) ainsi que des hémorragies intraoculaires et périoculaires peuvent être observées, tout comme des gonflements des régions maxillaires, mandibulaires et submandibulaires ; hémorragies sous-cutanées et intramusculaires. Aucune anomalie visible, aucun effet secondaire connu sont reportés pour les Déplétions plaquettaires, des neutrophiles et des macrophages. Concernant les infections bactériennes, les souris peuvent présenter une baisse de la température corporelle et une perte de poids. Les souris peuvent apparaître léthargiques et insensibles aux stimuli. Les souris seront observées quotidiennement notamment pour la recherche des possibles phénotypes ci-dessus inclus dans les calculs des points limites. Les effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des prises de sang et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupération de sang et de tissus biologiques

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L’exploration du rôle inflammatoire plaquettaire dans la maladie thromboembolique veineuse (MTEV) nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme et dans le but de cibler des thérapeutiques modulant la physiologie des plaquettes sanguines.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisant. Nous avons évalué in vitro le rôle inflammatoire des plaquettes sanguines en lien avec l’immunothrombose que ce soit dans des contextes infectieux ou non. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche. Afin de réduire le protocole, une étude pilote de 10 animaux permettra la mise au point et la maîtrise des gestes opérationnels. Un groupe « mise au point de la procédure » ainsi que 2 groupes « expérimentaux » de souris permettront par la suite de répondre à l’hypothèse de travail.

Raffinement

Le bien-être animal est au cœur de cette étude. Nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permette d'avoir un enrichissement (avec paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les contraintes subites par les animaux sont faibles. Afin de réduire la souffrance occasionnée par l’expérience, les souris seront observées quotidiennement et seront mises à mort lorsqu’une perte de poids de plus de 20% sera constatée ou lorsque qu’un pointage limite de 5 sera atteint dans la grille de suivi du bien-être animal. Ce seuil correspond à un niveau de souffrance ne pouvant être prolongé chez l’animal. Les souris vont subir de 1 à 2 injections intraveineuses d'une durée de 4 secondes chacune, sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Une ponction cardiaque lors du prélèvement sanguin sera réalisée sur les animaux sous anesthésie.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de la physiopathologie des phénomènes thrombotiques. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations immunologiques humaines. Nous étudions les séquelles de la thrombose veineuse chez la souris. Pour notre étude, nous utiliserons des souris consanguines de plus de 20 grammes, âgées de 6 à 10 semaines. Les mâles et les femelles seront inclus dans nos expériences, sauf si la formation de thrombus s'avère absente/moins reproductible chez l'un des deux sexes lors de la mise en place du modèle animal, ce qui à ce jour n’est pas démontré dans les études de prévalences homme/femme dans cette pathologie.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont exposées à une hypergravité de 2G par centrifugation pendant 24 heures pour ouvrir la barrière hématoencéphalique, avec des prélèvements de glycémie, des injections d'un composé et d'un traceur fluorescent, avant une perfusion intracardiaque terminale sous anesthésie. Le porteur indique que la centrifugation réduit la prise de boisson et de nourriture sur 24 à 48 heures sans induire de stress selon les taux de corticostérone mesurés. Le projet teste des composés modulant la barrière, avec des applications présentées jusqu'à la remise en forme des spationautes.

Objectifs

Aujourd’hui la barrière hématoencéphalique (BHE) est impliquée dans les mécanismes d’échange entre le compartiment sanguin et le parenchyme cérébral (neurones et cellules associées qui établissent les fonctions cérébrales). Elle est assurée par les cellules endothéliales bordant la lumière des vaisseaux et d’autres cellules comme les péricytes, les astrocytes et des macrophages. Ces cellules forment l’unité neurovasculaire qui permet le passage sélectif de molécule du sang vers le cerveau et vice-versa. Si la rupture des vaisseaux sanguins cérébraux induit des accidents vasculaires cérébraux, des défaillances plus subtiles de la BHE participent aux maladies neurodégénératives ou sont produites dans les pathologies métaboliques ou par des agents infectieux. Depuis 2-3 ans sont décrits des modulations physiologiques de l’efficacité de la BHE. Dans ce contexte la maitrise pharmacologique de l’efficacité de la BHE pourrait améliorer le fonctionnement cérébral comme suggéré dans des modèles de la maladie d’Alzheimer. Enfin, des ouvertures de la BHE de faible amplitude et temporaire pourraient améliorer la vectorisation de médicament dans le cerveau comme envisagée pour le traitement de la maladie de Parkinson. Ainsi des molécules favorisant une ouverture de la BHE, ou améliorant son efficacité sont recherchées en pharmacologie. Ces molécules une fois testées in vitro doivent passer par une étape de validation in vivo chez l’animal avant de faire l’objet d’essais précliniques. Pour cela nous proposons de tester certaines de ces molécules sur un modèle d’ouverture temporaire de la BHE chez la souris par exposition l’hypergravité. Cela permettra également de mieux comprendre comment l’efficacité de la BHE évolue dans des contextes de changement gravitaires et comment ce mécanisme peut être régulé. Le protocole consiste à exposer des souris, recevant le traitement pharmacologique, à 2G pendant 24h pour induire une ouverture de la BHE et mesurer si le traitement accentue ou diminue le passage de molécules du sang vers le cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet devra nous permettre de préciser des mécanismes d’action de l’hypergravité sur la BHE et de valider des composés pharmacologiques dans ce modèle d’ouverture partiel et temporaire de la BHE. Ces composés pouvant avoir des intérêts thérapeutiques soit pour protéger le cerveau d’ouvertures non désirées de la BHE soit pour au contraire ouvrir partiellement et temporairement la BHE pour aider au passage de molécule d’intérêt thérapeutique. Enfin ce projet permettra de préciser les mécanismes de l’ouverture de la BHE lors de l’exposition au changement gravitaire ce qui peut avoir également un intérêt biomédical puisque la centrifugation est proposée comme une contre mesure pour aider à la remise en forme des spationautes.

Procédures

Les animaux seront exposés à l'hypergravité apr centrifugation à 2g pendnt 24h. prélèvement sur animaux vigiles, au maximum les animaux subiront deux prélèvements sanguins à l'extrémité de la queue pour une mesure de leur glycémie à 48h d'intervalle, il s'agit d'un acte identique à celui pratiquer pour l'automesure de glycémie par les patients diabétiques. Le volume prélevé est de 10-30 µL. dans la procédure, les animaux subiront des injections intrapéritonéales après habituation à la contention pour l'injection d'une molécule pouvant améliorer l'efficacité de la barrière hématoencéphalique (BHE) et une injection rétro-orbitaire sous anesthésie générale d'un traceur fluorescent permettant de mesurer l'efficacité de la BHE . La procédure se termine par une anesthésie profonde et sans réveil pour perfusion intracardiaque.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables connus sont principalement les éventuels effets secondaires des composés pharmacologiques de régulation de la BHE. Ceux-ci devront être décrits et seront pris en considération, nous ne testerons que des composés dont les études in vitro et les études de toxicologie auront été réalisées et publiées. Les effets indésirables de la centrifugation sont également bien caractérisés, l’exposition à 2G n’induit pas de stress (mesuré par le taux circulant de corticostérone post-exposition) mais elle induit une baisse significative de la prise de boisson et de nourriture pendant les 24 à 48 h après le départ de la centrifugation. Ceci induit un léger retard à la prise de poids chez les animaux jeunes. Tous les animaux sont suivis par surveillance vidéo en permanence y compris au sein des nacelles de la centrifugeuse. Leurs poids sont pris régulièrement avant et après la centrifugation tout comme leur consommation de nourriture et de boisson. Après centrifugation la glycémie des animaux sera évaluée pour indexer leur statut métabolique et une mesure de corticostérone sera réalisée sur échantillon sanguin prélevé au moment de la pose de la perfusion intracardiaque. L’ensemble de ces paramètres nous permettent d’évaluer les potentielles altérations physiologiques et sont systématiquement associées à la publication des résultats.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes à des fins d 'investigations par histologie.

Remplacement

Les expériences proposées visent à identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires à l'origine de l’ouverture de la BHE en contexte hypergravitaire et apporter la preuve de l’efficacité in vivo de composés pharmacologiques sur la perméabilité de la BHE. L’ouverture physiopathologique de la BHE ne peut être étudiée que sur un modèle in vivo car elle implique des mécanismes complexes de régulation neurovasculaire comprenant des interactions entre différents types cellulaires impossible à reproduire in vitro. Nos expériences ont pour but de proposer ou renforcer des arguments précliniques à l’utilisation de molécules d’intérêt thérapeutique. Pour ces composés des preuves expérimentales auront suggéré ou démontré une action in vitro sur des cellules endothéliales en culture et des études de toxicologie auront démontré une utilisation in vivo possible.

Réduction

Les études précédentes démontrent qu’un nombre de 12 souris par centrifugation est suffisant pour une analyse statistique (2 way ANOVA pour comparer les interactions entre l’effet du traitement et l’effet de la centrifugation). Pour une validation expérimentale, la reproduction de l’effet observée est nécessaire et nous proposons donc 3 expériences qui devront aboutir au même résultat. Afin de Réduire le nombre de souris, les résultats seront évalués statistiquement après chaque centrifugation et la composition des groupes expérimentaux ré-évaluer à la baisse si besoin.

Raffinement

Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci, afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Les animaux sont en groupe sociaux tout au long de l’expérimentation et surveillance vidéo permanente dans le dispositif de modification gravitaire afin de pouvoir intervenir si un point limite est observé. Par ailleurs, ils sont hébergés dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Ils sont placés dans la centrifugeuse dans leur cage d’hébergement. Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition « ad libitum ». Les paramètres physiologiques tels que prise alimentaire, poids sont mesurés régulièrement tout au long du protocole expérimental. Les animaux seront manipulés pendant les 3 jours qui précèdent le début du traitement pharmacologique pour les habituer à la contention nécessaire à l’injection i.p. L'ensemble des données recueillies feront l'objet de l'argumentaire expérimental de la publication issues de ces expériences.

Choix des espèces

Le choix de la souris se base principalement par l’existence de données sur ce modèle qui permettent d’établir que l’hypergravité peut altérer l’efficacité de la barrière hématoencéphalique (BHE) et qu’il est le modèle le plus utiliser pour fonder des bases à la recherche préclinique. De plus si nous parvenions à identifier un composé efficace pour réduire l'ouverture de la BHE, il pourrait être testé rapidement sur d'autres modèles murins de pathologies neurodégénératives par exemple. Il s’agit de jeunes adultes arrivant dans l’établissement à l’âge de 8 semaines au moins. Ce choix se base principalement sur des expériences préliminaires et la littérature indiquant un état fonctionnel et stable de la barrière hématoencéphalique.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Souris immunodéficientes reconstituées avec des cellules humaines, elles sont irradiées, reçoivent une instillation intra-rectale induisant une colite chimique et des injections répétées d'un traitement, avant le prélèvement de leurs organes. Le projet teste un anticorps humain sur un modèle censé reproduire la maladie de Crohn. Le porteur présente ces souris "humanisées" comme une "alternative solide" à l'utilisation de primates, tout en décrivant des douleurs de colite atténuées par un antalgique.

Objectifs

L’objectif de ce projet est l’évaluation de l’effet d’un traitement humain sur les réponses immunes médiées par l’inflammation du colon. Le modèle conventionnel de colite induite chimiquement sera appliqué sur des souris immunodéficientes reconstituées avec des précurseurs de cellules humaines. Ce type de modèle est très intéressant car il reproduit les mêmes caractéristiques que la maladie de Crohn.

Bénéfices attendus

- Déterminer le potentiel thérapeutique de ce nouveau traitement innovant sur la colite ; - Comprendre les différents mécanismes d’action qui se mettent en place dans ce contexte.

Procédures

- Irradiation des souris vigile dans une boîte spéciale (3min) - Injection des cellules humaines en intraveineuse sur animal vigile (5min/animal) ; - Sous anesthésie gazeuse, des prélèvements sanguins seront réalisés sur toutes les souris (10min/souris) ; - Instillation de mélange de produits en intra-rectal sous anesthésie gazeuse (15min/animal) ; - Injection des traitements en intra-péritonéal sur animal vigile, 3 fois par semaine (1min/animal) ; - Euthanasie sous anesthésie gazeuse (6min/animal) ;

Impact sur les animaux

Irradiation des souris : pas de douleur associée à l’acte Prélèvements sanguins : pas de douleur associée à l’acte fait sous anesthésie ; au réveil, les animaux recevront un collyre pour prévenir l’assèchement des yeux Instillation de produits en intra rectal : pas de douleur associée à l’acte fait sous anesthésie, par contre, douleurs de colite minorées par un traitement antalgique Injection des traitements en intra-péritonéal : légère douleur, traitement non irritant Euthanasie : pas de douleurs, animal anesthésié

Devenir

A la fin de l'expérience, les animaux seront autopsiés afin d'effectuer des prélévements d'organes/tissus ce qui justifie la mise à mort des souris.

Remplacement

Vu la complexité du système immunitaire, les études préalablement réalisées ne peuvent pas remplacer les études sur les organismes vivants. Il est donc nécessaire de tester le potentiel thérapeutique de candidat médicamenteux dans un modèle de colite proche de l’Homme. Une alternative solide à l’utilisation de primates en recherche préclinique est le modèle de souris dites « humanisées ».

Réduction

L’effet d’un candidat médicamenteux dans ce modèle de colite sera analysé par le biais des tests statistiques. Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; et de sorte à avoir les contrôles suffisants pour pouvoir conclure quant aux résultats obtenus.

Raffinement

Au début du protocole, les souris seront réparties par groupe de 3-5 souris par cage avec des moyens d’enrichissement (frisottis, dôme et tunnel). Une surveillance quotidienne des animaux en protocole sera appliquée pour déceler une éventuelle douleur, souffrance ou mal-être. Nous prévoyons une administration d’analgésique, de la buprénorphine à 0,05mg/kg en sous cutané deux fois par jour, pour tout animal souffrant. A noter qu’en cas de point limite ou souffrance qui ne serait pas gérable par anti-douleur ; l’animale sera euthanasié. Concernant la perte de poids, elle sera est calculée par rapport au poids initial à jour 0. Les conditions d’hébergement et de nursing seront les suivants : Les souris seront hébergées par groupe de 5 maximum dans des cages type 2L disposées sur des portoirs ventilés. Un change de litière régulier (minimum 1 fois par semaine) sera réalisé. Un contrôle de l’alimentation et des boissons sera effectué à chaque passage. La salle d’hébergement est soumise à l’alternation de rythmes jour / nuit et à une isolation efficace afin de limiter les bruits. L’accès à l’animalerie est strictement limité au personnel autorisé. Les personnels habilités à accéder à l’animalerie doivent revêtir une tenue adaptée au niveau de sécurité.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris immunodéficiente pour deux raisons principales : * Elles présentent une facilité de reproduction, d'hébergement et de manipulation. * Nous testons un traitement humain qui ne peut pas être testé que dans un modèle humanisé. Nous avons choisi des souris déficientes en cellules immunes car elles permettent l'acceptation de la greffe des cellules humaines. Un tel protocole chez des souris immunocompétentes ne serait pas possible, les cellules et tissus humains seraient rejetés par le système immunitaire. Nous avons choisi d’utiliser des souris adultes, pour leurs poids relativement stables en fin de croissance, pour la facilité de manipulation (injection des cellules et des traitements), de prélèvement d'échantillons, d'évaluation de bien-être.

300 souris et 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une implantation de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, puis des séances de radiothérapie et d'IRM, la tumeur pouvant provoquer des troubles neurologiques, une perte d'appétit et des troubles du mouvement en phase terminale avant le prélèvement du cerveau. Le projet teste une source de rayons X expérimentale contre les gliomes, avec un transfert en clinique humaine présenté comme un objectif. Le porteur affirme qu'il est "impossible" d'étudier ces réponses sur des expériences in vitro.

Objectifs

Les gliomes sont des tumeurs cérébrales ayant une incidence de 4 à 5 nouveaux cas par an pour 100 000 personnes. Il s’agit également du deuxième type de cancer le plus fréquent chez l’enfant. Les patients atteints de glioblastome, le plus agressif des gliomes, survivent en moyenne 14 mois après le diagnostic de la tumeur et ce malgré le traitement combinant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. C’est pourquoi il est nécessaire de chercher de nouveaux traitements. Notre projet s’inscrit dans ce contexte en utilisant une source de rayons X très particulière et encore expérimentale, de basse énergie mais de haut flux, permettant (i) de sélectionner au mieux les énergies intéressantes (ii) de faire un microfractionnement spatial de la dose. Ces deux spécificités ne sont pas techniquement possibles sur les sources classiques hospitalières à l’heure actuelle. Le potentiel de cette technique est étudié depuis une vingtaine d’années déjà, selon différentes approches expérimentale comme l'irradiation de cellules en culture ou des calculs dosimétriques. Ces approches bien qu’indispensables restent très limitées car elles ne prennent pas en compte la complexité du tissu tumoral, se développant de façon autonome, possédant sa propre vascularisation. L’objectif de notre projet vise à tester les modalités d’imagerie (diagnostique) et les modalités d’irradiation (géométrie, balistique, dose) sur des tumeurs proches des tumeurs humaines grâce à l’utilisation de modèles précliniques de rongeurs porteurs de tumeurs (souris et rats). Ce projet portant sur la physiologie tumorale, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d'acquérir un ensemble de données précliniques de haute qualité sur des animaux porteurs de tumeurs cérébrales pour des protocoles de radiothérapie par rayonnements X de haute énergie. Les études réalisées pendant les 5 ans du projet permettront d’élargir nos connaissances sur les réponses biologiques du tissu tumoral et du tissu sain exposés aux microfaisceaux, d’évaluer le rôle du microenvironnement tumoral par rapport à l’efficacité du traitement, d’analyser les effets des rayonnements sur la vascularisation tumorale et saine, sur le comportement des animaux. L'objectif est également de pouvoir proposer un schéma d'irradiation optimal (nombre d'incidences, dose, géométrie) avec une préservation efficace des tissus sains pour un transfert réaliste vers un essai clinique. En effet, la radiothérapie par microfaisceaux est une méthode innovante et prometteuse, permettant de détruire efficacement le tissu tumoral tout en préservant le tissu sain environnant. Elle répresente donc une bonne alternative de la radiothérapie conventionnelle et ses effets secondaires. Ce projet est un facteur clé pour promouvoir notre méthode en clinique humaine et pour pouvoir proposer aux patients de tumeur cérébrale un meilleur rapport entre l'efficacité thérapeutique et effets secondaires, une meilleure qualité de vie et une survie prolongée.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : implantation de cellules tumorales sous anesthésie générale et locale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; radiothérapie par microfaisceaux ou par irradiation conventionnelle sous anesthésie générale, sur 500 animaux (250 rats, 250 souris), une fois par animal, pendant environ 30 minutes ; imagerie par resonnance magnetique sous anesthésie générale, sur 600 animaux (300 rats, 300 souris), 3 à 4 fois par animal, pendant environ 1 heure

Impact sur les animaux

Le changement d'environnement et le transport des animaux de l'animalerie jusqu'au lieu d'irradiation représente du stress et de l'angoisse. La procédure de radiothérapie n'induit pas de douleur mais du stress et de l'angoisse. L'inoculation tumorale répresente une douleur locale et du stress. Il peut y avoir l’apparition de troubles neurologiques dus à l'effet de masse induit par la tumeur en phase terminale, c'est-à-dire à partir de 2 semaines après l'implantation (troubles du mouvement, perte d'appétit). Dans des rares cas la radiothérapie elle-même peut induire une perte d'appétit. Une alopécie et, plus rarement, une dermatite radio-induite transitoire peuvent apparaitre dans le champ d'irradiation environ 2 semaines après l'exposition. La procédure d’imagerie implique du stress pour les animaux et l’injection de l’agent de contraste induit une douleur locale.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux sont mis à mort pour obtenir un prélèvement cérébral. D’après les connaissances actuelles (littérature) et notre expertise, un délai de 2 semaines entre la radiothérapie et le prélèvement cérébral pour analyse histologique permet une bonne évaluation des réponses tissulaires différentielles entre l’irradiation par microfaisceaux ou champ plein auxquelles nous nous attendons. Cette analyse histologique est complémentée par la courbe de suivi long terme qui est indispensable pour évaluer l’efficacité de notre traitement et pour pouvoir proposer un protocole d’irradiation optimisé et transférable à un futur essai clinique.

Remplacement

La thérapie anticancéreuse a pour but d’éradiquer la tumeur ou de ralentir sa croissance tout en préservant au maximum les tissus sains avoisinants. La seule alternative aux études animales est l’étude in vitro (cellules). Cependant, il est impossible d'étudier la réponse tumorale et les effets secondaires sur la fonction cérébrale, l'irradiation de la peau et des os du crâne avec des expériences in vitro. En effet, l’appréciation de l’efficacité d’une technique de thérapie anticancéreuse nécessite le passage par un organisme vivant, reflétant la complexité des interactions entre le tissu sain et le tissu tumoral, la présence d’une vascularisation tumorale et d’un système immunitaire, le microenvironnement tumoral et l’index thérapeutique. Les modèles de tumeurs les plus reproductibles et à croissance rapide ont été développés chez les rongeurs. L’un des outils permettant de mesurer l’efficacité thérapeutique est l’établissement de courbes de suivi long terme permettant de calculer des moyennes et médiane de survie. Parallèlement, certains animaux sont mis à mort à temps fixes pour la réalisation d’études visant à obtenir une ‘image’ de la tumeur ou de l’organe à un moment donné afin d’appréhender les interactions rayonnement-matière spécifiques de la technique. Par ailleurs, des études ex vivo ont déjà été menées dans le passé mais elles ne correspondent pas suffisamment aux buts recherchés lors d'irradiations d'un organisme vivant comme mentionné ci-dessus. Ces études incluent des simulations informatiques pour simuler les interactions entre photons et matière et des irradiations de cellules en culture.

Réduction

Pour le calcul du nombre d'animaux, il faut prendre en considération la variabilité intra- et inter-tumorale pour une population de rongeurs implantés suivant un même protocole. Tous les groupes seront comparés entre eux en utilisant des tests statistiques appropriés et reconnus pour chaque étude. Nos précédentes expériences montrent qu’un nombre d’animaux de 7-8 animaux suffit à obtenir des résultats robustes. Nous prévoyons donc des groupes d’animaux n=10 du aux problèmes éventuels rencontrés durant les différentes étapes de l’expérience. Ce calcul mène à utiliser 60 animaux par expérience, 2 expériences par an, sur 5 ans, 600 animaux au total.

Raffinement

Les animaux arrivent à l’animalerie une semaine avant l’implantation tumorale pour acclimatation et seront hébergés en groupes. Ils sont hébergés dans des grandes cages. Nous utiliserons la procédure d’enrichissement définie par le SBEA et l’animalerie. Nous allons réduire le stress du transport par un enrichissement (litière de la cage d’hébergement, cachettes etc), transport groupés en cage filtrée, hydrogel. Afin de réduire le stress et la douleur des procédures chirurgicales, de l’imagerie et de la radiothérapie, ces procédures sont réalisées sous anesthésie soit (i) par inhalation (ii) soit par induction gazeuse suivie d’une injection intrapéritonéale d’un mélange d'anesthésiques/antalgiques et d’une injection sous-cutanée d'un anesthésique local au-dessus du site d’implantation des cellules tumorales. Une injection postopératoire d'antalgique sera administrée lors de l’implantation tumorale. Les animaux sont observés quotidiennement par le responsable du projet après chaque procédure et seront hébergés en cage isolée dès que les premiers signes cliniques apparaissent (perte d'appétit, perte de poids, prostration, convulsions). Les animaux disposent alors de nourriture humide à l’assiette et/ou d’un aliment riche en nutriment (« boost »). L'administration d'antalgiques sera considérée pour soulager la douleur (décision prise par le responsable du projet). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant les symptômes observés (examen clinique (EC) 2 fois par jour après chaque procédure et en cas de symptômes cliniques, EC quotidien pendant les 3 premières semaines post irradiation en cas de bonne santé générale, ensuite EC un jour sur 2 ou 3 en cas de bonne santé générale jusqu'à la mis à mort). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux sont mis à mort quand les points limites, definis dans la grille de symptômes et basés à la fois sur le comportement et le poids, sont atteints.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux les plus reproductibles et les plus rapides, conduisant à une utilisation optimisée, plus efficace et sur de plus petits nombre d’animaux, sont disponibles essentiellement chez la souris et le rat. Cela concerne en particulier la littérature abondante des irradiations comparables à nos expériences. L'utilisation de rongeurs d'un même patrimoine génétique permet une grande réproductibilité de résultats. Les souris sont favorisées car elles sont adaptées à notre installation et peuvent être manipulées et hébergées facilement. Les rats sont importants dans notre cas, car du fait de leur taille plus importante, les irradiations et la dosimétrie sont plus faciles à mettre en oeuvre de façon fiable et reproductible. Les lignées de cellules tumorales chez le rat que nous utiliserons sont bien adaptées pour étudier les effets de la radiothérapie sur le microenvironnement tumoral. Nous validerons nos protocoles d'irradiations (les plus optimisés, efficaces, sûrs et transférables en clinique) chez 2 espèces d'animaux et plusieurs modèles tumoraux différents, permettant d'élargir et de faire progresser nos connaissances dans le domaine. Les animaux sont utilisés entre 4 à 12 semaines après la naissance (4 à 8 semaines pour les souris, 8 à 12 semaines pour les rats), ce qui est un bon compromis pour avoir des animaux de petite taille et sevrés. Les modèles tumoraux ont été développés dans les animaux à cet âge quand le cerveau est encore en cours de développement, ce qui nous mène à choisir le même stade de développement pour rester reproductible dans nos résultats. Par ailleurs les animaux plus vieux développent des rapports de dominants/dominés plus difficile à gérer en animalerie. Enfin, les courbes de suivi long terme durent environ 6 mois (pour certains animaux seulement), justifiant aussi l’utilisation de cette tranche d’âge.

2 000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une greffe de tumeur dans l'os du tibia ou du fémur, puis des traitements par voies multiples, des irradiations, des séances d'imagerie et des prélèvements de moelle osseuse à l'aiguille, la tumeur pouvant provoquer douleurs, fractures et métastases pulmonaires. Le projet est mené par une société prestataire de services en recherche préclinique qui propose ces modèles à des clients du secteur pharmaceutique. Le porteur affirme que les méthodes alternatives "ne permettent pas" de prévoir l'efficacité des candidats-médicaments in vivo.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer d’origine osseuse ou induisant métastases osseuses, avec ou sans métastases, déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer, spécifiquement les cancers d’origine osseuse ou induisant des métastases osseuses. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant la greffe (

Impact sur les animaux

Deux types de greffe pourront être réalisées (sous anesthésie générale et analgésie): intra tibiale et intra fémorale. Cela pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner une douleur, une gêne, des problèmes de mobilité (liés au membre greffé et au volume tumoral), le développement de métastases pulmonaires causant des difficultés respiratoires, une perte de poids. Les animaux recevront des traitements par voie IM, ID, SC, IV (bolus), orale, IN, IT, IP et / ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Dans le cas des rayons ionisants, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’irradiation. Cela pourra entrainer un stress léger. Dans le cas de l’imagerie, les animaux seront transportés dans leur cage d’origine vers la plateforme d’imagerie et imagés sous anesthésie générale. Cela pourra entrainer un stress léger. Il pourra aussi être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1-2 jours. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress de 1-2j. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (volume tumoral et/ou poids). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traitéet/ou traité avec le véhicule et un groupe avec tumeur, traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas démultiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu du taux de prise tumorale variable et afin de pouvoir former des groupes homogènes en poids et/ou en volume tumoral, et pour prendre en compte l’exclusion d’animaux chez lesquels la tumeur se développerait excessivement dans le mauvais tissu (sous cutané, musculaire, au lieu d’intra-osseux) il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 30% d’animaux non randomisés. Le nombre d’animaux par groupe est choisi sur la base des précédentes études réalisées dans nos laboratoires pour les modèles connus (en général 6 à 15 animaux) afin de sélectionner le nombre d’animaux minimum pour observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et volume tumoral). Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal pour remplacer des analyses terminales en cours d’étude.

Raffinement

Les animaux seront monitorés au minimum 2 fois par semaine. Cette fréquence sera augmentée pour les tumeurs à pousse rapide. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès que la perte de poids >15% sera observée sur certains animaux. La greffe intra osseuse, les prélèvements de moelle osseuse, la pose d’implants hormonaux, ou la thoracotomie, seront réalisés sous anesthésie profonde avec opiacé. Un alpha2 agoniste sera administré pour la thoracotomie. Pour la greffe intra osseuse, une analgésie locale avec dépôt d’anesthésiques locaux en sous-cutané au niveau du genou sera réalisée et les animaux recevront un anti inflammatoire non stéroïdien. Les autres administrations et prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (IV, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Les administrations douloureuses (IM, ID) seront réalisées avec analgésie préalable (opiacés). Les prélèvements de moelle osseuse seront limités à 3 fois par patte (2 sur la patte greffée) dans la vie de l’animal et systématiquement espacés de 2 semaines (y compris intervalle avec la greffe pour la patte greffée). Dans les modèles connus pour induire des métastases pulmonaires, ou les modèles inconnus, pouvant donc théoriquement causer des métastases pulmonaires, une attention particulière sera portée à la respiration des animaux (posture, fréquence respiratoire). Les difficultés respiratoires marquées constitueront un point limite. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Les points limites précoces du modèle seront les suivants : fracture osseuse, incapacité de se maintenir debout ou de se déplacer, perte de poids >20%. Si l’un des signes cliniques liés aux points limites est observé, l’animal est mis en observation et un traitement est si possible mis en place. Par exemple, en cas de douleur constatée, le vétérinaire prescrira un traitement antalgique. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction de pathologie cancéreuse et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux. En cas de toxicité un arbre décisionnel validé par la SBEA sera utilisé. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie pour sortir l’animal de la procédure.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Également, la littérature décrit l’utilisation d’animaux adulte pour ce type de modèle.