Procédures sévères

1120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès la naissance, elles reçoivent des injections intraveineuses répétées, dans la veine temporale puis dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie tous les cinq à sept jours, avec des prélèvements d'urine et de sang réguliers, pour développer une thérapie par ARN messager contre une maladie métabolique rare. Un quart des souris portent la mutation et présentent un risque de mort de 50 % dans les trois premiers jours de vie. Le porteur affirme que le recours à l'animal reste "indispensable", l'efficacité d'injections répétées ne pouvant selon lui se prédire in vitro.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer des stratégies thérapeutiques pour traiter une maladie métabolique rare d’origine génétique, causée par la dysfonction d’une enzyme. La forme classique de cette maladie se caractérise par un coma en période néonatale pouvant conduire au décès en l’absence de traitement en urgence. Il existe également des formes moins sévères, chroniques, sans épisode aigu néonatal sévère et des formes se révélant par des troubles neurologiques lors d’épisodes aigus de stress métabolique (fièvre...). A ce jour, le principal traitement repose sur un régime alimentaire extrêmement strict, limité en protéines. Ce régime est très efficace mais il doit être poursuivi à vie et ne permet pas de prévenir le risque de complications graves, parfois mortelles. Un tel régime altère de façon significative la qualité de vie. Certains patients peuvent bénéficier d’une transplantation hépatique qui certes guérit la maladie, mais demeure associée à un risque propre de rejet et de décès. L’efficacité de la transplantation hépatique dans cette maladie nous a conduit à proposer le projet ici présenté. Notre objectif est de développer une stratégie de traitement de cette maladie métabolique par une approche de thérapie innovante basée sur l’utilisation d’ARN messagers, non toxiques, qui ont montré qu’ils pouvaient corriger de manière stable des maladies où d’autres protéines sont manquantes après une seule administration. La spécificité de cette étude est d’étudier l’efficacité à long terme de cette thérapie administrée par injections multiples dans des modèles murins de cette maladie métabolique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de faire la preuve de concept de l’efficacité de long terme de cette thérapie innovante chez la souris, ouvrant la voie du développement d’une nouvelle stratégie thérapeutique chez l’homme.

Procédures

Les animaux de cette étude seront soumis à des injections par voie intraveineuse dans la veine temporale le jour de la naissance puis à des injections par voie intraveineuse tous les 5 ou 7 jours dans le sinus veineux retro-orbitaire, sous anesthésie gazeuse, à des prélèvements d'urine quotidiens la première semaine de vie puis deux fois par semaine et à des prélèvements de sang au niveau de la veine maxillaire à partir de trois semaines de vie avec 1 prélèvement par semaine sauf pour les 5ème, 9ème, 13ème, 17ème, 21ème et 25ème semaines pour les souris suivies 6 mois et pour la semaine précédant la mise à mort pour les souris mises à mort à partir de 4 semaines, où 2 prélèvements de sang seront réalisés. Ces différents actes seront le plus brefs possibles (1 min pour les injections néonatales, 1 min pour les prélèvements de sang, 5 min environ pour l'injection sous anesthésie (temps d'anesthésie inclus)) et pratiqués par du personnel entrainé.

Impact sur les animaux

Les souris KO malades (25% des souris comptées dans le projet) présentent un phénotype grave : risque de 50% de décès au cours des 3 premiers jours et 100% au cours des 14 premiers jours. Cependant le traitement administré devrait très largement améliorer les symptômes. Les autres nuisances que subiront les souris seront : une douleur associée à une injection IV sur souris vigile (injection initiale unique sur souriceau), un stress associé à une anesthésie pour une injection IV, de façon hebdomadaire (injections tous les 5 ou 7 jours sous anesthésie gazeuse) et une douleur associée à un prélèvement sanguin sur souris vigile, à partir de trois semaines, de façon hebdomadaire (sauf pour les 5ème, 9ème, 13ème, 17ème, 21ème et 25ème semaines pour les souris suivies 6 mois et pour la semaine précédant la mise à mort pour les souris mises à mort à partir de 4 semaines de l’étude de pharmacocinétique/pharmacodynamie où 2 prélèvements de sang seront réalisés).

Devenir

Mise à mort pour analyse des tissus.

Remplacement

Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux dans ce projet, nos collaborateurs ont déjà testé différentes formulations d’ARNm in vitro sur des cellules de foie cultivées (Hep3b, HepG2) en laboratoire. Ces tests étudient l’expression et la fonction de la protéine d’intérêt et permettent de sélectionner in vitro les traitements les plus efficaces. Cependant, l’utilisation d’animaux modèles restent indispensable. Il n’est en effet pas possible de prédire si l’expression de la protéine in vivo sera suffisante pour traiter la maladie. De plus, il n’est pas possible de prédire in vitro, l’efficacité d’injections répétées du traitement, ni la fréquence nécessaire de ces injections. Enfin, seule l’utilisation d’un modèle animal permet d’étudier le développement d’une réponse immunitaire contre le traitement qui peut en diminuer l’efficacité. Ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, nous nous sommes basés sur les résultats obtenus par nos collaborateurs chez des souris saines et sur nos précédents travaux chez des souris malades par injection unique à la naissance pour sélectionner les formulations les plus efficaces à tester. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons les deux formulations d’ARN messagers thérapeutiques les plus efficaces précédemment sélectionnées pour restaurer l’enzyme défectueuse au niveau des cellules du foie, sur le long terme par des injections multiples. Le nombre d'animaux nécessaires par lot a été déterminé grâce aux études publiées précédemment développant une approche similaire. Ce nombre permet de prendre en compte le risque de décès liés à la sévérité de la maladie (pour les KO, 25% du total des souris, mais très largement diminué par le traitement) et les risques inhérents aux injections et prélèvements répétés. Nous étudierons les réponses à nos traitements à la fois pour les mâles et les femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’accouplements et aussi le nombre de souris atteintes non utilisées.

Raffinement

Nous allons utiliser des procédures de raffinement pour éviter la souffrance des souris lors de prélèvements sanguins et pendant l'injection du vecteur thérapeutique, en particulier pour éviter le cannibalisme. Au moment de l’injection chez les nouveau-nés ; la mère sera éloignée afin de minimiser son stress. Les souriceaux seront recouverts de sciure de la cage de la mère et replacés rapidement dans la cage. Les injections chez les animaux plus âgés seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Une surveillance régulière sera mise en place et des points limites adaptés ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l'animal si nécessaire. Les souris seront gardées dans des portoirs ventilés dans lesquels nous ajouterons du coton, une maisonnette et des bâtonnets à ronger. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé. Les accouplements contrôlés sont lancés du mardi au vendredi afin d'obtenir un maximum de naissance en semaine permettant une prise en charge optimale des souriceaux.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux disponibles pour cette maladie métabolique, les modèles murins sont les plus faciles à produire. Grace à ces modèle de souris, nous pourrons obtenir des résultats très importants et très rapidement pour le développement de la thérapie par ARNm de cette maladie métabolique, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. De plus, les modèles murins sont de bons modèles de la maladie humaine récapitulant le phénotype clinique sévère et biochimique et modélisent chacun deux populations de patients différentes. Nouveau-nés le jour de la naissance car la maladie présente un phénotype très sévère entrainant un décès de la souris dans les 15 premiers jours de vie ; souriceaux et souris adultes jusqu’à 6 mois pour le suivi.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de formol sous la peau de la patte, qui provoque une douleur classée sévère, pour tester des molécules candidates contre la douleur. Le porteur décrit ce test comme un outil de screening intégré à l'offre de service commerciale du laboratoire, vendue à ses clients. Il affirme que l'étude de la douleur chez l'animal vigile reste la seule option, les modèles in vitro ne mesurant selon lui que la nociception.

Objectifs

L’objectif de ce projet s’inscrit dans une activité de screening de molécules. Le laboratoire réalise de la prestation de service pour le développement de candidats médicaments. Le domaine d’application est la douleur. La littérature a documenté depuis des années un test de douleur en deux phases permettant le screening de molécule : le test au formol. L’injection sous cutanée d’une solution aqueuse de formaldéhyde (formol) induit chez l’animal une douleur modérée, diffuse et prolongée selon un schéma bi-phasique. Une phase précoce ou aiguë (0 à 10 minutes) correspondant à l’activation directe des fibres nociceptives par le formol est d’abord observée, suivie après une phase de quiescence (5 min), d’une phase tardive (15 à 35 minutes) résultant du développement de l’inflammation. L'évaluation de la douleur s'effectue par l'observation du comportement spontané (léchage de la patte injectée) de la souris isolée dans un box. L’avantage principal de ce test est qu’il permet d’analyser l’action de différents composés sur la douleur aiguë et persistante au sein d’un seul et même test.

Bénéfices attendus

Ce modèle sera intégré à l’offre de service de l’entreprise. L’entreprise peut ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés qui permet de proposer de tester ces candidats médicaments chez la souris. De plus, ce modèle étant rapide et simple à mettre en place, il s’inscrit dans l’outil de screening.

Procédures

Les souris reçoivent une injection sous-cutanée plantaire de formol pour l’induction du modèle (environ 30secondes). Ils sont soumis à une seule administration de composés (candidats médicaments à potentiel anti-douleur, véhicule ou référence) par voie p.o., ip., sc., i.v. ou i.m (environ 30secondes). Les souris peuvent aussi être soumises à un prélèvement de sang afin de surveiller la pharmacocinétique d’un composé. (environ 1minute)

Impact sur les animaux

L’animal reçoit une injection en sous-cutanée plantaire au niveau de la patte arrière. L’aiguille est introduite au niveau du talon. Le formol injecté va induire une douleur locale. La patte va présenter un gonflement plus ou moins important en fonction de la réponse inflammatoire de l’animal. Les animaux vont recevoir un traitement par voie p.o., i.p., s.c, i.v., Intrarectale. Des points limites/nuisances associés à la pharmacologie peuvent aussi apparaitre (tremblement, sédation …). Dans le cadre de certaines études, un prélèvement de sang peut être réalisé sous anesthésie (Intracardiaque, caudale, jugulaire, retro-orbital). En prélèvement unique, 1.2ml de sang peuvent être prélever sans réveil de l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort. Le but de ce projet est de réaliser des études de screening dans un modèle de douleur lié à l’injection de formol dans la patte. Cette injection reste douloureuse et implique la mobilisation de différentes voies de signalisation de la douleur. On ne peut donc pas être sûr de retrouver un animal sain plusieurs jours après. De plus, cette procédure est classée en sévère car la douleur est importante. Ce projet a pour but de tester des molécules en cours de développement. Leur potentielle toxicité à long terme n’est pas toujours connue à ce stade du développement. De plus, des interactions avec ces composés pourraient être possibles, si les animaux étaient gardés pour d’autres études. Garder les animaux ne nous permet pas non plus de rester dans des conditions standard or le stade de développement des animaux est important dans l’installation des pathologies sur lesquels le laboratoire travaille.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=12 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées par la société. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV. Ce test permet également de mesurer deux types de douleur. La première phase d’observation suite à l’injection de formol va engendrer une douleur aigue sensible aux anti-inflammatoires. Puis 17-27min après l’injection, une douleur de type neuropathique est testée (pas excès de nociception). Ceci permet donc de limiter le nombre de modèle à tester en screening.

Raffinement

Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation, habituation aux compartiments de tests). De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, papier kraft et briquettes en bois à ronger). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein de la société. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes. Ce stade nous permet d’avoir une maturation de l’ensemble des systèmes/ réseaux de douleur (nerveux, immunitaire…). Ceci semble être la meilleure solution pour des études de screening de molécules.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rendues diabétiques par la streptozotocine, ces souris immunodéficientes subissent une à deux chirurgies de greffe d'organoïdes intestinaux, des injections répétées et des prélèvements de sang pour suivre la glycémie, avant la mise à mort pour examiner les greffons. Le porteur indique un risque d'infection et de détresse après chirurgie et une hyperglycémie pouvant être mortelle si elle est trop élevée. Il affirme que le diabète s'exprime à l'échelle de l'"organisme" entier et que son étude sur l'animal "ne peut être remplacée".

Objectifs

Le pancréas joue un rôle clé dans l'homéostasie nutritionnelle. Il contient des cellules exocrines et endocrines (îlots de Langerhans). Ces îlots se composent majoritairement de cellules α et β synthétisant respectivement les hormones glucagon et insuline, responsables de la régulation de la glycémie. Notre recherche se concentre sur le diabète de type 1, une maladie caractérisée par la perte sélective des cellules β. Sans traitement, cette condition peut avoir de graves complications telles que des dommages vasculaires. Le seul traitement efficace est la supplémentation en insuline exogène. Cependant des facteurs environnementaux peuvent provoquer de fortes variations de la glycémie malgré un traitement à l’insuline, et donc éventuellement conduire aux complications mentionnées. Nos travaux s’intéressent à la régénération des cellules β. Nous avons montré que la surexpression du gène Pax4 dans les cellules α résulte en leur régénération et conversion en cellules « β-like », capables de « soigner » un diabète chez la souris. Il est intéressant de noter qu'une telle conversion est aussi visible dans le tractus gastrointestinal (TGI). Cependant, il est difficile de savoir si les effets observés sur la glycémie sont causés par la contribution du TGI ou pancréatique. Pour solutionner ce problème, nous proposons de réaliser des expériences de transplantation (et transplantectomie) d’organoïdes gastrointestinaux dans un modèle murin diabétique afin d’étudier spécifiquement la fonctionnalité des cellules « β-like » gastrointestinales. Les organoïdes sont des micro-tissus multicellulaires en trois dimensions, dérivés de cellules souches et conçus pour imiter la structure et la fonctionnalité des organes. Nous utiliserons 144 souris pour l’ensemble de ce projet en accordant une attention particulière à l’application stricte de la règle des 3R : Remplacement : Le diabète résulte de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. Réduction : Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques (G power) nous a permis de réduire le nombre d’animaux au minimum. Raffinement : Nous utiliserons une grille de score permettant de mesurer les éventuelles souffrances avec des points limites précoces et adaptés. Des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux, ceux-ci étant hébergés dans un environnement enrichi et en groupes sociaux.

Bénéfices attendus

Le but de ces travaux est de démontrer in-vivo la fonctionnalité des cellules « β-like » gastrointestinales et de mettre en lumière le potentiel des cellules endocrines du tractus gastrointestinal à constituer une source renouvelable de cellules β après reprogrammation pour restaurer la masse des cellules β chez les patients diabétiques de type 1.

Procédures

Des transplantations/transplantectomies d’organoïdes gastrointestinaux sont prévues (durée de l’intervention : ~20 min/animal, 1 ou 2 interventions espacées de 10 semaines, en fonction du groupe), nécessitant une mise à jeun de 5 heures avant la chirurgie et une anesthésie (durée totale de l’anesthésie : 30 min, 1 ou 2 interventions espacées de 10 semaines, en fonction du groupe). Les animaux recevront des injections quotidiennes (3 jours/semaine pendant 9 semaines, durée de l’intervention : ~5 s). Des prélèvements sont prévus pour suivre la glycémie des animaux (1 fois par semaine pendant 10 semaines, 1 goutte de sang, durée du prélèvement : ~10 s). En fin d'expérience, il sera réalisé un test nécessitant une mise à jeun de 5 heures puis une injection d’un produit augmentant transitoirement la glycémie (durée de l’intervention : ~5 s) suivie de 6 prélèvements d’une très faible quantité de sang à la queue (classiquement, l'expérimentateur fait perler le sang et 6 "perles" sont ainsi utilisées pour lectures de glycémie, durée d'un prélèvement : 10 s) à des intervalles de temps de plus en plus longs (entre 15 et 120 min).

Impact sur les animaux

Des transplantations/transplantectomies d’organoïdes gastrointestinaux sont prévues. Les animaux peuvent éventuellement développer une infection ou montrer des signes de douleur ou de détresse à la suite de la chirurgie. Le traitement à la streptozotocine va entrainer une hyperglycémie (qui peut s’avérer létale si elle est trop élevée). Pour ce projet, les animaux vont développer un diabète très modéré (hyperglycémie ne dépassant pas les 350 mg/dL). Concernant le traitement au tamoxifène, aucune douleur n’est escomptée. Cependant un léger gonflement des testicules peut être observer à forte dose. Cet effet indésirable, qui plus est indolore, n’altère en rien la fertilité et le comportement des animaux. Enfin, des prélèvements et injections sont prévus, et peuvent éventuellement être source de désagréments pour les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour examen post-mortem des organes et des greffons en particulier.

Remplacement

Le diabète est une maladie d’origine multifactorielle (y compris environnementale). De plus, cette pathologie s’exprime à l’échelle d’un organisme et fait donc intervenir tous les organes susceptibles de stocker ou consommer du glucose (la plupart des organes). Ainsi, son apparition et sa gravité résultent de l’intégration de plusieurs défauts et son étude sur l’animal intact est essentielle et ne peut être remplacée. De plus, nos résultats préliminaires obtenus ex-vivo sur des organoïdes gastrointestinaux sont très encourageants et justifient le développement de la partie in-vivo de ce projet.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’application de tests statistiques (G power sur des lots d'animaux précédant - puissance : 0,8 - p

Raffinement

Un anesthésique (isoflurane, 2L/min avec 2% O2) sera utilisé pour réduire le stress et angoisse chez l'animal et pour rendre l'anesthésie plus stable. Avant l'anesthésie, un analgésique (méloxicam, 2 mg/kg) sera administré afin de prévenir les sensations de douleur pendant et après la chirurgie. Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en œuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé ou la souffrance des animaux seront observées selon des grilles d'évaluations indiquées ci-dessous et en annexe. En amont de chaque procédure, des dispositions (habituation) sont prises pour minimiser tout stress aux animaux. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi (maisonnettes, buchettes), en groupes sociaux et en accord avec la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Ce projet a pour but de déterminer la fonctionnalité des cellules « β-like » gastrointestinales induites par l’expression du gène Pax4 dans un système biologique intégré. La souris correspond au meilleur compromis pour suivre sur le long terme le devenir de organoïdes transplantés. En effet, la souris est très proche de l’homme pour ce qui est des mécanismes de régulation de la glycémie/du nombre de cellules β. Nous utiliserons des animaux immunodéficients NSG âgés de 10 et 20 semaines. Des âges correspondant au stade adulte, un stade sélectionné comme le meilleur compromis. En effet, les souris sont alors considérées comme adultes et ne sont plus soumises aux conséquences métaboliques du sevrage. Elles sont donc obtenues rapidement et ne sont pas considérées comme trop âgées. De plus, nous avons choisi de travailler sur deux âges différents afin de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter la régénération des cellules gastrointestinales.

25 700 rongeurs, souris, rats, hamsters dorés et gerbilles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie réutilisée, 20 gerbilles placées et la grande majorité tuée. Ils reçoivent des composés chimiques ou biologiques par toutes les voies possibles, jusqu'à des administrations intracérébrales et par minipompe implantée, sur une période pouvant aller jusqu'à un an, pour déterminer la dose maximale tolérée. Le porteur décrit perte de poids, posture voûtée, cyanose et détérioration de l'état général, avec mise à mort dès 20 % de perte de poids ou lorsque 20 % des animaux d'un groupe ont dû être euthanasiés. Il affirme que les données in vitro sont "souvent insuffisantes" pour prédire la toxicité réelle et que la vérification chez le rongeur reste nécessaire.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérance des animaux pour un composé biologique ou chimique après une ou plusieurs administrations chez le rongeur. Ce projet permettra d’identifier la dose maximale aprés une ou plusieurs administrations qui n’engendre pas d’effet toxique chez les animaux (tolérance, Maximum Tolerated Dose, MTD).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer toxicité et la tolérabilité in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 jour à 1 an . Cette évaluation est critique afin de pouvoir ensuite réaliser des études d’efficacité.

Procédures

Afin d’évaluer la tolérabilité de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure; intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie; orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ); sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon); ou par minipompe (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Des administrations intravésicales (par cystocentèse ou cathéter) pourront être réalisées (anesthésie générale de moins d’une heure) après privation d’eau sur maximum 4h et vidange de la vessie par pression légère sur le ventre. Il sera aussi possible de réaliser des administrations intracérébrales. Ce geste sera réalisé lors d’une anesthésie de moins d’une heure avec analgésie. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 1 an. Des effets secondaires des traitements (toxicité) pourront être observés et une grille de scoring et des points limites adaptés à l’objectif de l’étude ont été mis en place. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés.. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine et/ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement les animaux en cages, sans enrichissement (max une heure). En fin de projet, la plupart des animaux seront euthanasiés pour récupération des tissus, organes, et du sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie. Les animaux ayant subi une administration unique de produit n’ayant pas présenté d’effets secondaires ou de signes cliniques et ayant été gardés en procédure au maximum une semaine pourront être gardés en vies sur avis du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Lors de l’injection pour la première fois d’un composé les effets sur l’animal peuvent être : une perte de poids, un aspect corporel détérioré, une distension abdominale, une posture courbée, la texture de la fourrure altérée, une couleur des oreilles et des pattes plus pâles ou cyanosées, des expressions faciales de douleur, une respiration et des habitudes naturelles détériorées ; critères d’observation avancés : comportement provoqué anormal, déshydratation, diarrhée, hypothermie… Pour certaines administrations intravésicales, il pourra être nécessaire de priver les animaux d’eau au maximum 4h, cela pourra engendrer une sensation de soif. Dans le cas d’administrations par injections ou dans le cas de prélèvements sanguins, ceux-ci génèreront une douleur limitée à celle d’une piqûre d’aiguille. Dans le cas d’intervention chirurgicale (pose de minipompe, implant, stéréotaxie etc), une douleur modérée transitoire pourrait être générée mais sera gérée par un traitement antalgique adéquat.

Devenir

Après chacune des deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont la toxicité et la tolérabilité seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro (toxicité et efficacité cellulaire) afin d’éviter l’administration des composés présentant un mauvais index thérapeutique. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire les effets in vivo des molécules. La toxicité et la tolérabilité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal.

Réduction

Dans la mesure du possible, afin de limiter le nombre d’animaux inclus dans une étude, le même animal recevra des doses croissantes du même composé (au minimum 72h d’élimination entre deux doses) plutôt que d’avoir recours à des animaux différents pour chaque dose. Dans le cas de recherche de toxicité aigüe avec différents groupes pour les différentes doses, dans la mesure du possible, le premier traitement des différents groupes sera décalé d’au minimum 24h, avec un lancement initialement du groupe recevant la plus faible dose. Ainsi l’administration n’aura pas lieu pour les groupes qui auraient dû recevoir une dose supérieure à celle du premier groupe dans lequel des effets secondaires seront observés. En pratique, si 20% c ou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Sur la base des expériences passées dans notre centre, le nombre minimum permettant d’obtenir une puissance statistique suffisante pour conclure a été déterminé : 3 à 5 animaux par groupe seront utilisés. Ce nombre pourra augmenter jusqu’à 10 si nécessaire pour obtenir une puissance statistique différente, compte tenu des analyses ex-vivo prévues et de leur variabilité. Dans le cas où la bioanalyse suite aux prélèvements nécessiterait un volume trop important de fluides, le nombre d’animaux devra être augmenté, jusqu’à au maximum 15 animaux par groupe. Dans le cas de prélèvements terminaux à différents points de temps (collecte d’organes/tissus, ex collecte de peau à plusieurs points de temps), un groupe d’animaux devra être inclus pour chaque point de temps. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.

Raffinement

Une grille de scoring clinique a été mise en place (voir procédure). Les animaux seront pesés tous les jours dès l’administration de composés. Une perte de poids de plus de 20% constituera un point limite. Dans le contexte de première administration de composé non testé in vivo, les animaux sont scorés toutes les deux heures pendant les 6 premières heures post-administration. Un scoring clinique sera réalisé quotidiennement dès l’administration des composés. Si 20% iou plus des animaux recevant une dose ont été euthanasiés sur point limite, le traitement à cette dose et à toute dose supérieure sera stoppé et il ne sera pas envisagé d’administrer de dose supérieure. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernaent l’état général de l’animal sont listés en détail dans les procédures. Dans le cas où l’administration de composé nécessite une chirurgie, une analgésie, un suivi adapté et des mesures post-chirurgicales sont mises en place pour prévenir la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique in vitro est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer la toxicité/tolérabilité des composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. Pour certaines études pré-réglementaires le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.

4 000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent par gavage une dose unique d'un produit dont la toxicité est inconnue, puis des prélèvements sanguins, pour classer les substances selon leur toxicité aiguë. Le porteur reconnaît des effets pouvant aller de l'hypersalivation aux tremblements, à la prostration et aux convulsions imposant la mise à mort. Il présente les modèles in silico et in vitro comme complémentaires, mais qualifie l'animal d'"incontournable" pour évaluer un produit sur un "organisme entier".

Objectifs

Ces premières études courtes d’évaluation de la toxicité aiguë in vivo permettent de confirmer la toxicité éventuelle du produit et d’éliminer du processus de développement des produits dont la toxicité est trop élevée et que les données provenant d’essais in vitro ou in silico n’auraient pas révélées. La toxicité aiguë désigne des effets nocifs résultant de l’administration d'une seule dose d'un produit ou d'une seule exposition à celui-ci. On évite ainsi d’utiliser des animaux de laboratoire pour des produits dont le développement ne pourrait arriver à son terme. Les études d’évaluation de la toxicité aiguë par voie orale chez la souris ou chez le rat : Acute Rat or Mouse Oral Screen (AROS or AMOS) ont pour objectifs de tester une dose de référence établie sur la base de la connaissance des produits déjà développés et de la famille chimique testée.

Bénéfices attendus

Les données générées permettent de caractériser le potentiel toxique d’un produit suite à une administration unique et ainsi de différencier et classer les produits en fonction de leur toxicité après une exposition aiguë (risque accidentel). Ceci permet d'éliminer, très rapidement et en utilisant peu d'animaux du processus de développement, des produits trop toxiques, d'éviter des études plus longues et donc l'utilisation d'un plus grand nombre d'animaux. Ces études sont nécessaires pour permettre le transport du produit testé vers d’autres installations d’essai en conformité avec la réglementation et garantir la sécurité des utilisateurs.

Procédures

Les animaux vigiles seront exposés oralement par gavage aux produits par une administration unique. Cette procédure est réalisée en moins de 15 secondes. Des prélèvements sanguins, de volumes très faibles pourront être pratiqués sans anesthésie au cours de l'étude. Chaque prélèvement prend moins de 2 minutes et sera réalisé au maximum 3 fois au cours de l'étude.

Impact sur les animaux

Les effets toxiques attendus sur ce projet peuvent être sévères car ce sont les premières études réalisées sur l'animal. Les signes cliniques les plus communs sont des augmentations de salivation, les signes cliniques les plus sévères qui nécessitent l'euthanasie de l'animal sont des baisses de température corporelle, des tremblements, de la prostration ou des convulsions. Les produits sont administrés une fois par gavage à l'aide de sondes souples (procédure qui peut induire un stress inférieur à 15 sec). En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d'une période de 24h pour l’analyse des concentrations de la substance à tester. Les prélèvements peuvent être faits à la veine caudale ou saphène. Ces derniers peuvent induire une douleur légère et de petits hématomes, qui disparaissent rapidement. Avant traitement, les rats sont soumis à un jeûne de 20h maximum pouvant engendrer une perte de poids inférieure à 10% du poids corporel et réversible après la réintroduction de la nourriture.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort en fin d'étude. La réutilisation de ces animaux n'est pas possible car les effets induits par l'administration de substances chimiques pourraient affecter les résultats de toute étude ultérieure.

Remplacement

Pour évaluer la sécurité des produits chimiques sur la santé humaine, des études combinant des modélisations mathématiques par ordinateurs (études in silico) ainsi que des modèles cellulaires (tests in vitro) sont réalisées. Des modèles animaux (études in vivo) sont cependant incontournables pour appréhender les effets d’un produit chimique sur un organisme entier.

Réduction

La taille des groupes est réduite au minimum pour permettre une évaluation de la toxicité : 3 animaux par groupe, un seul sexe et pas de groupe témoin.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu pour leur bien-être. Les procédures (surveillance clinique, administration des substances chimiques, l'anesthésie, les prélèvements...) seront effectuées par du personnel qualifié et expérimenté pour éviter le stress et l'inconfort inutiles. Les animaux sont observés quotidiennement y compris le week-end, avec une attention plus particulière le jour du traitement. Des points limites appropriés et validés par le Comité d'éthique et la SBEA ont été mis en place, ainsi qu'un arbre décisionnel et de critères d'arrêt de souffrance. Une évaluation rétrospective sur le bien-être animal est réalisée par la SBEA sur toutes les études. La priorité est de garantir le bien-être des animaux en n’administrant les produits qu’à des doses appropriées : la dose maximale utilisée est en général 300 mg/kg. On utilise donc des doses inférieures aux doses limites préconisées dans les lignes directrices pour le calcul de la toxicité aiguë (Dose létale 50%). En fonction de la toxicité connue d'une famille, une dose inferieure sera testée en première intention et le choix de la 2eme dose dépendra des signes observés.

Choix des espèces

Ces études sont réalisées chez le rongeur car ce sont les modèles expérimentaux choisis de préférence, en raison de leur utilisation fréquente dans les études toxicologiques et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Les études décrites dans ce projet utilisent de jeunes rongeurs adultes à partir de 6-7 semaines et jusqu’à 15 semaines, conformément aux études constitutives du dossier de mise sur le marché des produits.