Procédures sévères
Lutter contre les infections à Clostridium difficile à l’aide de bactéries
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont gavées avec la bactérie Clostridioides difficile, qui provoque une colite sévère et une perte de poids, puis reçoivent une souche bactérienne testée comme traitement, avec une mise à mort dès 20 % de perte de poids. Le porteur indique que les souris seront tuées faute de pouvoir être réutilisées, replacées ou adoptées après l'infection. Il présente cette bactérie comme une alternative possible à la transplantation de microbiote fécal, après des résultats obtenus in vitro.
Objectifs
Clostridioides difficile, anciennement dénommée Clostridium difficile (C. difficile), est une bactérie anaérobie stricte. Elle est retrouvée dans l’environnement ainsi que dans l’intestin de l’Homme et de l’animal. Les études épidémiologiques montrent une colonisation asymptomatique fréquente des nourrissons et des enfants de moins de deux ans avec des taux compris entre 20 à 70%. Chez l’adulte en population générale, son portage asymptomatique est estimé aux alentours de 3% mais s’élèverait à 10-25% en milieu hospitalier. C. difficile revêt un intérêt majeur en santé publique puisqu’elle est responsable de 10 à 25% des diarrhées post-antibiotiques, de 10% des diarrhées nosocomiales et de plus de 95% des colites pseudo-membraneuses. En France, la Haute Autorité de santé estime l’incidence des infections à C. difficile (ICD) dans les établissements de santé entre 0,5 et 3 cas pour 10 000 patients-jours. Certaines ICD sont réfractaires aux traitements et dans 18% des cas, les patients guéris vont faire une ICD récidivante. La transplantation du microbiote fécal (TMF) est une stratégie extrêmement efficace pour traiter les ICD. Les méta-analyses montrent une efficacité dans 84-91% des cas. Nous savons que le microbiote intestinal héberge une quantité et une diversité de microorganismes dépassant de loin le nombre total de cellules composant notre propre corps. Ainsi la transplantation d’un écosystème aussi complexe peut entrainer des effets secondaires indésirables. Les travaux les plus avancés concernent notamment l’obésité et montrent très clairement, chez la souris mince, que la transplantation d’un microbiote intestinal provenant de souris ou d’êtres humains obèses se traduit pas une prise de poids anormalement élevée. Par ailleurs, il a été rapporté dans la littérature des cas de patients devenus obèses suite à une TMF dans le cadre du traitement d’ICD. On touche ici à la « limite » de la TMF car il nous est impossible de contrôler ce qui est administré et donc d’en évaluer les risques sur le long terme pour la personne greffée. Nous nous proposons de tester l’efficacité d’une bactérie dans le traitement d’ICD. Cette souche appartient au phylum des Bacteroidetes, un des phyla majoritaires du microbiote intestinal humain. Cette souche n’a jamais été rapportée comme pouvant exercer un quelconque effet néfaste et pourrait faire un bon candidat dans le traitement des ICD. Par ailleurs,des études in vitro menées au laboratoire ont montré son efficacité.
Bénéfices attendus
D’une façon globale ce projet permettra, nous l’espérons, de valider une souche bactérienne comme étant bénéfique dans le traitement de l’ICD. A long terme, cela pourrait permettre de remplacer la transplantation de microbiote fécal par une pratique tout aussi efficace mais plus sûre du point de vue microbiologique.
Procédures
Les animaux seront tous gavés avec C. difficile (1 seul gavage), ce qui représente un maximum de 250 souris. Ils recevront ensuite soit du PBS (un maximum de 80 souris), soit la souche au potentiel effet bénéfique (1 gavage quotidien) soit un maximum de 80 souris recevant la souche sauvage et un maximum de 40 souris recevant la souche déficiante pour le gène suspecté d'être efficace. Le gavage se fera sur animal vigile par du personnel expérimenté, habitué à cet acte qui hormis la contention n'induit aucune douleur à l'animal et ne dure que quelques secondes. En ce qui concerne la durée des gavages par notre souche d'intérêt, pour les expérience de traitement curatif, les animaux recevront un gavage quotidien après administration de la souche de C. difficile ce qui représente 10 jours de gavages. Pour les expérience de traitement préventif, les animaux recevront un gavage quotidien de la bactérie d'intérêt immédiatement après arrêt de l'antibiothérapie, ce qui représente 13 jours de gavages.
Impact sur les animaux
Tous les animaux recevront un traitement antibiotiques qui n’a jamais été rapporté dans la littérature comme induisant un stress/douleur... Les antibiotiques seront administrés par l’eau de boisson (pendant 3 jours), sauf un qui le sera par injection intrapéritonéale (injection unique) qui n’induit que la douleur liée à la piqure. Tous les animaux subiront des gavages. C’est une manipulation qui hormis la contention n'induit aucune douleur à l'animal et ne dure que quelques secondes. Notre souche d’intérêt dont nous voulons tester l’effet bénéfique, est une souche présente naturellement dans un microbiote sain et ne devrait pas induire de nuisance chez l’animal. En revanche, l’infection par C. difficile se traduit par une colite sévère ainsi qu’une perte de poids.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort. Ils ne peuvent pas être réutilisés, ni replacés ni adoptés car ils auront été infectés par C. difficile.
Remplacement
Notre approche expérimentale inclut une première analyse in vitro sur des lignées épithéliales intestinales immortalisées. Nous avons montré l'effet bénéfique de notre souche que nous voulons tester in vivo. Notre souche diminue significativement la réponse inflammatoire suite à une infection par C. diffcicile. Ayant montré son efficacité in vitro, nous souhaitons valider ces résultat dans un modèle murin d'ICD, modèle qui permet notamment d'englober la complexité de la réponse immunitaire.
Réduction
Nous n’avons jamais utilisé ce modèle infectieux et afin de réduire le nombre total de souris utilisées, nous allons dans un premier temps faire une expérience pilote. 10 souris maximum seront infectées uniquement avec C. difficile de manière à nous assurer que dans nos mains, le modèle fonctionne bien. De plus cette approche permettra de valider le système de score que nous souhaitons employer pour définir les points limites. Dans notre étude nous souhaitons vérifier qu’une bactérie d’intérêt limite les effets dus à l’infection par C. difficile. Nous nous placerons tout d’abord dans les meilleures conditions : traitement curatif (c’est-à-dire une préexposition à cette souche avant l’infection par C. difficile) et faible dose de C. Difficile administrée. Si aucun effet bénéfique n’est observé, nous arrêterons l’expérience. Un modèle curatif (administration de la souche d’intérêt après l’infection par C. difficile) ne sera mis en place que si un effet bénéfique est déjà observé en modèle préventif. Nous avons prévu également de tester 2 doses infectieuses de C. difficile. Nous ne testerons la dose élevée que si nous observons un effet bénéfique de notre traitement.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans uun salle climatisée (22 ± 2°C) avec un cycle 12/12h (jour/nuit, 7h00 à 19h00) et un taux d'humidité maintenu à 55%. Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en carton. Un suivi quotidien des animaux sera effectué de manière à repérer toute détresse animale (journalier puis 3 fois/jour après l'infection). Le poids des souris sera également suivi avec attention (pesées effectuées tous les jours dès l’infection par C. difficile) car c’est un très bon marqueur de l’inflammation intestinale et de la sévérité d’une diarrhée. Une perte de plus de 20% du poids avant induction de la colite constituera un critère d’arrêt et l’animal en question sera mis à mort. Les expériences seront réalisées en toute sécurité, notre animalerie permettant la manipulation de pathogènes de classe 2, comme C. difficile.
Choix des espèces
Les souris sont communément utilisées pour mimer les ICD. En effet, C. difficile induit une colite comparble chez la souris a celle induite chez l'Homme suite à une infection post-antibiothérapie. Les souris seront âgées de 9 semaines car c'était l'âge des animaux utilisés dans la publication qui fait référence dans le cadre des ICD en modèle murin, ainsi que dans la majorité de la littérature scientifique du domaine.
Comprendre les mécanismes immunitaires responsables de l’efficacité des vaccins contre la fièvre jaune : modélisation chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
90 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 56 d'entre eux étant classés en souffrance sévère, seuls quatre contrôles non infectés étant gardés en vie. Ils reçoivent une puce implantée par chirurgie, sont infectés par le virus de la fièvre jaune ou vaccinés, puis subissent des prélèvements de sang trois fois par semaine, quatre prélèvements de moelle osseuse et des biopsies de peau et de ganglions. Le porteur indique que l'infection peut provoquer fièvre, perte de poids et vomissements, et que les animaux infectés seront tués pour prélever des tissus inaccessibles chez l'humain. Il affirme que seul le primate non humain permet cette étude, les rongeurs n'étant sensibles au virus que dans des conditions artificielles.
Objectifs
Le virus de la fièvre jaune (YFV) est endémique en Afrique, en Amérique Centrale et en Amérique du Sud. Il représente un risque important d’émergence ou ré-émergence dans des régions actuellement non affectées comme l’Asie et le sud de l’Europe. L’organisation mondiale de la santé (OMS) estime chaque année à 200 000 le nombre de cas de fièvre jaune et à 30 000 le nombre de décès dus à cette maladie. Le taux de létalité est élevé, entre 20 et 60% selon les épidémies. Un vaccin homologué très sûr et efficace existe mais dont la fabrication industrielle est délicate et les réserves sont insuffisantes au niveau mondial. Par ailleurs, la biologie du virus et les mécanismes immunologiques conduisant à l’efficacité du vaccin sont encore aujourd’hui mal compris. Des études additionnelles approfondies sont donc nécessaires pour développer de nouveaux vaccins, aussi efficaces que le vaccin actuel mais plus faciles à produire, et améliorer ainsi notre préparation aux épidémies de fièvre jaune. Ce projet a pour but de mieux comprendre les bases moléculaires et cellulaires de la capacité à induire une réaction immunitaire et de l’efficacité des vaccins antiamaril (contre la fièvre jaune) avec l’objectif ultime d’aider au développement rationnel de nouveaux vaccins contre le virus de la fièvre jaune et les virus apparentés. Pour cela, ce projet étudiera le rôle de mutations dans la protéine d’enveloppe du vaccin antiamaril ainsi que le rôle de la persistance des antigènes du virus dans l’établissement des réponses immunitaires antiamaril efficaces et durables.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet aboutira à une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires moléculaires et cellulaires qui sous-tendent l’efficacité de la vaccination antiamarile ainsi qu’à une caractérisation approfondie de la distribution et de la persistance des antigènes du YFV après infection et après vaccination. Les études de corrélation entre ces différents a comparaison des résultats obtenus aux étapes 1 et 2 nous permettronta d’identifier des marqueurs prédictifs d’une immunité efficace. A plus long terme, l’ensemble des données générées dans ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes immunitaires qui gouvernent l’établissement et le maintien d’une mémoire immunitaire efficace et fournira une base solide pour le développement rationnel de nouveaux vaccins contre le YFV et autres virus responsables de maladies infectieuses graves chez l’homme et les animaux.
Procédures
Une puce de suivi de la température sera implantée en sous-cutané dans la région dorsale sur tous les animaux par chirurgie miniinvasive, sous anesthésie générale qui durera au total 1 heure. Les animaux, à l’exception des animaux contrôles, seront infectés avec le YFV et/ou immunisés avec le vaccin antiamaril par voie sous-cutanée sous anesthésie générale, pour une durée totale de 30 minutes. Des examens cliniques seront réalisés sur tous les animaux : pesée, prises de sang sous anesthésie générale de 20 minutes, minimum 3 fois par semaine dans les 2 semaines suivant la vaccination et/ou l’inoculation virale, puis 1 fois toutes les 2 semaines. Quatre prélèvements de moelle osseuse, espacés d’au moins 2 semaines, seront effectués sur une partie des animaux sous anesthésie générale de 20 minutes, . Quatre biopsies de peau et 4 biopsies de ganglions pourront également être pratiquées sous anesthésie générale de 1 heure. Les animaux pourront recevoir un traitement permettant d’identifier les cellules en division, par injection intraveineuse sous anesthésie générale de 20 minutes, une fois par jour pendant 10 jours maximum.
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles chez les animaux lors de l’infection par le YFV sont : - fièvre pendant 6 à 8 jours - perte de poids pendant 8 à 10 jours - nausées, vomissements rares et ponctuels, possibles entre le jour 2 et le jour 10 après exposition au virus Les nuisances théoriques possibles chez les animaux après les vaccinations sont : - réaction locale au niveau du site d’immunisation : rougeur de la peau, gonflement très rare, sur une durée de 1 à 3 jours Les nuisances possibles chez les animaux après les anesthésies répétées sont : - dysorexie, plus ou moins perte de poids mineure Les nuisances possibles chez les animaux après les prélèvements hématologiques répétés sont : - anémie transitoire Les nuisances possibles chez les animaux après les chirurgies sont : - réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie rare, durée de 1 à 5 jours
Devenir
Les animaux non infectés du groupe contrôle (n=4) seront gardés en vie, sur avis du vétérinaire, et pourront être inclus dans d’autres projets compatibles avec la procédure suivie dans notre projet, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour tous les animaux infectés ou vaccinés, une euthanasie sera nécessaire afin d'accéder aux tissus et organes, et réaliser des prélèvements, inaccessibles chez l’humain, qui permettront d'analyser et évaluer de façon approfondie les charges virales ainsi que les réponses immunitaires.
Remplacement
L’étude et la caractérisation des réponses immunitaires induites lors de l’infection par le YFV ou lors de la vaccination antiamarile nécessitent l’exploration de fonctions physiologiques et d’interactions systémiques à l’échelle de l’organisme entier. Les données ne peuvent être obtenues que de manière incomplète chez l’humain, en raison de l’inaccessibilité des tissus et organes impliqués. A ce jour, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux, les systèmes expérimentaux in silico et in vitro basés sur l’étude de cellules ou de tissus isolés ne permettant pas de construire des modèles pertinents des interactions hôte-pathogène, de la mise en place et de la persistance de la réponse immunitaire à une infection ou une vaccination.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire : Les études de détermination de la dose infectieuse seront réalisées avec une approche parcimonieuse, en incluant les animaux au fur et à mesure, en fonction des résultats précédemment obtenus. Ces études incluront 1 à 3 animaux par groupe selon un plan expérimental qui prend en compte l’ensemble des animaux pour l’analyse (par exemple : 8 animaux au total dont 2 infectés par la dose A, 3 infectés par la dose B et 3 infectés par la dose C). Les études de caractérisation des réponses induites par l’infection ou la vaccination, qui requièrent des analyses statistiques, incluront 6 animaux par groupe expérimental. . Le nombre d’animaux par groupe a été calculé pour garantir la puissance statistique nécessaire pour conclure, en utilisant des tests non paramétriques adaptés aux petits échantillons.
Raffinement
Des protocoles d’analgésie ont été définis et validés par l’équipe vétérinaire afin de minimiser la douleur à chaque intervention. Toutes les interventions sur les animaux sont réalisées sous anesthésie : vaccinations, exposition au virus, prélèvements de sang, procédures chirurgicales. Les interventions par chirurgie mini-invasive seront privilégiées afin de réduire la douleur postopératoire et une analgésie systématique sera mise en place lors des biopsies de peau et de ganglion. Les volumes de sang et de moelle osseuse prélevés seront réduits au minimum nécessaire. En cas d’apparition de réaction locale suite aux prélèvements, un traitement symptomatique pourra être instauré après examen par le vétérinaire. L’état des animaux sera surveillé quotidiennement et tout signe clinique anormal sera signalé aux responsables du projet et au vétérinaire. En cas de signes de douleur, un traitement symptomatique pourra être mis en place par le vétérinaire responsable. Des points limites et des critères d’arrêt sont prévus pour limiter la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Les primates non humains (PNH) utilisés dans ce projet sont susceptibles à l’infection par le YFV et développent une pathologie similaire à celle décrite chez l’humain. De plus, le système immunitaire des PNH est très proche de celui des humains et les réponses vaccinales semblables à celles observées chez l’homme. En revanche, les rongeurs ne sont sensibles au YFV qu’après inoculation intracrânienne et/ou chez des animaux rendus artificiellement déficients au niveau de leurs défenses immunitaires. Ces conditions sont très éloignées de la transmission naturelle du YFV chez l’humain (par piqûre de moustique) et sont incompatibles avec l’étude du système immunitaire. Les vaccins qui seront étudiés dans ce projet pourront faire l’objet d’essais cliniques ultérieurs chez l’adulte. Il est donc indispensable de réaliser ces études chez un animal adulte, possédant unsystème immunitaire « mature » : ainsi tous les animaux entrant dans le projet seront adultes.
Rôle du système vestibulaire dans la perception du temps et mécanismes cérébraux sous-jacents
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
362 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 196 d'entre eux étant classés en souffrance sévère. Placés en restriction alimentaire pendant un mois, ils subissent soit une exposition à une hypergravité de 2 G pendant 24 heures ou 30 jours, soit une destruction chirurgicale des récepteurs vestibulaires par labyrinthectomie ou section du nerf. Le porteur indique que ces atteintes provoquent désorientation, troubles de l'équilibre et de la marche, et que les rats seront tués pour prélever leur cerveau. Il présente le projet comme une recherche fondamentale sur la perception du temps chez les astronautes et les patients vestibulaires.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans un cadre de recherche fondamentale qui vise à évaluer le rôle du système vestibulaire sur la perception du temps. Chez les astronautes, la perception du temps est modifiée lorsqu’ils sont soumis à des modifications d’accélération de gravité (décollage de fusée, mise en orbite, retour sur terre). Cela compromet leur efficacité dans l’utilisation de commandes, la prise de décision, etc... Il s’agit d’un des freins essentiels à la possibilité de très longs voyages spatiaux. Mais, les mécanismes cérébraux sous-jacents à ces modifications comportementales ne sont pas connus et le rôle du système vestibulaire dans les mécanismes de perception du temps n’a jamais été étudié. Dans un premier temps, les effets de la gravité sur les mécanismes cognitifs de perception temporelle seront étudiés. Ainsi, nous évaluerons les effets induits par différents délais d’expositions à l’hypergravité de groupes de rongeurs sur des tâches comportementales évaluant la perception du temps. Dans un deuxième temps, les mêmes tests comportementaux seront utilisés afin d’évaluer les performances chez des rongeurs soumis à deux types de déafférentations vestibulaires. En effet, des perturbations cognitives comparables à celles observées dans l’espace ont également été reportées chez les patients aréflexiques vestibulaires (ayant une perte bilatérale des entrées sensorielles vestibulaires). Les pathologies vestibulaires se caractérisent par des épisodes imprévisibles et souvent récurrents de vertiges, associés à des déséquilibres posturaux au repos ou lors de déplacements, et de nombreux déficits cognitifs. Cet ensemble de symptômes impacte considérablement la vie quotidienne des patients. Ce projet permettra de mieux appréhender le rôle du système vestibulaire dans les mécanismes cérébraux relatifs à l’intégration et à la perception des durées. Les deux procédures utilisées impactent les récepteurs vestibulaires périphériques, organe sensoriel dédiés à la perception de la gravité terrestre, et seront combinés à des approches immunohistochimiques pour comprendre en détail le rôle des entrées vestibulaires dans les réseaux neuronaux de la cognition temporelle.
Bénéfices attendus
Les données obtenues permettront de comprendre en détail le rôle du système vestibulaire dans les perturbations cognitives observées chez l’homme, que ce soit chez des patients présentant des pathologies vestibulaires ou chez les astronautes soumis à des changements de gravité. Des troubles cognitifs comparables sont en effet observés chez ces deux populations. Une identification précise de ces perturbations comportementales suivie de l’étude des mécanismes cérébraux sous-jacents permettra ainsi d’améliorer la prise en charge des patients vestibulaires qui ont des troubles perceptivo-cognitifs particulièrement handicapant au quotidien, mais également des astronautes dans le but de limiter les risques durant les vols spatiaux.
Procédures
A l’exception de 6 animaux satellites, tous les rats prévus dans ce projet sont placés en restriction alimentaire durant toute la période d’apprentissage (1 mois) des deux tâches comportementales. Lorsque les animaux ont terminé l’apprentissage, des atteintes vestibulaires sont appliquées (première partie : hypergravité, deuxième partie : perte des informations vestibulaires) pour mieux comprendre le rôle de cet organe sensoriel sur les mécanismes de perception du temps. Ils sont ensuite testés à deux délais : un délai précoce (inférieur à une semaine) et un délai tardif adapté à l’atteinte vestibulaire (15 jours après hypergravité, 14 ou 30 jours après chirurgie vestibulaire). Durant les tests comportementaux, des récompenses alimentaires sont distribuées aux animaux après une bonne réponse. Ainsi, la restriction alimentaire est nécessaire pour assurer une bonne motivation des rongeurs. Les animaux étant également testés à des délais tardifs dans les deux parties du projet, la restriction sera suspendue, puis réappliquée 4 jours avant les dernières évaluations comportementales . L’apport de nourriture aux animaux restreints sera adapté en fonction de la courbe de croissance des animaux satellites, non restreints. Dans la première procédure visant à étudier l’influence de l’hypergravité sur la perception du temps, 40 rats sont placés dans un champ gravitaire de 2G durant 24h et 40 rats sont placés dans ces mêmes conditions durant 30 jours. Les animaux contrôles de cette procédure sont placés dans des conditions similaires aux groupes 2G sans modifications du champ gravitaire (même pièce d’hébergement avec les mêmes conditions de lumière, de son et de température) pendant les délais de 24h (n=40) et 30 jours (n=40). Dans la seconde procédure visant à étudier l’influence d’une perte bilatérale des informations vestibulaires sur la perception du temps, 48 rats sont labyrinthectomisés bilatéralement (destruction des récepteurs vestibulaires périphériques, temps estimé de la chirurgie : 1h30), 68 rats sont neurectomisés bilatéralement (découpe du nerfs reliant les récepteurs vestibulaires périphériques au système nerveux central, temps estimé: 2h30) et 80 rats sont opérés sans atteintes des nerfs vestibulaires ou des récepteurs vestibulaires périphériques (groupes contrôles non-lésés, temps estimé: 30 minutes). Pour les deux chirurgies, l’analgésie est induite par injection sous-cutanée de buprénorphine 30 min avant l’anesthésie (durée : 1 minute).
Impact sur les animaux
La mise en hypergravité des animaux peut potentiellement induire une augmentation du niveau de stress en induisant une sensation d’alourdissement, et en perturbant leurs déplacements dans l’espace. Les animaux pourraient alors s’immobiliser pendant quelques heures avant de s’adapter au nouveau référentiel gravitationnel et de reprendre une activité normale. La perte bilatérale des informations vestibulaires périphériques induit une désorientation des animaux, des troubles oculaires et posturo-locomoteurs (perte d’équilibre, déviation de la marche, élargissement de la surface du polygone de sustentation), à court terme (3 jours post-labyrinthectomie et 5 à 7 jours post-neurectomie). Des processus de compensation par d’autres modalités sensorielles se développent durant cette période dite « critique », et la majorité des troubles induits par la lésion disparaissent, ou s’atténuent très fortement après une dizaine de jours.
Devenir
L’ensemble des rats utilisés dans les deux procédures de ce projet seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour des investigations immunohistochimiques. Ces prélèvements permettront de corréler les résultats des études comportementales avec les atteintes cérébrales observées.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est, pour l’instant, nécessaire pour vérifier d’un point de vue cellulaire les effets comportementaux induits par les protocoles impactant les récepteurs vestibulaires périphériques utilisés dans ce projet. Par ailleurs, l'étude de la cinétique d'expression des mécanismes cellulaires de neuroplasticité dans les régions cérébrales d’intérêts étudiées dans ce projet ne peut se faire que chez un modèle biologique vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduits au maximum pour chaque groupe en fonction des données issues de la littérature présentant les taux de survie des rongeurs soumis aux mêmes procédures chirurgicales en ayant pour but de conserver un nombre d’animaux suffisant pour les analyses comportementales (labyrinthectomies : 86% (n=12) et neurectomies : 60% (n=17) ; groupes contrôles et groupes soumis à l’hypergravité : n=10). Des groupes de 10 animaux sont utilisés pour les études comportementales ; ce nombre a été estimé en fonction de la littérature. En effet, une étude précédente évaluant les déficits attentionnels de rats soumis à des LVB sur des dispositifs de conditionnement opérant similaires à ceux présents dans notre laboratoire a utilisé des effectifs similaires. Par ailleurs, n’ayant aucune donnée préliminaire au laboratoire, nous ne pouvons pas réaliser de test statistique afin d’estimer plus précisément le nombre d’animaux nécessaires.
Raffinement
Durant les deux premiers jours en hypergravité, et les deux premiers jours post-chirurgie, un gel nutritionnel est déposé dans les cages des animaux, ainsi que des croquettes. Dans la centrifugeuse, les animaux seront suivis quotidiennement par l’expérimentateur (caméras placées dans chaque nacelles). La centrifugeuse sera arrêtée au minimum deux fois par semaines pour effectuer le change des cages et des biberons des animaux. A chaque arrêt de la centrifugeuse, les animaux seront pesés et leur apparence et comportement évalués selon une grille de score du bien-être animal. Les animaux subissant une chirurgie seront soumis à des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés, pesés et évalués quotidiennement. Enfin, les co-porteurs du projet sont formés en expérimentation animale (niveau concepteur) et sensibilisés au bien-être des animaux. La personne réalisant les chirurgies a suivi la formation adaptée afin de garantir les bonnes pratiques limitant au maximum la souffrance des animaux.
Choix des espèces
L’utilisation d’un modèle rat dans le cadre de ce projet est pertinente pour de nombreuses raisons. Dans un premier temps, les atteintes vestibulaires appliquées sur les rongeurs reproduisent les symptômes observés en clinique chez les astronautes (mise en hypergravité) et les patients vestibulaires (déafférentations vestibulaires). Dans un second temps, le recours aux modèles animaux est pour l’instant nécessaire pour observer l’impact de ces atteintes dans les différentes structures cérébrales impliquées. Or l’étude de ces mécanismes est un processus biologique qui ne peut, pour l’instant, qu’être étudié sur un modèle biologique vivant. De plus, des données préliminaires obtenues au laboratoire ont montré que l’apprentissage des tâches de conditionnement opérant sur écran tactile est plus rapide chez un modèle rat que chez la souris, ce qui limite la durée de la restriction alimentaire imposée aux animaux Nous utiliserons des rats âgés de 8 à 10 semaines, sortis de la période pubertaire, pour l’étude des mécanismes cérébraux sous-jacents aux tests comportementaux développés.
Formation initiale et qualification du personnel à la technique d’efficacité par épreuve rage
- Formation professionnelle
1 705 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 103 d'entre elles étant classées en souffrance sévère. Elles servent à former et qualifier le personnel à l'épreuve rage utilisée pour le contrôle des lots de vaccins vétérinaires, les souris témoins développant les symptômes sévères de la rage. Le porteur indique que deux tiers des souris vaccinées survivent mais que le niveau de confinement interdit toute sortie vivante, si bien que toutes sont euthanasiées. Il justifie l'usage d'animaux vivants par les exigences de la Pharmacopée européenne.
Objectifs
Les autorités de santé demandent la démonstration de l’activité et de l’identité virale des lots commerciaux de chaque vaccin via des contrôles qualité qui ont pour finalité l’autorisation de mise sur le marché (AMM). De ce fait, la sécurité des lots de vaccins peut être évaluée sur des modèles animaux. Le projet a pour objectif de qualifier le personnel à la technique d’efficacité par épreuve rage sur espèce alternative (souris). Cette technique vise à être en conformité avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires, dans la constitution d’un dossier d’AMM pour un vaccin. Former et qualifier du personnel compétent pour utiliser les modèles rongeurs permet de garantir une commercialisation de vaccins efficaces et surs qui protègent l’animal de la maladie.
Bénéfices attendus
Les tests de contrôle qualité permettent la libération d’un nombre important de doses de vaccins qui protègent les animaux, et indirectement, l’homme, contre la rage.
Procédures
Tous les animaux sont manipulés. 1 ou 2 injections en fonction de la technique pour les vaccinations et s’effectuent sur animal vigile. Les épreuves s’effectuent sur des animaux avec anesthésie générale. Ces actes sont inférieurs à 1 minute. Aucun prélèvement n’est effectué. Les animaux sont euthanasiés à la fin de la technique selon les recommandations de l’annexe IV de la Directive 2010/63.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent présenter une légère augmentation de stress due aux injections et aux manipulations. Les animaux témoins montrent les symptômes sévères liés aux maladies testées. Des points limites spécifiques aux pathologies sont appliqués. La période de formation/qualification est supervisée par du personnel formé et compétent.
Devenir
Sur une séance les 2/3 des souris vaccinées sont protégées et de développent pas les symptômes de la rage. Le niveau de confinement du bâtiment ne permet pas la sortie vivante de ces animaux. Les autres animaux sont euthanasiés pour raison éthique.
Remplacement
La validation de la technique pour être dans la carte de contrôle (limites définies du titre vaccinal et viral) doit forcément se faire sur animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux est défini au plus juste selon la pharmacopée correspondant à l’activité du vaccin rabique inactivé pour usage vétérinaire.
Raffinement
Des points limites spécifiques aux pathologies sont déterminés pour l’ensemble des animaux. L'injection de la souche d'épreuve s'effectue sous anesthésie. Le personnel vérifie l’évolution de l’état général et si les points limites spécifiques sont atteints, la souris est euthanasiée. Le personnel est compétent pour identifier les cas pour lesquels l’animal n’est plus dans sa zone de confort. Les conditions d’hébergement varient selon l’espèce et l’âge des animaux pour maximiser leur confort et leur bien-être. Tous les animaux sont hébergés en groupe et des enrichissements adaptés du milieu ont été mis en place dans les hébergements. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
La souris est l’espèce référencée dans la Pharmacopée Européenne 01/2002 :0451 Adultes Le stade de développement selon la pharmacopée EU 01/2002 :0451 indique d’utiliser des souris femelles saines âgées de 4 semaines environ et provenant du même élevage.
Etude de l’utililsation de molécules vasodilatatrices pour le traitement d’une neuropathie périphérique chimiquement induite à un stade chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de modéré à sévère. Elles reçoivent huit injections d'oxaliplatine, une chimiothérapie, sur huit semaines pour développer une douleur neuropathique chronique, évaluée par les tests de von Frey et de la plaque froide. Le porteur indique qu'aucun médicament ne permet de soulager cette douleur et que les souris sont donc tuées à la fin plutôt que traitées. Il teste des molécules vasodilatatrices dont l'effet observé jusqu'ici reste limité aux phases précoces de la maladie.
Objectifs
Les neuropathies périphériques chimiquement induites (NPCI) sont un effet secondaire de nombreux traitements de chimiothérapie. L’oxaliplatine, notamment employée pour traiter les cancers du côlon, engendre des douleurs neuropathiques chez près de 80% des patients. Il n’existe pas de traitement spécifique à ces douleurs, et faisant face à une qualité de vie réduite, les patients n’ont pas d’autre choix que de réduire ou d’arrêter le traitement anti-cancéreux. La chimiothérapie étant administrée par voie intraveineuse, nous émettons l’hypothèse d’une implication des vaisseaux sanguins dans ce processus pathologique. Pour étudier l’impact de la pathologie sur la composante vasculaire, nous avons développé un modèle murin de NPCI aigue. Il nous a permis d’identifier certains mécanismes vasculaires pouvant être impliqués dans la mise en place de la pathologie. Cependant chez l’Homme il existe une forme chronique avec des symptômes plus lourds. Nous souhaitons donc approfondir nos connaissances de la pathologie en développant un modèle murin de NPCI chronique. Nous aurons ainsi une idée plus précise des mécanismes impliqués aux différents stades de la maladie. De plus, nous posons l’hypothèse qu’un flux sanguin modifié pourrait participer aux symptômes des NPCI, au moins dans les premiers stades de la pathologie. Développer un modèle murin chronique nous permettra d’évaluer cette piste thérapeutique à plus long terme. Pour ce faire, nous administrons par voie intraveineuse l’oxaliplatine 1 fois par semaine et différentes molécules vasodilatatrices tous les jours ou tous les deux jours par voie orale sur une période de 8 semaines. Les symptômes neuropathiques sont évalués grâce aux tests comportementaux de Von Frey et de la plaque froide. A la fin des procédures, des études post mortem seront conduites pour évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués à partir des nerfs sciatiques des animaux.
Bénéfices attendus
Les neuropathies périphériques chimiquement induites sont un problème de santé publique majeur. Pour l’oxaliplatine, traitement majoritairement utilisé pour traiter les cancers du côlon, 80% des patients développeront des symptômes neuropathiques à la suite des cycles de chimiothérapie. Ces patients ont une qualité de vie réduite avec des symptômes douloureux qui peuvent devenir insupportables et conduisent alors à la réduction ou à l’arrêt du traitement anticancéreux. Avec ce projet, nous souhaitons approfondir notre compréhension des mécanismes menant au développement de la pathologie. Nous avons déjà identifié des facteurs pouvant être impliqués dans les stades précoces de la pathologie ; nous étudions notamment l’impact du flux sanguin sur l’apparition des symptômes neuropathiques. Nos données suggèrent que l’administration de molécules vasodilatatrices permet d’atténuer les symptômes neuropathiques dans une phase précoce. Nous souhaitons alors développer un modèle de neuropathie périphérique chronique, afin de déterminer si cette piste thérapeutique peut être envisagée à long terme pour prévenir, soulager ou retarder les symptômes neuropathiques. De plus, l’étude du modèle chronique pourra mettre en évidence des mécanismes cellulaires et moléculaires différents de ceux menant aux symptômes précoces et ainsi mieux définir l’étiologie de cette neuropathie. Le développement d’un tel modèle complètera ainsi notre compréhension des mécanismes pathologiques à différents stades et degrés de sévérité et permettra d’affiner les stratégies thérapeutiques pouvant être proposées chez l’Homme.
Procédures
Les animaux recevront 8 injections intraveineuses d’oxaliplatine ou de glucose pour les animaux du groupe contrôle au cours de 8 semaines. Ils seront éveillés pendant la procédure d’injection, maintenus dans un dispositif de contention laissant libre accès à leur queue, endroit de l’administration. Ces animaux pourront recevoir, tous les jours ou tous les deux jours, par voie orale, des molécules vasodilatatrices dans le but de réduire les symptômes neuropathiques induits par l’oxaliplatine. Leurs symptômes seront régulièrement évalués, deux fois par semaines, lors de tests comportementaux établissant leur sensibilité aux stimuli tactiles et froids. Selon les besoins expérimentaux, les animaux pourront faire l’objet d’une anesthésie profonde et d’une analgésie préalable à la perfusion intracardiaque et l’exsanguination. Certains animaux recevront également une injection intraveineuse de fluorescéine 15 minutes avant la procédure de perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les souris recevant une dose cumulée de 80 mg/kg d’oxaliplatine sur 8 semaines, nous pouvons nous attendre à une petite perte de poids de nos animaux. Les souris traitées à l’oxaliplatine développeront une neuropathie périphérique avec des sensations d’inconfort au niveau des pattes lors des tests comportementaux. Nous étudions cette pathologie car il n’y aucun moyen de traiter les symptômes neuropathiques chez les patients. Les souris ne pourront donc pas être soulagées avec des médicaments qui se sont avérés inefficaces. Leur comportement et douleurs potentielles seront suivis quotidiennement et une euthanasie éthique sera effectuée si un des points limite venait à être franchi.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chacune des procédures car nous prélevons les organes (cerveaux, nerfs sciatiques et peaux de pattes) à l’issue des procédures afin de conduire des études post mortem. De plus, nous ne pouvons pas laisser les animaux en vie en fin de procédure car l’administration d’oxaliplatine entraine une douleur neuropathique qui peut durer dans le temps chez certains animaux. Cette douleur ne pouvant être prise en charge par aucun médicament, nous euthanasions les animaux à la fin de la procédure pour leur éviter des souffrances inutiles.
Remplacement
Ce projet modélise une pathologie humaine, la neuropathie périphérique chimiquement induite à un stade chronique et l’effet d’une potentielle solution thérapeutique. Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres comportementaux et physiologiques ; il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé correspond au minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifique valide. Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques afin d'étudier les différences entre nos différents groupes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans un milieu enrichi en coton de nidification et avec un enrichissement de type dôme. Toutes les précautions sont prises afin d’assurer au mieux le bien-être de l’animal en réduisant au minimum leur stress lors des manipulations. Nous avons déterminé des critères d’arrêt précoce pour lesquels les animaux seront pris en charge et sortis des procédures. Pour ce faire, l’état général et le comportement des animaux seront suivis tout au long des procédures. Nous étudions une pathologie, la neuropathie périphérique induite par l’oxaliplatine car aucun traitement actuel ne permet de soulager les douleurs. Il sera donc impossible de soulager pharmaceutiquement un animal présentant ces symptômes. Tout animal présentant des signes de stress ou de douleur sera exclu de la procédure. Les signes à surveiller sont notamment les suivants : • Absence de toilettage • Changements dans la posture et la démarche • Absence d’interactions avec les congénères • Perte de poids supérieure à 25% du poids de l’animal avant le début des expérimentations • Refus de se faire manipuler, agressivité • Réponses anormalement importantes aux tests comportementaux Les animaux seront surveillés et pesés 3 fois par semaine. Si une anomalie venait à être détectée, un suivi quotidien des animaux sera mis en place les jours suivants jusqu’à un retour à un état normal. Si les signes cités ci-dessus ne sont pas atténués dans les deux jours suivant l’exclusion de l’animal, ce dernier sera euthanasié par élongation cervicale. D’après la littérature et notre retour d’expérience, les souris se comportent normalement et il est rare de devoir exclure et euthanasier un animal.
Choix des espèces
Nos données préliminaires concernant le rôle du système vasculaire intra-nerveux dans le développement d’une neuropathie périphérique induite par l’oxaliplatine à un stade aigu ont été obtenues sur un modèle murin de cette pathologie. Ces premiers résultats suggèrent un lien entre la vasoconstriction et les premières étapes de la maladie puisque l’administration de molécules vasodilatatrices semble atténuer les symptômes neuropathiques. Nous souhaitons maintenant étudier la pathologie à plus long terme, pour comprendre les mécanismes impliqués et évaluer l’efficacité de cette piste thérapeutique à un stade chronique. Ces études seront à la fois comportementales mais également cellulaires et moléculaires en post-mortem. Il n’est donc pas possible d’étudier les interactions entre les systèmes vasculaires et nerveux en utilisant des cultures cellulaires. Cette étude doit être réalisée in vivo et requiert le recours à des animaux vivants. La neuropathie périphérique chimiquement induite est un effet secondaire de nombreux traitement anti-cancéreux. C’est donc une pathologie qui touche majoritairement les adultes. Nous travaillons alors chez la souris adulte, âgée entre de 3 et 6 mois.
Mise au point d’une Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour le meilleur suivi d’un modèle préclinique de greffes de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris (1/2)
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
22 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont la gravité va du sans réveil au sévère. Quatorze reçoivent une greffe de cellules tumorales directement dans l'hypophyse par chirurgie crânienne, puis un suivi par IRM sous anesthésie, pour mettre au point l'imagerie d'un nouveau modèle de tumeur. Le porteur indique que ces tumeurs peuvent provoquer une compression du crâne, des maux de tête et une atteinte de la vision, tout en affirmant que les souris ne devraient pas atteindre ces stades. L'étude se limite à valider la faisabilité de l'imagerie, les retombées thérapeutiques restant renvoyées à des projets ultérieurs.
Objectifs
Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1/1500). Bien que bénignes, elles provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives et agressives. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques classiques et il est indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Il existe peu d’outils d’étude pour caractériser leur comportement, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise à approfondir le développement d’un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques. La mise en place et la validation de ce nouveau modèle de greffes intra-hypophysaires a déjà été réalisé par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Notre projet vise à réaliser une étude pilote qui confirmera la faisabilité de mettre en place un suivi par Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) et de quantifier le volume tumoral de cellules greffées à un stade précoce de développement tumoral. Le projet se deroulera sur deux animaleries.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester la faisabilité de réaliser des imageries IRM de l’hypophyse et développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Le modèle qui sera mis en place permettra d'obtenir des résultats plus fiables que ceux obtenus sur tumeurs qui ont poussées sous la peau. L'imagerie IRM permet de tirer beaucoup d'informations et permet de reconstruire la tumeur en 3D. Il devrait enfin améliorer le suivi des animaux expérimentaux en prévenant mieux le développement de lésions tumorales et limitant ainsi leur exposition à de possibles gênes ou souffrances inutiles.
Procédures
Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cet acte n’aura lieu qu’une fois. Les animaux subiront une anesthésie gazeuse d’une heure maximum lors de la procédure d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM). Une injection de produit de contraste dans la cavité abdominale sera réalisé durant l’imagerie pour permettre de mieux visualiser les tumeurs.
Impact sur les animaux
Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La chirurgie (incision de 0.5 cm) va entrainer de la démangeaison pendant la cicatrisation. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. La procédure d’imagerie sera intégralement réalisée sous anesthésie gazeuse tout comme l’injection d’un produit de contraste pour mieux visualiser les tumeurs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales réalisées. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques permettront d’exploiter au mieux nos résultats et compléter les analyses d’image réalisées par IRM.
Remplacement
Les modèles de greffes tumorales orthotopiques (injection de cellules tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées) représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.
Réduction
Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs que nous pourrons étudier par imagerie. Dans le cadre des travaux proposés, 22 souris devraient nous permettre d’aboutir à la démonstration ou non de la faisabilité de développer des outils d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) permettant de raffiner nos analyses, identifier plus rapidement l’apparition de lésions et espérer suivre l’effet de nouveaux composés thérapeutiques. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’une IRM sur un nouveau modèle préclinique. L’utilisation de 8 souris non-greffées et la greffe de 14 souris au maximum sur 1 an nous permettra de confirmer la faisabilité de réaliser des imageries IRM et quantifier la taille des tumeurs étudiées.
Raffinement
L’imagerie de type IRM que nous souhaitons mettre en place vise par définition à raffiner le suivi et le bien-être du modèle préclinique de greffe intra-hypophysaire que nous développons. En parallèle de l’utilisation de cet outil, nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider la faisabilité mais aussi la sensibilité de l’imagerie par IRM que nous souhaitons mettre en place pour un meilleur suivi éthique de nos modèles expérimentaux.
Choix des espèces
Le modèle de souris choisi possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Il est réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse et permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.
Evaluation de la migraine, induite par injection répétée de Nitroglycérine, à l’aide de différents tests précliniques réalisés chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
1 800 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent cinq injections de nitroglycérine pour déclencher des crises de migraine, puis des composés fournis par des clients, et subissent des tests de douleur provoquée, allodynie et hyperalgie thermiques et mécaniques. Le porteur décrit des crampes abdominales, une douleur aiguë à l'injection et le stress de l'isolement, et précise qu'aucun antidouleur n'accompagne le modèle. Ce modèle "s'inscrit dans l'offre de service de l'entreprise", qui le propose à ses clients pour tester des candidats médicaments.
Objectifs
La migraine chronique est une maladie invalidante qui touche des centaines de millions de personnes à l'échelle mondiale. Le développement de nouveaux traitements contre la migraine est lent. Il existe de nombreux modèles mimant les phases aigues de la migraine. Ici, nous souhaitons évaluer un modèle de migraine chez l’animal par différents tests. La Nitroglycérine est un déclencheur de migraine connu chez l’homme et est donc un bon candidat pour ce modèle. Afin d’évaluer la migraine, différents tests sont réalisés. La migraine induite par la Nitroglycérine provoque de l’hypersensitivité thermique qui sera évalué par des tests thermique. De plus, une composante de douleur mécanique a aussi été démontrée et sera mis en évidence par des tests adéquats.
Bénéfices attendus
Ce modèle s’inscrit dans l’offre de service de l’entreprise. Elle peut ainsi offrir à ses clients un choix varié de tests pour évaluer la migraine dans le but de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs causés par l’administration répétées de Nitroglycérine.
Procédures
Injection (environ 15 secondes) de NTG en intrapéritonéale (5 injections par études) Administration de composés clients via différentes voies et sous différents schémas d’administration (environ 15 secondes par administration) Prélèvements sanguins répétés selon les besoins (1 à 2 minutes par prélèvement)
Impact sur les animaux
Suite à nos recherches bibliographiques, peu d’informations sont données sur des effets secondaires de ce modèle. Lors de nos précédentes études, nous n’avons observé aucun signe clinique inquiétant mais nous avons observé des crampes abdominales dans la minute suivant l'injection de NTG ou son véhicule. Nous serons quand même particulièrement attentifs aux signes cliniques notables et sévères. Certaines nuisances sont connues : - Douleur aigue de courte durée lors de l’injection intrapéritonéale de NTG ou de son véhicule (5 fois), - Stress des animaux lors de leur isolement en rack lors des tests (à J1, 3, 5, 7 et 9) durant 30 min à 2h30, - Douleur liée aux tests d’allodynie (douleur provoquée par un stimulus qui ne cause habituellement pas de douleur), d’allodynie thermique et d’hyperalgie (douleur anormalement amplifiée suscitée par un stimulus douloureux) thermique à J1, 3, 5, 7 et 9, - Douleur aigue lors de l’injection des composés clients ou molécules pharmacologiques de référence.
Devenir
Les effets de l’injection répétée de nitroglycérine chez le rat (5 injections) ne sont pas connus sur le long terme (après J11). De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité selon les bonnes pratiques recommandées.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » (https://www.iasp-pain.org/terminology). L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat.
Raffinement
Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Nous limitons les doses et les injections au minimum afin de ne pas induire de douleurs supplémentaires. Les tests comportent une valeur de cut-off à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation et 24h aux salles de tests). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise de l'entreprise (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude ou à défaut par un autre technicien (formé à l’expérimentation animale niveau I ou II). De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique et briquettes en bois à ronger)
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein de l'entreprise. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Lors de l’induction (J1), des rats de 200-250g (âge = 5-6 semaines) seront utilisés afin de rester en accord avec les articles étudiés. Ces mêmes rats atteindront un poids d’environ 250-300g le dernier jour de test (J9).
Internalisation des fonctions hippocampiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 598 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles subissent jusqu'à deux chirurgies crâniennes, une fixation de la tête pendant l'exploration d'un environnement virtuel sous privation d'eau, des injections d'oxytocine dès la naissance et un test d'anxiété en arène ouverte, pour étudier comment se forment les séquences neuronales de l'hippocampe au cours du développement. Une partie des souris porte une mutation reproduisant l'autisme, avec une surmortalité et une anxiété accrue décrites par le porteur. Sur le remplacement, il affirme que ces mécanismes ne peuvent s'étudier hors de "l'organisme entier" et conclut que la souris est "indispensable", les retombées pour l'autisme et Alzheimer restant renvoyées au conditionnel.
Objectifs
Au cours du développement, les neurones se connectent en réseaux locaux et à grande échelle pour produire notre cerveau fonctionnel capable d'acquérir des connaissances et de guider le comportement. La manière dont ces fonctions et les réseaux neuronaux sous-jacents émergent au cours du développement reste mal comprise. Cette information est essentielle non seulement pour comprendre le développement du cerveau mais aussi les maladies associées au developpement telles que l'autisme ainsi que la maladie d’Alzheimer. Dans ce projet, nous proposons d'aborder ces questions chez les rongeurs en développement. L'hippocampe est une partie du cerveau clé impliquée dans la mémoire, la planification et l'imagination chez les humains et la navigation spatiale chez les rongeurs. Ces processus reposent sur la capacité de former des représentations. Les neurones de l'hippocampe (appelées cellules de lieu) déchargent séquentiellement en présence d'informations sensorielles externes pendant l'exploration spatiale. Cependant, l'activation séquentielle des neurones hippocampiques peut également être observée lorsque les entrées externes sont réduites au minimum (lorsque nous dormons par exemple). Ces observations suggèrent que les séquences hippocampiques ne résultent pas simplement des indices sensoriels externes rencontrés séquentiellement au cours de l'exploration, mais pourraient remplir des fonctions supplémentaires dans la formation de la mémoire et la planification. Dans ce projet, nos objectifs sont de 1) comprendre comment ces séquences générées de façon interne émergent au cours du développement, 2) quels mécanismes sous-tendent leur maturation et 3) d'étudier comment ils sont affectés dans les troubles du spectre autistique et la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
L'étude proposée aura un impact majeur dans le domaine des neurosciences du développement. L'hypothèse dominante est que, au début du développement, l'activité spontanée est principalement générée en interne, suivie d'un raffinement dépendant des sens. Pendant longtemps, cette hypothèse a dominé le domaine du développement de l'hippocampe. Le projet actuel, qui implique des explorations chez des animaux en comportement, vise à réviser ce concept influent et classique en proposant un modèle très différent, dans lequel les formes précoces de l'activité hippocampique et ses fonctions de mémoire élémentaires sont principalement contrôlées par des entrées sensorielles externes, tandis que les modèles internes, impliqués dans les souvenirs durables, sont retardés au cours du développement. S'il est prouvé, ce concept aura également un impact majeur dans le domaine du développement cognitif en fournissant une compréhension mécanistique de l'amnésie infantile, qui reste l'un des phénomènes les moins bien compris. Ce projet apportera également une contribution majeure à la compréhension mécaniste des déficits cognitifs chez les patients autistes et pourrait ouvrir de nouvelles voies pour trouver un traitement contre l'autisme. Ce nouveau concept pourra également permettre de réinterpréter les données obtenues dans d’autre troubles du neurodéveloppement. Nous prévoyons de diffuser les connaissances acquises grâce à cette subvention lors de la "Fête de la science", de la semaine de sensibilisation au cerveau dans les écoles et de la nuit des chercheurs européens. Les résultats seront communiqués à plusieurs associations nationales et internationales de malades atteints de troubles du spectre autistiques et de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Procédures chirurgicales : 2 par animal une longue ne devant pas excéder 3h une courte ne devant pas excéder 1h. Tâche d'orientation et de mémoire spatiale: entrainements de 5 mn 4 fois par jours pendant 5 jours. Test d'anxiété: exploration d'une arène ouverte une fois pendant 10 mn. Injection d'oxytocine: 1 injection en sous cutané une fois pas jours pendant 7 jours à partir du premier jours de vie post-natale. Gavage : 1 fois pas animal.
Impact sur les animaux
Les expériences au cours du développement seront réalisées au cours de la troisième semaine de vie postnatale, avant et après le sevrage. Les animaux seront séparés de leur mère et de leur fratrie pendant la durée des entrainements/enregistrements ce qui peut engendrer un stress même si à ce stade les animaux commencent à sortir du nid pour explorer spontanément leur environnement. Entre deux entrainements/enregistrements les animaux seront remis dans leur cage en présence de leur mère et de leur fratrie jusqu’au sevrage. Ces enregistrements nécessitent une chirurgie qui entraine un stress physiologique atténué par les procédures d’analgésie et soins pré et post-opératoire. Une perte de poids peut être observée post-chirurgie diminuée par des mesures spécifiques détaillées plus bas. Le modèle de neurodéveloppement avec troubles du spectre autistique que nous utilisons (souris mutante pour le gène Magel 2) présentent une sur létalité post-natale liée à un déficit de succion, une hypotonie généralisée, une perte de poids dans les premiers jours de vie puis une hyperphagie, un déficit de comportements sociaux et une anxiété accrue. L’immobilité forcée peut être perçue comme un événement stressant si elle n’est pas mise en place de façon adéquate. De plus s’ils ne sont pas habitués à cette procédure, les animaux peuvent se débattre et se blesser. Pour éviter tout désagrément, les souris sont habituées progressivement à cette condition. De plus, l’apport de récompense hydrique permet d’associer cette situation à un renforcement positif pour l’animal. De plus la possibilité de courir sur la roue limite l’impression d’immobilité forcée et le stress associé. Tout signe de stress, caractérisé par une rigidité des membres, une posture arrondie du dos, une réaction anormale aux stimuli environnementaux (sursauts) ou de vocalisations, induira l’interruption de la procédure et le retour une étape antérieure d’habituation. Certaines souris peuvent présenter des complications post-opératoire (inflammation, infection) diminuée par injection d'anti-inflamatoires et d'antibiotiques si besoin. Chez l’adulte une privation hydrique est instaurée pour motiver les animaux à explorer l’environnement virtuel. Les animaux sont tête fixée ce qui peut être une source de stress même si ils peuvent courir sur une roue et voient défiler une environnement virtuel leur donnant une impression de déplacement.
Devenir
Pour les animaux enregistrés le cerveau doit être fixé par perfusion intracardiaque sous anesthésie générale/ analgésie pour vérifié la localisation correcte des électrodes. Pour les animaux utilisés pour le comportement ils seront mis à mort car aucun système ne permet leur adoption.
Remplacement
Nos expériences visent à identifier les circuits neuronaux qui permettent à un animal d’acquérir des connaissances sur son environnement et de les utiliser afin de se déplacer efficacement dans son environnement. Il n'existe pas aujourd’hui de méthode de substitution in vitro ou en culture cellulaire pour étudier les activités neuronales du réseau hippocampique en situation de comportement où les informations externes et internes sont impliquées. De plus, les enjeux propres de ce projet ne peuvent pas être envisagés hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, ces connaissances fondamentales ne pouvant pas être transposées sur des modèles ex-vivo ou organoïdes, le remplacement d’êtres vivants n’est donc pas possible. De plus, nous privilégions les rongeurs plutôt que des humains, car 1) les méthodes d’investigation des corrélats neurophysiologiques de l’espace sont souvent indirectes chez ces derniers (et purement indirectes chez l’individu sain) 2) les approches expérimentales actuelles chez l’humain ne sont pas compatibles avec des études causales 3) les études développementales des corrélats neurophysiologiques de l’espace sur individu sain n’est pas envisageable chez l’enfant humain du fait des très fortes contraintes éthiques et techniques. Les activités neuronales des patients souffrant de troubles du spectre autistique avec une mutation du gène Magel2 ne peuvent être recueillies chez l’humain du fait de l’absence de phénotype épileptique lié à cette mutation et du principe de non-malfaisance envers ces patients. Enfin, le modèle rongeur nous paraît approprié car les corrélats neurobiologiques de l’espace identifiés chez celui-ci l’ont aussi été chez l’humain. Ce parallélisme suggère que les rongeurs sont un modèle pertinent pour identifier la façon dont les réseaux neuronaux codent la position spatiale et encodent nos souvenirs. Or, la connaissance de ces mécanismes est aussi indispensable pour identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques, notamment dans la maladie d’Alzheimer qui affecte en premier les régions cérébrales essentielles dans la navigation spatiale et la mémoire des évènements de la vie. L’emploi de souris comme modèle d’étude des processus d’internalisation est une méthode pertinente dans l’étude de certains déficits connus, notamment sociaux, chez les personnes souffrant de troubles du spectre autistique.
Réduction
Pour comprendre le fonctionnement des réseaux neuronaux hippocampiques dans des tâches de navigation, il est essentiel de pouvoir enregistrer simultanément une grande population de neurones ou de les enregistrer sur une certaine durée ; le tout chez un animal effectuant une tâche de navigation spatiale. Cet objectif est conditionné par le nombre de sites d’enregistrement (ou ‘canaux’) : plus il y a de canaux, plus grande sera la population neuronale enregistrée. Actuellement, nous utilisons soit des électrodes à 64 canaux (Neuronexus) de façon aiguë, juste avant les enregistrements, soit des enregsitrements en chronique. Ces techniques nous permettent alternativement d’enregistrer d’une part jusqu’à 200 neurones en aigu tout en effectuant plusieurs sessions d’enregistrement chez un animal. D’autre part, les enregistrements chroniques permettent de suivre une population neuronale dans le temps et au cours d’un apprentissage. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé est fortement diminué. Nos recherches concernant différents stades du développement, les animaux issus d’une même portée pourront donc être utilisés pour différentes étapes de procédures : les juvéniles non utilisés pour les études développementales seront utilisés plus tard dans le cadre d'études menées chez l'adulte. Pour les souris des portées de modèles autistiques ou de la maladie d'Alzheimer, les animaux présentant le génotype requis par l’étude constitueront la population cible ; les animaux ne présentant pas le génotype requis seront aussi étudiés en tant que contrôles de la population cible, réduisant le nombre de portées à produire dans le cadre de cette procédure. De même, les mâles et femelles seront étudiés dans le cadre des procédures TSA, aboutissant à une utilisation de l’ensemble des animaux de chaque portée. Enfin, les données obtenues au cours du projet seront mises à disposition de la communauté scientifique pour analyses complémentaires et utilisation dans des modèles computationnels.
Raffinement
Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Une attention particulière sera portée aux juvéniles cours des chirurgies pour réduire douleur et stress (anesthésie générale et locale, tapis chauffant, suivi strict post- chirurgie en particulier après leur réintroduction au sein de la portée). Les mères et leur juvéniles opérés ou non seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux et de papier permettant aux femelles de faire des nids. Les enregistrements auront lieu dans une salle chauffée pour éviter tout stress du au froid et isolée phonétiquement. Les juvéniles et adultes seront habitués aux expérimentateurs et aux salles/conditions d’expérimentation pendant de longues sessions d’habituation quotidiennes. De la nourriture humidifiée sera fournie en poste opératoire pour les juvéniles après sevrage et les adultes pour faciliter la reprise de poids. Les animaux seront pesés et observés quotidiennement et une échelle de Morton et Griffiths, 1985, Vet. Rec. 116 : 431-36 sera utilisée pour décider d'intervention nécessaire pour améliorer le bien-être des animaux en fonction des observations (mise en pause de l’expérimentation si signes de stress trop importants, analgésie générale ou locale si signes de douleur, administration d’anti-inflammatoires si signes d’inflammation, antibiotiques si signes d’infection, arrêt de la privation hydrique si perte de poids >20% du poids initial) ou déterminer le point limite au-delà duquel l'expérimentation sera interrompue le cas échéant.
Choix des espèces
Cette étude s’effectuera sur des souris. Le modèle murin permet de tirer des conclusions générales sur le fonctionnement de l’hippocampe et son rôle dans la cognition spatiale et plus largement la mémoire. Les cellules de lieu et les séquences internes ont été décrites dans de nombreuses espèces de mammifères, y compris chez l’homme. Le cycle de reproduction rapide de la souris permet de travailler facilement à différents stades de développement. De plus le développement de lignées transgénique nous permettra d’utiliser des outils indispensables pour l’identification des cellules enregistrées comme les stimulations optogénétiques et de travailler sur des modèles murins de troubles du neurodéveloppement avec troubles du spectre autistique.
Mise en place d’un modèle primate non humain de peste pulmonaire et étude d’un vaccin anti-peste.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Tous les macaques qui recevront la bactérie de la peste seront tués, en raison des atteintes de la maladie et du risque pour la santé humaine, et seuls ceux exposés à une bactérie non pathogène, ou vaccinés sans être infectés, pourront être réutilisés après avis vétérinaire. 104 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 22 déclarés réutilisés. Ceux qui reçoivent Yersinia pestis, en aérosol ou par une sonde dans la trachée, sont ensuite isolés en cage individuelle et peuvent développer fièvre, symptômes de pneumonie, anorexie et léthargie, et chaque macaque subit environ 10 à 30 anesthésies, jusqu'à 14 prises de sang et trois scanners du thorax. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative non animale" et que l'évaluation d'un vaccin "nécessite un organisme entier", tout en indiquant que le protocole s'appuie sur des publications dont une bonne partie repose sur des résultats obtenus chez la souris.
Objectifs
Au cours de l’histoire, les trois grandes épidémies de peste ont fait jusqu’à 100 millions de morts. Le bacille à l’origine de la peste, Yersinia pestis, est responsable des différentes formes de peste (bubonique, pulmonaire, septicémique, méningée et digestive), selon la voie d’entrée du bacille (bactérie de forme allongée)) dans l’organisme du patient. La peste reste mortelle de nos jours dans le monde, les derniers décès reportés datant de moins d’un an. Bien qu’il existe des traitements antibiotiques relativement efficaces contre la plupart des formes de la peste, le risque d’émergence de bacilles multirésistants aux antibiotiques posent des problèmes de santé publique. Il existe un vaccin commercial, mais celui-ci n’est pas homologué en France du fait de ses nombreux effets secondaires. À ce titre, le développement d’un nouveau vaccin oral contre Y.pestis est primordial. Les objectifs du projet sont donc de : *mettre en place un modèle de peste pulmonaire avec Y. pestis chez le primate non humain *déterminer la dose optimale de vaccin requise pour induire une réponse immunitaire maximale pour un bon niveau de sécurité, *Démontrer l’innocuité et l’efficacité du vaccin contre la peste pulmonaire
Bénéfices attendus
La recherche d’un vaccin efficace et sûr contre la peste est un enjeu de sécurité et de santé majeur. A court terme, ce projet permettra de disposer d’un modèle pertinent pour évaluer l’efficacité d’un vaccin contre la peste. A plus long terme, le vaccin développé dans ce projet sera utile non seulement pour lutter contre les épidémies récurrentes et peut s’avérer être la seule alternative possible face à l’émergence de bactéries multirésistantes.
Procédures
*Prélèvement de sang, jusqu’à 1 fois par jour pendant la première semaine puis une fois par semaine pendant 7 semaines (max : 14). Un prélèvement de sang prend environ 2 minutes par animal. *Prélèvement de fluides nasopharyngés et rectaux et prélèvement de fèces, jusqu’à 1 fois par jour pendant la première semaine puis une fois par semaine pendant 7 semaines (max 14). Ces prélèvements prennent environ 5 minutes en tout. *Imagerie de type scanner du thorax seront réalisées (maximum 3/animal). Ceci prend environ 20 minutes. *Suivi quotidien des animaux (incluant un suivi vigile, un suivi anesthesié, une pesée, les contrôles des paramètres de santé de l’animal (respiration, fréquence cardiaque, oxymétrie etc…). Jusqu’à 5 fois par semaine. Ce nombre pourra être adapté si l’animal montre des signes de mauvaise santé. Ceci est réalisé sur animal anesthésié et prend environ 5 minutes. *Exposition des animaux par voie aérosol : une fois par animal. Ceci est réalisé sur un animal anesthsié à l’aide soit d’un masque positionné sur la bouche et le nez de l’animal ou soit à l’aide d’une boite d’aérosolisation dans laquelle est positionnée la tête de l’animal. Ceci prend environ 20 minutes. *Exposition par voie endotrachéale : une fois par animal. Ceci est réalisé sur animal anesthésié à l’aide d’une sonde à ballonnet. Ceci prend environ 15 minutes par animal. *Vaccination orale : une fois par animal. Ceci est réalisé sur animal anesthésié à l’aide d’une sonde gastrique utilisable en clinique humaine. Ceci prend environ 10 minutes par animal. Toutes ces manipulations seront effectués sur des animaux anesthésiés. Le nombre d’anesthésie est variable car les animaux ne seront pas observés pendant le même temps à différentes étapes du projet. Cela peut varier entre environ 10 et 30 fois par animal répartis sur des temps allant de quelques jours à plusieurs mois. Le temps que dure l’anesthésie est également variable et ira de 10 minutes (prélèvements habituels + contrôles de l’état de santé) à 30 minutes environ (imagerie).
Impact sur les animaux
La peste pulmonaire chez le modèle primate non humain est proche de ce qui a été documenté chez l’homme et est donc potentiellement mortelle si elle évolue sans traitement. Dans les deux jours post infection, il est attendu que les animaux développent une fièvre. Dès le troisième jour, des symptômes semblables à une pneumonie (sans toux) seront détectables. Une anorexie et un état léthargique pourront accompagner ce stade. Des atteintes du foie et de la rate sont possibles et seront surveillées. Les animaux vont également subir des anesthésies répétées qui pourront se traduire par une légère déshydratation qui sera surveillée et compensée au besoin. Enfin, un ou deux lavages broncho-alvéolaire pourront être réalisés chez les animaux anesthésiés afin de suivre la présence de la bactérie directement dans le poumon. Afin de limiter l’inconfort lié à cette procédure le nombre de ces procédure a été limité au minimum et un traitement symptomatique pourra être utilisé le cas écéhant. Par ailleurs, l’hébergement individuel des animaux, qui aura lieu uniquement après exposition au bacille pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement par l’enrichissement de leur milieu de vie. D’après les résultats obtenus chez la souris, il n’est pas attendu que le vaccin provoque de nuisance.
Devenir
Du fait que la pathologie a des conséquences importantes pour les animaux et que le bacille représente un risque pour la santé humaine, tous les animaux qui recevront la bactérie seront euthanasiés. Les animaux ayant reçu soit une bactérie non pathogène, soit le vaccin mais n’ayant pas reçu la bactérie pourront être réutilisés dans d’autres protocoles après un avis vétérinaire favorable.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour réaliser ce projet. L’objectif est de mettre en place un modèle cliniquement cohérent d’infection par Y. pestis pour évaluer la protection induite par un vaccin. Ce type d’évaluation nécessite un organisme entier car les atteintes sont multiples et réparties sur plusieurs organes. Le modèle choisi doit permettre d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorale et cellulaire). Enfin, la recherche d’effets secondaires indésirables consécutifs à la vaccination demande un modèle suffisamment proche de l’homme pour espérer une bonne représentation de ce qui sera observé. A ce titre, et en l’état actuel des connaissances, ces différents éléments ne peuvent pas encore être étudiés in vitro, in silico (à l’aide d’une modélisation mathématique) ou ex vivo (en dehors de l’organisme). Toutefois, cette phase préclinique de test du vaccin ainsi que l’établissement du modèle reposent sur l’analyse d’un ensemble de publications scientifiques reconnues et dont une bonne partie repose sur des résultats obtenus chez la souris.
Réduction
L’établissement de la dose vaccinale suit une méthode éprouvée dans la littérature scientifique ce qui permettra une approche statistique robuste en utilisant le moins d’animaux possible. La mise en place du modèle d’infection par Y. pestis repose sur une méthode déjà publiée. Cette méthode permettra de ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaire car nous attendrons d’avoir les résultats d’une étape avant de passer à la suivante. De ce fait, le nombre d’animaux inclus pourra être revu à la baisse. Cette méthode a été démontrée comme statistiquement robuste en utilisant le minimum d’animaux. Enfin, lors de la vérification de la réponse vaccinale, le nombre d’animaux retenu par groupe a été limité au minimum permettant une comparaison des résultats obtenus par l’utilisation de tests statistiques bien établis et démontrant ainsi l’efficacité du candidat vaccin testé.
Raffinement
L’ensemble des procédures seront effectuées sur des animaux anesthésiés. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et des mesures seront réalisées à chaque anesthésie en plus des mesures de température toute les deux heures grâce à la puce implantée à l’animal avant le début de l’expérimentation. Des points limites basé sur la bibliographie ont été établis par les vétérinaires de l’installation et le responsable de la cellule locale du bien-être animal avant le début des expérimentations animales. Ceux-ci seront adaptés au fur et à mesure de l’établissement du modèle afin de suivre de près l’évolution clinique des animaux et de proposer une approche prédictive qui servira d’aide à la décision de mise en place de mesure limitant la souffrance et à la décision d’euthanasie.
Choix des espèces
Considérant toutes les contraintes énumérées ci-dessus, le primate non humain a été choisi comme modèle d’étude pour ce projet. Les macaques cynomolgus ont été sélectionnés pour plusieurs raisons : • Leur sensibilité à l’infection par Y.pestis. • Ils réunissent les éléments nécessaires à l’évaluation de vaccins : leurs réponses immunitaires et vaccinales sont similaires à celles de l’homme, et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire et de la réponse vaccinale sont disponibles et maitrisés chez ces espèces, contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires régulièrement utilisées comme le rat ou la souris. • Ils ont déjà fait l’objet de quelques publications scientifiques qui détaillent des symptômes et des atteintes semblables à ce qui est observé chez l’homme. Les animaux devront être adultes: les objectifs du projet sont de mettre en place un modèle de peste pulmonaire et d’étudier la protection par un candidat vaccin contre Y. pestis. De ce point de vue, il est donc primordial que les animaux disposent d’un système immunitaire et d’un système respiratoire pleinement mature. Le système immunitaire et le volume des poumons évoluent en fonction du stade de développement et de l’âge des animaux. Nous utiliserons donc des animaux adultes d’âge et de poids semblables.
Validation du modèle murin de coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) et évaluation de différentes thérapeutiques sur la dysfonction endothéliale lors d’une CIVD induite par un choc septique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Une première chirurgie de 15 minutes provoque un choc septique, puis une seconde, 20 heures plus tard, maintient chaque souris quatre heures sous anesthésie générale, placée sous réanimation et suivie dans ses paramètres physiologiques, avant des injections de traitements. 600 souris génétiquement modifiées, de jeunes adultes de 8 à 12 semaines, vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance sévère, certains groupes recevant une perfusion de plasma à la place de la première opération. Pour des procédures classées à ce niveau, le porteur évoque fièvre, tension basse, palpitations, baisse des urines, stress et "une certaine douleur liée à la chirurgie". Toutes sont mises à mort à la fin du projet pour des "prélèvements complémentaires", le porteur prévoyant de prélever sur une même souris foie, cœur, reins, poumons, vaisseaux, liquide broncho-alvéolaire et sang.
Objectifs
Le choc septique est l’une des formes les plus graves d’une inflammation, il s’agit d’un motif fréquent d’admission à l’hôpital avec un taux élévé de mortalité (30 à 40%), sans traitement spécifique. Lorsque le choc septique se complique de CIVD (coagulation intravasculaire disséminée), la mortalité est de 70% malgré une prise en charge optimale. A l’heure actuelle, il n’existe en effet aucun traitement spécifique de la CIVD. Notre projet vise à valider un nouveau modèle murin de choc septique avec CIVD permettant de se rapprocher au mieux de la pathologie chez l’Homme. Une fois validé, ce modèle nous permettra d’évaluer de nouvelles cibles thérapeutiques de la CIVD du choc septique afin d’améliorer le pronostic des patients.
Bénéfices attendus
Notre projet de recherche consiste d’abord à valider un modèle murin de CIVD au cours du choc septique afin de pouvoir réaliser des études pré-cliniques. L’utilisation de ce modèle nous permettra d’étudier précisemment cette maladie afin de mieux la comprendre, et d’évaluer des options thérapeutiques afin de mieux la traiter et d’améliorer le pronostic des patients.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie, sous anesthésie générale, de 15 minutes, pour l’induction d’un choc septique, suivie 20 heures après, par une seconde chirurgie, sous anesthésie générale, pendant 4 heures pour la mise en place des éléments de réanimation et le suivi des paramètres physiologique de l’animal comme chez l’homme. Au décours de cette réanimation, les animaux recevront des traitements par injection. Pour certains groupes d’animaux, la première chirurgie sera remplacée par une perfusion de plasma sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les souris pourront être stressées, avoir de la fièvre, une tension basse, palpitations, uriner moins et pourront ressentir une certaine douleur liée à la chirurgie.
Devenir
A la fin du projet, les souris seront mises à mort afin de réaliser divers prélèvements complémentaires.
Remplacement
Le remplacement du modèle animal par un autre modèle n’est pas possible car le choc septique est une maladie systémique. Aucun autre modèle ne peut approcher la complexité de cette pathologie. Cependant, l’identification préalable des mécanismes moléculaires probablement impliqués ont été faits à l’aide de méthodes alternatives (modèle de cultures cellulaires stimulées par une endotoxine).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum afin d’obtenir des données statistiquement significatives, avec des tests statistiques adaptés selon les questions posées. De plus, de manière à réduire au minimum les expériences, le maximum de prélèvements sera réalisé sur une même souris (organes : foie, cœur, reins, poumons, vaisseaux, liquides broncho-alvéolaires et sang).
Raffinement
Afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés, les expériences sont raffinées : - les phases douloureuses seront réalisées sur des animaux anesthésiés - les animaux sont alors replacés dans leur cage d’origine avec des congénères qui ont subi la même opération. La nourriture standard sera déposée au fond pour faciliter la prise de nutriments et l’hydratation, ainsi que du coton pour permettre aux animaux de se maintenir au chaud. - des traitements contre la douleur seront administrés - les expériences auront une durée limitée dans le temps et réduite au minimum nécessaire. Des points limites ont été établis permettant de limiter la souffrance et la douleur de l’animal. Une période d’habituation d’au moins 2 semaines sera respectée avant la chirurgie.
Choix des espèces
Le modèle de choc septique chez la souris est beaucoup utilisé dans la recherche sur le choc septique. Ils permettent de reproduire la plupart des observations faites chez les individus en choc septique. Ce modèle génétiquement modifié est le plus adapté afin d’étudier la CIVD (troubles de la coagulation) induite par le choc septique. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte (entre 8 et 12 semaines) car les systèmes vasculaires et immunitaires sont matures.
Evaluation du potentiel thérapeutique des astrocytes dans les maladies psychiatriques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Elles sont soumises à un isolement social de cinquante jours pour modéliser la schizophrénie, à une injection de vecteurs viraux dans le cerveau et à une restriction d'eau de quinze jours, pour tester le rôle des astrocytes dans cette maladie. Le porteur décrit l'isolement social comme la nuisance "nécessaire" à l'apparition des symptômes. Les cerveaux sont prélevés après la mise à mort.
Objectifs
Le cerveau est constitué de neurones ainsi que d'un autre type cellulaire au moins aussi abondant appelé astrocyte. Alors que le rôle des neurones dans le fonctionnement cérébral est largement reconnu et étudié, le rôle des astrocytes et leurs interactions avec les neurones reste très largement méconnu. Néanmoins, les données récentes suggèrent qu’ils seraient aussi impliqués dans le contrôle des états comportementaux et des fonctions cognitives et dans certaines situations pathologiques. Nous avons montré que les astrocytes du cortex préfrontal regulent les niveaux extracellulaires de dopamine, malgré leur incapacité à produire ce neuromodulateur. Plusieurs maladies psychiatriques telles que la schizophrénie sont associées à une hypodopaminergie du cortex préfrontal, c’est à dire un déficit des niveaux de dopamine du cortex préfrontal. Le présent projet vise donc à évaluer la possibilité de corriger l'hypodopaminergie préfrontale en permettant la production de dopamine par les astrocytes. Nous chercherons également à déterminer si cette correction est suffisante pour restaurer la physiologie du cortex préfrontal ainsi que les fonctions cognitives qui y sont associées.
Bénéfices attendus
Le projet consistera à produire un modèle murin développemental de la schizophrénie par isolement social puis à déterminer les dysfonctionnements physiologiques et comportementaux associés à ce modèle. Une seconde phase consistera à corriger le manque de dopamine du cortex préfrontal de « souris schizoprene » par transfection de l'enzyme tyrosine hydroxylase dans les astrocytes du cortex préfrontal puis à déterminer les potentiels effets bénéfiques de ce traitement sur des paramètres électrophysiologiques et comportementaux déficitaires dans ce modèle. Ce projet permettra de tester si les astrocytes du cortex préfrontal peuvent être une cible thérapeutique de choix dans les traitements des maladies psychiatriques associées à un manque de dopamine préfrontale. Il apportera potentiellement la preuve de concept que le manque de dopamine et ses conséquences physiologiques et comportementales peuvent être corrigées par production astrocytaire de dopamine.
Procédures
Intervention chirurgicale d'injection intracerebrale de vecteurs AAV (Virus adéno-associé): la durée de la procédure est de 1 heure et elle n'est réalisée une seule fois par animal. Isolement social: la durée de la procédure est de 50 jours et elle n'est réalisée qu'une seule fois par animal. Restriction hydrique: la durée de la procédure est de 15 jours maximum et elle n'est réalisée qu'une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
L'isolement social pourra provoquer un inconfort dû au manque de stimulation de l'animal. Cette nuisance est necessaire au présent projet puisque c'est elle qui permet le développement des symptomes cognitifs permettant de modéliser la schizophrenie. Certains animaux seront soumis à une chirurgie pour l'injection intracerebrale de vecteurs viraux ce qui entrainera une douleur modérée post-opératoire. Certains test comportementaux necessiteront une restriction hydrique (pour motiver les animaux à utiliser les stratégies cognitives permettant l'obtention d'une récompense) ce qui entrainera une sensation de soif et donc un inconfort physiologique. Les souris seront cependant hydratée quotidiennement.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux seront prélevés pour réaliser: 1/ des expériences d’immunohistochimie permettant d'identifier les changements moléculaires liés à la schizophrenie, 2/ des expériences d'imagerie des monoamine, permettant de déterminer les déficits ou abbération dans les dynamiques de libérations de neuromodulateurs essentiels aux activités cérébrales, 3/des expériences d'électrophysiologie permettant d'évaluer les modifications physiologiques liées à la schizophrénie, 4/ des expériences comportementales permettant des tester les changements cognitifs associés à la schizophrénie.
Remplacement
Le remplacement du modèle animal n'est pas possible dans ce projet puisqu'il s'agit de tester le potentiel thérapeutique de la dopamine astrocytaire sur les paramètres physiologiques et comportementaux déficients dans la schizophrenie. Ces paramètres ne peuvent êtres mesurés in vitro.
Réduction
Afin d'optimiser de nombre de souris utilisé pour ce projet, plusieurs tests comportementaux seront effectués sur les mêmes souris. Enfin, sur chaque cerveau perfusé, plusieurs marquages immunohistochimiques seront réalisés. Nous avons par ailleurs effectué un test de puissance pour évaluer un nombre optimal d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux (l’approche statistique prévue, et les tests choisis sont indiquées au sein de chaque procédure expérimentale dans la rubrique "Indiquez le nombre de lots et le nombre d'animaux par lot, et les justifier").
Raffinement
Pour le bien-être des animaux, l'environnement d'élevage de tous les animaux sera enrichi au minimum avec des cotons permettant de réaliser des nids et des bâtonnets de bois quand cela sera possible avec en plus des cachettes. Pour toute chirurgie, les animaux recevront les doses nécessaires d’anesthésiques, analgésiques et antalgiques en pré- et post-opératoire. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler des signes de douleur sur la base de la grille d'évaluation de la douleur. L’animal serait euthanasié par dislocation cervicale s’il présentait des signes évidents de douleur, c’est-à-dire le niveau 3 de la grille de score utilisée.
Choix des espèces
La souche utilisée dans ce projet d'étude est la plus répandue dans les laboratoires de Neurosciences aujourd'hui. De plus, elle présente une reproduction facile et une bonne stabilité malgré une reproduction par croisement consanguin. Elle a été ici choisie pour pouvoir comparer nos résultats avec ceux publiés dans la littérature. De plus, le fond génétique de cette espèce est celui qui a été utilisé pour créer les souris modifiées génétiquement que nous souhaitons utiliser dans ce projet. Nous utiliseront également la lignée Aldh1l1-GFP, qui exprime la GFP (Green Fluorescent Protein, une protéine qui, lorsqu’elle est exprimée dans les cellules, émet de la fluorescence verte qui rend les cellules visibles) spécifiquement dans les astrocytes et permettra donc d'en examiner les changements morphologiques. Les animaux seront utilisés entre 3 et 5 mois d'âge puisque la procédure permettant d'obtenir la modèle Scz par isolement social prévoit un isolement d'un minimum de 50 jours après le sevrage.
Effet d’un entraînement intensif sur des paramètres in vivo chez un modèle de rat spontanément obèse.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
12 rats spontanément obèses vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Sept d'entre eux suivent un entraînement intensif sur tapis cinq jours par semaine pendant six semaines, et tous subissent un test d'effort maximal classé sévère, répété jusqu'à trois fois, ainsi que des prélèvements sanguins sous anesthésie. Les organes sont prélevés après la mise à mort. Le porteur affirme ne pouvoir remplacer l'animal par des cellules ou des modèles informatiques, ces méthodes n'apportant selon lui pas de réponse "intégrative".
Objectifs
Notre étude a pour objectif d’évaluer les effets d’un entraînement intensif de haute intensité sur la communication in vitro entre le muscle strié squelettique et le tissu adipeux chez un modèle de rat spontanément obèse.. Ce travail sur un modèle animal pathologique est la suite de notre précédent projet qui a porté sur le rat sain.
Bénéfices attendus
Tous les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes physiologiques impliqués dans les bénéfices de l’entraînement intensif sur l’organisme au profit de la santé humaine. A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur la compréhension des mécanismes in vivo du métabolisme aérobie/anaérobie (test de VO2max et prélèvements sanguins). Nous suivons individuellement chaque animal qui est son propre témoin (suivi longitudinal) en plus de comparer nos deux groupes d’animaux. Ces mécanismes sont aussi explorés sur les tissus prélevés après mise à mort. A moyen terme, la mise en place de co-cultures muscles-adipocytes à partir d’animaux entraînés et obèses, permettra de vérifier la durabilité des effets de l’exercice et d’explorer la communication de ces populations de cellules en dupliquant les mesures sur les cellules uniquement. A plus long terme, ces données sur cellules seront une vraie plus-value sur la compréhension des mécanismes induits par l’entraînement intensif, surtout sur le tissu adipeux car les données bibliographiques sont contradictoires chez les individus obèses.
Procédures
Tous les animaux (n = 12) sont soumis à deux prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse au niveau de la veine latérale caudale aux âges de 7 et 12 semaines. La mesure de leur pression artérielle et la mesure de la microcirculation cutanée se feront à l’aide de méthodes non invasives sous anesthésie gazeuse l’une à la suite de l’autre. La durée de l’anesthésie sera de 45 minutes. Cette analyse sera réalisée deux fois aux âges de 7 et 13 semaines. Ils réalisent tous un test de capacité maximale aérobie (appelé test de VO2max) à l’âge de 8 semaines et seuls les animaux entraînés en intermittent intensif (n=7) referont ce test (à 11 et 14 semaines) pour réajuster l’entraînement à leurs capacités individuelles. Le jour du test, ils ne feront pas leur séance d’entraînement et récupèreront 48 heures avant de reprendre l’entraînement. durée du test entre 5 et 20 minutes en fonction des capacités maximales individuelles de chaque rat. L’entraînement individualisé (n = 7) débute à l’âge de 9 semaines et perdure 6 semaines consécutives à raison de 5 séances/semaine d’une durée de 36 min/jour. Les animaux non entraînés (n = 5) ne courent pas mais sont manipulés quotidiennement de la même façon que les animaux entraînés.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont : - le stress lié à la manipulation quotidienne des animaux : acte de gravité légère, tous les jours, pendant 8 semaines consécutives. - le stress lié à la contention lors de l’anesthésie gazeuse pour permettre la réalisation des prélèvements sanguins : acte de gravité légère, 2 fois sur l’ensemble du projet aux âges de 7 et 12 semaines, durée estimée de 6 minutes. -le stress lié au test d’évaluation des capacités maximales du rat (VO2 max) : acte de gravité sévère, durée entre 5 et 20 minutes en fonction des capacités maximales des individus. Ce test est réalisé 3 fois dans le projet avec un repos de 2 semaines entre chaque test. - le stress lié à la course journalière sur le tapis de course calorimétrique ou le tapis non calorimétrique : acte de gravité modérée, durée 45 min par jour, 5 fois par semaine, pendant 6 semaines consécutives. - le stress lors de la contention lors de l’anesthésie gazeuse réalisée avant la mesure de microcirculation cutanée et la pression artérielle en non invasif, acte de gravité légère, durée estimée de 6 minutes, 2 fois dans le projet aux âges de 7 et 13 semaines.
Devenir
Nous devons travailler sur des prélèvements d’organes et c’est la raison pour laquelle, à l’issue de notre projet, tous les animaux sont mis à mort.
Remplacement
Notre travail porte sur une étude intégrative et non invasive des effets de l’entraînement physique intensif sur le métabolisme aérobie/anaérobie chez des individus obèses. A l’heure actuelle, les mesures de VO2 max sont réalisées chez l’homme mais nous ne pouvons pas récupérer tous ses organes pour étudier les mécanismes physiologiques à l’issue d’une période d’entraînement. Il n’est pas non plus possible de remplacer le modèle animal actuel par des cellules ou des modèles bio-informatiques car ces méthodes alternatives n’apportent pas de réponses intégratives.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au strict minimum pour que les résultats soient statistiquement exploitables par rapport à nos projets précédents. Nous avons aussi prévu un pourcentage d’échec maximal de 28% en lien avec le refus de courir uniquement dans le groupe entraîné, soit 2 rats sur 7 au départ. De plus, après mise à mort des animaux, la mise en place de co-cultures primaires muscle-tissu adipeux duplique les expériences. Cette technique nous permet, dès à présent, de réduire le nombre d’animaux à utiliser par rapport à nos projets précédents qui portent sur la même thématique.
Raffinement
Tout au long de la procédure, les conditions de stabulation sont réalisées dans un souci de bien-être de l’animal et ils sont suivis quotidiennement à l’aide de tables de suivi de soin. Toute la procédure expérimentale est réalisée par des personnes formées et habituées à travailler avec des animaux de laboratoire, surtout sur l’entraînement sur tapis roulant. Avant de démarrer le protocole d’entraînement intensif, les animaux sont habitués sur le tapis roulant à marcher, puis à courir jusqu’à atteindre 30 min de course quotidienne environ, pendant au minimum 4 jours. Cette étape est primordiale : elle permet à l’expérimentateur et à l’animal de créer une confiance qui conditionne la réussite de la tâche à accomplir. Les vitesses sont maintenues sur des durées adaptées à l’aptitude des rats et leur compréhension de l’exercice. Le test de capacité maximale aérobie (VO2 max) est toujours réalisé seul le vendredi (pas de séance d’entraînement ce jour-là) pour que les animaux soient au repos pendant 2 jours avant de reprendre l’entraînement le lundi suivant. A l’issue de chaque séance d’entraînement, les animaux sont récompensés par un petit morceau de pomme. L’insertion de la puce d'identification en sous-cutané, les mesures de pression artérielle et de microcirculation cutanée et les prélèvements sanguins se feront sous anesthésie gazeuse et la ponction cardiaque terminale sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le rat est un animal doué et intelligent qui peut être conditionné à l’activité physique. Les mécanismes physiologiques de l’activité physique sur le modèle de rat spontanément obèse sont très proches de ce qui se déroule chez l’homme obèse. Tous les protocoles démarrent à l’âge de 6 semaines et se terminent à 15 semaines. Nous travaillons sur des animaux jeunes pour qu’ils s’habituent à être manipulés par l’homme sans occasionner de stress ou d’angoisse lors de la course sur tapis roulant.