Procédures sévères

32 souris vont être utilisées dans des procédures pouvant atteindre un niveau de souffrance sévère. La plupart sont tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, seules les femelles porteuses de la mutation étant gardées pour entretenir la lignée. Ces souris knock-in reproduisant une myopathie myotubulaire subissent des tests répétés de force musculaire, dont un où l'expérimentateur tire sur la queue de l'animal agrippé à une grille, puis une mesure terminale des propriétés du muscle sous anesthésie sans réveil. Le porteur décrit une faiblesse musculaire et un poids réduit dès cinq semaines, et affirme que la souris est la 'seule espèce' assez proche de l'humain pour ces mesures.

Objectifs

La myotubularine (MTM1) est une protéine qui est mutée dans une maladie musculaire sévère appelée myopathie myotubulaire. Seuls les patients mâles sont atteints par cette myopathie ; ils présentent une faiblesse musculaire généralisée et des déficiences respiratoires. Plus de 60% d' entre eux ne survivent pas plus de 2 ans. Le but de cette étude est de comprendre plus en détails cette maladie à l' aide d 'un nouveau modèle souris qui possède une mutation importante pour le fonctionnement de la protéine MTM1. Une meilleure connaissance de cette fonction essentielle nous permettra de mieux comprendre cette myopathie et potentiellement de pouvoir proposer de nouvelles thérapies plus ciblées.

Bénéfices attendus

Par cette étude nous envisageons d’évaluer les conséquences fonctionnelles, cellulaires et biomoléculaires de cette mutation sur la maladie, dans un nouveau modèle de souris pour la myopathie myutubulaire. Ainsi, une caractérisation globale sur des aspects comportementaux, physiologiques, biomoléculaires et histologiques nous permettrons de mieux comprendre la maladie et de mieux évaluer les effets de la maladie.

Procédures

Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques à savoir: 1.Mesurer la force du corps: test réalisé à raison de trois essais d'une minute par souris avec quinze minutes de pause entre chaque essai. 2. Mesurer la force des pattes (sur 2 ou 4 pattes): trois essais par souris avec un temps de repos de quinze minutes entre chaque essai. 3. Mesurer la position des pattes pendant le déplacement: test effectué une fois par semaine. 4. Evaluation de l’activité locomotrice: ce test se déroule sur 2 heures. 5. Mesure de la position des pattes pendant la marche (l’angle des pattes et la longueur des pas): ce test durera une minute au maximum. Les 5 tests cités precédemment seront réalisés une fois par semaine à partir de l âge de 4 semaines et jusqu' à 8 semaines car des données préliminaires ont montré une faiblesse musculaire dès l 'âge de 5 semaines. 6. Mesure des propriétés contractiles musculaires in situ qui est une procédure expérimentale sans réveil: les souris seront anesthésiées par injection intrapéritonéale d 'un anti douleur et d 'un mélange d'anesthésiques pendant cinq secondes environ. La durée totale de cette procédure sera au maximum d 'une heure.

Impact sur les animaux

Pour cette étude , nous utiliserons un modèle atteint de Myopathie myotubulaire (MTM1). Cette souris développe une faiblesse musculaire et peut montrer des difficultés de locomotion qui apparaissent vers 5 semaines d' âge en moyenne. Ces animaux mutants ont également un poids corporel inférieur aux animaux contrôles (données préliminaires de nos collaborateurs). Les nuisances ou effets indésirables causés par les différents tests phénotypiques sont les suivants: pour la mesure de la force du corps, la souris reste accrochée sur une grille retournée pendant maximum 1 minute. Pour la mesure de la force des pattes, l'expérimentateur tire progressivement sur la queue de l'animal agrippé sur la grille du dynanomètre afin d'obtenir la force développée par la souris. Pour les tests de position des pattes et de l activité locomotrice, il n y a pas de nuisance hormis la manipulation de la souris. Ces différents tests peuvent cependant générer du stress physique chez l animal. La mesure des propriétés contractiles musculaires in situ est réalisée sous anesthésie par une injection d 'anesthésiques et d 'anti douleur , ce qui nécessite de manipuler la souris. Ce dernier test est sans réveil, à la fin de l'expérimentation les animaux sont mis à mort puis les différents muscles et organes sont prélevés pour des analyses ultérieures.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante pour ce qui concerne les tests de phénotypage. . La dernière expérimentation qui est "sans réveil" consiste à mesurer les propriétés contractiles musculaires in situ sous anesthésie. A l'issue de cette procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir prélever des organes pour de futures expériences. Cela concerne l'ensemble des animaux qui serviront à caractériser la lignée soit 24 animaux. Pour l 'évaluation des symptomes des souris malades, les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure car il s 'agit d' une étude pilote, sauf les femelles porteuses de la mutation qui pourront ête réutilisées pour le maintien de la lignée. Pour le suivi des animaux géniteurs, nous conserverons uniquement les femelles porteuses de la mutation et les mâles WT pour de futurs nouveaux croisements de maintien de la lignée, les autres génotypes produits ne seront pas utilisables pour ces croisements et seront donc euthanasiés.

Remplacement

Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie et d’autre part de mieux comprendre une activité essentielle de la protéine défectueuse (myotubularine) dans cette myopathie. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation de la force musculaire seraient impossible à évaluer. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car le phénotype musulaire pathologique ne se développerait pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible.

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un test maximum par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d’accouplements avec deux femelles pour un mâle. Nos connaissances sur ce modèle animal mutant et de précédentes études montrent que 12 souris par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante. Seuls les animaux mâles seront étudiés soit 24 souris au total pour cette étude (caractérisation de la lignée). Un nombre minimum de souris sera également utilisé pour évaluer la dommagibilité de cette lignée, à savoir 8 souris par groupe (mâles et femelles sauvages, mâles mutants et femelles porteuses de la mutation.

Raffinement

Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d’accouplements seront constituées de deux femelles par cage facilitant l’élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. Pour le nouveau-né, la souffrance sera évaluée visuellement : capacité à se retourner, couleur de la peau, capacité à se mouvoir. À partir du sevrage, une perte de poids de 20% en une semaine conduira à l’arrêt du protocole. En cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l’étude sera prématurément stoppée.

Choix des espèces

Afin d’évaluer et de mieux comprendre les mécanismes cellulaires induits par une mutation du gène MTM1, nous avons besoin de réaliser des expériences physiologiques in vivo. De plus, cette nouvelle lignée mutante nous permettra de mieux comprendre un des rôles clé dans la myopathie myutubulaire. Les symptômes de faiblesse musculaire liés à cette mutation ponctuelle apparaissent relativement tôt c'est à dire vers 5 semaines (données préliminaires de nos collaborateurs) et d’autre part, nous souhaitons suivre l 'évolution de cette myopathie. Les souris mâles seront utilisées lors des tests de comportement afin d'évaluer la progression des symptômes (entre 4 et 8 semaines d âge). Ces mesures ne peuvent pas ête réalisées sur d 'autres espèces évolutivement plus éloignées de l Homme car la structure du muscle y serait trop différente. La souris est la seule espèce physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser ces expériences.

3 162 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent des neurochirurgies et une lésion de la moelle épinière provoquant une paralysie des membres inférieurs, avec un risque de douleurs de type allodynie et d'infection urinaire, ainsi que des injections répétées dans l'œil. La mise à mort permet de récupérer les structures nerveuses. Le porteur affirme que le modèle murin est "non remplaçable" et présente la souris comme le standard international de la recherche sur la régénération du système nerveux.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière représentent entre 250 000 et 500 000 patients par an dans le monde. Ce sont souvent de jeunes patients puisque d’après les données de l’Organisation Mondial pour la santé, ces atteintes surviennent chez des personnes âgées entre 20 et 29 ans. Plus de 90 pour 100 de cas sont dus à des blessures traumatiques comme les accidents de la route, la violence ou les chutes. Cependant la proportion des lésions non traumatiques comme les cancers progresse d’année en année. Les patients souffrant de lésions de la moelle restent handicapés de façon permanente puisque les neurones du système nerveux central (SNC- cerveau, moelle épinière) n’ont pas la capacité de repousse. A ce jour il n’y a pas de traitement afin de réparer le SNC. La compréhension des mécanismes moléculaires des lésions du système nerveux représente donc un défi majeur en biologie dans le but de développer des stratégies thérapeutiques innovantes. Le but de ce projet d’identifier l’effet de nouvelles molécules sur la repousse axonale dans le SNC afin de permettre la reconstruction des circuits neuronales et le retour fonctionnel. Ces molécules ont été sélectionnées suite à des tests dans les cultures de neurones. Le but de ce projet est de tester les molécules les plus prometteuses in vivo chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont extrêmement importants d’un point de vue aussi bien fondamentale qu’appliqué. En effet, nos travaux vont définir des molécules clés pour permettre la neuroprotection et la régénération du système nerveux centrale. Notre projet caractérisera en détail des molécules importantes pour la régénération du système nerveux central. Non seulement nous allons identifier et valider de nouvelles cibles qui permettront de faire régénérer les nerfs, mais nous allons aussi mettre en évidence la formation de nouveaux circuits après une lésion. Ces données seront essentielles dans une optique translationnelle. En effet, nos résultats permettront de mettre en évidence de nouvelles cibles qui peuvent être exploités pour le développement de thérapies innovantes dans le domaine des lésions de la moelle mais aussi en cas d’atteintes traumatiques du cerveau.

Procédures

Les souris subissent des neurochirurgies pour une durée de 40minutes, anesthésie inclue. Les souris peuvent subir une ou plusieurs neurochirurgies. Les souris sont soumises à un traitement pharmacologique pendant 2 à 6 semaines, tous les 2 jours. Le geste dure 1 minute. Les animaux subiront des désagréments liés à l’anesthésie et à la plaie d’implique les injections ou les neurochirurgies qui se caractérisent essentiellement par une douleur modérée. Les souris participeront également à des tests de comportement pour évaluer le retour moteur et sensitif. Ces tests ne sont pas douloureux. Elles seront testées sur une durée de 6 semaines à une fréquence d'une à deux fois par semaine. Les souris seront acclimatées à la salle de comportement pour 1h avant de commencer le test qui dure au maximum 15min.

Impact sur les animaux

Ce projet implique des injections répétitives dans l’oeil. Le risque de ces expériences est d’induire une inflammation de l’oeil. Les animaux vont subir plusieurs injections en intra-péritonéales pour induire une anesthésie et pour les traitements pharmacologiques. Les animaux subissent une lésion de la moelle épinière induisant la paralysie des membres inférieurs chez la souris pouvant éventuellement induire à un risque d’infection urinaire. Cette lésion peut également induire un risque de douleurs (type allodynie).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer les structures d'intérêt. De ce fait, les animaux ne peuvent pas être réutiliser.

Remplacement

Pour atteindre nos objectifs, les modèles murins sont essentiels et non remplaçables car i) les paradigmes de lésion chez la souris sont les mêmes que chez l’humain, ii) un très grand nombre de lignées de souris transgéniques sont déjà disponibles pour nos recherches, iii) les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents acteurs (neurones, cellules gliales, environnement de la lésion…) et ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Le modèle murin est le standard international reconnu pour la recherche sur la régénération du système nerveux central. iv) les moélcules testés in vivo chez la souris ont été préalablement caracterisées dans des cultures de neurones.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : -les études préliminaires des molécules sur des cultures primaires de neurones -La validation systématique de toutes nos préparations de virus pour s’assurer de leur efficacité avant les expériences -L’entrainement de toutes les personnes qui pratiquent les expériences pour ne pas perdre d’animaux dû à de mauvaises chirurgies. -L’utilisation de tests statistiques optimaux pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Seules les molécules montrant un effet seront utilisées chez les animaux.

Raffinement

L’ensemble des animaux qui auront subi une intervention chirurgicale seront observés quotidiennement et seront pesés aux moins deux fois par semaine. Une échelle de cotation de souffrance basée sur les signes indicatifs de gêne ou de douleur sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir le point limite permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. Pour l’ensemble des procédures, le poids des souris sera vérifié quotidiennement pendant une semaine à la suite des chirurgies. Les animaux auront de l’eau gélifiée dans leur cage ainsi que leur nourriture. Nous serons attentifs à leur comportement : pour l’entretien du poil en cas de doutes, nous en discuterons avec le vétérinaire réfèrent. Néanmoins, nous serons particulièrement vigilants au bien être des souris : elles recevront un analgésique 24h avant les interventions chirurgicales et ce pendant 48h.

Choix des espèces

La régénération du système nerveux est un phénomène multifactoriel qui s’intègre dans la formation d’un circuit neuronal. La modélisation de ce processus dans un système unicellulaire (telle que la culture cellulaire) ne permet ni d’identifier correctement les voies moléculaires ni de tester efficacement les capacités de régénération. La souris représente le modèle in-vivo standard dans la communauté scientifique grâce à une grande similitude avec l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autres modèles telles que le poisson zèbre dont le système nerveux central régénère spontanément ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les paradigmes scientifiques que nous utilisons. La souris permet aussi l’utilisation de tests de comportement pour analyser le retour fonctionnel. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles tels que le rat. Pour l’ensemble des expériences proposées nous utiliserons des souris dont le système nerveux est considéré comme mature (plus de 4 semaines). En effet le système nerveux en cours de développement présente de grande capacité de régénérescence, ce qui est perdu dans le système nerveux mature. Nous voulons étudier les mécanismes de régénérescence et de plasticité axonale dans le système nerveux central adulte pour être le plus proche possible des lésions traumatiques chez l’homme.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles sont infectées par le virus de la vaccine par voie intranasale, dont une partie pour établir la dose létale, puis traitées par des injections deux fois par jour, avec perte de poids, détresse respiratoire et léthargie possibles. La mise à mort est justifiée par des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne rend compte d'une infection multiviscérale et présente le projet comme une préparation contre une réémergence de la variole.

Objectifs

L'objectif du projet est d'établir la preuve d'efficacité thérapeutique in vivo de molécules ciblant de nombreux virus et notamment les « Poxvirus ». Les Poxvirus sont des virus qui infectent les hommes et les animaux et sont responsables dans l’histoire d’épidémies très graves comme le virus de la variole ayant un taux de mortalité aux alentours des 30%. Bien qu’éradiqué, le virus est maintenu dans deux centres de recherche (aux Etats-Unis et en Russie) et une reconstruction du virus par génie génétique est possible. Une réapparition accidentelle ou une réintroduction volontaire du virus pourrait engendrer une pandémie avec un taux de mortalité estimé de 15 à 90%. D'autres poxvirus circulent, comme le monkeypox et le camelpox, et sont préoccupants. Il n'existe à l'heure actuelle qu'une seule molécule anti-poxvirus approuvée, mais les poxvirus développent rapidement des résistances contre celle-ci. Il est donc nécessaire de disposer de plusieurs antiviraux efficaces. Nous avons développé des molécules capables de bloquer la formation du virus et ainsi bloquer sa dissémination dans l'organisme. Les performances in vitro des molécules et les résultats préliminaires obtenus nous confortent et apportent un rationnel suffisant pour la poursuite des développements.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'établir l'efficacité de molécules d’intérêt contre une infection par un poxvirus. Ces résultats ouvriront la voie à une création de société pour assurer le développement pharmaceutique de ces molécules. Ce développement impliquera le test chez une seconde espèce animale, la poursuite des développements notamment une optimisation de la formulation et des études toxicologiques. En cas de succès, à plus long terme, le bénéfice final sera de pouvoir proposer des molécules thérapeutiques antivariolique et anti-poxvirus pour le traitement des émergences virales et assurer des stocks nationaux de préparation contre une réémergence de la variole d'origine accidentelle ou provoquée. Comme le montre la crise COVID, la vaccination d'une population importante est très complexe, longue, et requiert d'avoir en parallèle à disposition des médicaments antiviraux pour faire face aux premières phases de l’épidémie.

Procédures

Procédure 1a : détermination de la DL90 (dose létale 90%) du poxvirus ; les animaux seront anesthésiés une fois par injection intrapéritonéale puis infectés une fois par instillation intranasale. Procédure 1b : évaluation de l'innocuité du traitement sur 10 jours ; les animaux recevront 2 fois par jour pendant maximum 10 jours une injection au niveau du flanc d’une des molécules à différentes doses. Procédure 2a : évaluation de l'efficacité anti VACV-WR de la molécule ; les animaux seront anesthésiés une fois par injection intrapéritonéale puis infectés une fois par instillation intranasale et recevront 2 fois par jour pendant maximum 12 jours une injection des molécules au niveau du flanc. Un suivi précis des animaux sera alors réalisé. Les animaux en fin de procédure seront mis à mort après sédation préalable . Procédure 2b : Analyse des titres viraux dans les poumons à J+4 post-infection ; les animaux seront anesthésiés une fois puis infectés une fois par instillation intranasale. Les animaux recevront 2 fois par jour pendant maximum 6 jours une injection de la molécule au niveau du flanc. Les animaux en fin de procédure seront mis à mort après sédation préalable.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables suivants peuvent être observés jusqu'à atteinte des points limites préalablement définis : perte de poids rapide ou progressive de 20 %, difficultés respiratoires, réduction de la mobilité, nécrose tissulaire au point d’injection, léthargie.

Devenir

Expérience 1a : Les souris n'ayant pas été mis à mort au cours de la détermination de la DL90 du virus de la vaccine le seront à la fin de la procédure pour des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Expérience 1b : Les souris utilisées pour l'évaluation de l'innocuité du traitement sur 10 jours seront mis à mort à la fin de la procédure pour des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Expérience 2a : Les souris n'ayant pas été euthanasiées au cours de l'essai d'efficacité antivirale de la molécule seront mis à mort à la fin de la procédure pour des raisons de biosécurité empêchant leur sortie de l'installation. Expérience 2b : Les souris utilisées pour l'analyse des titres viraux à J+4 post-infection dans les poumons seront mis à mort pour dissection.

Remplacement

Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’évaluer les effets bénéfiques d’une molécule luttant contre une infection avec du virus de la vaccine. Les méthodes in vitro et ex vivo ne rendent pas compte de la complexité d'une infection multiviscérale.

Réduction

Nous avons calculé le nombre d’animaux de façon à obtenir des données statistiquement fiables avec le moins d’animaux possible. Seule la molécule la plus efficace in vitro est testée in vivo, et avec le minimum de conditions de concentrations et de plannings de traitement nécessaires au retour scientifique permettant d'évaluer le potentiel antiviral de la molécule testée. Le nombre d’animaux par groupe est suffisant pour mettre en évidence des différences de survie par la méthode de Kaplan-Meier et de charge virale par le test de Mann-Whitney.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux sur litière et avec un enrichissement (abri et matériel de nidification) afin de réduire le stress. Les souris sont hébergées en groupes avec un enrichissement du milieu (maison en carton, coton). Les procédures d’instillation du virus sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l'anesthésie les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les animaux sont quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance persistante l’expérience sera stoppée.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle d'étude pour évaluer l'efficacité de molécules antivirales contre le virus de la vaccine, avec notamment une réplication importante du virus dans les voies respiratoires. La littérature sur ce modèle est suffisamment riche pour permettre une comparaison de l’efficacité de la molécule. Souris Balb/c âgées de 4 à 6 semaines : il s’agit de la souche la plus utilisée pour les infections par du virus de la vaccine et l’âge est bien adapté car les souris âgées de 4 à 6 semaines ont déjà un système immunitaire fonctionnel.

Parmi les 3 450 souris, certaines sont immunodéprimées pour accepter des cellules de glioblastome d'origine humaine, les autres, immunocompétentes, recevant des cellules tumorales de souris. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère : jusqu'à deux chirurgies, l'implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau puis une résection, des injections cinq jours sur sept pendant 28 jours, deux séances de radiothérapie et une prise de sang tous les quinze jours. Les tumeurs, cérébrales ou sous la peau, peuvent selon le porteur "générer des souffrances et une perte d'appétit", et l'équipe veut savoir si un inhibiteur de la respiration mitochondriale les ralentit et prolonge la survie. Le porteur écrit que la mise à mort finale de toutes les souris vise à "éviter des souffrances", et prévoit de maintenir les mêmes souris en vie pour établir des courbes de survie.

Objectifs

Le glioblastome (GB) est la tumeur cérébrale la plus commune et agressive chez l’adulte. Malheureusement, il n’existe aucun traitement efficace pour cette maladie et la survie moyenne des patients est d’environ 15 mois après le diagnostic. Les patients atteints de GB subissent généralement une résection chirurgicale pour éliminer autant que possible la tumeur cérébrale. Après la chirurgie, dans le but d’éliminer les cellules cancéreuses restantes, un traitement aux rayonnements ionisants (IR) et au Témozolomide (TMZ) est administré aux patients. Malheureusement, ce traitement standard actuel n’empêche pas la tumeur de récidiver. Les cellules à l'origine des récidives tumorales sont appelées « cellules de type-souches de glioblastome » (GSCs). Comprendre le fonctionnement de ces cellules est essentiel pour développer de nouvelles stratégies pour les cibler, les tuer et éviter la récidive de la tumeur. Nous avons récemment identifié un inhibiteur de la respiration mitochondrial (qui fournit de l'énergie aux cellules), capable d'éliminer ces GSCs. Nous étudierons si l’administration de cet inhibiteur ralentit la progression tumorale et prolonge la survie des animaux en combinaison ou non avec les traitements actuels standards. De plus essayerons d’identifier les protéines qui existent spécifiquement chez les cellules de glioblastome et qui sont impliquées dans le développement de la maladie et la résistance aux thérapies.

Bénéfices attendus

Ces expériences nous permettront d’identifier les protéines spécifiquement surexprimées par les glioblastomes. Ces protéines anormalement surexprimées par les glioblastomes, représentent de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous pourrons également identifier des protéines impliquées dans la résistance aux traitements actuels, en identifiant les protéines surexprimées dans les cellules de glioblastomes n’ayant pas été éliminées par la thérapie et donc résistantes. Enfin, nous étudierons si l’inhibition de la respiration mitochondriale (qui permet de fournir de l'énergie aux cellules) diminue la progression tumorale et augmente la durée de vie des animaux de façon plus efficace que les traitements actuels. Ainsi, en utilisant des modèles souris de glioblastomes ressemblant aux tumeurs observées chez les patients atteints de glioblastome, de nouvelles cibles thérapeutiques pourront être identifiées.

Procédures

- Les animaux seront soumis à des chirurgies. Les chirurgies sont des procédures qui durent environ 25 minutes et seront réalisées au maximum deux fois. - Les souris seront soumises à des traitements chaque jour pendant 5 jours, après 2 jours de repos un nouveau cycle de 5 jours de traitement sera réalisé. Les cycles de traitement seront répétés sur une durée de 28 jours. L'injection des traitements dure moins de 1 minute par souris.- Les souris seront soumises à une radiothérapie 2 fois à 4 jours d'intervalle. Cela dure 5 minutes par souris. - Les souris seront soumises à des prises de sang chaque 15 jours. Cela dure 5 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront une chirurgie (implantation de cellules de glioblastome dans le cerveau) et une implantation en sous-cutanée de cellules de glioblastome, qui peut induire des souffrances et une perte d’appétit. Le développement de tumeurs cérébrales ou sous-cutanées peut générer des souffrances et une perte d’appétit. Les animaux recevront des traitements par injections. Les injections peuvent induire une anxiété et une irritation au point d’injection. Les animaux recevront une radiothérapie qui peut induire des souffrances, une perte d’appétit, une irritation de la cornée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu de la procédure. Les animaux sont implantés avec des cellules de cerveau cancéreuses et développeront des tumeurs. Ils seront sacrifiés à la fin de la procédure pour éviter des souffrances.

Remplacement

Nous avons isolé et mis en culture des cellules de glioblastome à partir de tumeurs de plusieurs patients. Nous avons obtenu des données robustes en utilisant ces modèles de culture cellulaire pour supporter l’hypothèse qu'un inhibiteur de la respiration mitochondriale (qui fournit de l'énergie aux cellules) peut représenter une stratégie thérapeutique efficace pour traiter le glioblastome. En effet, nous avons montré que cet inhibiteur diminue fortement la multiplication et le caractère agressif de ces cellules. Nous souhaitons maintenant savoir si ce composé est efficace lorsque les cellules de glioblastome sont dans leur environnement tumoral et si ce composé peut augmenter l'espérance de vie des animaux de façon plus efficace que les traitements actuels standards utilisés pour traiter le glioblastome. Le micro-environnement et les échanges entre les cellules non-tumorales ont un rôle majeur dans la progression de la maladie. Des modèles d’organoïdes composés de plusieurs types cellulaires ont été développés. Cependant, ces modèles ne sont pas parfaits et ne nous permettent pas l’étude du rôle du micro-environnement dans le glioblastome. En effet, les composants immunitaires dans les cultures d’organoïdes ne peuvent pas être maintenus sur de longues périodes et le manque de cellules endothéliales et de système vasculaire tumoral est un problème majeur qui limite l'utilité des organoïdes des tumeurs cérébrales. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable. Nous avons utilisé des lignées cellulaires dérivées de patients comme preuve de principe pour minimiser l'utilisation de souris.

Réduction

Une manip pilote avec un petit groupe d'animaux est tout d'abord réalisée pour définir les meilleures conditions. Nous avons mis en place des stratégies pour réduire le nombre de souris en utilisant le même groupe de souris pour obtenir plusieurs résultats. Par exemple, l'imagerie bioluminescente est une méthode non invasive qui nous permet d’évaluer le volume de la tumeur dans le temps tandis que les mêmes souris peuvent être maintenues pour générer les courbes de survie et pour les prélèvements sanguins.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cages collectives, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d’un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre d’explorer, de jouer et de ronger. Ces cages offrent aux animaux un espace important pour se redresser. Les chirurgies (implantation des cellules et résection) se déroulent sur animaux anesthésiés. Les animaux sont placés sur un tapis chauffant. Des analgésiques sont donnés en amont de la chirurgie. L'incision avec un ciseau au niveau de la peau de la tête se fait suite à une anesthésie locale. Les animaux ont gel ophtalmique tout au long de l'opération afin de réduire la sécheresse oculaire. Une injection de saline est réalisée pour éviter une déshydratation de l’animal. Suite aux chirurgies, un analgésique est administré 2 fois par jour pendant les 72h suivant l’opération. Pour le suivi de la croissance tumorale, une méthode non invasive est utilisée, les souris sont anesthésiées et maintenues sous anesthésie dans une boîte d’imagerie. Du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux pour éviter un dessèchement de la cornée. Les souris sont réchauffées grâce à une plaque chauffante à 37°C placée dans l’imageur. Les injections intrapéritonéales et les radiations sont des procédures rapides. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages avec leurs congénères et surveillés quotidiennement pour détecter l’apparition d’éventuels effets secondaires. Suite à la prise de sang, une injection de saline est réalisée. Des points limites sont définis pour éviter une souffrance à l’animal.

Choix des espèces

2 modèles expérimentaux seront utilisés : •Des souris immuno compétentes qui recevront des cellules de types souches de glioblastome d’origine souris. Ce modèle nous permet d’étudier le rôle du microenvironnement dans le développement tumoral. •Des souris immunodéprimées qui recevront des cellules de types souches de glioblastome d’origine humaine. Ces souris permettent d'implanter des cellules humaines sans que le système immunitaire ne rejette la greffe. Ce modèle nous permet d’obtenir des tumeurs ressemblant aux tumeurs observées chez les patients atteints de glioblastome. Nous utiliserons des souris de 7 à 9 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs mois, donc l’implantation dans de jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.