Procédures sévères

796 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour mettre au point une mesure de la douleur viscérale par distension du colon et du rectum. Un ballonnet est inséré dans le rectum sous anesthésie puis gonflé sur l'animal éveillé, sans analgésie, le porteur indiquant que soulager la douleur serait incompatible avec l'objectif de l'étude. Il estime qu'environ un tiers des souris, soit 265 individus, seront réutilisées dans d'autres procédures légères ou modérées, le reste étant tué. Sur le remplacement, il affirme que seuls des animaux vigiles permettent d'étudier la douleur et pas seulement la nociception.

Objectifs

Le syndrome du côlon irritable (irritable bowel syndrome: IBS) est un trouble gastro-intestinal fonctionnel caractérisé par des douleurs abdominales récurrentes associées à des troubles du transit intestinal. Environ 1 personne sur 10 dans le monde souffre du syndrome du côlon irritable et ce diagnostic est associés à une altération de la qualité de vie des patients ainsi que des impacts socio-économiques importants. L’objectif global de ce projet est de développer des modèles murins de syndrome du côlon irritable afin de mesurer l’hypersensibilité viscérale dans le but final d’évaluer l’efficacité de différentes molécules analgésiques. Le projet se découpe en différents sous-objectifs : 1) Développement d’une méthode de mesure de la douleur viscérale (distension colorectale (DCR) couplée à la mesure de la pression intra-colonique (ICP)). 2) Développement de modèles murins de syndrome du côlon irritable. La présente demande d’autorisation de projet ne porte que sur le sous-objectif n°1. Lorsque la méthode de mesure de la douleur viscérale sera maitrisée, des modèles reproduisant la pathophysiologie du syndrome du côlon irritable seront développés (objectif n°2) et couplés à cette méthode mesure. Ce travail fera l’objet d’une prochaine demande.

Bénéfices attendus

La douleur viscérale est une cause récurrente de consultation médicale. Le syndrome du côlon irritable, qui entraine des douleurs viscérales récurrentes, a une prévalence s’élevant à une personne sur 10 dans le monde et des conséquences socio-économiques lourdes. Les options pharmacologiques pour la prise en charge des patients restent limitées, et concentrées sur la régularisation du transit intestinal, bien que la douleur soit la plainte principale des patients. Ce projet vise à développer une mesure de la sensibilité viscérale basée sur une stimulation mimant le passage des selles dans le colon/rectum (qui est un événement douloureux chez les patients) puis dans un second temps à le coupler à des modèles d’hypersensibilité viscérale reproduisant la pathophysiologie du syndrome du côlon irritable. De plus, le test développé dans ce projet a été employé chez l’homme comme mesure de la sensibilité viscérale dans l’étude du syndrome du côlon irritable. Le développement et l’amélioration de modèles afin que ceux-ci se rapprochent au mieux de la physiopathologie du syndrome du côlon irritable soutient la recherche pharmaceutique dans le développement de traitements en raffinant les outils d’évaluation des molécules et in fine les patients en augmentant les chances de succès de développement de médicaments capables de les soulager.

Procédures

Chaque animal ne subira qu'une seule procédure. Chaque procédure comprend une contention légère durant maximum 2 heures au total, l'insertion du ballonnet sous anesthésie et la distension.

Impact sur les animaux

Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, les tests entraînent inévitablement l’apparition de douleurs passagères. Toutefois l’insertion du ballonnet permettant de simuler le passage des selles dans le colon/rectum est réalisée sous anesthésie gazeuse afin de favoriser le relâchement musculaire de l’animal et d’éviter tout dommage tissulaire ou stress lié à la contention des animaux pour réaliser l’insertion. Une fois l’animal éveillé, le ballonnet est ensuite gonflé progressivement et la pression intracolonique est enregistrée. L’enregistrement est réalisé sur des animaux éveillés afin d’éviter toute interférence des anesthésiques sur l’activité musculaire et donc la pression intracolonique puis le ballonnet est dégonflé et retiré. Aucun effet indésirable n’est attendu en dehors de la période d’observation.

Devenir

Les animaux ayant subi le protocole de distension colorectale n’en gardant pas de séquelles, il est envisageable de les garder en vie en vue de leur réutilisation pour dans d’autres protocoles. Ainsi, en fonction des besoins liés à l’activité de l'établissement, les animaux n’ayant présenté aucun signe clinique (notable ou sévère) pourront être réutilisés dans le cadre des procédures classées « légère » ou « modérées » afin de contribuer à l’objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés pour la recherche. Les animaux qui ne pourront être réutilisés seront euthanasiés par les méthodes décrites précédemment. En se basant sur une estimation de l’activité de l'entreprise, il est estimé qu’environ 1/3 des animaux seront réutilisés.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux s’élève à 796 souris. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est basé sur les données publiées dans l’article princeps décrivant le développement du test de distension colorectale/mesure de la pression intracolonique et sur les données de nos collaborateurs maitrisant la technique. Ce nombre est cohérent avec l’expérience du laboratoire dans d’autres modèles de douleurs viscérale. Cette estimation théorique sera confirmée lors des stades initiaux de développement du modèle (dès que l’approbation du projet permettra le début des expérimentations et la génération de données) par la réalisation d’une analyse statistique par la méthode des tirages aléatoires et d’un calcul de puissance via BiostaTGV. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Les animaux inclus dans une étude seront randomisés en utilisant un fichier Excel pour leur attribuer aléatoirement un numéro d’individu et un code de groupe de traitement. L’administration des composés et les tests comportementaux seront réalisés par du personnel en aveugle, n’ayant connaissance que du code de groupe de traitement mais pas de l’identité du produit/traitement administré. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat).

Raffinement

L’objectif global du projet étant de développer un protocole permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésiques, l’utilisation d’anti-douleur est incompatible avec l’objectif scientifique des procédures. Toutefois, le test de distension colorectale/mesure de la pression intracolonique (DCR/ICP) a été sélectionné car il correspond à un raffinement par rapport à la technique canonique de mesure de la douleur viscérale, à savoir l’enregistrement des crampes abdominale par la technique d’électromyographie. En effet la technique de DCR/ICP ne nécessite pas de chirurgie ni d’hébergement des animaux en cages individuelles. Le protocole initial décrit dans ce document s’appuie sur les données de la littérature et de nos collaborateurs. Cependant, plusieurs axes de raffinement seront investigués durant ce projet : nécessité ou non de la mise à jeun des animaux, possibilité de réduction de la durée et de l’intensité de la procédure, etc. L’enjeu de cette étape de mise au point du modèle est la détermination des paramètres de test les moins sévères permettant d’obtenir des résultats robustes et reproductibles en vue de leur application dans la suite du projet.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet car sa sensibilité au stimulus utilisé est confirmée et que différents modèles de syndrome du colon irritable, dont plusieurs d’intérêt, ont été développés dans cette espèce. Le syndrome du côlon irritable étant principalement répandus chez les adultes dans la population humaine, les souris utilisées seront adultes.

350 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris subit l'ablation d'un rein et la pose d'un clamp sur les vaisseaux du rein restant, une chirurgie de vingt à trente minutes destinée à recréer une lésion d'ischémie rénale. Le porteur indique que cette chirurgie provoque "indubitablement" une douleur, une perte de poids et une déshydratation. Il affirme qu'un prélèvement sanguin important est "nécessaire" pour les analyses, ce qui justifie la mise à mort de tous les animaux.

Objectifs

La transplantation est le meilleur traitement de l'insuffisance rénale terminale. Malgré les améliorations apportées ces dernières années dans leur prise en charge, 30% des reins greffés ne récupèrent pas une fonction normale après la greffe. L'identification des causes de cette absence de récupération est indispensable à l'amélioration de la greffe. Une de ces causes pourrait être l'existence d'une première agression du rein du donneur avant le prélèvement pour la greffe. Un tiers des donneurs en état de mort cérébrale a souffert d'un arrêt cardiaque récupéré (ACR). L'arrêt temporaire de la circulation sanguine qui en découle est un facteur reconnu de stress important pour le rein. Cependant, et de façon surprenant, aucune étude n'a pour l'instant mis en évidence d'effet négatif de cet ACR sur la fonction du rein après greffe. D'autres facteurs pourraient donc expliquer pourquoi les reins ne récupèrent pas tous une fonction normale après greffe. Notre hypothèse est que l'intervalle entre l'arrêt cardiaque et le prélèvement du greffon pourrait influencer sa survie et sa fonction. Nous avons testé cette hypothèse grâce au registre CRISTAL, qui contient toutes les informations sur les conditions du prélèvement de rein chez le donneur pour la greffe. Nous avons ainsi montré qu'un délai entre arrêt cardiaque et prélèvement inférieur ou égal à 3 jours est associé à un risque plus élevé de mauvaise fonction du rein après greffe. Afin de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables, nous allons utiliser deux modèles animaux, la souris et le porc, chez qui nous allons recréer les conditions de l'arrêt cardiaque et du prélèvement pour la greffe. Cette demande d'autorisation de projet porte sur le modèle souris.

Bénéfices attendus

L'insuffisance rénale chronique est un problème majeur de Santé Publique, et son meilleur traitement, la greffe rénale, est limité par la durée réduite de fonctionnement du greffon. Le nombre de patients sur la liste d'attente d'une greffe de rein a augmenté de 6% en 2020. Cependant, le nombre de greffons n'augmente pas de la même façon, demeurant ainsi largement insuffisant. Il est donc indispensable d'augmenter la qualité et la survie des greffons disponibles afin de diminuer le risque de non-reprise de fonction, qui survient rapidement après transplantation. Si notre projet confirme notre hypothèse de travail, il pourra permettre d'améliorer la qualité des greffons en recommandant un intervalle de temps optimal pour le prélèvement après un arrêt cardiaque récupéré (ACR). Le délai entre ACR et prélèvement du rein pour greffe est un paramètre modifiable qui n'a jamais été étudié auparavant.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : (1) Tous les animaux du projet (350 souris mâles de 9-10 semaines) seront soumis à une procédure chirurgicale qui consiste à exciser le rein droit et à poser un clamp autour du pédicule vasculaire rénal gauche Cette chirurgie dure entre 20 et 30 minutes. Des prélèvements de 50 microlitres d'urine seront effectués avant la chirurgie et à plusieurs temps après la chirurgie (miction spontanée ou léger massage abdominal). La durée de cette procédure, effectuée sur animal vigile, est de 1-2 minutes. 290 animaux y seront soumis. (3) Tous les animaux recevront au moins une injection intrapéritonéale. Cette procédure, effectuée sur animal vigile, dure 1 minute. (4) Tous les animaux seront soumis à la mesure du débit de filtration glomérulaire qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter par voie intra-veineuse le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure 5 minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire 2h plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que 2 minutes. (5) Tous les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale, avant d'être euthanasiés par élongation cervicale, réalisée par une personne expérimentée.

Impact sur les animaux

La chirurgie et l'induction de d'une insuffisance rénale aigue provoquent indubitablement une douleur, une altération de l'état général et un stress de l'animal : (1) douleur provoquée par la procédure chirurgicale nécessaire pour la néphrectomie et la pose du clamp vasculaire (ouverture des plan cutané et musculaire, sutures); (2) altération de l'état général : perte de poids, déshydratation; (3) stress induit par les manipulations quotidiennes.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés. En effet, nous avons besoin de prélever le rein ischémié et un volume de sang important (500µl) pour réaliser toutes les analyses nécessaires à l'évaluation de la fonction et de la structure rénales. Ces prélèvements ne permettent pas de garder les animaux en vie.

Remplacement

Comme indiqué ci-dessus, une partie du projet est réalisée à partir des données de l'Agence de Biomédecine et sur des biopsies de greffons humains. Ces travaux nous ont permis de poser les hypothèses décrites ci-dessus qu'il faut maintenant tester dans l'organe complexe qu'est le rein, composé de plusieurs types de cellules chargés chacun d'une mission spécifique (cellule épithéliale tubulaire, cellules de la paroi des vaisseaux et cellules du système immunitaire).

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (les lésions tubulaires) dans notre modèle. Dans le cas de l'ischémie-reperfusion, des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux) et de morceaux de bois à ronger. Les animaux sont observés quotidiennement. Si une agressivité est observée, des abris seront placés dans la cage. Les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur (injection de buprénorphine avant la chirurgie, 6h, 24h, 36h et 48h après). Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur et/ou problème de cicatrisation. Les animaux seront pesés quotidiennement pendant 7 jours puis une fois par semaine. Les critères d’arrêt sont la prostration, la présence de plaies ne cicatrisant pas, ou la perte de 20% du poids initial. Pour assurer le bien-être des animaux pendant et après la chirurgie, des antalgiques seront administrés avant et après l'opération, pendant 48h. La semaine suivant la chirurgie, les animaux seront examinés quotidiennement puis une fois par semaine.

Choix des espèces

- modèle d'ischémie proposé pour ce projet bien validé dans cette espèce dans le laboratoire ; - nombreuses données relatives au projet déjà disponibles dans la littérature scientifique, plus que dans d'autres espèces. Tous les animaux sont des mâles C57Bl/6J fournis par un éleveur agrée. Ils sont livrés à l'âge de 7 semaines. Une période d'acclimatation de 2-3 semaines est respectée avant le début des procédures. Les animaux sont donc soumis aux procédures à l'âge de 9-10 semaines. Des animaux jeunes sont utilisés pour éviter l'accumulation de tissu gras autour du pédicule vasculaire rénal, qui peut gêner l'interruption de la circulation.

Toutes tuées par injection après une ponction cardiaque sous anesthésie, au terme de dix semaines de régime, 48 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux opérations à une semaine d'intervalle leur retirent les cinq sixièmes de la masse des reins pour provoquer une insuffisance rénale chronique, puis elles reçoivent un régime plus ou moins riche en phosphate et passent deux fois 24 heures en cage métabolique. Le porteur cite comme effets possibles l'anurie, la perte de poids, l'hypothermie, l'hypoactivité, une incision douloureuse et des douleurs gastriques, avec dos voûté et diarrhée. Cette étude pilote sur des souris témoins, non modifiées, cherche uniquement à savoir si elles "tolèrent bien la néphrectomie", si leurs vaisseaux se calcifient et si leur sexe change la réponse, en vue d'une seconde étude sur des souris génétiquement modifiées.

Objectifs

La mortalité cardiovasculaire est la principale cause de décès dans l'insuffisance rénale chronique (IRC) à cause du développement de calcifications vasculaires (CV), facteur prédictif important de la mortalité. Lors de cette pathologie, la diminution de la fonction rénale induit la réduction de l’élimination du phosphate (Pi) (sel minéral présent dans le corps humain), cela conduit à une accumulation de cet élément dans le corps au niveau sérique. Ce phénomène est la principale cause de développement de CV. Chez un individu sain, la concentration sérique de Pi est maintenue dans la plage normale par l'équilibre entre un phénomène d’entrée au niveau intestinal et de sortie au niveau rénal, ce dernier étant donc déficient lors de l’IRC. Dans notre étude, nous nous intéressons essentiellement aux mécanismes d’entrée du Pi via le processus d’absorption intestinale et spécifiquement à celui du passage du Pi entre les cellules intestinales. De plus, malgré l’augmentation du taux sériques de Pi, le processus d’entrée reste anormalement activé, cela suggère que la détection et/ou le transport du Pi intestinal sont défectueux dans cette pathologie. Nous souhaitons donc étudier les médiateurs impliqués dans l’absorption du Pi de façon à identifier, dans le futur, des cibles thérapeutiques pour diminuer la concentration sérique de phosphate via la réduction de l’entrée de ce sel dans l’organisme. Ceci permettrait de limiter le développement de CV et donc de réduire la mortalité des patients atteints d’IRC. Nous avons récemment découvert que des souris modifiées génétiquement pour une certaine protéine : la sialoprotéine osseuse (BSP) présentent une absorption intestinale de Pi réduite, ce qui en fait un modèle intéressant pour tester le rôle de ce défaut dans le développement des CV au cours de l'IRC. Dans le futur ces souris seront étudiées et donc rendues malades via une opération d’ablation de 5/6ème des reins (néphrectomie (Nx)-laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place). De plus ces souris recevront une alimentation avec des taux de Pi normaux ou très élevés durant 10 semaines. Cependant, la présente demande concerne la mise en place d’une étude pilote préalable. Ici, nous chercherons uniquement à caractériser la réponse en termes de CV de souris contrôle néphrectomisées, en fonction de leur régime (plus ou moins riche en phosphate) et de leur sexe.

Bénéfices attendus

Sur le court terme, cette étude pilote nous permettra de savoir si les souris contrôles tolèrent bien la néphrectomie, si elles sont capables de développer des CV sous régime riche en phosphate et également si le sexe des animaux impacte leur réponse. Les résultats de cette étude pilote nous permettront d’ajuster le nombre et le sexe des animaux pour la prochaine étude.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une néphrectomie des 5/6ème (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place), il s’agit de deux procédures chirurgicales à 1 semaine d’intervalle, et chaque chirurgie dure environ 30 minutes. Les animaux auront eu une analgésie préalable ainsi qu’une anesthésie locale et gazeuse lors des procédures : buprénorphine (injection sous cutanée de 5 secondes, 30 minutes avant le début de la chirurgie et 4 heures post-op) ; xylocaine (injection sous cutanée de 5 secondes sur le site de l'opération - 5 minutes avant la chirurgie). La couverture analgésique post-opératoire est également prévue et sera en continue et adaptée en fonction de l’étude des signes cliniques (buprénorphine avec respect du délai d'administration - délai de 4 à 8 heures). Les animaux seront ensuite placés pendant 10 semaines sous régime ± riches en phosphate. Pendant cette période, les animaux seront placés 2 fois pendant 24 heures en cage métabolique pour collecter les urines et les fèces. A la fin de l’étude, un acte de prélèvement de sang sur cœur battant va être réaliser via une ponction cardiaque (sur des animaux anesthésiés (injection en intrapéritonéale de 5 secondes- mélange de Kétamine et Xylazine)), les animaux seront ensuite euthanasiés à l’aide d’une injection d’un produit pharmaceutique (Euthasol, injection en intrapéritonéale de 5 secondes) , pour ensuite collecter les organes nécessaires aux analyses de l’étude.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut être source de douleur, mais également la modification du régime alimentaire et le passage en cage métabolique. Les effets possibles sont : l’anurie, la perte de poids, l’hypothermie, des modifications comportementales (protestation, hypoactivité), une zone d’incision douloureuse, des douleurs gastriques (dos vouté, diarrhée). Anurie : durée post-chirurgical (environ 3h), Hypothermie : pendant chirurgie et réveil : environ 2h, Modifications comportementales : peut se déclencher pendant les 11 semaines post chirurgie, Zone d’incision douloureuse : pendant la cicatrisation post – chirurgie, Douleurs gastriques : peut arriver pendant les 10 semaines de régime High phosphate.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissu biologique et de sang.

Remplacement

Nous souhaitons investiguer la relation entre divers organes : le rein (néphrectomie), l’intestin (via l’absorption paracellulaire) et l’arche aortique/carotides (développement de CV). La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme minéral et surtout celui du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.

Réduction

De façon à optimiser le nombre d’animaux et notamment à réduire au juste nécessaire, cette étude pilote est proposée. Ces résultats vont nous permettre de choisir le sexe des animaux utilisés pour les prochaines études (non présentées dans cette demande), et d’adapter le nombre au taux de mortalité observer ici. Après étude statistique ; il faut inclure au moins 8 animaux par groupe, mais en prenant en compte un taux de mortalité inférieur à 10% 12 semaines après néphrectomie, un nombre de 12 animaux par groupe a été jugé suffisant pour obtenir une puissance statistique robuste. Les études de cages métaboliques seront réalisées sur les mêmes animaux avant et après de façon à ce que l’animal soit son propre contrôle et donc diminuer la variabilité inter-individus.

Raffinement

Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. La procédure expérimentale implique la réalisation d’une néphrectomie pour induire une insuffisance rénale chronique, ce qui engendre de la douleur pour les animaux. Pour limiter le stress des autres animaux dans la salle d’hébergement, tous les animaux ayant subi l’intervention seront placés dans une autre salle d’isolement. Avant l’expérience, les animaux seront déjà placés dans cette salle pour les habituer. De plus, les souris seront entrainées à être changées via un passage dans un tube pour ne pas avoir à toucher leur dos/queue lors des changes après néphrectomie car la zone pourrait être douloureuse. Ce tube sera toujours dans la cage et constituera également un enrichissement physique. Une grille de scoring sera proposée pour évaluer le bien-être des animaux. Les actes douloureux comme la chirurgie seront effectués sous anesthésie, et la couverture analgésique sera continue et suffisante durant toute l’étude. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de Nx, ce point permettra de réduire le taux de mortalité. Les animaux seront sous surveillance accrue à compter de leur chirurgie.

Choix des espèces

Ici, l'étude pilote est proposée sur des souris contrôles. Dans le futur (si les résultats de cette étude pilote sont concluants), une seconde étude sur des souris génétiquement modifiées sera réalisée pour une meilleure compréhension de la pathologie. Ces études sont la suite de projets portant sur l'étude du métabolisme et menées dans le laboratoire. De ce fait, nous souhaitons continuer ce nouveau projet sur le même modèle que les souris utilisées précédemment au laboratoire et nous disposons de ces modèles de souris à l'animalerie. Cette étude pilote est donc proposée sur la souris. L’induction de l’insuffisance rénale chronique via une néphrectomie des 5/6ème (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place) est connue et maîtrisée chez la souris (plus de 200 animaux opérés, et un taux de mortalité global post opératoire faible). L’étude pilote sera menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population.

1 968 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris reçoit une injection de neurotoxine botulique qui provoque une paralysie motrice et une insuffisance respiratoire irréversibles, avant une mise à mort par dislocation cervicale. Le projet compare des méthodes de détection en s'appuyant sur le test de létalité DL50 chez la souris, présenté comme la méthode "de référence". Le porteur revendique un objectif de remplacement "à terme", tout en maintenant l'usage de la souris comme standard de sensibilité.

Objectifs

Dans son ensemble, ce projet a pour ambition de répondre aux trois questions scientifiques décrites ci-dessous et qui s’inscrivent plus largement dans le défi sociétal de diminuer ou proscrire le recours aux tests diagnostiques sur animaux : 1) Établir des recommandations sur la validité et les limites des principales méthodes de détection des neurotoxines botuliques (BoNT). Cette étude dans son ensemble apportera des éléments scientifiques factuels permettant de définir les méthodes les plus sensibles et les plus spécifiques vis-à-vis de matrices environnementales et cliniques et en fonction des principaux sérotypes et sous-types de BoNT isolés en clinique. 2) Harmoniser et valider des produits de référence et des méthodes partagées dans le plus grand nombre possible de laboratoires Européens. 3) Établir des recommandations sur les développements technologiques à poursuivre pour améliorer la sensibilité ou spécificité des méthodes de diagnostic des neurotoxines botuliques et en particulier pour les sous-types les plus rarement retrouvés en clinique.

Bénéfices attendus

Les résultats apportés par ce programme auront des retombées tant en santé humaine qu’en terme de réduction du nombre d’animaux utilisés pour le diagnostic du botulisme : Bénéfices à court terme : - Un progrès notable sera obtenu en Europe par l’évaluation comparative de différentes méthodes de détection des neurotoxines vis-à-vis des principaux sérotypes et sous-types de BoNT isolés en clinique. - Le test de létalité chez la souris servira de standard de sensibilité de détection de l’activité des neurotoxines botuliques dans différentes matrices. Bénéfices à long terme : - Ce projet est une étape nécessaire en vue de l’utilisation de méthodes de remplacement du test de létalité chez la souris pour le diagnostic des neurotoxines botuliques. Ce programme permettra une comparaison complète de cinq méthodes in vitro en s’appuyant sur des données comparatives de dose léthale 50 (quantité d'une matière, administrée en une seule fois, qui cause la mort de 50 % (la moitié) d'un groupe d'animaux d'essai) obtenues sur modèle souris. - L’amélioration des méthodes biochimiques de détection des neurotoxines botuliques contribuera à l’amélioration du diagnostic précoce du botulisme, point essentiel à la réussite du traitement par sérothérapie et des réponses à la menace biologique au niveau national et international. Ce projet permettra de réduire le risque biologique dans les sociétés civiles. - Ce projet va donc directement permettre l’implémentation de la Directive européenne 2010/63/EU pour la protection des animaux et la réduction drastique de leur utilisation.

Procédures

Les animaux sont soumis à une seule injection intrapéritonéale (geste validé 19A)

Impact sur les animaux

Les signes caractéristiques de paralysie due à l’activité des toxines botuliques sont une paralysie motrice et une insuffisance respiratoire avec discordance respiratoire se manifestant par un resserrement de la ceinture abdominale et un soulèvement de la cage thoracique non synchrone avec les mouvements des flancs. Des signes précurseurs peuvent être observés notamment l’attitude générale de l’animal et/ou sa fourrure moins lisse et soignée. Les signes peuvent apparaitre plus ou moins rapidement en fonction du sérotype et sous-type de toxine botulique. Une fois que les signes apparaissent, ils évoluent de façon irréversible sauf dans le cas de doses inférieures proche de la LD50 (léger creusement des flancs) pour lesquelles les souris peuvent survivre et récupérer. Il est donc essentiel de procéder à un suivi de l’évolution du processus d’intoxication chez l’animal jusqu’aux premiers signes de souffrance sur une durée de 4 jours (selon la directive Européenne de la pharmacopée 10.0 référence 01/2020:0085, https://pheur.edqm.eu/home). Nous avons mis en place une surveillance quotidienne des animaux injectés, pour que tout animal présentant les signes avancés caractéristiques de paralysie irréversible due à la toxine botulique (symptomatologie combinée de paralysie motrice, insuffisance respiratoire et resserrement majeur de la ceinture abdominale) soient mis à mort par dislocation cervicale pour éviter une souffrance prolongée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Les méthodes alternatives nouvellement développées pour la détection des neurotoxines botulique et leur sérotypage nécessitent pour un futur développement clinique une étape d’évaluation de leur sensibilité et spécificité par un groupe de laboratoires experts et ce vis-à-vis du test de létalité chez la souris qui est aujourd’hui la méthode standard de détection de l’activité des neurotoxines botuliques. A terme ce projet à pour ambition d’apporter des éléments rationnels pour progresser vers un remplacement des tests souris dans le diagnostique du botulisme et l’étude des toxines botuliques.

Réduction

La méthode de réduction est l’emploi du plus faible nombre de souris possible afin d’atteindre un coefficient de variation proche de 20% idéalement. Les conditions recommandées par les biostatisticien.ne.s ont conduit à : 1) l’utilisation de groupe de 2 ou 4 animaux et tests d’un minimum de dilutions encadrant les LD50. 2) bonnes pratiques de laboratoire et gestion des résultats pour permettre de limiter le nombre d’expériences nécessaires à l’obtention de résultats fiables tout en intégrant les recommandations de la pharmacopée Européenne 10.0 référence 01/2020:0085.

Raffinement

La surveillance des souris a été accrue afin de détecter le plus tôt possible les signes cliniques du botulisme. Nous cherchons à identifier des critères précoces notés sur la feuille d’observation qui nous permettront de prévoir l’apparition des symptômes de paralysie et donc mettre à mort l’animal. Des cotons « Dietgel » sont placés dans la cage dans le cas ou certaines souris auraient du mal à se déplacer. Si nous observons une déshydratation des souris nous leur injecterons 0.5 mL de sérum physiologique par voie sous cutanée.

Choix des espèces

Le test de référence de létalité sur souris est la seule méthode reconnue de référence dans la pharmacopée 10.0 référence 01/2020:0085 pour la détection et le dosage des toxines botuliques. Cette méthode doit être réalisée sur modèle souris afin d’obtenir la meilleure sensibilité de tous les sérotypes connus pour être pathogènes chez l’homme. Souris adultes swiss IOPS âgées de 4-7 semaines. La sensibilité des souris aux toxines botuliques dépend de leur âge et de leur poids. Le test de référence de létalité sur souris est la seule méthode reconnue de référence dans la pharmacopée pour la détection et le dosage des toxines botuliques, ainsi que pour la détermination d’anticorps neutralisants. Cette méthode doit être réalisée sur la souris à ce stade de développement afin d’obtenir la meilleure sensibilité.

600 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie intracrânienne pour recevoir une greffe de cellules souches de glioblastome issues de patients, dont deux enfants, jusqu'à dix prélèvements sanguins et jusqu'à cent injections intrapéritonéales, la tumeur cérébrale étant surveillée par imagerie. Le projet cherche la dose minimale efficace d'un candidat médicament contre ce cancer, bénéfice formulé comme une progression. Le porteur indique que les souris sont mises à mort avant que la tumeur ne provoque des symptômes.

Objectifs

Nous développons une molécule innovante qui présente la propriété de contraindre les cellules cancéreuses de glioblastome (CSG) les plus agressives et résistantes aux chimiothérapies, à perdre leur agressivité et devenir sensibles aux traitements. Ce candidat-médicament bloque le développement de la tumeur qui se forme lorsqu'on implante des cellules souches de gliome isolés de patient chez la souris immunodéprimée et augmente l'effet de la chimiothérapie de référence, le témozolomide (TMZ). Notre objectif est de rechercher la dose minimale efficace du candidat médicament pour prévenir des effets indésirables, d'étudier la réversibilité du traitement ainsi que l'effet du traitement sur une récidive. Ces effets seront étudiés sur plusieurs cultures de CSG de patients différents dont deux sont des enfants, de manière à renforcer la preuve de principe et montrer que ce candidat médicament pourrait être efficace sur plusieurs types de tumeurs.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de progresser vers la mise au point d'un traitement contre un cancer incurable et parmi les plus agressifs, le glioblastome.

Procédures

Chirurgie intra-crânienne n=1, environ 20min Prélèvement sanguin nombre maximal= 10, environ une minute Injection intrapéritonéale nombre maximal =100, quelques secondes

Impact sur les animaux

Les nuisances seront la chirurgie, les injections intrapéritonéales du mélange d'anesthésique, de l'antalgique puis du candidat médicament, du composé luminescent ainsi que de la chimiothérapie de référence, les prélèvements sanguins et, potentiellement, le développement tumoral. En effet, la croissance tumorale peut être à l’origine de symptômes engendrant une souffrance chez l’animal. Pour la prévenir, nous mettons à mort les animaux avant que la taille de la tumeur n’engendre les manifestations cliniques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure afin de permettre l'analyse de leur cerveau et des échantillons sanguins.

Remplacement

Lors du développement du candidat médicament nous avons utilisé des cultures cellulaires et des modèles qui miment le modèle animal pour identifier les concentrations efficaces et les seuils de toxicité. Ces techniques ont permis de n'utiliser que la quantité d'animaux strictement nécessaire.

Réduction

Nous utilisons un dispositif d'imagerie du petit animal qui permet de suivre la croissance tumorale en conservant les animaux vivants. Pour cela, nos CSG ont été modifiées pour produire de la lumière. Ce dispositif permet de réduire considérablement le nombre d'animaux sans altérer les résultats de l'étude. Nous avons calculé le nombre d'animaux strictement nécessaires pour obtenir des résultats significatifs.

Raffinement

Le suivi longitudinal de la croissance tumorale par l'imagerie du petit animal permet d'observer le développement tumoral Nous avons observé que l'apparition des symptômes liés à une trop forte croissance tumorale pouvait être évitée en définissant un seuil au delà duquel les animaux sont mis à mort. Ce critère biologique est un point limite qui permet de prévenir la souffrance des souris. L'hébergement se fera dans des conditions propres à répondre à l'instinct des souris ce qui limitera les inconvénients de la captivité. Nous veillerons à ce qu'aucun animal ne reste seul dans une cage en lui pourvoyant, le cas échéant, un animal de compagnie.

Choix des espèces

Le développement de xénogreffe est la plupart du temps ralenti par le système immunitaire de l'hôte. Pour cette raison nous utiliserons des souris immunodéprimées. De plus, la réussite de la prise de greffe de cellules souches cancéreuses de gliome nécessite des animaux adultes mais encore jeunes. Pour cette raison, nous utiliserons des animaux de 6 semaines.