Procédures sévères

1 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour prélever leurs organes. Certaines reçoivent pendant quatre mois un régime gras qui provoque surpoids et foie gras, d'autres entrent dans des protocoles qui installent une cirrhose progressive, dont l'un passe par une chirurgie de dix à quinze minutes sous anesthésie. Le projet vise à préciser le rôle du récepteur P2X4R dans la stéatose et la fibrose du foie, avec à terme l'espoir de "pistes de traitement" pour des maladies sans traitement spécifique efficace. Le porteur affirme que les régimes "n'entraînent aucune douleur ou autre nuisance", sans nommer ni l'intervention chirurgicale, ni les autres méthodes d'induction de la cirrhose, ni les molécules administrées, ni les procédures classées sévères.

Objectifs

Il s’agit de déterminer le rôle d'un récepteur (protéine spécifique) dans les maladies du foie au cours desquelles il existe une surcharge en graisse et une fibrose. Nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux permettant de mimer ces maladies chez la souris, ainsi que des molécules pouvant être administrées aux animaus afin de tester l'implication de ce récepteur. L'objectif est de mettre à jour de nouvelles pistes de traitement des maladies du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à déterminer le rôle d'un récepteur (protéine spécifique) dans lesmaladies du foie, en analysant son impact sur la stéatose et la fibrose. La persepective médicale est de définir une ou des pistes de traitement liées à cette protéine. En effet à ce jour aucun traitement spécifique de ces patholopgies du foie n'est efficace.

Procédures

Dans ce projet les animaux sont nourris avec des régimes spéciaux pouvant induire un foie gras associé à un un surpoids (régime gras pendant 4 mois, autres régimes durant 2 à 7 semaines), qui n'entraînent aucune douleur ou autre nuisance. D'autres souris entreront dans des protocoles expérimentaux entrainant le développement progressif d'une cirrhose du foie, dont la nuisance essentielle est la perte de poids corporel qui sera surveillée 2 fois par semaine. Pour induire la fibrose du foie, un des modèles expérimentaux est chirurgical (10 à 15 minutes par intervention), pratiqué sous anesthésie générale par un opérateur entrainé, encadré par des traitements antalgiques prévenant toute douleur post-opératoire. Les prélèvements se font sur les souris après leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Dans ce projet les animaux sont nourris avec des régimes spéciaux pouvant induire un foie gras associé à un un surpoids (régime gras), qui n'entraîne aucune douleur ou autre nuisance. D'autres souris entreront dans des protocoles expérimentaux entrainant le développement progressif d'une cirrhose du foie, dont la nuisance essentielle est la perte de poids corporel qui sera surveillée 2 fois par semaine.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, pour prélèvement des organes nous permettant d'évaluer l'efficacité des traitements utilisés sur les maladies du foie mimées chez ces souris.

Remplacement

Nos projets visent à étudier des mécanismes intégrés au sein de l'organisme et du tissu hépatique conduisant à la surcharge du foie en graisses et à la fibrose. Nos protocoles utilisent à la fois des méthodes in vitro (cultures cellulaires) et in vivo (souris), de façon complémentaire. Les approches in vivo chez la souris restent indispensables dans la perspective médicale de tester un récepteur spécifique comme cible thérapeutique des maladies hépatiques stéato-fibrosantes.

Réduction

Une bonne programmation des expériences, avec réflexion anticipée et approfondie concernant les tissus à prélever, les conditions de prélèvement, ainsi que le nombre minimal de souris à inclure dans chaque groupe expérimental, permettent d’éviter la répétition inutile des expériences. Le nombre d’animaux utilisés est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables

Raffinement

Toutes les souris sont hébergées en cages de 4 à 5, l'environnement est systématiquement enrichi (tubes PVC et petites maisons). La consistance du régime riche en graisses étant assez pâteuse, un morceau de bois est placé dans la cage des souris soumises à ce régime afin de s’assurer que les souris puissent continuer de ronger. Durant les 4 mois de régime, ou au cours des autres protocoles expérimentaux, les souris sont surveillées de près de façon à dépister tout signe de souffrance. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie, avec analgésie avant et après l'intervention. Une grille d’évaluation quotidienne de la douleur a été mise en place pour la surveillance des animaux en cours de procédure afin de s'assurer du bien-être animal.

Choix des espèces

La souris est le rongeur de choix pour l’étude de la surcharge lipidique et de la fibrose du foie, du fait de l’existence de modèles expérimentaux au point dans le laboratoire et de la possibilité de disposer de souris génétiquement modifiées. De plus, les mécanismes impliqués dans ces pathologies chez la souris sont proches de ceux observés chez l’Homme. Nous utilisons des souris prédisposées avec l’âge à une prise de poids et au développement d’une intolérance au glucose. Ces souris sous régime permettent donc d’étudier les complications hépatiques de la surcharge pondérale, responsable d'une partie de plus en plus importante des maladies du foie. Les souris entrent dans les protocoles expérimentaux entre 8 et 16 semaines d'âge en fonction des types de traitements.

2400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 960 en gravité sévère. Elles reçoivent des transferts de microbiote par voie intracolique ou orale, puis une colite est induite par un produit ajouté à l'eau de boisson, provoquant perte de poids, sang dans les selles et diarrhée. Les rubriques objectifs et bénéfices du résumé reprennent presque mot pour mot la même phrase sur la découverte de déterminants bactériens. Le porteur affirme que le recours à des souris axéniques est "obligatoire" pour établir le rôle du microbiote.

Objectifs

L'objectif est d'étudier l'implication du microbiote (sain ou pathologique) dans l'apparition de la colite. Cela permettra également la découverte éventuelle de déterminants bactériens responsables de l'apparition de ces maladies ou de leur aggravation afin d'envisager de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Cela permettra également la découvert éventuelle de déterminants bactériens responsables de l'apparition de ces maladies ou de leur aggravation afin d'envisager de nouvelles thérapies.

Procédures

Le projet comporte 3 procédures: 1- Transfert de microbiote par administration intracolique sous anesthésie gazeuse 2- Transfert de microbiote par voix orale sur souris vigile 3- Induction de la colite au DSS (ajout dans l'eau de boisson)

Impact sur les animaux

Perte de poids, apparition de sang dans les selles, diarrhée

Devenir

mis à mort

Remplacement

Il est maintenant largement admis que le microbiote intestinal joue un rôle essentiel dans la physiopathologie des maladies inflammatoires de l'intestin. Les interactions complexes entre la muqueuse de l'hôte et son microbiote impliquent des mécanismes qu'il est impossible de reproduire avec des études in vitro. L'utilisation d'animaux élevés en condition axénique est donc obligatoire pour élucider le rôle causatif des modifications du microbiote muqueux dans la physiopathologie des maladies digestives.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux. De plus, nous avons déjà validé certaines de nos approches expérimentales in vitro permettant d'optimiser l'utilisation des animaux. Les résultats actuels ont permis de valider que des lots de 10 souris permettent d'acquérir des données fiables. Les rongeurs utilisés sont consanguins et de même âge réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit grâce au suivi rapproché quotidien des animaux, l’enrichissement de leur environnement (coton ou sopalin afin qu'ils puissent faire un nid) et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). De plus une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant l'expérimentation. Les expérimentateurs ont reçu une formation garantissant également les bons gestes lors de la manipulation des animaux (livret de compétences). De plus les animaux seront pesés en début d'expérimentation puis de manière hebdomadaire. Au cours de la procédure 3 (colite au DSS), ils seront pesés quotidiennement afin de vérifier qu'il n'y ait pas de perte de poids supérieure à 20%. Tout animal présentant un aspect inhabituel : prostration, pelage terne et hirsute, traces de blessures infligées par les autres animaux sera isolé. Il fera l'objet d'une attention accrue et benéficiera de soins appropriés (désinfection des plaies par exemple ou accès facilté à la nourriture). Si aucune amélioration de son état n'est constaté au bout de 24h, il sera mis à mort pour eviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans l'utilisation de modèles qui reproduisent la complexité des maladies inflammatoires chez l'Homme. Il existe à ce jour peu de modèle d'animaux axéniques. La souris est un de ces modèles. Des études récentes ont montré que le transfert d'un microbiote donné pouvait modifier le métabolisme de l'hôte, dans ce cas, la souris. C'est pourquoi nous avons choisi ce modèle. Les animaux seront utilisés principalement à l'âge adulte pour permettre la bonne maturation des fonctions de barrieres de la muqueuse intestinale (production de mucus, production de peptides antimicrobiens, mise en place efficace des jonctions serrées). Le modèle DSS permettra d'étudier le rôle du microbiote dans la séverité de la colite.

1314 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 792 en gravité sévère. Ils subissent des chocs électriques aux pattes ou à la paupière, une restriction hydrique pouvant durer 50 jours et des chirurgies cérébrales de quatre à six heures avec implantation d'électrodes et de fibres optiques, le porteur indiquant que l'anesthésie est incompatible avec certains actes. Les rats implantés sont maintenus isolés pour préserver le matériel, ce que le porteur présente comme un moyen de maximiser les données par animal. L'étude porte sur le rôle du sommeil dans la formation des souvenirs de peur, avec des retombées thérapeutiques annoncées à long terme.

Objectifs

Notre projet de recherche a pour but d’approfondir notre connaissance du rôle du sommeil pendant la formation de souvenirs aversifs normaux ou pathologiques comme dans le cas du syndrome de stress post-traumatiques (SSPT). Nous testerons chez le rat si la coordination entre l'hippocampe et l'amygdale baso-latérale (BLA) est altérée pendant le sommeil suite à une expérience traumatique induisant des réponses inexactes aux indices et aux contextes. Nous chercherons également à comprendre comment les souvenirs associant un contexte à une valence émotionnelle donnée sont formés et stabilisés dans des conditions normales. En effet, l'identification des processus de formation de souvenirs émotionnels est essentielle pour comprendre comment ces processus sont affectés dans la maladie. Nous voulons notamment comprendre si et comment la coordination entre les hippocampes dorsal et ventral soutient l'acquisition et la consolidation dépendante du sommeil des souvenirs aversifs spatiaux. Pour cela, nous nous appuierons sur un processus en deux étapes. Pour identifier les mécanismes physiologiques potentiels, nous réaliserons des enregistrements in vivo à grande échelle, multi-structures chez des rats libres de leurs mouvements et endormis (corrélations). Ensuite, nous ciblerons spécifiquement ces mécanismes physiologiques grâce à l'enregistrement et la manipulation optogénétique de réseaux neuronaux (causalité). Notre projet se décompose comme suit : - Etude des réactivations hippocampe dorsal-BLA des associations lieu-menace dans dans un modèle rongeur de SSPT. - Interactions hippocampe ventral-BLA pendant le sommeil après une association lieu-menace normale ou de type SSPT. - Description physiologique approfondie de la coordination entre les parties dorsale et ventrale de l'hippocampe pendant l'exécution et la consolidation dépendante du sommeil d'une tâche spatiale aversive. - Etablir un lien de causalité entre la coordination dorso-ventrale de l'hippocampe et la consolidation des souvenirs aversifs.

Bénéfices attendus

Le syndrome de stress post-traumatiques (SSPT) et l'anxiété généralisée sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. De nouvelles approches thérapeutiques publiées récemment dans la littérature proposée pour la prévention et le traitement du SSPT incluent la privation de sommeil après un traumatisme et la stimulation cérébrale profonde pour le SSPT résistant aux médicaments. Il est essentiel que la recherche fondamentale suive ces évolutions médicales pour pouvoir affiner les cibles thérapeutiques. Ce projet utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents tests de comportements et à différentes chirurgies. - comportement : - choc électrique léger au niveau des pattes (uniquement lors de la session de conditionnement, procédure sévère) - restriction hydrique/accès limité (maximum de 50 jours, procédure modérée) - restriction hydrique/accès limité et choc électrique au niveau de la paupière (maximum de 50 jours, procédure modérée) - prélèvement sanguin au niveau de la queue (une fois, procédure légère) - injection de corticostérone (une fois/jour, procédure légère) - chirurgie du cerveau (4 à 6h) pour implantation (procédure modérée) : - d’électrodes - injection de virus (4 à 6h) - de fibres optiques (4 à 6h) - chirurgie (4h, procédure modérée) : implantation d’une électrode au niveau de la paupière - fixation du tissu cérébral. L’ensemble des actes chirurgicaux ainsi que la fixation du tissu cérébral sont réalisées sous anesthésie/analgésie. Pour les autres actes, la pratique d’une anesthésie et/ou d’une analgésie est incompatible avec la finalité de la procédure expérimentale.

Impact sur les animaux

Le projet est conçu de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisance induite par les actes effectués : • Choc électrique léger au niveau des pattes → léger stress au moment du test • Restriction hydrique → perte de poids • Choc électrique léger au niveau de la paupière → possible irritation de la peau lié au grattage de l’animal suite au choc • Prélèvement sanguin au niveau de la queue et injection ip de substance → stress très léger dû à la contention et légère douleur liée à l’insertion d’une aiguille • Chirurgie stéréotaxique : implantation d’électrodes, de fibres optiques et injection de virus → légère perte de poids et douleur post-chirurgicale pendant 48h, isolement → stress léger • Chirurgie : implantation d’une électrodes au niveau de la paupière → légère perte de poids et douleur post-chirurgicale pendant 48h, isolement → stress léger

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem).

Remplacement

Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'optogénétique implique la modification génétique des neurones ciblés : elle est interdite chez l'humain. Enfin, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.

Réduction

Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Notre équipe pratique les différents tests depuis quelques années, ce qui nous a permis de raffiner au maximum le nombre d’animaux du projet. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 1314 animaux.

Raffinement

Après leur réception, les animaux sont habitués aux expérimentateurs par une manipulation bienveillante pendant 5 jours (5 min) de manière à réduire le stress lors des procédures. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes ou individuellement et disposeront d’un enrichissement de nidification. Les animaux implantés seront maintenus en isolation : la présence d'un autre rat pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal et ne permettant pas de récolter des données. Le maintien en isolation permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Les animaux non-implantés servent de groupe contrôle et doivent donc être logés dans les mêmes conditions que les animaux implantés. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’isolement les animaux implantés sont maintenus dans des cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal isolé d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive et auditive). Lorsqu’un animal est implanté, pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture ne sera plus placée dans la mangeoire au niveau de la grille de la cage, mais sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur, les animaux seront exclus du protocole. Les procédures comportementales sont modérément aversives et brèves et n'induisent pas d'angoisse sur le long-terme.

Choix des espèces

Les modèles murins sont habituellement utilisés pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec l'apprentissage. Ici, les rats sont privilégiés par rapport aux souris car ils permettent d'implanter plus d'électrodes simultanément et donc de réduire le nombre total d'animaux utilisés. Le rat est un modèle classique pour l'étude des réseaux neuronaux en comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage le qualifient comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Nous utiliserons des rats Long Evans pour leur vivacité sur les protocoles d'apprentissage (souche classique pour les études sur la mémoire). Nous utiliserons de jeunes adultes (2 à 6 mois), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés. Leur poids correspond également aux atlas stéréotaxiques disponibles pour cibler les structures d'intérêt.

1100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 960 en gravité sévère. 700 d'entre elles subissent une injection virale dans le cerveau et pour une partie l'implantation d'une fibre optique, puis toutes reçoivent trois chocs électriques lors d'un conditionnement de peur avant d'être mises à mort environ 90 minutes plus tard. Le projet cherche à identifier les altérations cérébrales associées au passage d'une mémoire émotionnelle normale à une mémoire de type post-traumatique. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne permet d'étudier la mémorisation sans une espèce proche de l'humain.

Objectifs

Si les caractéristiques cliniques de l’état de stress post-traumatique (ESPT) sont bien décrites, les bases neurobiologiques de cette pathologie sont encore méconnues. L’un des traits cardinaux de cette pathologie, se développant à la suite d’un événement de stress intense, est une altération mnésique paradoxale associant à la fois une amnésie et une hypermnésie. S’il est connu qu’un épisode de stress et que la formation d’une mémoire peuvent s’accompagner de phénomènes de plasticité cellulaire (modifications de la morphologie cellulaire et des épines dendritiques, altération de la neurogénèse adulte) et synaptique, notamment au sein du réseau hippocampoamygdalien, les effets différentiels de deux types de mémoires sur ces phénomènes restent méconnues. Ce projet a pour objectif de déterminer dans quelle mesure certaines de ces altérations du réseau hippocampo-amygdalien peuvent être spécifiquement associées au passage d'une mémoire émotionnelle normale à une mémoire de type psottraumatique.

Bénéfices attendus

En identifiant les bases neurobiologiques spécifiques de la mémoire traumatique, ce projet doit ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement de ce trouble lié au stress.

Procédures

700 animaux sont soumis à des procédures chirurgicales : 300 animaux (3 réplications avec 20 animaux par groupe) sont soumis à une procédure d’injection virale permettant de visualiser les neurones. Cette procédure sous anesthésie générale dure environ 30 minutes. 400 animaux (2 réplications avec 20 animaux par groupe) sont soumis à une procédure d’injection virale afin d’exprimer un canal sensible à la lumière dans les neurones d’intérêt et aussi à une procédure d’implantation de fibre optique afin de manipuler par la lumière l’activité de ces neurones. Cette procédure sous anesthésie générale dure environ 60 minutes. Les animaux sont soumis à une procédure comportementale (1 seule fois) où ils recevront 3 chocs électriques (0.3 mA, de 1 seconde).

Impact sur les animaux

Ce modèle de conditionnement implique des effets stressants chez les animaux liés à : - une chirurgie - un isolement - l'application de chocs électriques lors de la procédure comportementale. Néanmoins, afin de réaliser nos études neurobiologiques, les animaux sont mis à mort rapidement (90min) à la suite de ce conditionnement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après les procédures comportementales, en vue de la réalisation d’analyses.

Remplacement

L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine. 3) Le modèle comportemental a été établi chez la souris et l’ensemble des appareils comportementaux que nous utiliserons sont dimensionnés pour cette espèce.

Réduction

Concernant la réduction, l’effectif se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Nous avons en effet déterminé ce nombre suites aux expériences précédentes utilisant les mêmes tests comportementaux.

Raffinement

Concernant le raffinement, les souris issues de centres d’élevages agréés, seront hébergées tout au long de leur vie en cage collective avec un environnement enrichi dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit. Elles recevront de l’eau et de la nourriture à volonté, elles seront changées régulièrement et elles seront observées tous les jours de la semaine et pesées 1 fois par semaine par un personnel qualifié. Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et surveillé deux fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal être (perte de poids, poils hérissés, prostration…), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera euthanasié dans les 48h. Concernant les procédures de chirurgies, nous appliqueront des mesures de raffinement adaptées afin d’éviter la douleur et le risque d’infection. Suite à l’anesthésie, l’animal reçoit une injection d’un médicament ayant un effet anti-douleur qui sera encore efficace lors de son réveil. Du gel hydratant est également posé sur chaque oeil afin d’éviter tout dessèchement. La zone d’incision est désinfectée, ensuite, un anesthésique local est injecté dans la zone à inciser. A la fin de l’opération, l’animal est placé dans une chambre chauffée à 36°C et est régulièrement surveillé jusqu’à son réveil puis est remis dans sa cage avec un peu de nourriture humide. Un suivi postopératoire est effectué pendant 4 jours avec l’observation de la plaie. Par ailleurs, le lendemain les reçoivent une injection d’un antiinflammatoire non stéroïdien toutes les 12h le jour de l’opération et le lendemain.

Choix des espèces

La souris: -est un mammifère présentant une proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. L’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris: pour une comparaison des résultats, l’étude des mécanismes neurobiologiques responsables du passage d’une mémoire normale à une mémoire traumatique implique l’utilisation de cette espèce -permet des approches invasives (approches pharmacologiques etc.) permettant d’étudier l’effet de molécules sur le système nerveux central et les phénomènes de mémorisation via l’étude comportementale -offre la possibilité d’être manipulée génétiquement: l’utilisation de souris transgéniques permettra l’analyse des modifications neuromorphologiques. A plus long terme, dans le cadre de collaborations, des modèles knockout ou transgéniques seront utilisés pour compléter l’exploration des mécanismes de plasticité altérés dans cette pathologie de la mémoire. Tous les animaux utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines, ce qui correspond au stade jeune adulte chez la souris. Etant donné que les études comportementales et pharmacologiques réalisées précédemment dans l'équipe ont été réalisées chez des souris jeunes adultes, dans un souci de cohérence, ce stade de développement a été sélectionné.

1 230 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. La plupart subissent une chirurgie cérébrale dès l'âge de nouveau-né, parfois deux interventions et des injections répétées sur 72 heures, pour étudier la neurotransmission dans un modèle de schizophrénie. Le porteur indique que les procédures peuvent provoquer des arrêts cardiaques, le cannibalisme des nouveau-nés par leur mère, des inflammations et des pertes de poids, et que la lignée transgénique présente des crises d'épilepsie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du cerveau en développement, le bénéfice restant une meilleure compréhension fondamentale des synapses.

Objectifs

Le cervelet est une structure cérébrale qui permet à tout individu de s’adapter à son environnement en contrôlant et corrigeant la posture et les mouvements en fonction des informations qu’il reçoit du monde extérieur et du reste du corps. Une mauvaise transmission de ces informations pourrait être à l’origine de symptômes schizophréniques. L’objectif de ce projet est d’identifier les molécules qui jouent un rôle essentiel dans la communication au sein des réseaux de neurones du cervelet et qui, lorsqu’elles sont altérées, pourraient être responsables de troubles schizophréniques.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre les bases moléculaires des dysfonctionnements synaptiques dans le cortex cérébelleux de la souris qui pourraient être à l’origine de troubles psychotiques associés à la schizophrénie. Les voies anatomiques impliquées dans le traitement temporel (intervalle de temps) des informations sensorimotrices chez la souris sont les mêmes que chez l'homme et cette propriété est particulièrement affectée chez les patients schizophrènes. Ce projet permettra en outre de faire des progrès dans les connaissances fondamentales du fonctionnement des synapses et sur la façon dont le cervelet encode les informations sensorielles et motrices.

Procédures

Tous les animaux subiront au moins une procédure chirurgicale. Un premier groupe d’animaux nouveau-nés subira une seule intervention chirurgicale d'une durée de 30 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde. Un deuxième groupe d’animaux subira une intervention chirurgicale entre 5 jours et 12 jours post-natal d'une durée de 20 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde puis une seconde intervention chirurgicale après le sevrage d’une durée de 30 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde. Un troisième groupe d’animaux nouveau-nés subira une seule intervention chirurgicale d'une durée de 30 minutes maximum sous anesthésie et analgésie profonde complétées par 4 injections par jour sur 72h00 (durée d'une injection = 30 secondes à 1 minute).

Impact sur les animaux

Les animaux génétiquement modifiés utilisés pour le maintien de la lignée présentent de façon épisodique un phénotype dommageable sous forme de crises d'épilepsie. Les procédures appliquées pourront induire : des arrêts cardiaques, du cannibalisme de souris nouveau-nées par leur mère, du stress pendant quelques heures, des inflammations pendant 2-3 jours, des douleurs modérées, des stéréotypies ou des pertes perte de poids pendant 2-3 jours.

Devenir

Dans les procédures conduisant à des enregistrements ou des anayses neuroanatomiques, les animaux sont mis à mort afin de réaliser des analyses électrophysiologiques, tissulaires et histologiques.

Remplacement

Pour ce projet, nous souhaitons étudier dans le cerveau de souris adultes des phénomènes biologiques complexes qui se mettent en place dans le cerveau des souris nouveau-nées. Ces phénomènes sont contrôlés à tout moment par différentes parties du cerveau. Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico qui puissent reproduire la complexité des phénomènes biologiques qui se mettent en place dans le cerveau pendant la croissance de la souris ce qui signifie que le modèle animal ne peut pas être remplacé.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. l’utilisation conjointe de plusieurs outils expérimentaux permettra de diviser par deux le nombre d’animaux nécessaires pour le projet. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, nous testerons in vitro la fonctionnalité des outils moléculaires développés spécifiquement pour ce projet.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en groupes sociaux. Elles font l’objet d’observations régulières tout au long de l'expérience et l'enrichissement (matériel de nidification et bâton à ronger) est systématiquement appliqué à toutes les cages. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les nuisances liées au phénotype dommageable de souris transgéniques seront limitées par la présence de tunnel dans les cages, par des changes réalisés par le même manipulateur et dans des conditions limitées de bruit et de vibrations. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris est justifié par le fait que de nombreux modèles génétiques développés chez la souris ont permis de comprendre les mécanismes physiologiques et moléculaires responsables de pathologies neurologiques humaines. Ainsi, nous utiliserons un modèle génétique souris qui reproduit certains aspects de la schizophrénie. La schizophrénie est une pathologie neuro-développementale qui implique des modifications du fonctionnement du cerveau pendant l’enfance. C’est la raison pour laquelle la plupart des procédures expérimentale seront réalisées chez des souris nouveau-nées (5 à 10 jours post-natal). Cela nous permettra en effet d'étudier le fonctionnement du cerveau à un stage juvénile (3 à 6 semaines).

Dix des 13 brebis, opérées du genou, seront tuées pour prélever les condyles portant l'implant, et seules les 3 donneuses de moelle osseuse "pourront être replacées dans l'élevage". Âgées de deux à quatre ans, ces brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, chaque geste étant réalisé sous anesthésie générale : ponction de moelle, implantation en 45 minutes d'un biomatériau chargé de cellules souches dans des lésions du genou, trois séances d'IRM. Après l'opération, elles peuvent souffrir des genoux, une douleur traitée par antalgiques, et restent dans un box de 3,5 mètres sur 3,5 pendant la cicatrisation. Le bénéfice annoncé à court terme est la validation de ces cellules "chez la brebis", le porteur précise que "Ce travail fera l'objet d'une publication", et il avance pour l'humain une économie "en termes de coût de la santé".

Objectifs

Les pathologies ostéo-articulaires sont aujourd’hui un problème de santé publique dont la prévalence augmente avec l’augmentation de l’âge de la population avec plus de 10 millions personnes qui souffrent de l’arthrose en France aujourd’hui . Actuellement, les possibilités thérapeutiques proposées chez l’homme ne permettent pas de régénérer un tissu cartilagineux articulaire normal, et de ce fait, sont incapables de restaurer la fonction de l’articulation. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité de ce biomatériau en termes de régénération tissulaire et avons également confirmé ces résultats après implantation chez le petit rongeur. Une étude in vitro réalisée sur le modèle ovin a permis de montrer l'efficacité de notre implant associé une autogreffe de cellules souches mésenchymateuses autologues pour la régénération de lésions ostéocartilagineuses. Dans l’étude actuelle, nous souhaitons confirmer ces résultats chez la brebis, en utilisant le même modèle d’étude que précédemment pour la régénération cartilagineuse avec comme différence l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses (CSM) allogéniques de brebis et d’une membrane déposée en superficie du matériau composite utilisé dans l’étude précédente, au niveau de lésions intra-articulaires du genou. Nous avons développé des biomatériaux résorbables hybrides dans le but de régénérer à la fois le tissu ostéochondral mais également le cartilage articulaire. Ces matériaux sont d’une part nanofibreux et équipés de nanoréservoir contenant de l’hydroxyapatite, pour régénérer l’os sous-chondral et d’autre part, ils sont recouverts d’un hydrogel d’alginate contenant des CSM allogéniques pour la réparation du cartilage articulaire en surface. Une couche superficielle supplémentaire nanofibreuse contenant de la chondroitine sulfate et de l’acide hyaluronique vient recouvrir l’ensemble du biomatériel dans certains groupes à tester. L’hypothèse est que les données apportées par cette étude nous permettrons ainsi de confirmer le potentiel de réparation ostéo-chondrale de ces biomatériaux associés à des CSM allogèniques. L’objectif de cette étude sera d’évaluer l’efficacité sur la régénération du cartilage articulaire de ces implants hybrides.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu à court terme est la validation de l’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques dans la réparation des lesions du cartlilage articulaire chez la brebis. Ce travail fera l’objet d’une publication. Le bénéfice à long terme concerne essentiellement l’être humain. Le but est de traiter les lésions cartilagineuses pour éviter qu’elles aboutissent à une arthrose évoluée nécessitant une intervention de type prothèse. Ce serait un bénéfice (une économie) en termes de coût de la santé. Il est nécessaire de tester cette hypothèse sur un modèle gros animal avant de proposer ce type de traitement chez l’être humain (principe de précaution) car les tests sur des petits animaux ne sont pas transposables pour des raisons évidentes de taille, d’anatomie et donc de contraintes mécaniques. Les principaux avantages de l’utilisation de cellules allogéniques par rapport aux cellules autologues sont : a/ d’éviter le prélévement de moelle osseuse 2 à 3 semaines avant l’intervention sur le cartilage b/ de pouvoir administrer un nombre connu à l’avance de cellules.

Procédures

Il n'est pas prévu de prélèvement sur animaux vigiles. Tous les gestes seront réalisés sous anesthésie générale. 3 procédures seront utilisées .1. ponction de moelle osseuse (5 min). 2. intervention pour implantation du dispositi (45 min). 3. IRM (3 x15 min)

Impact sur les animaux

Une intervention sur les genoux et douleur post-opératoire au niveau des genoux opérés, traitée par antalgiques adaptés. Tout geste sur une articulation peut entraîner des complications : -Anesthésiques : difficultés à l’intubation, troubles du rythme cardiaque etc … Moyens mis en œuvre = surveillance permanente de l’animal -Per-opératoires : pas de complications per-operatoires prévisibles car - pas de risque de hémorragique puisqu’on est à distance des gros vaisseaux qui sont à la face postérieure du genou. L’hémostase des petits vaisseaux sera faite au bistouri électrique et la brebis n’est pas sous anticoagulant. - Pas de risque de fracture car aucune contrainte sur l’os, seul un geste sur le cartilage - Post-opératoires : comme pour tout geste chirurgical sur une articulation les risques sont : - Une douleur post-opératoire, qui n’est pas certaine mais dont la présence sera détectée par l’observation de l’animal - Un retard de cicatrisation : surveillance quotidienne - Infection : surveillance quotidienne et geste chirurgicale adapté si nécessaire ou euthanasie Déambulation libre en box de 3,5 m x 3,5 m pendant la période de cicactrisation puis jusqu’au 6ème mois, Déambulation quotidienne sur un périmétre plus large.

Devenir

Les 3 brebis prévues pour le prélèvement de moelle osseuse, pourront être replacées dans l’élevage. Ce prélèvement ne modifie en rien leur état. Les 7 brebis opérées devront être euthanasiées pour pouvoir prélever les condyles en vue de l’analyse des implants et de leur effets sur la régénération du cartilage, ainsi que les 3 brebis surnuméraires demandées dans cet avenant.

Remplacement

Ce protocole d’étude respecte la règle des trois R de l’expérimentation animale (Replacement, Reduction, Refinement) grâce à la possibilité d’imagerie non invasive de l’IRM qui permet de suivre l’évolution des lésions sans avoir à faire de prélèvement chez l’animal. L’utilisation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques évite une anesthésie supplémentaire car il n’est plus nécessaire de prélever de moelle osseuse autologue. Il n’y a pas d’alternative non animale pour étudier le cartilage articulaire. Suite à des études in vitro, nous avons montré l’efficacité des implants 3D des chondro-, ostéo-inducteurs et des CSM en termes de régénération ostéochondrale. La principale limite des études-in vitro est l’absence de contrainte biomécanique et son effet sur l’implant et la cicatrisation. Le passage sur animal vivant est ensuite indispensable pour valider notre approche. Il n’est actuellement pas légal de tester chez l’homme une technique innovante sans l’avoir testé chez l’animal quand cela est possible (principe de précaution)

Réduction

Une première étude a été faite sur ce même schéma avec 4 brebis mais en utilisant des CSM autologues, confirmant leur utilité dans la réparation des lésions cartilagineuses.

Raffinement

Dans le protocole actuel le même schéma est reproduit avec comme différence l’utilisation des CSM allogéniques et dans un des groupes une membrane superficielle sensée améliorer la cicatrisation du cartilage. Les 4 brebis de la première étude (opérées des 2 genoux) ont pu être toutes suivies jusqu’au terme de l’expérimentation, ce qui a permis de valider le concept de l’implant utilisé. Cependant sur un aussi petit effectif un incident (problème à l’anesthésie, mauvaise récupération post-opératoire, infection du site opératoire) la perte d’un seul animal peut compromettre le résultat de l’ensemble de l’étude et donc finalement avoir inclus inutilement les autres animaux. Pour pallier cela et augmenter les chances d’atteindre les objectifs scientifiques il est prévu d’augmenter le nombre d’animaux à 7 brebis minimum pour pallier aux éventuels incidents rendant inexploitable une implantation chez l’un des animaux. 3 brebis supplémentaires sont demandées afin de comparer l’efficacité des cellules allogénique du premier groupe aux cellules autologues de ce nouveau groupe.

Choix des espèces

La brebis est le modèle gros animal reconnu pour l’étude de l’arthrose. Les brebis agées de 2 à 4 ans sont le modèle animal utilisé habituellement dans les autres études sur le cartilage. Pour ne pas induire une variable supplémentaire par rapport aux études existantes il a été décidé de conserver ce sexe et cette tranche d’age .