Procédures sévères
Etude du couplage neuromécanique par imagerie ultrasonore
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
107 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, la plupart menées sous anesthésie sans réveil. Ils subissent une chirurgie puis environ trois heures d'imagerie cérébrale, et 15 d'entre eux reçoivent cinq injections destinées à induire des crises de migraine. Le porteur reconnaît qu'il "n'est pas possible" de soulager les animaux pendant ces crises, la douleur faisant l'objet de l'étude, et applique un test de sensibilité par pression d'un poil sur la face. Il affirme qu'étudier le cerveau "entier et fonctionnel" rend impossible tout recours à l'in vitro ou l'in silico.
Objectifs
Le cerveau, comme les autres organes, nécessite un apport en énergie pour maintenir son activité. Ainsi, lors de l’exécution d’une tâche, l’activation neuronale résultante s’accompagne d’une augmentation locale du flux sanguin, permettant un approvisionnement des neurones en oxygène et nutriments. Ce phénomène physiologique, appelé couplage neurovasculaire, est à la base de plusieurs techniques d’imagerie fonctionnelle. En plus d’une augmentation de la désoxygénation locale, puis de l’afflux sanguin induits par l’activité cérébrale au cours d’une tâche qui sont les éléments clés mesurés dans de nombreux types d’imagerie, cette activité cérébrale pourrait s’accompagner de changements locaux de dureté des tissus. Ce phénomène est appelé couplage neuromécanique, par analogie au couplage neurovasculaire. Le but de ce projet est : 1) de mettre au point une méthode permettant d’étudier l’existence de ce couplage neuromécanique dans le cerveau, puis 2) de l’appliquer à l’étude d’une pathologie vasculaire cérébrale : la migraine. Ces travaux seront réalisés chez le rat anesthésié. Dans la première partie du projet, nous souhaitons développer cette technique de mesure combinée de l’activité neuronale (par suivi du débit sanguin local) et de la dureté du tissu (élastographie). Cette première partie méthodologique définira et optimisera les éléments essentiels expérimentaux de ces expérimentations, c’est-à-dire les paramètres physiques d’imagerie à utiliser pour mesurer ces deux composantes de la réponse cérébrale, mais également les conditions expérimentales permettant une activation optimale. Ces travaux reposent sur une expertise reconnue de notre laboratoire dans l’étude fonctionnelle des zones cérébrales chez le rongeur. Ainsi, 4 grands types d’éléments clefs à optimiser ont été identifiés et chacun d’entre eux sera l’objet d’une étude sur deux types de stimulations. La deuxième partie de ce projet a pour but d’utiliser cette méthologie mise au point et de l’appliquer à l’étude du couplage neuromécanique dans un modèle animal de migraine chez le rat. Nous avons choisi le modèle le moins invalidant et le plus court possible. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérience d’imagerie. Cette séance d’imagerie durera environ 3h. Aucune douleur , ni souffrance n’est attendue du fait des mesures mises en place et de l’anesthésie de l’animal au cours de la procédure.
Bénéfices attendus
Le couplage neuromécanique est un sujet qui n’a jusqu’à présent pas fait l’objet de nombreuses recherches et dont l’existence reste encore controversée dans la littérature. Les quelques études faisant état de ce phénomène physiologique utilisent la technique d’élastographie par résonnance magnétique, qui est moins précise temporellement que la technique que nous souhaitons mettre en place et nécessite un plus grand nombre d’acquisitions pour obtenir un signal exploitable. Par conséquent, le projet décrit ici pourrait permettre une observation plus fine du phénomène, sur un plus grand nombre de mesures, et comprendre ainsi le lien fondamental entre activation neuronale et élasticité des vaisseaux. Si la thématique de cette étude est très fondamentale, ce projet est aussi translationnel. En effet, le couplage neuromécanique pourrait, à plus long terme, permettre de diagnostiquer certaines pathologies vasculaires, telles que la HHT (Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia), caractérisée par l’absence de capillaires entre les veines et les artères, ou encore CADASIL, une maladie génétique qui atteint les petits vaisseaux dans le cerveau. La mesure combinée des variations de flux sanguin et de la rigidité dans le cerveau pourrait permettre de discriminer ces pathologies et d’en établir un diagnostic plus complet et plus fiable en clinique.
Procédures
Sous anesthésie générale, les animaux subiront une opération chirurgicale, pendant environ 1h. Cette anesthésie sera ensuite maintenue pour réaliser les mesures d’imagerie (les acquisitions en imagerie dureront environ 3 heures). Au cours des expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. L’anesthésie prolongée des animaux pour ces séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront suivies au cours du temps grâce au suivi des fréquences cardique et respiratoire (Labchart). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’isoflurane pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal). Comme nous voulons étudier les mécanismes neuromécaniques cérébraux associés aux douleurs migraineuses, nous devrons induire ce modèle chez 15 animaux et pour cela, réaliser 5 injections intrapéritonéales (une par jour sur 5 jours). Il est possible que certaines de ces injections induisent une douleur aiguë orofaciale transitoire. La crise migraineuse elle-même aura lieu sous anesthésie à la 5ème injection. Les animaux du groupe contrôle recevront une injection de sérum physiologique avec la meme fréquence. Il ne nous est malheuresement pas possible de soulager les animaux pendant les crises migraineuses qui pourraient se mettre en place suite aux 4 premières injections d’ISDN. Cet effet devrait être modéré cependant car il a été montré qu’il fallait attendre la 5ème injection pour observer l’induction d’une crise migraineuse. Un suivi étroit de la sensibilité orofaciale des animaux sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal si la souffrance devenait incontrôlable). Ce test de sensibilité, qui dure moins d’une heure, sera réalisé avant le développement du modèle, puis au 4ème jour d’induction du modèle. Il implique de laisser les animaux libres de leurs mouvements, seuls dans une cage ouverte. Après une phase d’habituation, l’expérimentateur appliquera un poil calibré sur la face de l’animal afin de réaliser une pression douce de ce poil. Les animaux seront directement mis à mort à la fin de la séance d’imagerie.
Impact sur les animaux
- Au cours des expériences d’imagerie, aucune nuisance n’est attendue puisque les expériences seront réalisées sur animaux anesthésiés et seront sans réveil. - Les seules nuisances envisagées sont celles causées par le modèle de migraine. Comme nous voulons étudier les mécanismes cérébraux associés aux douleurs migraineuses, il ne nous est pas possible de soulager les animaux pendant les crises migraineuses qui pourraient se mettre en place suite aux 4 premières injections de la molécule induisant la migraine. La douleur associée aux crises migraineuses se mettra en place progressivement suite aux injections de la molécule induisant la migraine et correspond à une douleur modérée. Un suivi étroit de la sensibilité orofaciale des animaux sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure). Les animaux seront directement mis à mort après la dernière séance d’imagerie. Notons que la plupart de nos analyses en imagerie se feront sur animal anesthésié, limitant ainsi la perception douloureuse de l’animal. Néanmois, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront suivies au cours du temps grâce au suivi des fréquences cardiaques et respiratoires (Labchart). Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’isoflurane pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal).
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront mis à mort car ils auront subi une ouverture de leur boîte crânienne donc ne pourront pas être réveillés.
Remplacement
Notre étude s’intéresse aux propritétés hémodynamiques et mécaniques du cerveau en activité, entier et fonctionnel ; il est par conséquent impossible de réaliser ces manipulations ex vivo, in vitro ou in silico. Par ailleurs, les ultrasons n’ont jamais été utilisés pour étudier parallèlement le flux sanguin et la rigidité. Aucune donnée n’a donc été collectée à ce sujet, d’où la nécessité de réaliser les manipulations décrites dans ce projet
Réduction
Pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à notre projet, nous avons utilisé un logiciel de statistiques. Le nombre d’animaux ainsi estimé est de N = 10 par groupe pour la première procédure. La mise au point réalisée en manipulation préliminaire permettra de réduire le nombre d’animaux utilisé dans la suite du projet. Pour la seconde procédure, en tenant compte du fait que la différence d’effet entre nos deux groupes expérimentaux (rats migraineux et contrôles) n’est pas connue et, de plus, que 20% des animaux injectés avec le donneur de monoxyde d’azote étaient non-répondeurs, il sera nécessaire d’inclure N =12 animaux contrôles et N =15 animaux injectés avec le donneur de monoxyde d’azote. Au total, le nombre d’animaux nécessaire au projet est de 107.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Ils seront hébergés deux par deux dans une cage contenant un enrichissement (tube en carton, bois à ronger). Un suivi quotidien sera assuré, contrôlant leur comportement général, leur apparence et la présence d’eau et de nourriture (échelle de suivi de la douleur). Nous avons déterminé des points limites anticipés, liés à l’état général de santé et de bien-être et liés au modèle expérimental et aux procédures détaillées. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous définirons un score décisionnel en fonction des observations quotidiennes permettant de modifier la procédure en cours avec administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou de mettre à mort par administration d’une dose létale d’Euthasol sous anesthésie. Application d’Ocrygel sur les yeux au cours de la chirurgie pour éviter que les yeux ne se dessèchent. Pendant les acquisitions, monitoring des paramètres physiologiques (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température) pour surveiller le maintien du niveau d’anesthésie. Pendant toute la durée des actes sous anesthésie, les constantes vitales seront suivies : température corporelle, et fréquences cardiaque et respiratoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement la mise à mort de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’Euthasol.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour l’étude des bases physiologiques du cerveau car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionelle transposables à l’Homme. Du fait du développement et de la grande caractérisation morpho-fonctionnelle du cortex chez le rat et la souris, ces deux espèces de rongeurs sont – dans l’absolu – deux espèces de choix pour notre étude fonctionnelle neuromécanique. Cependant, la souris ayant une taille de cerveau significativement plus petite que celle du rat complique grandement la mise au point et l’application à court terme de la technique. En effet, une surface de cortex, ainsi que des distances de transmission de ces ondes de cisaillementvgf sont nécessaire afin de mesurer de façon reproductible ce mécanisme. Ainsi, bien que nous souhaitions à plus long terme étudier ce couplage chez la souris, ce premier projet utilise exclusivement des rats. Les mises au point seront plus faciles car le cortex étant plus grand, il y aura une plus grande place pour la propagation des ondes de cisaillement et leur mesure. Les animaux utilisés dans cette étude seront des rats adultes (7 semaines et plus) car leur cerveau est pleinement développé et d’un grand volume, adapté pour des acquisitions en imagerie.
Exploration de la pression arterielle chez la souris in vivo
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
1 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, une large part étant menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections et des mesures de pression artérielle par brassard à la queue, et 530 d'entre elles portent un modèle de sclérose latérale amyotrophique entraînant une paralysie progressive des membres. Le porteur indique adapter les cages avec des tétines allongées pour les animaux affaiblis, et affirme qu'"il n'existe pas de modèle de remplacement" pour cette maladie. Il présente les retombées thérapeutiques au conditionnel et à terme, alors que la mise à mort des animaux est certaine.
Objectifs
L'ensemble des grandes fonctions de notre organisme (digestion, respiration, régulations cardiovasculaires...) est sous le contrôle du système nerveux autonome. Celui-ci se divise en deux grandes branches : le système nerveux autonome sympathique (SNAS) et le système nerveux autonome parasympathique. Nous menons actuellement au laboratoire deux projets de recherche qui utilisent la même procédure expérimentale afin de savoir (1) si certains neurones thoraciques de la moelle épinière qui présentent des propriétés de senseur chimique font partie du SNAS et (2) si lors de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), le SNAS est altéré et contribue à la physiopathologie de cette maladie. Afin de répondre à nos questions, nous regarderons l'effet de molécules, connues pour activer le SNAS, sur la pression artérielle. Celle-ci sera mesurée au niveau de la queue chez l'animal avec un système de brassard comme utilisé chez l’homme. Deux types de modèles murins seront utilisés dont un est un modèle murin de la SLA qui récapitule la maladie humaine (dégénérescence progressive des motoneurones entrainant progressivement une paralysie). Nous faisons l'hypothèse que les modifications génétiques portées par les souris modifient le fonctionnement du SNAS et que sa stimulation induira des effets différents entre souris sauvages et génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Ce projet éthique fait partie d'un nouvel axe de recherche développé depuis deux ans au laboratoire qui vise à comprendre l'organisation et le fonctionnement du SNAS en situations physiologique et physiopathologique. Dans le contexte de la SLA, les données sur le SNAS sont parcellaires. Des données récentes montrent que le SNAS exerce un contrôle extrêmement puissant à tous les étages de la communication entre motoneurones et muscles. Nous espérons donc que cette étude permettra de démontrer l'implication du SANS dans la SLA et donc potentiellement à terme de développer de nouveaux outils thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle encore aujourd'hui aucun traitement même partiel n'existe.
Procédures
1320 animaux recevront une à deux injections sous anesthésie générale sans autre procédure invasive. 50 mâles seront utilisés comme reproducteurs mais euthanasiés avant tous développement de signes cliniques liés à la maladie.
Impact sur les animaux
530 animaux présenteront un phénotype dommageable similaire aux symptômes de la SLA (sclérose latéral amyotrophique) avec diminution de la motricité des membres postérieurs. L'ensemble des animaux (1370) subiront une mise en contention, 2 à 3 injections sous cutanées, une anesthésie sans réveil ainsi que des mesures de pression artérielle répétées au niveau de la queue
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés dès la fin des manipulations.
Remplacement
Il n'existe pas de modéle de remplacement pour aborder la physiologie et la physiopathologie du système nerveux et de la maladie étudiée (SLA ou Sclérose Latérale Amyotrophique)
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous proposons d'injecter deux molécules d'interet par animal. Il n'est neanmoins pas possible d'augmenter le nombre de ces injections afin de limiter les effets croisés entre composés actifs. Le nombre d'animaux par lots à été déterminé grâce à un logiciel de statistiques en estimant qu'une différence est significative à partir de 5mmHg entre les groupes. Les analyses seront faites avec des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Le système de mesure de pression artérielle externe permet de n'être absolument pas invasif puisqu'il consiste en la pose d'un ballonnet sur la queue, similaire à ce qui est utilisé sur les bras des patients humains lors de consultations médicales. Les animaux présentant un phénotype dommageable seront suivis quotidiennement avec une grille de scoring validée. Des dispositifs d'adaptation de la vie des animaux commençant à présenter des faiblesses au niveau des membres seront mis en place comme des tétines de biberon plus longues et de la nourriture dans la cage pour un accès à l'alimentation et à l'eau facilité.
Choix des espèces
La souris est un modele le dont le genome est parfaitement connu. Le choix de l'espece souris est motivé par la présence de modeles genetiquement modifiés extremement pertinents pour les questions scientifiques posées. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Les souris présentant un déficit d'un gène codant pour un canal calcique seront utilisées lorsqu'elle auront entre 8 et 10 semaines (l'expression visible de l'absence du canal ne changeant pas avec l'âge) . Les souris présentant la maladie SLA (sclérose latéral amyotrophique) seront analysées à différents stades de la maladie et donc à différents âges (pré et postsymptomatiques): 21 jours, 40 jours, 60 jours, 75 jours, 90 jours, 105 jours et 110 jours d'âge).
Étude du remodelage veino-lymphatique chez la souris pour comprendre la physiopathologie de l’hypertension intracrânienne idiopathique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Selon leur groupe, des souris subissent une ligature des deux veines jugulaires, reçoivent des vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien ou portent un cathéter intracrânien pendant douze à quatorze jours, seules en cage, avec une injection par jour pendant six jours. 696 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour l'étude de leur cerveau et de la dure-mère, certaines au terme d'une mesure de pression intracrânienne menée sans réveil. Un régime gras rend une partie d'entre elles obèses pendant quatre à dix semaines, d'autres restent isolées jusqu'à 31 jours en cage d'activité locomotrice, pour tenter de reproduire l'hypertension intracrânienne idiopathique, maladie de la femme jeune en surpoids que l'équipe étudie aussi par IRM chez des patients. Les tests comportementaux, répartis sur deux jours et demi, ne sont pas nommés, et le porteur reconnaît que l'isolement des souris porteuses d'un cathéter "peut occasionner une souffrance de l'animal et des troubles du comportement".
Objectifs
Les vaisseaux lymphatiques récemment mis en évidence dans les méninges du système nerveux central semblent impliqués dans un grand nombre de pathologies neurologiques. Ces vaisseaux lymphatiques sont absents du tissu cérébral et uniquement présents dans l’enveloppe la plus externe au cerveau : la dure mère. Au sein même de cette enveloppe, ils sont plus spécifiquement localisés le long des sinus veineux duraux. Des travaux récents ont montré que cette proximité anatomique veino-lymphatique jouait un rôle clé dans l’immunité du système nerveux central. Nos hypothèses sont les suivantes : 1) Une altération du réseau veineux cérébral influera le réseau lymphatique, et inversement, 2) La dérégulation du complexe veino-lymphatique chez l’Homme pourrait être impliquée dans une pathologie rare dont les mécanismes sont encore inconnus : l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I). Cette pathologie touche spécifiquement la femme jeune en surpoids et associe une rétention de fluide dans le système nerveux central à des sténoses, c’est-à-dire des rétrécissements, des sinus veineux duraux. Nos objectifs sont de caractériser les mécanismes de cette pathologie, et d’explorer la neuro-inflammation qui pourrait être impliquée dans l’altération des fonctions cognitives observées chez ces patientes. Dans cette étude, nous allons combiner une analyse par imagerie par résonnance magnétique (IRM) du réseau veino-lymphatique dural chez l’Homme (patients avec HTIC-I et contrôles), et une étude expérimentale sur des modèles animaux d’HTIC-I. Notre programme d’étude chez la souris est le suivant : 1) Modéliser chez la souris l’HTIC-I 2) Étudier comment une altération du flux veineux pourrait affecter le réseau lymphatique 3) Étudier comment une manipulation du réseau lymphatique (amplification et altération) pourrait induire, amplifier ou diminuer les caractéristiques de l’HTIC-I 4) Analyser les conséquences sur le comportement et la cognition de l’altération des réseaux lymphatique et veineux 5) Analyser les conséquences sur l’inflammation du cerveau et des méninges d’une altération des réseaux lymphatique et veineux 6) Étudier comment le genre féminin et l’obésité participent à la physiopathologie de la maladie. Nous utiliserons sur 5 ans un total de **696 souris non transgéniques.
Bénéfices attendus
D'un point de vue médical, l’hypertension intracrânienne idiopathique (HTIC-I) est une maladie mystérieuse aux frontières de la neurologie, de l'ophtalmologie et de la neurochirurgie. Cette maladie affecte les femmes jeunes en âge de procréer et peut conduire à une altération majeure du champ visuel ou à la cécité. Les traitements existants soulagent les symptômes, mais ne ciblent pas la cause de la maladie, ils sont invasifs, ont une efficacité limitée et sont associés à des risques et effets secondaires non négligeables. Des thérapies alternatives, plus efficaces et moins invasives, ciblant directement la cause biologique de la maladie semblent nécessaires. Cependant, un prérequis nécessaire de ce développement est de comprendre la physiopathologie et les mécanismes biologiques impliqués. A long terme, l'objectif de cette étude est d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles avec un potentiel réaliste pour améliorer le pronostic de cette maladie. D'un point de vue scientifique, l'HTIC-I est un modèle de maladie cérébrale paradigmatique qui semble parfaitement illustrer une dysfonction primitive du complexe veno- duro-lymphatique. Tandis que le rôle et l'anatomie des lymphatiques ont été bien étudiés chez l'animal, leur caractérisation chez l'humain et leur rôle dans les pathologies neurologiques est très méconnu. L'exploration du complexe veno-lymphatique et de sa plasticité pourrait conduire à des avancées significatives en neurosciences.
Procédures
Les procédures suivantes seront réalisées après une prise en charge première de la douleur par des médicaments, et hydratation. Les souris sont ensuite anesthésiées par anesthésie gazeuse. Les interventions sont réalisées en conditions stériles chirurgicales. Un protocole de prise en charge de la douleur sera suivi en post opératoire. On identifie les procédures suivantes qui seront réalisés selon le plan expérimental en fonction des groupes d’animaux : 1. Chirurgie de ligature bilatérale des veines jugulaires (Durée : 1 heure, préparation 30 min). 2. Mesure de pression intracrânienne : La mesure de la pression intracrânienne est une procédure sans réveil (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 3. Manipulation du réseau lymphatique par injection de vecteurs viraux dans le liquide céphalorachidien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 4. Mise en place d'un cathéter intracrânien (durée : 30 minutes, préparation : 30 minutes). 5. Mise en place du cathéter intracrânien et injection de traceurs de fluorescence différente à 30 minutes d’intervalle (préparation : 30 min, durée : 1h30), procédure sans réveil. **6. IRM cérébrale avant et après chirurgie de ligature jugulaire (préparation : 30 minutes, durée de la procédure : 40 minutes)**. Les autres procédures ne nécessiteront pas d’analgésie ou d’anesthésie de l’animal et consiste en : 1. Des tests comportementaux répartis sur deux jours et demi. 2. Un régime riche en graisse pour rendre l’animal obèse pendant toute la durée de l’experimentation soit entre 4 et 10 semaines. 3. Isolement pour cathéter intracrânien laissé en place pendant 12 à 14 jours. 4. Injection par le cathéter intracrânine une fois par jour pendant 6 jours. **5. Étude d’activité dans des cages d’activité locomotrice nécessitant l’isolement de l’animal pendant 31 jours. 6. Étude d’activité dans des cages comportant une roue d’activité nécessitant l’isolement de l’animal sur 4 périodes de 3 jours**
Impact sur les animaux
Dans cette expérimentation, les nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être divisés en effets indésirables liés aux chirurgies réalisés sous anesthésie générale et incluent les accidents survenant lors de l’anesthésie (accident opératoire, hémorragie, mauvaise tolérance de l’anesthésie pouvant conduire au décès de l’animal ou à l’interruption de la chirurgie), les effets indésirables post opératoires (douleur, infection de la cicatrice ou du site opératoire, stress, inactivité mobilité réduite, comportement anormal). Les procédures réalisées sans anesthésie sont de sévérité moindre mais peuvent entrainer un inconfort, ou un stress de l’animal qu’il conviendra de détecter et de prendre en compte. Le phénotype obèse peut engendrer des difficultés pour l’animal à se déplacer. L’isolement de l’animal porteur d’un cathéter intracrânien peut occasionner une souffrance de l’animal et des troubles du comportement qu’il conviendra de détecter et de prendre en charge précocement et préventivement par un enrichissement du milieu.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études histologiques et biochimiques de la dure mère et du cerveau des animaux.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet, l’étude des mécanismes physiopathologiques ne peut être modélisée autrement que par des modèles vivants. Le recours à ces animaux est indispensable afin de pouvoir analyser les réactions physiologiques à l’atteinte d’une fonction.
Réduction
Trois lots d’animaux seront nécessaires en raison de traitements différents des échantillons en post mortem (n= 660). **A ceci s’ajoutent les animaux des procédures 9 et 10 (n=36) dont l’analyse est clinique par IRM ou tests comportementaux.** Afin de réduire les contraintes pour les animaux, les études histologiques seront couplées aux études cliniques (comportement et mesure de PIC). Un calcul de puissance a été réalisé pour évaluer le nombre d’animaux par groupe, ainsi un nombre de 10 animaux pour chaque condition expérimentale pour analyse histologique a été calculé afin d’obtenir des données reproductibles et solides nécessaires pour réaliser des analyses robustes. Tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 15 animaux par groupe a été estimé pour un groupe avec analyse post mortem en immuno histochimie. Pour le groupe avec analyse en cytométrie de flux, un nombre minimal de 18 souris par groupe est nécessaire sur le plan technique en raison de la faible cellularité de la dure mère. Tenant compte du risque de perte d’animaux pendant la chirurgie, le nombre de 20 animaux par groupe a été estimé pour ce groupe. Ce nombre de 18 souris par groupe a été validé également par le calcul de puissance réalisé pour évaluer la taille de l’échantillon. Un nombre minimal de 3 animaux est nécessaire pour les analyses en imagerie post mortem 3D, les données étant qualitatives et ne nécessitant pas d’analyse statistique. Par conséquent, tenant compte du risque de perte d’animaux en per ou post opératoire immédiat, le nombre de 5 animaux par groupe nous semble pertinent. **Pour la procédure 9 (IRM), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 6 animaux par lot a été validé. Pour la procédure 10 (tests comportementaux en cage individuelle), chaque animal étant son propre témoin, un nombre de 12 animaux par lot a été validé.** Pour analyser les résultats de l’étude, nous utiliserons les tests diagnostiques dédiés aux échantillons et à leur distribution. Ainsi, un total de **696 souris sera nécessaire en tout pour répondre à l’ensemble des objectifs.
Raffinement
A réception des animaux une procédure d’acclimatation d’une semaine aux nouveaux locaux sera réalisée. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés en cage en portoir ventilé par groupes de 3 afin de fournir un environnement social enrichi. Les animaux auront à disposition des composants de nidification de type « Nestlet ». Ils auront à disposition de la nourriture en permanence et accès à l’eau . Si l’animal a du mal à se déplacer, par exemple juste après une chirurgie, les croquettes seront mouillées et une solution d’hydratation gélifiée sera mis en place. Les paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie, pH de l’eau) seront surveillés quotidiennement. Un suivi de l’ensemble des animaux sera effectué quotidiennement. Le poids des souris sera vérifié deux fois par semaine après une chirurgie. Le cahier opératoire sera rempli le jour de l’intervention pour renseigner le temps per-opératoire et post opératoire immédiat, à J1-J2 et J8 post chirurgie. Il servira à notifier les éléments de surveillance, ainsi que les administrations d’antalgique. Une grille de surveillance sera remplie tous les jours les premières 48 heures puis tous les deux jours après une chirurgie, et utilisée pour la surveillance de la douleur et la détections de points limites. La grille sera cotée de 0 (aucune souffrance) à 15 (Souffrance maximale) et guidera l’administration d’antalgique et le rythme de surveillance des animaux. Les critères de surveillance seront : l’apparence de l’animal, le comportement naturel, la perte de poids, le comportement provoqué, le site de la chirurgie. Ce suivi permettra de vérifier l’état général des animauxet de détecter un état de stress ou de douleur nécessitant un traitement, ou la mise en place d’une procédure d’euthanasie. Un protocole d’antalgie adapté sera mis au point, pour traiter ou prévenir une douleur induite par une procédure. L’animal bénéficiera avant tout geste chirurgical d’une association d’antalgique par opiacés et d’anti-inflammatoire. Le protocole d’antalgie sera adapté à la grille de surveillance. L’indication d’antalgiques, le rythme de surveillance, et l’identification des points limites conduisant à l’euthanasie de l’animal seront définis en fonction du score.Une anesthésie sera réalisée pour tout geste susceptible d’entrainer une souffrance physique ou morale de l’animal. Les animaux isolés seront surveillés spécifiquement et auront accès à un enrichissement supplémentaire.
Choix des espèces
Notre objectif est d'identifier les mécanismes du remodelage veino-lymphatique et de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués. Le modèle animal est donc indispensable à notre recherche. Concernant l’espèce, les modèles de chirurgie et de manipulation du réseau lymphatique ont été préalablement développées chez la souris avec de bons résultats. L’expérience de notre équipe et les données existantes dans la littérature sont majoritairement basées sur la souris. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal adulte après développement du réseau lymphatique chez la souris c’est-à-dire après 8 semaines post-natal. Les injections intracrâniennes et la mesure de pression intracrânienne devront être effectuées sur des animaux jeunes adultes (âgés de 2 mois à un an), un âge auquel la boite crânienne est mature et stable, autorisant une chirurgie stéréotaxique précise.
Etablissement de modèles orthotopiques et métastatiques de sarcomes. Efficacité et synergie de thérapies ciblées et de chimiothérapies standards dans ces modèles.
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffées de cellules humaines de sarcome dans un muscle ou dans une veine, des souris immunodéficientes développent une tumeur retirée par chirurgie quand elle atteint 1 000 millimètres cubes, afin de prolonger leur survie le temps de suivre l'apparition des métastases. L'opération peut entraîner une perte de poids et de mobilité pendant une semaine environ, et les métastases pulmonaires peuvent gêner la respiration. Les souris reçoivent des traitements par gavage ou par injection, et certaines subissent cinq irradiations par semaine pendant quatre semaines sur leurs métastases. Au total, 2 184 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à la fin des traitements ou à l'atteinte d'un point limite, et leurs organes métastasés sont prélevés.
Objectifs
Les sarcomes des tissus mous sont des tumeurs rares très complexes et hétérogènes (plus de 70 sous-types différents) qui touchent environ 4000 personnes par an en France. Malgré une chirurgie bien conduite suivie de traitements par chimiothérapies ou radiothérapies, plus de 40 pourcent des patients développent des métastases. A ce stade métastatique, peu de médicaments sont efficaces et les progrès depuis les 20 dernières années sont faibles avec une médiane de survie globale qui est passée de 12 à 18 mois seulement. Il existe donc dans cette pathologie un réel besoin de nouvelles thérapies permettant de cibler les processus metastatiques afin d’améliorer significativement les chances de survie des patients. Notre équipe est localisée dans un centre de référence dans le traitement de ce cancer rare, ce qui nous offre la possibilité d'obtenir des tumeurs de patients et ainsi de pouvoir développer des lignées cellulaires et des modèles de souris xénogreffées avec ces tumeurs. A partir de ces modèles, nous avons mis en place une plateforme préclinique qui nous permet d’étudier les effets biologiques et pharmacologiques de nouveaux médicaments en développement. Ces nouveaux composés sont dans un 1er temps testés in vitro sur des cellules en culture et dans la mesure où ils sont concluants, ils sont testés sur des souris de laboratoire préalablement implantées avec des tumeurs de patients quand cela est possible ou des cellules cancéreuses. Cependant, ces modèles sont limités par le fait qu’ils ne font pas de métastases dans la souris du fait de l’injection des cellules en sous-cutanée. Nous souhaiterions développer de nouveaux modèles afin d’optimiser l’apparition de métastases, soit en injectant les cellules directement dans la circulation sanguine, soit en les injectant dans leur organe d’origine pour bénéficier d’un microenvironnement propice. Une fois ces modèles établis, nous testerons l’efficacité de nouvelles molécules permettant d’inhiber ces processus métastatiques.
Bénéfices attendus
Les modèles de sarcomes des tissus mous métastatiques sont quasiment inexistants, or plus de 40% des patients développent des métastases. Il est donc primordial de trouver de nouveaux médicaments ciblant ces processus. Ce projet permettra d’avoir des modèles plus proches de la réalité du patient et de reproduire les processus métastatiques afin de trouver de nouvelles molécules les inhibant. Ces expérimentations s'inscrivent donc dans un projet de recherche translationnelle qui vise à élargir l'éventail thérapeutique dans le traitement des sarcomes des tissus mous.
Procédures
- greffes de cellules humaines en intramusculaire ou intraveineuse (une fois, durée 2min par souris) - Exerese de la tumeur primaire (une fois, durée 5min par souris) - Traitements medicamenteux par gavages / injections intrapéritonéales ou intraveineuses (durée et nombre de fois différents en fonction du traitement > une demande spécifique à chaque traitement sera soumise à la structure en charge du bien-etre animal) - Irradiations des metastases (radiothérapie) (durée 4 semaines à raison de 5 irradiations par semaine)
Impact sur les animaux
La procédure de xenogreffes en intramusculaire pourra provoquer un inconfort léger et diminuer la mobilité des souris. Lorsque que la tumeur primaire atteint une taille de 1000mm3, la souris sera opérée afin d’enlever la tumeur primaire et ainsi prolonger sa survie tout en permettant un suivi plus long de l’apparition des métastases. Cette chirurgie pourra provoquer une perte de poids ainsi qu'une perte de mobilité pendant 1 semaine environ. Dans le cas de métastases pulmonaires, des problèmes respiratoires peuvent survenir. En ce qui concerne l'administration des traitements, les gestes sont réalisés par du personnels expérimentés maitrisant ces injections. Ces gestes sont donc réalisés rapidement et n’entrainent que peu de stress chez l’animal. Cependant, pour les injections intraveineuses, des œdèmes éventuels et nécroses à la queue sont possible ; pour les gavages: cas de fausse route possible ; pour les injections intrapéritonéales: peu de stress
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des traitements, quand les tumeurs primaires atteignent 1000mm3 ou lorsqu’un point limite est atteint. Les souris sont euthanasiées puis leurs organes métastasés sont prélevés pour analyses.
Remplacement
Ces expérimentations s'inscrivent dans un projet de recherche translationnelle qui vise à élargir l'éventail thérapeutique dans le traitement des sarcomes des tissus mous. Nous avons étudié les effets biologiques et pharmacologiques de nombreuses nouvelles molécules en développement sur des lignées de sarcomes in vitro. Nous souhaitons dorénavant étendre ces études à un modèle plus complet qu’est le petit animal. En effet, l’oncogenèse et plus particulièrement l’apparition de métastases sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel avant de pouvoir réaliser les essais chez l'homme.
Réduction
Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. La croissance tumorale des cellules greffées sera suivie tout au long des expériences ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés, le but étant d'obtenir des données significatives d'efficacité du médicament. Nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Toutes les expérimentations sont réalisées par du personnel qualifié. Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, utilisation de tapis chauffant et d'ocrygel, mesure hebdomadaire du poids des souris et du volume tumoral, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).
Choix des espèces
Le but du projet étant de valider l’efficacité de nouvelles thérapies ciblées afin d'utiliser ces médicaments en clinique chez l'homme, il faut nécessairement un modèle de mammifères pour extrapoler les résultats. Nous avons donc choisi de réaliser nos expériences sur des souris immunodéficientes. Ce sont des modèles très immunodéprimés (ne possédant que très peu de système immunitaire) particulièrement adaptés à l'implantation de cellules tumorales. Animaux âgés de 8-12 semaines (jeunes adultes) pour qu’ils puissent supporter la greffe et le développement de la tumeur.
Rôle de CD44 sur les fonctions des lymphocytes T au cours de la stéatohépatite non alcoolique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont soumises à un régime déficient en méthionine et choline qui déclenche une maladie chronique du foie, avec prises de sang et injection intra-péritonéale, la perte de poids servant de point limite. Le porteur indique surveiller le dos voûté et le poil négligé, et affirme utiliser un nombre "minimum mais nécessaire" d'animaux. Il conclut qu'"aucune autre espèce ne peut être utilisée" car les études in vitro ne reproduisent pas les interactions entre organes.
Objectifs
Les maladies chroniques du foie représentent la principale cause de développement du cancer du foie et sont associées au syndrome métabolique (surpoids, diabète, obésité, hypertension…). Le spectre de ces complications hépatiques va d’une stéatose simple (foie gras), à la stéatohépatite, puis à la fibrose, voire la cirrhose et au cancer. Malgré l'importance clinique de ces pathologies, aucun traitement pharmacologique efficace n’est actuellement disponible. La mise en place d’une inflammation hépatique chronique à bas bruit joue un rôle crucial dans le développement des maladies dans cet organe. Les cellules immunitaires sont impliquées dans les processus inflammatoires suite à un stress microbien, métabolique et aux signaux de danger. Ces cellules sont retrouvées, entre autres, dans le tissu adipeux et l’intestin. Ces organes participent au développement et à l'évolution des complications hépatiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine exprimée à la surface des cellules immunitaires et qui régule leur fonctions, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation. Chez les patients atteints d’une maladie chronique du foie, l’expression hépatique de CD44 est augmentée en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux dont le gène CD44 est non-fonctionnel, dans les cellules immunitaires, et soumis à un régime favorisant l’apparition de ces complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle dans ces maladies. Ces études seront réalisées dans le souci d'utiliser un nombre raisonnable d'animaux sans compromettre les objectifs du projet et tenant compte des exigences de remplacement, réduction et raffinement. Ce projet utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. De plus, leur bien-être sera scrupuleusement pris en compte en termes de conditions d’élevage (température, hygrométrie), d’hébergement (présence de tige en coton et d'igloo dans les cages), et de soins afin de réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, d’une part, la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou CD8, dans un contexte de complications hépatiques. D’autre part, de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie. De plus, l’invalidation spécifique de CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8 pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour ces maladies qui actuellement de disposent pas de traitements pharmacologies.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum pouvant durer jusqu'à 1min (en fin de régime et en fin de procédure). Une injection intra-péritonéale sera également effectuée en fin de régime. Cette injection durera quelques secondes.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Au cours de ce projet, le principal effet indésirable est la perte de poids chez l’animal. Les animaux seront donc surveillés trois fois par semaine. Si des signes de souffrances (dos voûté, poil non-entretenu, indifférence du milieu extérieur…) s’ajoutent à la perte de poids, l’animal sera sacrifié pour limiter toute souffrance inutile.
Devenir
A la fin de cette procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever leur organes. Ces organes sont ensuite utilisés afin de réaliser des analyses de biologie moléculaire et cellulaire indispensables pour notre étude.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel, ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites afin de confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour cette unique procédure, les souris seront mises sous régime déficient en méthionine et choline à partir de 20 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 30g. Les régimes déficients en méthionine et choline (MCDD) induisent un développement rapide des complications hépatiques. Cependant cette déficience en méthionine et choline induit une perte de poids qui nécessite l’utilisation de souris plus âgées (donc avec un poids plus élevé).
Développement d’un modèle souris d’infection au virus du Nil occidental (West Nile virus)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus du Nil occidental via une injection dans le coussinet plantaire, puis reçoivent chaque jour des candidats médicaments avant prélèvement d'organes. Le porteur indique que l'infection provoque un affaiblissement des membres postérieurs, une posture voûtée et une perte de poids, et qu'environ 30 % des souris meurent en dix à douze jours. Il présente le projet comme une prestation de service destinée à "répondre aux attentes de différents clients" et revendique un modèle "indispensable" faute d'alternative in vitro.
Objectifs
L'infection par le virus du Nil occidental (VNO) est une zoonose transmise par les moustiques qui est endémo-épidémique en Europe. Le virus se transmet entre les oiseaux par la piqûre de moustiques infectés et, accessoirement, les humains et d'autres mammifères peuvent être infectés. Environ 80 % des infections au VNO chez les humains sont asymptomatiques. La fièvre du Nil occidental (WNF) est la présentation clinique la plus courante. Les personnes âgées et immunodéprimées sont plus à risque de développer la maladie neuroinvasive du Nil occidental (WNND). Actuellement, les vaccins homologués ne sont pas encore prêts pour un usage humain, et le traitement est pour la plupart non spécifique et de soutien. Le développement d'un modèle de souris pour tester l'efficacité de médicaments anti-viraux ou vaccins permettra de contribuer à acquérir des données précliniques indispensables au développement de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
L'utilisation d'un modèle de souris pour étudier la physiopathologie de l'infection humaine par le virus du Nil occidental (VNO) peut contribuer à acquérir des connaissances concernant la cinétique de la réponse immunitaire et des voies spécifiques responsables du contrôle de l'infection par le VNO et de la clairance virale. Ce modèle préclinique in vivo permettra de tester l'efficacité de nouveaux candidats médicaments anti-viraux. Le développement de ce nouveau modèle pré-clinique permettra de répondre aux attentes de différents clients et contribuera au développement de thérapies anti-infectieuses innovantes. La demande d'un modèle préclinique prédictif est forte tant dans les domaines de recherche académique que dans les sociétés pharmaceutiques qui développent les molécules anti-infectieuses de demain, mais se heurte à une offre limitée.
Procédures
Ce projet a été écrit afin de réaliser de la prestation de service. Il nous est donc difficile à ce jour de définir le nombre d’intervention et leur durée mais le nombre de prélèvements est limité. Pour chaque injection (sous-cutanée, intrapéritonéale, intraveineuse) la durée maximale est de 1min, cela comprend le temps de la contention et de l'injection. Pour les prises de sang, l'animal est anesthésié dans la boite à induction pendant 2 à 3 min, puis la prise de sang est réalisée. L’animal est ensuite remis dans sa cage et surveillé. L’ensemble dure maximum 5 min. Pour des procédures dites « classiques », les souris anesthésiées seront infectées par le virus par injection dans le coussinet plantaire d'une patte arrière et l’administration de candidats médicaments sera réalisée tous les jours pendant maximum 12 jours avant prélèvement d’organes
Impact sur les animaux
Chez la souris, l'infection au WNV induit les signes cliniques habituels d'une maladie infectieuse : affaiblissement des membres postérieurs, posture voûtée, poil rugueux ou non soigné, activité réduite, respiration difficile, perte de poids et la mort dans 30% des cas. La cinétique de l'infection et des signes cliniques doit être établie pour chaque souche de virus car celle-ci varie considérablement d'un virus à un autre. 30% des souris infectées succombent à l'infection dans les 10–12 jours après l'infection, selon la dose d'inoculum.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour réaliser les différents prélèvements. Il n’y a pas de possibilité de remplacement, vu le contexte hautement pathogène
Remplacement
Le recours à l’animal de laboratoire se justifie dans le sens où l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses. Les souris sont généralement sensibles à l'infection par le VNO, et constituent le modèle de choix pour l'investigation de cette pathologie. Faciles à travailler, les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie
Réduction
Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet. Le nombre estimé est 200 animaux / an. Le nombre d'étude variera en fonction de la demande client. En fonction de la diversité et du nombre des paramètres biologiques à analyser entre 8 et 15 souris seront nécessaires par groupe. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 40, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de molécules à tester, doses différentes de la molécule testée).
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées dans des cages à 22 ± 2 °C et 50 ± 10% d’hygrométrie, en portoirs ventilés ou isolateurs, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé chaque semaine. Des sacs dégradables contenant la litière sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid et une bûchette en bois, comme enrichissement du milieu. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un suivi attentif du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par la structure en charge du bien-être animal. Afin de palier l'inconfort occasionné par l'injection dans le coussinet plantaire, des croquettes imbibées d'eau seront placées dans la cage afin de favoriser la prise alimentaire Pour le confort de l'animal, la prévention du stress est intégrée aux procédures expérimentales par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse (isoflurane) pendant tous les gestes douloureux, lors des différentes injections des traitements potentiels (injection intraveineuse, injection intra-musculaire...). Tout animal présentant des signes de douleur, souffrance ou stress sera mise à mort. Les critères d’arrêt utilisés sont: - Le suivi quotidien du poids - La combinaison de plusieurs des signes cliniques : posture courbée, piloérection, difficulté respiratoire, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus. Une grille de scoring (en annexe) permettra le suivi quotidien et une intervention précoce en cas de signes dus à la pathologie.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses. Les souris sont généralement sensibles à l'infection par le VNO, et constituent le modèle de choix pour l'investigation de cette pathologie. Les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie Une infection systémique par le VNO est pratiquée chez de jeunes souris adultes (âgées de 6 à 10 semaines)
Caractérisation d’un modèle de souris pour l’hyperthermie d’effort
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie étant menée sous anesthésie sans réveil. Elles sont soumises à un exercice forcé sur tapis, à un test de sensibilité à la chaleur ou à l'anesthésique, avec mesures de température rectale sur animal vigile, pour déclencher des crises d'hyperthermie d'effort. Le porteur indique que ces crises provoquent des mouvements spasmodiques et des difficultés respiratoires, et que des stimulations sont appliquées pour maintenir la course, les animaux étant tués rapidement une fois la crise déclenchée. Il affirme que les causes de cette pathologie "ne peuvent être étudiées qu'in vivo" et vise un dépistage génétique chez les sportifs et les militaires.
Objectifs
Le coup de chaleur d’exercice ou hyperthermie d’effort est une maladie mortelle qui survient chez des sujets jeunes au cours d’une activité physique prolongée et intense. Il se caractérise par une élévation de la température corporelle (supérieure à 43 degrés celsius), un état neurologique allant de la confusion au coma, une contracture musculaire généralisée. Le décès des patients intervient si aucune prise en charge n'est réalisée en raison d’une défaillance multi-viscérale à la suite d'un emballement métabolique. Les patients sont cependant indemnes de tout symptôme en dehors de la crise. L’incidence des crises d’hyperthermie d'effort a longtemps été difficile à estimer, les populations à risque étant très spécifiques (militaires en situation de marche commando ou sportifs), bien que leurs conséquences puissent être fatales. L'augmentation des épreuves sportives de haute intensité pour des amateurs (marathons, ultra-trails…) a conduit à une augmentation des survenues de crises (jusqu’à 1 sur 1000 coureurs de marathon). La physiopathologie de l'hyperthermie d'effort est à ce jour très mal connue. Un projet de recherche antérieur a été réalisé sur les prédispositions génétiques à l’hyperthemie d'effort en étudiant une cohorte de soldats ayant fait un épisode d’hyperthermie d'effort lors d’exercices de marche commando. A l’issue d’une analyse génétique de 15 patients, quatre mutations ont été trouvées sur un même gène, chez quatre patients non apparentés, faisant ainsi de ce gène une cause génétique majeure de cette pathologie. Le but de ce projet est l’étude d’un modèle de souris portant une des mutations retrouvées chez les patients afin de valider l’implication de mutations de ce gène dans l’hyperthermie d'effort. Ce modèle de souris permettra également l’étude des mécanismes physiopathologiques de la maladie. Au final ce modèle permettra une meilleure détection et prise en charge des patients susceptibles d’être sujets à une crise d’hyperthemie d'effort.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de valider l’implication d’un nouveau gène dans l’hyperthermie d’effort et ainsi permettra d’avoir un moyen diagnostic par criblage génétique chez les athlètes, les militaires et de manière générale les populations d’actifs afin d’identifier les personnes ayant une prédisposition à développer des crises d’hyperthermie d'effort. Ce dépistage en amont permettrait d'éviter la survenue d'accident létal au cours d'un exercice intense. Enfin il permettra d’identifier les mécanismes physiopathologiques de cette maladie, ce qui ouvrira à plus long terme sur le développement d'approches thérapeutiques ou préventives.
Procédures
Les souris sont exposées à une seule des interventions suivantes : un exercice physique (durée 1 heure maximum), un test de sensibilité à l’anesthésique (durée une heure maximum), un test de sensibilité à la chaleur (durée 30 minutes maximum). Tous les animaux auront une à deux mesures de température rectale (durée de moins de 30 secondes).
Impact sur les animaux
Des nuisances apparaissent lorsque les souris sont soumises à un exercice physique intense et prolongé, à une anesthésie, ou à une exposition prolongée à une température élevée, produisant l'apparition de crises d'hyperthermie. Ces nuisances sont de l'ordre du stress et de l'inconfort pendant la crise se manifestant par des mouvements altérés et spasmodiques et des difficultés respiratoires. Des nuisances telles de l'inconfort seront également présentes durant l’expérimentation car les souris seront soumises à des stimulations pour maintenir leur course sur le tapis. Un troisième inconfort est présent lors de la prise de température rectales sur les souris vigiles.
Devenir
Pour limiter la souffrance animale, les animaux seront mis à mort rapidement à l’issue du déclenchement de la crise d’hyperthermie. Par ailleurs, tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de préléver les tissus pour les analyses moléculaires et la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Il sera en effet nécessaire de préléver les tissus des animaux controles également afin de servir de controle pour les études moléculaires et d'identifier des marqueurs qui sont modifiés chez les animaux modèles mais pas chez les animaux controles.
Remplacement
L’objectif de ce projet est l’étude d’un modèle souris portant une des mutations retrouvées chez les patients ayant fait une crise d'hyperthermie d'effort. Cette mutation a été choisie sur les bases de données de la littérature, ainsi que d’analyses fonctionnelles sur système in-vitro (cellules) permettant de suggérer sa pathogénicité. Cependant les causes et conséquences physiologiques des crises d'hyperthemie d'effort ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupes et le nombre de répétitions des expériences sont réduites au maximum tout en optimisant l'interprétation statistique des résultats. Pour réduire le nombre d'animaux nécessaires, les études ne seront réalisées dans un première temps que sur des animaux porteurs d'une seule copie de la mutation, ce qui correspond exactement à la situation humaine, et sur un seul sexe. Si le phénotype n'est pas détectable, alors des animaux porteurs de deux copies du gène muté seront utilisés. Les femelles seront étudiées uniquement dans un second temps, en adaptant le nombre d'animaux selon les résultats obtenus sur les mâles.
Raffinement
Dans le but de réduire l’angoisse des animaux, des enrichissements seront placés dans les cages, ces dernières auront une taille adaptée au nombre d’animaux et seront régulièrement entretenues. Les animaux seront hébergés dans une pièce en conditions contrôlées. Les animaux seront manipulés de façon à limiter le stress. Les mesures de température effectuées par sonde rectale seront réalisées par des personnes compétentes afin de n’induire aucune douleur spécifique. Des point limites adaptés ont été mis en place afin de limiter la douleur éventuelle lié à notre projet.
Choix des espèces
Les techniques actuelles permettent facilement de reproduire les mutations à l’origine de maladie humaine sur un modèle murin. D’autre part, ce modèle est celui dont la physiologie se prête le mieux à l’exploration d’une pathologie déclenchée par l’exercice, en particulier par la proximité de ses structures musculaires et de son métabolisme avec l’humain. Les souris seront utilisées à partir de 2 mois en accord avec les études déjà réalisées dans la littérature sur des souris controles.
Caractérisation du pouvoir pathogène et infectieux des coronavirus aviaires et étude de la barrière d’espèces sur les oiseaux d’élevage
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
Dindes : 640
Autres oiseaux : 1280
2 560 oiseaux, 640 poulets, 640 dindes et 1 280 autres oiseaux, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont inoculés avec des coronavirus aviaires puis soumis à des écouvillonnages oraux, cloacaux et trachéaux répétés, à des prises de sang et à la récolte de liquide lacrymal jusqu'en fin d'expérimentation. Le porteur indique que l'infection peut provoquer diarrhées, prostration et amaigrissement, et précise que le recours aux antidouleurs "n'est pas envisageable" car il interférerait avec l'infection virale. Il présente ces données comme "indispensables" à une meilleure gestion sanitaire des élevages.
Objectifs
L'objectif global de ce projet est de mieux caractériser les différents coronavirus aviaires circulants au sein des espèces principales de volailles d'élevage. Plus précisément, il s'agira d'étudier i) le pouvoir pathogène et infectieux de souches isolées de coronavirus aviaires (virus de la bronchite infectieuse, coronavirus de la dinde, coronavirus de la pintade, coronavirus du canard) sur l’espèce à partir de laquelle le prélèvement d’origine a été obtenu, et ii) la capacité de franchissement de la barrière d’espèces de ces coronavirus aviaires sur diverses espèces d’oiseaux d’élevage.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont une caractérisation fine in vivo pour une meilleure compréhension du comportement des souches de coronavirus aviaires inoculées chez l’hôte cible et chez des hôtes voisins afin d’étudier la capacité de ces souches à infecter d’autres espèces aviaires et de pouvoir apporter des éléments indispensables à une meilleure gestion des mesures sanitaires et à un meilleur contrôle de la diffusion de ces agents dans les élevages.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Contention : sur tous les animaux, dès qu’une observation rapprochée des signes cliniques ou dès qu’un prélèvement s’avèrent nécessaires (environ 5 min par animal, dépendra du nombre de prélèvements à réaliser au moment de la contention) - Inoculation : sur tous les animaux, a lieu une seule fois en début d’expérimentation (1 min par animal) - Ecouvillonnages oraux et de l'orifice des voies génitales et urinaires : sur tous les animaux, quotidiens jusque 14 jours post-inoculation puis bi-hebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (2 min par animal) - Ecouvillonnages trachéaux : sur tous les animaux, fréquence bihebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (1 min par animal) - Récolte du liquide lacrymal : sur tous les animaux, fréquence bi-hebdomadaire jusque 14 jours post-inoculation puis hebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (2 min par animal) - Prises de sang : sur tous les animaux, fréquence bi-hebdomadaire jusque 14 jours post-inoculation puis hebdomadaire jusqu’en fin d’expérimentation (1 min par animal) - Mise à mort pour récolte d’organes : sur 3 sujets avec une fréquence hebdomadaire sur 5 semaines flexibles durant l’expérimentation, et sur les animaux restants en fin d’expérimentation
Impact sur les animaux
Les signes cliniques attendus varient selon les virus inoculés. Cela peut être des râles et des éternuements pour le virus de la bronchite infectieuse, et des diarrhées, de la prostration, une diminution de la motilité et/ou un amaigrissement pour le coronavirus de la dinde, le coronavirus de la pintade et le coronavirus du canard. Outres les signes cliniques attendus suite à l'inoculation du virus, d'autres nuisances pour l'animal sont attendues : irritation passagère des tissus oro-pharyngés, trachéaux, cloacaux et oculaires suite aux écouvillonnages et à la collecte du liquide lacrymal, stress passager lors de la contention, léger hématome suite aux prises de sang, potentielles blessures contre les grillages des parcs d'hébergement.
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux restants seront concernés par la mise à mort pour empêcher toute possibilité de répandre dans l'environnement les agents infectieux utilisés dans ces conditions expérimentales.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale n’a lieu que lorsque cela s’avère strictement nécessaire. Même si certains types cellulaires ou des systèmes in ovo existent pour la réplication des coronavirus aviaires, ces modèles ne sont pas applicables concernant la connaissance des maladies provoquées par ces virus chez l’animal et l’étude du tropisme d’hôte.
Réduction
La stratégie pour réduire au minimum le nombre d’animaux est basée sur deux éléments indissociables : l'expérience et les statistiques. Concernant l'expérience, le laboratoire peut s'appuyer sur son expertise dans le domaine en se basant sur de précédentes études utilisant le même type de données générées afin de travailler sur un effectif minimum d'animaux. Pour ce projet, compter par exemple sur 10 animaux en fin d’expérimentation devrait permettre d’avoir suffisamment de relevés du poids vif des animaux et de relevés du poids des organes récoltés post-mortem pour rendre les analyses robustes. Ces analyses se basent sur des tests statistiques où les analyses de variances (qui permettent de déterminer si tel ou tel paramètre étudié est statistiquement différent d'une condition expérimentale à une autre) qui seront réalisées nécessitent un effectif minimal pour permettre l'obtention de résultats fiables.
Raffinement
Le recours aux antidouleurs n’étant pas envisageable à cause de l’interférence générée avec l’infection virale, la stratégie appliquée pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse en cours d’expérimentation est la surveillance quotidienne des animaux, la définition de points limites conduisant à une mise à mort compassionnelle en cas d’atteinte, et la réalisation de prélèvements les moins invasifs possible et uniquement lorsque cela permet de répondre aux objectifs du projet. Pour limiter le stress des animaux, toutes les procédures sont faites individuellement sans que le reste des animaux puisse voir l’intervention.
Choix des espèces
Les espèces d’oiseau choisies sont soit l’espèce cible de l’agent viral étudié, soit une autre espèce qui pourrait être sensible à cet agent. Animaux de 1 jour à 30 semaines d’âge, selon la classe d’âge cible de l’agent viral utilisé.
Développement d’un modèle de défaillance hépatique et multiorganes chez la souris cirrhotique. Application à l’évaluation de molécules dans cette pathologie.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
3 180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles reçoivent pendant dix semaines des injections d'un composé toxique pour le foie, puis un empoisonnement à l'acétaminophène associé à une inflammation, pour développer un modèle de défaillance hépatique aiguë et y tester des médicaments. Le porteur indique s'attendre à des animaux "en état de choc et de détresse cardio-respiratoire", certains devant être mis à mort par anticipation. Il revendique de reproduire une gravité "sévère" tout en maintenant les animaux dans un état jugé acceptable, et affirme qu'aucune expérience in vitro ne peut remplacer cette évaluation.
Objectifs
Développer un modèle pertinent pour tester des médicaments destinés aux soins des patients lors de décompensation aigue de la cirrhose du foie, ce besoin clinique n’est pas satisfait aujourd’hui. Le malade chronique du foie (origine alcoolique ou non, virale ou médicamenteuse) peut sous l’effet d’un agent déclenchant décompenser, le fragile équilibre qui préservait une fonction à ses organes majeurs est rompu. Une cascade d'événements tels que septicémie, ou défaillance multiviscérale peut entrainer la mort. Un modèle expérimental qui imite l'évolution de la décompensation cirrhotique est crucial pour la découverte de traitements pour ces patients. L’installation et évolution de cette maladie sont lente chez l’homme, elles résultent d’une agression et d’un stress continu des cellules hépatiques, auquel vient subitement s’ajouter un événement aigu qui précite la décompensation. La modèle CALPS reproduit chez la souris rapidement cet enchainement d’évènement, il associe une agression lente du foie par un agent toxique pour le foie, puis un stress oxydatif puissant et une inflammation massive. • C : CCl4 : le tetrachlorure de carbone est toxique pour le foie son métabolisme produit des radicaux libres, oxydants et toxiques pour les cellules du foie. • A : l’Acétaminophène (Doliprane) peut produire s’il est ingéré massivement un stress oxydatif violent qui peut engendrer la mort par empoisonnement. • LPS : le LipoPolySaccharide un constituant de la paroi de bactéries déclenche la réaction inflammatoire défense contre l’infection. L’administration régulière prolongée du CCl4 pendant 10 semaines produit l’altération de la fonction hépatique. L’empoisonnement à l’acétaminophène associé à une inflammation massive déclenche la défaillance aigue, et une rupture progressive des fonctions des organes (foie, reins, atteinte cardio-respiratoire, troubles de l’hémostase, et troubles centraux) qui se manifeste par des augmentations de biomarqueurs spécifiques (enzyme hépatiques, cytokines, ionogrammes, paramètres hématologiques), cela pouvant entrainer la mort. Ce modèle expérimental permettra d’évaluer l’efficacité de nouveaux médicaments par les dosages des biomarqueurs. C’est le défi que nous nous fixons.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible. Aujourd’hui on va adresser les traitements qui vont agir sur la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent à agir simultanément sur les différentes voies qui sont à l’origine des défaillances multiples. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme)
Procédures
Au cours des procédures expérimentales décrites dans ce dossier, nous ne procéderons qu'à 3 gestes techniques différents : 1/ l'injection par voie intrapéritonéale. Elle sera pratiquée 2 fois par semaine pendant la première phase de 10 semaines d'induction de la fibrose. Les volumes injectés seront de 2mL/kg dans un véhicule gras (huile) , soit 20 injections IP 2/ l'administration de composé par voie orale à l'aide de sonde d'intubation orogastrique. Leur durée n'excèdera pas 14 jours à raison d'un gavage quotidien de 10ml/Kg à l'aide d'un véhicule aqueurx et physiologique, soit 14 gavages. 3/ ou à la place de l'administration orale : l'injection par voie intrapéritonéale. Elle sera pratiquée 1 fois par jour pendant la phase de 14 jours max d'évaluation des composé à tester . Les volumes injectés seront de 10mL/kg dans un véhicule aqueux. Soit 14 injection IP 4/ le prélèvement sanguin intermédiaire ou terminal. Dans les 2 cas ils seront pratiqués sous anesthésie générale à l'isoflurane. Cahque animal ne subira qu'un seul prélèvement sanguin intermédiaire d'un volume maximal de 150µL de sang total. Le prélèvement terminal sera lui plus abondant (vol max) , mais l'animal ne sera pas réveillé avant se mise à mort.
Impact sur les animaux
L’ACLF représente un évènement grave chez un patient, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez la souris présente lors de l’induction de l’ACLF des signes clini ques d’inconfort manifestes. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux atteindront des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
L'évaluation histologique des organes majeurs (foie, reins et poumons) et une investigation approfondie des biomarqueurs plasmatiques circulants imposent la mise à mort des animaux
Remplacement
Etant donné la complexité de l’évènement étudié qui produit le dysfonctionnement de plusieurs organes, il nous est impossible de remplacer cette expérimentation par des expériences in vitro. L’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste nécessaire. L’administration des composés dans le contexte d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et « global».
Réduction
Une première phase de sélection des meilleurs composés est effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires simples et complexes de type organoïdes, ce qui permet d’ajouter un filtre pour n’engager des études in vivo qu’avec les produits les plus pertinents et prometteurs.
Raffinement
L'ACLF qui par définition est chez l'homme une pathologie qui entraine le décès à 28 jours de 20 à 70% des patients hospitalisés. Le modèle d'étude expérimental est lui aussi sévère, la précipitation de la décompensation est subite, nous avons établi des grilles de scoring et une surveillance accrue des animaux de manière à ne pas conserver un animal qui aurait atteint les points d'arrêt anticipés.
Choix des espèces
Sur la base de la littérature scientifique, aucun modèle invertébré ne permet à ce jour dans le cadre de la cirrhose du foie de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de cette pathologie ou celles qui lui sont associées. Le génome des rongeurs et celui de l'homme ont 90% d’homologie, cela en fait un modèle de choix dans les études pharmacologiques. Le choix de l'espèce souris a été fait en se basant sur la littérature scientifique et sur nos connaissances des caractéristiques des molécules à tester. Les animaux seront des jeunes adultes matures qui seront immunocompétents
Génération d’hybridomes pour des applications de recherche, de détection et de diagnostic.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 276 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes et des prélèvements sanguins, et une partie subit l'injection de cellules d'hybridome déclenchant la formation d'un liquide abdominal, pour produire des anticorps monoclonaux destinés à des tests de diagnostic. Le porteur indique que l'accumulation de ce liquide provoque une douleur abdominale durant cinq à six jours. Il affirme que l'immunisation des souris reste "indispensable" à court terme, les méthodes in vitro ne produisant pas de réponses immunitaires suffisantes.
Objectifs
Le projet vise à la génération et à la production d’anticorps monoclonaux de souris dirigés contre différentes cibles antigéniques dans le cadre de multiples programmes de recherche. Ces anticorps reconnaissent très spécifiquement des antigènes, marqueurs d’agents étrangers à un organisme. La finalité de la majorité des anticorps générés dans ce projet est le développement de tests de détection et de diagnostic de microorganismes pathogènes ou de toxines reliés à des problématiques de maladies infectieuses émergentes ou ré émergentes (ex : Ebola, ZIKA, SARS-CoV2, Variole du singe, etc…) et d’intérêt dans le domaine de la maitrise et la détection des risques biologiques. Les tests développés sont pour l’essentiel des tests rapides antigéniques » (ex : test antigénique COVID19) qui utilisent les anticorps monoclonaux pour permettre la détection spécifique des agents pathogènes (ex : bactéries, virus ou toxines. Les anticorps monoclonaux sont utilisés depuis plusieurs décennies dans ce type d’application, néanmoins de nouveaux tests rapides de diagnostic et de détection doivent régulièrement être mis au point pour suivre les émergences des maladies infectieuses, de différentes pathologies, pour la bio sécurité et la bio sureté. Le développement de nouveaux tests antigéniques nécessite donc la génération de nouvelles lignées cellulaires sécrétrices d’anticorps monoclonaux spécifiques pour répondre à ces besoins importants pour la santé publique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont la génération de nouveaux anticorps monoclonaux, permettant la mise au point de tests de diagnostic ou de détection de maladies infectieuses émergentes ou ré-émergentes. Dans les exemples récents nous pouvons notamment citer les tests rapides antigéniques rapides et autotests pour la COVID19. L’obtention d’anticorps monoclonaux permet également de développer des tests de diagnostic de différentes pathologies et aussi pour la détection environnementale d’agents biologiques (bactéries, virus et toxines) dans le cadre de la lutte contre les menaces biologiques. Ce projet participe à la lutte contre ces menaces au sens large et permet de générer des anticorps monoclonaux sur le territoire national pour garantir la souveraineté et la sécurité des approvisionnements dont nous avons pu mesurer l’importance lors de la pandémie de COVID19. Cela permettra la mise au point, la validation et la fourniture de moyens diagnostiques appropriés, performants et répondant aux préconisations des Autorités de santé.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 ou 4 injections (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) d’antigènes avec une seringue pour les immuniser à la fréquence d’une injection par mois. Les animaux seront soumis à 3 ou 4 prises de sang (durée de l’intervention environ 30 à 40 secondes) à la fréquence maximale d’un prélèvement par mois. Certains animaux seront soumis à une injection d’une substance immunostimulante et de cellules hybridomes (durée totale de chaque injection d’environ 10 secondes) déclenchant la formation d’un liquide abdominal dont le prélèvement est réalisé après euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Douleur au point d’injection induite par l’injection de substances non pathogènes destinées à immuniser les animaux contre un antigène. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée, est de l’ordre de quelques heures. Douleur abdominale induite par l’injection d’une substance immunostimulante. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée, est de l’ordre de quelques heures. Douleur induite par l’accumulation d’un liquide abdominal. La durée de l’effet, compensé par une analgésie adaptée, est de 5 à 6 jours.
Devenir
Tous les animaux inclus dans une procédure sont euthanasiés en accord avec les protocoles scientifiques publiés pour la génération et la production d’hybridomes et d’anticorps monoclonaux de souris.
Remplacement
Le développement d’hybridomes à des fins diagnostiques ou de détection nécessite l’immunisation d’animaux afin d’obtenir les lymphocytes immuno-stimulés par l’antigène. Le niveau d’immunisation recherché correspond à un état d’hyper immunisation. Les méthodes d’immunisation in vitro avec des lymphocytes naïfs ne permettent pas aujourd’hui d’obtenir des réponses immunitaires suffisantes. Les autres technologies basées sur l’utilisation, notamment, de phages ne permettent pas la génération de réactifs de qualité suffisante pour permettre la mise au point de tests diagnostiques répondant aux spécifications attendues par les autorités de santé. Dans une vision moyen terme, le laboratoire souhaite débuter des études visant à mettre au point des organoïdes en culture permettant la maturation de lymphocytes, avec l’objectif dans plusieurs années, de pouvoir obtenir des réponses immunitaires in vitro de haute affinité. Dans l’immédiat l’immunisation des souris reste indispensable. Le criblage et la caractérisation des anticorps produits par l'ensemble des hybridomes générés ne peut se faire en parallèle qu'avec une méthode de production identique pour chaque anticorps. Il est impossible dans le cadre de ce criblage d'optimiser les conditions de culture cellualire et l’adaptation à un milieu de culture spécifique pour permettre une production in vitro de ces hybridomes. Nous avons besoin à ce niveau d’une garantie de résultats. En dehors de ces circonstances, des méthodes de production in vitro en bioréacteur sont réalisées pour les productions massiques d’anticorps.
Réduction
Les études statistiques ne sont pas adaptables à ce type de projet. Les résultats sont évalués par rapport au nombre d’hybridomes attendus et au nombre d’anticorps estimés à produire. Cette estimation tient compte de notre expérience passée dans ce type de projet et du constat que dans le projet précédent, nous avons utilisé moins de 30% de ce que nous avions estimé à priori. Quoi qu’il en soit, tous les efforts seront faits pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, notamment pour le degré sévère.
Raffinement
Les prise de sang seront réalisées après anesthésie des animaux. Les animaux seront hébergés à 4 par cage avec cycle diurne-nocturne de 12 heures. L’eau et la nourriture seront fournies à volonté. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel sous la supervision permanente du responsable du bien-être animal. L’hébergement animal est organisé en accord avec l’annexe III de la directive 2010/63/EU. Si un des points limites établis est proche d’être atteint, l’animal pourra être euthanasié afin de lui éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Les souris sont un choix obligatoire car les cellules de myélome (lignée cellulaire établie et approvisionnée auprès de collections internationales de cellules) employées pour fusionner les lymphocytes sont des cellules de souris. Différentes souches de souris pourront être utilisées en fonction des antigènes injectés car elles peuvent avoir un répertoire immunologique différent qui peut modifier le niveau de réponse immunitaire. Ces choix seront faits selon les données bibliographiques et l’expérience passée du laboratoire. Toutes les souris que nous utiliserons seront de jeunes adultes (6 à 8 semaines). A cet âge, les animaux ont la maturité immunologique nécessaire pour obtenir de bonnes réponses immunitaires. Jeunes adultes (6 à 8 semaines). Les animaux adultes ont la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses immunitaires.
Etude de viabilité du juvénile de mulet Liza ramada exposé à différentes concentrations de Vulcanodinium rugosum
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
300 juvéniles de mulet vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les poissons sont exposés pendant trois jours à des microalgues toxiques dont les toxines peuvent provoquer paralysie, arrêt respiratoire et mort, pour mesurer l'effet de ces toxines sur leur survie. Le porteur indique que les individus survivants sont ensuite euthanasiés pour éviter toute dissémination de microalgues dans les lagunes. Il juge le mulet "impossible à remplacer" par un modèle mathématique, aucune étude n'ayant encore porté sur la viabilité de poissons exposés à cette microalgue.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la problématique globale des efflorescences phytoplanctoniques impliquant des dinoflagellés toxiques, dont les enjeux s’étendent à l’ensemble circumméditerranéen : la France, l’Espagne et l’Italie sont directement concernées en Europe de l’Ouest. La façade Méditerranéenne française connait des développements importants des microalgues toxiques avec des épisodes d’intoxications des produits de la mer entrainant de fortes répercussions économiques, écologiques et sanitaires. Ces efflorescences correspondent à des phénomènes sporadiques connus sous le nom de HAB (Harmful Algal Blooms). Dans le cadre du dispositif de surveillance des mollusques (renommé REPHYTOX), la présence de pinnatoxines G (PnTX G) a été mise en évidence dès 2009 dans les échantillons de moules dans la lagune d'Ingril. Le dinoflagellé producteur, V.rugosum a été formellement identifié qu’en 2011 et son aire d'expansion à d'autres lagunes du Languedoc Roussillon fut confirmée. V.rugosum est une espèce thermophile productrice de pinnatoxines (PNTX, appartenant au groupe de Fast Acting Toxins) et de portimine, une toxine lipophile. Les PNTX, antagonistes des récepteurs de l'acéthylcholine, entraînent des symptômes neuromusculaires après l'ingestion chez la souris (perte de l'activité motrice, dépression respiratoire, arrêt respiratoire). Des études ont montré l'accumulation des toxines produites par V.rugosum dans les mollusques bivalves ainsi que chez les copépodes, chez lesquels elles provoquent une diminution de la viabilité in vitro. Aucune étude n'a pour l'heure été faite concernant l'accumulation de ces toxines chez les poissons ou un effet sur leur viabilité. D'un point de vue écologique, il est indispensable de comprendre l'impact de ces toxines sur les maillons supérieurs trophiques (poissons planctophages) afin d'évaluer les conséquences de ces toxines sur les écosystèmes lagunaires. Par ailleurs, l'accumulation des toxines chez ces poissons pourrait avoir des conséquences sanitaires, et la potentielle diminution des populations pourrait engendrer des répercussions économiques sur les stocks de pêches. Le mulet est une espèce phytoplanctophage et zooplanctophage répandue dans les lagunes méditerranéennes et dont les larves et juvéniles pourraient être impactées par les efflorescences de V.rugosum.
Bénéfices attendus
Aucune étude n'a pour l'heure été faite concernant l'accumulation de ces toxines chez les poissons ou un effet sur leur viabilité. D'un point de vue écologique, il est indispensable de comprendre l'impact de ces toxines sur les maillons supérieurs trophiques (poissons planctophages) afin d'évaluer les conséquences de ces toxines sur les écosystèmes lagunaires. Par ailleurs, l'accumulation des toxines chez ces poissons pourraient avoir des conséquences sanitaires, et la potentielle diminution des populations pourraient engendrer des répercussions économiques sur les stocks de pêches. Le mulet est une espèce phytoplanctophage et zooplanctophage répandue dans les lagunes méditerranéennes et dont les larves et juvéniles pourraient être impactées par les efflorescences de V.rugosum.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intoxication par des microalgues toxiques pendant une période de 3 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent souffrir lors de la période d'acclimatation du fait du temps d'adaptation au nouvel environnement, ainsi que lors des transferts (bien que ces derniers se fasse à l'épuisette). Lors de la phase d'intoxication, les toxines peuvent provoquer une souffrance chez les animaux du fait de leur action neuromusculaire : les symptômes attendus sont une paralysie, un arrêt respiratoire et le décès.
Devenir
A l'issue de l'étude, tous les individus seront euthanasiés afin d'empêcher une potentielle dissémination de microalgues toxiques ou non présentes dans les lagunes méditerranéennes.
Remplacement
Il est impossible de remplacer le mulet par d'autres modèles. En effet, l'intérêt du projet est d'étudier l'impact des toxines sur un organisme à la fois phytoplanctophage (pouvant donc se nourrir de V.rugosum) et zooplanctophage (pouvant donc être impacté par l'effet des toxines sur le zooplancton). Ce modèle présente également l'intérêt d'être abondant dans les lagunes méditerranéennes, notamment dans la période prévue pour l'expérimentation. Enfin le mulet est une espèce robuste qui s'acclimate en général bien au milieu en laboratoire. Aucune étude n'ayant par ailleurs été déjà été effectuée sur la viabilité de poissons soumis à V.rugosum, il n'aurait pas été envisageable de remplacer notre modèle par un modèle mathématique ou bio-informatique.
Réduction
Le nombre d'individus sera n = 300 parmi lesquels 60 seront soumis à l'algue témoin S.accuminata, 60 seront soumis à une concentration de 20c/mL de V.rugosum, 60 à une concentration de 80c/mL de V.rugosum, et 60 à une concentration de 300c/mL de V.rugosum. Ce nombre est nécessaire pour étudier un impact de V.rugosum sur la viabilité des juvéniles de poissons et ce pour différentes concentrations en algue. Parmi les 60 poissons restants, 30 seront utilisés en amont pour faire une étude de l'alimentation, et les 30 derniers constituent une marge, étant supposée une mortalité d'une partie des poissons lors de l'acclimatation. L'expérience sera réalisée sur une durée de 3 jours, les toxines étant à action rapide. Afin d'évaluer l'impact de l'exposition sur la viabilité des poissons, une courbe de survie sera tracée et une analyse de Kaplan Meier sera réalisée. Par ailleurs, les concentrations en toxines dans les poissons en fonction des abondances en microalgues seront comparées à l'aide d'un test de Kruskal-Wallis. L'impact du temps sur la concentration en toxines dans les tissus sera analysé à l'aide d'une Anova suivi d'un test post hoc de Tuckey, si les conditions d'une Anova sont remplies. Dans le cas contraire, un test non paramétrique de Friedman suivi d'un test post hoc de Conover sera utilisé.
Raffinement
Les conditions expérimentales ont été pensées pour limiter au maximum le stress et la souffrance des animaux. Suite à la pêche, réalisée à l'épuisette soit une technique très douce, les poissons sont transférés dans les deux heures dans des aquariums pour une période de récupération et d'acclimatation de 3 semaines, à une densité maximale de 2,5 individus par litre d'eau ce qui permet d'exprimer le comportement naturel (activité natatoire tout en étant à proximité des congénères, les juvéniles de mulets se déplaçant en bans). Les aquariums sont oxygénés à l'aide de bulleurs et les individus sont nourris 1 fois par jour à l'aide d'un mélange de phytoplancton et de zooplancton ce qui correspond à leur alimentation naturelle. Les aquariums sont placés à l'abri de toute nuisance visuelle et sonore dans un laboratoire dédié et les poissons sont dérangés le moins possible (une fois toutes les deux heures pour vérifier s'il y a eu des morts et auquel cas les enlever). Les animaux sont nourris tous les jours et les nitrites et nitrates sont contrôlés tous les deux jours. Une attention particulière est portée au comportement et à l'état physique des poissons : durant l'acclimatation, lorsque des signes de souffrance importante sont notés (points limites : position verticale ou sur le côté, amorphie), les poissons sont retirés et euthanasiés. La densité suffisamment faible et la nourriture en quantité suffisante supprime le phénomène de canibalisme. Pour l'expérimentation, les individus sont divisés et transférés à l'épuisette dans des bacs conservant les mêmes paramètres à l'exception de l'alimentation, les animaux étant nourris avec les microalgues testées. L'utilisation de l'épuisette permet de limiter la douleur durant les transferts. La durée de l'expériementation, sur 3 jours seulement, permet de limiter la durée de la souffrance potentielle des animaux soumis aux toxines.
Choix des espèces
Le projet cible l'évaluation de la réponse des mulets aux toxines produites par V.Rugosum. Les animaux sont juvéniles. C'est en effet aux stades larvaires et juvéniles que les poissons sont les plus sensibles aux pressions environnantes, et qu'un effet des toxines a donc le plus de chance d'être observé. Les stades larvaires et post-larvaires présentent l'inconvénient de la difficulté d'identification de l'espèce ce qui justifie l'utilisation du stade juvénile.
Etudes pharmacocinétiques de composés ou de dispositifs médicaux libérant des principes actifs chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1800
2 250 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent des injections de principes actifs, l'implantation de matériaux sous anesthésie et des prélèvements sanguins, avant d'être mis à mort et autopsiés pour prélever leurs organes, pour déterminer la cinétique et la biodistribution de composés ou de dispositifs médicaux. Le porteur, une société de recherche contractuelle, indique adapter les points limites aux effets toxiques signalés par ses clients. Il affirme que le passage chez l'animal reste "indispensable" car les tests in vitro ne renseignent pas sur l'absorption, la distribution ou l'élimination des composés.
Objectifs
L'objectif du présent projet est d'évaluer la bio-distribution et de déterminer la cinétique ADMET (Absorption, Distribution, Métabolisme, Elimination, et Toxicité) de principes actifs administrés chez des rongeurs. Les principes actifs seront recherchés au niveau systémique, urinaire, fécal, et dans différents organes. Selon les composés évalués, la nature des prélèvements sera modulée. En parallèle, une analyse histopathologique pourra être réalisée sur certains organes afin de confronter les résultats de la bio-distribution et de l'observation des lésions histologiques sur les organes étudiés. Ces études permettront d'améliorer les schémas thérapeutiques d'administration des composés et de définir les métabolites à rechercher pour les études de toxicologie réglementaires ultérieures. Les traitements seront appliqués selon les schémas thérapeutiques spécifiques aux principes actifs étudiés. De même, un produit de référence pourra être utilisé et choisi pour correspondre au mieux aux principes actifs étudiés. Il sera appliqué selon le schéma thérapeutique spécifique au produit de référence choisi. La durée des protocoles variera en fonction des procédures et des principes actifs étudiés allant de 4 jours à 6 mois. Les animaux pourront être sacrifiés à différents points de cinétiques en cours de protocole, selon la nature des principes actifs étudiés. A chaque sacrifice, une analyse macroscopique des cadavres et des organes à prélever sera réalisée.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : -Court terme : chaque étude incluse dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la cinétique ADMET des composés étudiées. -Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet permettra d’améliorer la prévention, la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement de maladies, de mauvais états de santé, ou d'autres anomalies ou de leurs effets chez l'homme et/ou les animaux.
Procédures
Les injections des composés en parentérale sont réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés par un mélange isoflurane/air ou suite à la pose de cathéter. La durée des injections varie de 2 à 12 minutes par animal. Les fréquences d’administration dépendent des modes d'action des composés testés. Les différentes injections seront réalisées sur un maximum de 2 mois. Les implantations des matériaux sont réalisées sur animaux anesthésiés par un mélange isoflurane/air. L'implantation dure de 15 à 30 minutes par animal. Un protocole analgésique est également appliqué en péri-opératoire avec de la buprénorhine (Buprecare®). Quelque soit la méthode d’implantation, une seule implantation est réalisée à J0. Les prélèvements sanguins sont effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés par un mélange isoflurane/air. Les prélèvements sanguins durent 4 à 10 minutes par animal. Certains types de prélèvements nécessite un protocole analgésique (Buprénorphine (Buprecare®). Pour des prélèvements répétés chez les rats, une pose de cathéter connecté à un dispositif chronique de prélèvement peut être réalisé. Les prélèvements sont donc réalisés sur animal vigile directement au niveau du dispositif chronique de prélèvement. Les prélèvements seront réalisés au maximum sur 2 mois. Un volume sanguin de 0,135mL pour une souris de 25g et 1,2mL pour un rat de 250g est prélevé au maximum pour des prélèvements répétés. Une période minimum d’une semaine de récupération est nécessaire à l’animal avant de procéder à un nouveau prélèvement. Les volumes maximaux de prélèvements sanguins seront, pour un prélèvement unique, un volume de 300μl pour une souris de 25g et de 2400μl pour un rat de 250g. Les prélèvements de l’aorte abdominale ne se fera qu’en point final avant sacrifice de l’animal. Les urines peuvent être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où le pool d'urine libéré pendant ce laps de temps sera collecté. Le prélèvement du liquide synovial est réalisé si cela n’affecte pas l’analyse histologique de l’articulation ciblée. Le prélèvement du liquide synovial intra-articulaire se fait sous anesthésie générale par inhalation d'un mélange d'air et d'isoflurane ou sur cadavre en point final.
Impact sur les animaux
Notre société est une société de recherche contractuelle qui mène des études pour l'industrie pharmaceutique, agroalimentaire et biotechnologique. Comptes tenus des prés requis nécessaires à la mise en œuvre d’études in-vivo, nous demandons à nos clients un maximum d’informations permettant d’adapter le design d’étude et les points limites spécifiques aux éventuelles effets toxiques des molécules à tester. Ainsi les effets indésirables attendus sont systématiquements demandés à nos clients avant toute mise en œuvre du projet.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux seront humainement euthanasiés. Une fois sacrifié, une autopsie minutieuse sera réalisée et des organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser le principe actif et/ou évaluer la toxicité systémique par numération sanguine par exemple. Les organes seront également utilisés pour doser le principe actif et/ou pour réaliser des analyses histopathologiques.
Remplacement
Les principes actifs sont généralement, au préalable, testés in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin de vérifier les interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le Métabolisme, mais en aucun cas ne nous renseignent sur l'Absorption, la Distribution, ou l'Elimination de composés ainsi que leurs éventuelles interactions. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres pharmacocinétiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. D'autre part, les ICH exigent la validation de la pharmacocinétique chez les rongeurs.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité des réponses aux traitements, 15 animaux par groupe ont été prévu afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance) et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Pour chacune des procédures, un test statistique de Kruskall-Wallis suivit d'un test de Dunn sera réalisé.
Raffinement
Les animaux seront stabulés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors de l’implantation des dispositifs médicaux, des traitements antalgiques pré et post implantation et dès l’apparition des premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repéré le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et en s’appuyant sur des grilles de bien-être animal adaptées) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques.
Choix des espèces
Les rongeurs ont été choisi pour ce projet car il s'agit d'espèces mammifères reproduisant les réponses tissulaires proches de celles observables chez l'homme. Les paramètres ADMET étant fréquemment évalués chez le rongeur, leur utilisation permet de transposer assez facilement, par des méthodes de calculs, les résultats chez l'homme. Ces animaux sont de taille réduite mais suffisante pour obtenir un volume d'échantillon analysable. Les données obtenues chez les rongeurs permettent donc d'évaluer les doses à administrer chez les premiers patients dans le cadre des études cliniques. D'autre part, les ICH exigent la validation de la pharmacocinétique chez les rongeurs. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque étude et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.