Procédures sévères
Rôle de CD44 sur les fonctions des lymphocytes T au cours des complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Elles sont soumises à un régime gras ou à une alcoolisation, avec des injections intrapéritonéales pour induire une fibrose hépatique et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle de la glycoprotéine CD44 dans les complications hépatiques liées à l'obésité et à l'alcool. Le porteur indique que l'alcoolisation peut provoquer une détresse respiratoire et des signes d'ébriété, et que les injections peuvent entraîner rougeur, infection ou nécrose au point d'injection. Il affirme qu'une étude in vivo est "nécessaire" car les cultures cellulaires ne reproduisent pas les interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Une consommation chronique d'alcool conduit au même spectre d'altérations hépatiques qui vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, qui peut progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux dont le gène CD44 est non-fonctionnel, dans les cellules immunitaires, et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 dans la souffrance hépatique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, d’une part, la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou T CD8, dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et/ou la prise régulière d’alcool. D’autre part, de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie. De plus, l’invalidation spécifique de CD44 dans les lymphocytes T CD4 ou dans les lymphocytes CD8 permettrait de mettre en lumière de nouveaux mécanismes moléculaires.
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Le sang des animaux soumis à un régime alcoolisé sera prélevé en fin de procédure et ce prélèvement ne durera pas plus d'une minute. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. L'alcoolisation peut entraîner des signes de détresse respiratoire, des signes d’ébriété chez les animaux suivis d’un endormissement. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour les procédures 2 et 3 (souris mâles ou femelles), la mise sous régime alcool sera effectuée à environ 12-13 semaines d’âge ou lorsque le poids des souris atteint 20g. Pour la procédure 4 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. Pour étudier le vieillissement hépatique (procédure 5), les animaux ne seront utilisés qu’à un stade très avancé de leur développement et seront donc maintenus jusqu’à l’âge de 22 mois maximum.
Nouvelle thérapie pro-résolutive dans le contrôle de l’inflammation responsable du développement tumoral
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
7 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une inoculation de tumeur par injection sous-cutanée ou par chirurgie, puis des traitements intrapéritonéaux répétés pendant deux à quatre semaines, pour tester une thérapie contre l'inflammation liée au développement tumoral. Le porteur indique que les modèles orthotopiques du poumon et du mésothéliome altèrent la respiration, atteinte servant de point limite, et que ces modèles peuvent provoquer douleur, perte de poids et baisse de mobilité. Il affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et rend donc l'utilisation d'animaux "indispensable".
Objectifs
Ces dernières années, la compréhension des différents acteurs d'une réponse inflammatoire que ce soit dans le cas d'auto-immunité, de rejet d’organes, ou de réponse antitumorale a mis en lumière l’équilibre entre l’activation et l’inhibition de cette réponse. Les traitements de plus en plus ciblés visent des gènes spécifiques de l’immunité sur l’une ou l’autre catégorie des populations immunitaires avec pour effet de moduler la réponse immune. Les essais d'immunothérapie dans le cancer ont été rendus possibles grâce à la preuve de concept sur des modèles précliniques murins. Malgré ces avancées, les rechutes sont encore trop nombreuses et il est essentiel de chercher d’autres molécules et d’autres combinaisons. Les nouvelles stratégies d’immunothérapie cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires et pour cela les approches sont plus spécifiques de populations cellulaires ou des mécanismes immunitaires spécifiques de l’organe pathologique. Une nouvelle approche consiste à cibler une étape de l’inflammation récemment décrite et nommée la résolution de l’inflammation. En effet, cette étape fait suite à la réponse inflammatoire et permet d’éteindre de manière active la réponse immunitaire tout en permettant la mémoire de celle-ci. Il a été identifié des récepteurs spécifiques de cette étape qui jouent un rôle prépondérant dans le maintien de l’homéostasie mais aussi dans le contrôle de l’inflammation qui pourrait alors devenir chronique. Celle-ci étant responsable des maladies inflammatoires, d’une mauvaise réponse immunitaire contre les pathogènes, voire du développement tumoral. Nous aimerions donc tester différentes molécules capables d’activer un ou plusieurs de ces récepteurs et analyser les effets engendrés par cette activation dans des modèles de cancer induit par l’inflammation et/ou ayant des microenvironnements inflammatoires différents. En effet, nous aimerions évaluer le potentiel thérapeutique d’une telle stratégie encore inexplorée avec des traitements de type anticorps monoclonaux, traitement de référence aujourd’hui en immunothérapie.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet pourrait permettre d’identifier un traitement très novateur dans la recherche de nouvelle stratégie thérapeutique contre le cancer humain afin de répondre à des besoins cliniques importants. Durant toutes ces évaluations précliniques, de nouvelles découvertes pourront être faites, notamment durant l’étude de la mécanistique du produit sur le système immunitaire en mettant en lumière des populations cellulaires antitumorales et des mécanismes d’action particuliers et inhérents aux molécules étudiées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur murine via injection en sous-cutanée, ou via intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie. Les injections cutanées se font sous anesthésie générale sur un temps maximum de 10min d'anesthésie. Les injections nécessitant une intervention chirurgicale se font quant à elles sous anesthésie générale et sous analgésie sur une durée maximale de 15min par animal. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal (environ 1min par animal) pour les traitements (environ 3 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines selon le type de traitement) sur animaux vigiles et, si besoin, pour l’injection de luciférine lors du suivi de la croissance tumorale en bioluminescence (1 à 2 fois par semaine). Dans le cadre de l’étape d’identification des mécanismes mis en jeu dans la réponse antitumorale, un prélèvement de sang en intracardiaque des animaux pourra être effectuée sous anesthésie (intervention sans réveil).
Impact sur les animaux
L'induction des modèles tumoraux décrits dans cette saisine ont plusieurs effets indésirables en fonction du modèle. Pour les modèles orthotopiques du cancer du poumon et du mésothéliome : altération de la respiration (point-limite) Tous ces modèles (or les modèles sous-cutanées) peuvent induire de la douleur, une perte de poids chez la souris, une diminution de la mobilité, un stress notamment dû à la chirurgie associée et un comportement altéré provoqué par ses différents effets indésirables. Tous ces modèles sont considérés comme sévères et une attention particulière sera apportée régulièrement aux souris (quotidiennement aux points les plus critiques). Les modèles tumoraux sous-cutanés peuvent provoquer de la douleur en fonction de la taille, donc la tumeur ne devra pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, ni excéder une taille point limite.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique de ce genre nouveau de médicaments et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule.
Réduction
L’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé selon les résultats observés sur les trois traitements évalués et sur les modèles précliniques évalués. Seulement le ou les traitements efficaces en étape 1 et 5 se verront évalués lors des étapes suivantes limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Par conséquent, dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études d’une part pour faire des études de combinaison de traitements avec des traitements standard en oncologie et d’autre part, pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie. Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 7 à 10 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Les tests statistiques utilisés reposent sur une analyse de données dites non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ce test nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur l’efficacité thérapeutique des traitements entre les groupes de souris, puis un effet combinatoire de traitement avec des traitements anti-cancéreux conventionnels, et enfin décortiquer les mécanismes évoluant dans cette réponse antitumorale. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour-nuit de 12h-12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Si un mâle se retrouve dominant et attaque ses congénères malgré la présence d'enrichissements, il sera isolé dans une cage individuelle. L’analgésie quant à elle dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance tels que les animaux ayant un score clinique supérieur à 7 sur deux jours consécutifs ou un score de colite supérieur à 4 sur deux mesures consécutives, l’animal se verra administrer en sous-cutané une injection de buprénorphine à 0.1mg-kg deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie de la tétracaïne. Enfin, nous utiliserons préférentiellement des mâles car les hormones du sexe féminin peuvent apporter une protection générant de l’hétérogénéité sur le développement tumoral. Toutefois, nous n’excluons pas la possibilité de tester les thérapies sur les deux sexes car cette protection hormonale n’est pas valable pour tous les modèles précliniques de tumeur.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Les modèles d’inflammation dans ces souris autorisent une relevance pathologique satisfaisante en comparaison avec la réalité clinique. Des adultes de 7 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse antitumorale, et donc un stade tumoral différent.
Mécanismes de différenciation et du recrutement des cellules myéloïdes dans des conditions de développement tumoral
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 090 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des implantations de tumeurs, des injections d'induction de délétion génétique, des immunothérapies intrapéritonéales répétées et parfois une omentectomie ou une splénectomie, pour étudier le recrutement des cellules myéloïdes dans le développement tumoral. Le porteur indique que chaque modèle de cancer fait l'objet d'une grille d'évaluation de la douleur et d'un point limite, la mise à mort intervenant dans le respect de ces seuils. Il affirme que les cultures d'organoïdes 3D ne permettent pas d'analyser l'ensemble des populations cellulaires du microenvironnement tumoral.
Objectifs
Les macrophages ont une grande plasticité et leur état d’activation est régulé par l’intégration de signaux de l’environnement tissulaire dont ceux induits dans des situations d’infection, d’inflammation chronique ou de progression tumorale. Les cytokines sont des médiateurs clés de l’activation des macrophages : les interférons induisant des macrophages de type M1 pro-inflammatoires cytotoxiques; les cytokines IL-4 / IL-13 induisant des macrophages de type M2 immunorégulateurs. Récemment, de nombreux états intermédiaires à ces stades M1 et M2 ont été phénotypiquement caractérisés mais leur fonction dans des situations pathologiques reste à déterminer. De plus, les macrophages peuvent être d'origine embryonnaires et résidents dans les tissus, ou se différencier à partir des monocytes circulants et être recrutés sur un site inflamatoire. Nous réaliserons des analyses du recrutement et de l’orientation de la différenciation des macrophages au cours de la réponse immune contre des mélanomes ou des tumeurs du sein ou ovariennes ou pancréatiques. Ces analyses visent à comprendre comment les réponses immunitaires sont détournées par les cellules tumorales afin d'identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs de la progression tumorale et de mettre au point de nouvelles immunothérapies
Bénéfices attendus
Ces analyses visent à (i) comprendre comment les réponses immunitaires sont détournées par les cellules tumorales; (ii) identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs de la progression tumorale; (iii) mettre au point de nouvelles immunothérapies pour le traitement de cancer résistants aux traitement actuellement proposés.
Procédures
Certaines souris seront directement enrôlées dans des protocoles d'implantation de tumeurs. Le suivi de la pousse tumorale est régulier: une grille d'évaluation de la douleur et un point limite sont établis pour chaque modèle de cancer étudié. Certaines lots d'animauxt recevront un traitement (1 injection intra-péritonéale) d'induction de délétion génétique qui n'induit pas de phénotype dommageable, puis seront enrolés dans des protocoles d'implantation de tumeurs (1 injection sous-cutanée ou intra-péritonéale ou orthtopique, selon le type de cancer). Certaines lots d'animaux pourront recevoir des immunothérapies (1 injection intra-péritonéale tous les 3 jours pendant 2 semaines) visant à réduire la charge tumorale. Enfin, d'autres souris pourront subir un acte de petite chirurgie (omentectomie ou splénectomie) avant implantation ou induction de tumeurs. Dans tous les cas, le schéma expérimental s'étend au maximum sur 4 mois dont 1 mois pour induire la délétion génétique d'intérêt et 1 à 3 mois pour le développement tumoral (4 à 6 semaines pour le mélanome, le cancer du sein ou du pancréas; 10 semaines pour le cancer de l'ovaire). Les animaux subissent au maximum 6 interventions (1 implantation de tumeur - 10 minutes sous anesthésie pour transplantation orthotopique- et 5 injections intrapéritonéales-30 secondes chacune).
Impact sur les animaux
De manière générale, nous utiliserons le minimum de souris nécessaire pour nos expérimentations. Typiquement, 3 expériences indépendantes conduites selon le planning joint en annexe 3 (7 animaux non traités/ 7 animaux traités). Nous conduirons des analyses longitudinales afin de réduire le nombre d’animaux enrôlés. Les procédures de transplantation orthotopique des tumeurs permettent de limiter le développement tumoral au tissu cible (pancréas ou glande mammaire). Elles impliquent des actes de petite chirurgie pratiqués par une scientifique ayant suivi la formation appropriée. Les protocoles d’immunothérapie testés visent à réduire la pousse tumorale.
Devenir
Mise à mort dans le respect des points limites définis pour analyse du microenvironnement tumoral et des organes lymphoides drainant le site tumoral.
Remplacement
Les interactions macrophages/tumeurs seront également analysées dans des cultures d’organoïdes 3D in vitro. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas d’analyser les interactions impliquant l’ensemble des sous-populations de cellules immunes et non immunes retrouvées dans le micrenvironnement tumoral. Les données bibliographiques montrent que les dialogues entre cellules cancéreuses, cellules immunitaires et cellules du stroma tumoral jouent un rôle important dans l'éradication ou l'échappement des cancers et la résistance aux thérapies. Il est donc capiltal d'analyser des modèles murins pré-cliniques in vivo qui récapitulent tant sur le plan génétique que cellulaire la physiologie des pathologies cancéreuses humaines.
Réduction
Typiquement, 3 expériences indépendantes ; analyses longitudinales afin de réduire le nombre d’animaux enrôlés. Les protocoles d’immunothérapie testés visent à réduire la pousse tumorale. Nous appliquerons des tests statistiques permettant de comparer les groupes traités (n=7) /non traités (n=7) par immunothérapie. En effet, nos expériences antérieures (Etzerodt, J Exp Med 2019 ; doi.org/10.1084/jem.20182124) incluaient 6 animaux par groupe. Cependant, la pousse tumorale étant parfois hétérogène, nous préférons dans ce projet inclure 7 animaux par groupe afin d’augmenter la puissance du test statistique.
Raffinement
Notre projet propose (i) des injections orthotopiques afin de réduire l’invasion tumorale, suivant des protocoles d’implantation en accord avec les recommandations en terme d’anesthésie et d’antalgie ; (ii) un suivi longitudinal de la pousse tumorale par imagerie in vivo. Dans chaque modèle tumoral, des points limites spécifiques seront appliqués. Les conditions d'hébergement des souris au CIML respectent la DIRECTIVE 2010/63/UE : surface des cages; matériel pour confectionner des nids; Température/Hygrométrie/Photopériode contrôlées.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus adaptée pour étudier les réponses immunitaires et l’immunopathologie car les systèmes immunitaires murins et humains sont très proches. Par ailleurs, l'espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés [souris transgéniques; souris "knock-in"; souris "knock-out" dans la lignée germinale ou conditionnel] que nous utiliserons dans ce projet.
Etude de l’efficacité de la N-acétylcystéine à augmenter l’effet antalgique du paracétamol tout en inhibant son hépatotoxicité
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des tests de seuil de douleur par stimulation plantaire toutes les six heures, des administrations par gavage, la pose d'un cathéter intraveineux, des prélèvements sanguins et des IRM, avant d'être mises à mort par perfusion intracardiaque, pour tester l'ajout de N-acétylcystéine au paracétamol. Le porteur indique que la stimulation plantaire induit une douleur, dont l'animal peut se soustraire en retirant sa patte. Il affirme que les cultures cellulaires et les modélisations informatiques ne peuvent mimer la douleur, appréhendable selon lui uniquement dans l'"organisme entier".
Objectifs
Le paracétamol est un médicament de référence pour le traitement de la fièvre et de la douleur, à tous les âges de la vie et dans de très nombreuses circonstances. La dose actuellement recommandée chez l’adulte est de 3 à 4 grammes par jour, répartis en prises de 1 gramme maximum. Cette dose maximale est limitée par la toxicité, principalement hépatique, qui peut survenir à des doses plus élevées. Cependant, l’élimination par le corps du paracétamol lors d’une prescription classique expose à des périodes d’inefficacité. Pendant ces périodes, il n’est pas possible de soulager la fièvre ou la douleur sans avoir recours à d’autres médicaments, tels que les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ou les opiacés. Malheureusement, ces autres médicaments ont un profil d’effet indésirable bien moins bon que le paracétamol et les AINS sont même contre-indiqués lors d’infections bactériennes car ils sont susceptibles d’entraîner des complications pouvant conduire jusqu’au décès. Dans plusieurs études, augmenter la dose de paracétamol de façon très ponctuelle permet effectivement d’augmenter son efficacité. L’enjeu de pouvoir prescrire le paracétamol à forte dose, sur quelques jours ou plus, tout en se préservant de sa toxicité est donc important et n’a pas de solution à l’heure actuelle. La N-acétylcystéine (NAC) est l’antidote de référence lors des intoxications au paracétamol. Elle permet de s’opposer à l’action toxique du paracétamol sans en entraver son efficacité. Ce projet scientifique consiste à utiliser un modèle murin (souris) pour montrer que la combinaison de paracétamol et NAC dans un schéma à 6 administrations par 24h procure une meilleure antalgie dans le temps qu’un schéma classique à 4 administrations par 24h, tout en empêchant la survenue d’une toxicité hépatique.
Bénéfices attendus
L’amélioration de la prise en charge de la douleur est une problématique d’actualité. Permettre une meilleure prise en charge de la douleur grâce à un nouveau schéma thérapeutique du paracétamol permettrait également une réduction de l’utilisation des AINS (non indiqués en cas d’infection et souvent mal tolérés) et des opiacés, souvent mal tolérés et vecteurs de dépendance.
Procédures
1- Test de seuil de la douleur par stimulation plantaire (15 secondes ; toutes les 6h jusqu’à 23h post-traitement). 2- Administration médicamenteuse par gavage (30 secondes ; 4 à 6 administrations selon les groupes). 3- Pose d’un cathéter intraveineux et prélèvement sanguin (15 minutes ; 2 prélèvements). 4- Imagerie par résonance magnétique (IRM) (15 minutes ; 2 examens IRM). 5- Mise à mort par perfusion intracardiaque (15 minutes).
Impact sur les animaux
Test de seuil de la douleur : La stimulation plantaire induit une douleur chez l’animal. Néanmoins, l’animal pourra s’y soustraire en retirant sa patte du dispositif d’expérimentation. Par ailleurs, la procédure expérimentale sera réalisée durant une courte durée de manière à éviter toute lésion tissulaire. Administration médicamenteuse par gavage oral : Tous les moyens seront mis en œuvre pour éviter le stress et les blessures chez l’animal. Avant la procédure, la souris sera habituée à la contention. Une aiguille d’alimentation à bout rond, d’une longueur appropriée à la taille du sujet et flexible sera utilisée. Pour la tolérance de l’administration, l’aiguille sera trempée dans une solution appétente pour la souris (liquide sucré), ce qui stimulera également le réflexe de déglutition. Pose d’un cathéter intraveineux et prélèvement sanguin : L’incision de la queue de la souris est susceptible d’induire une douleur, laquelle sera prévenue par une analgésie locale réalisée avant le réveil de l’animal. Une attention particulière sera apportée afin de permettre aux tissus du site de la ponction de guérir avant le second prélèvement sanguin. Par ailleurs, après chaque prélèvement, l’expérimentateur s’assurera que l’animal ne saigne plus avant de le remettre dans sa cage. Imagerie par résonance magnétique (IRM) : Cette méthode impose des manipulations qui sont autant de stresseurs pour l’animal. De ce fait, l’anesthésie générale sera utilisée durant cette procédure et pratiquée par du personnel expérimenté.
Devenir
Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du protocole. La mise à mort des animaux est nécessaire pour le prélèvement des tissus en fin de protocole.
Remplacement
Les expériences in vitro de cultures cellulaires ou les modélisations informatiques ne permettent pas de mimer la douleur, et excluent les multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux et de l’organisme entier. Ainsi, les procédures expérimentales de ce projet ont un caractère de stricte nécessité visant à étudier la douleur, une pathologie morphologique dépendante de données architecturales et systémiques uniquement appréhendables in vivo. De fait, les expériences ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés est prévue par une limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, et déterminée selon la sensibilité des méthodes utilisées et l’expertise nécessaire à la bonne réalisation des techniques. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel GraphPad Prism (version 9). Nous vérifierons en premier lieu si les échantillons suivent la loi normale (hypothèse gaussienne) à l’aide de tests de Shapiro-Wilk. Le cas échéant, des tests paramétriques seront utilisés (ANOVA suivi de tests post-hoc en cas de différence significative) ; dans le cas contraire, des tests non paramétriques seront réalisés (comparaisons intergroupes : test de Kruskal-Wallis suivi de tests U de Mann-Whitney en cas de différence significative ; comparaisons intragroupes : test de Friedman suivi de tests de Wilcoxon en cas de différence significative).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés (anesthésiant : isoflurane ; analgésiques : lidocaïne, buprénorphine) durant chaque procédure (pose d’un cathéter intraveineux, IRM, perfusion intracardiaque). Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de la douleur. L’anatomie et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la douleur. Le stade de développement des animaux est de 8 à 12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de la douleur.
Étude pilote d’une stratégie de thérapie génique pour le traitement préclinique d’un modèle de rat myopathe
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
132 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Porteurs d'une dystrophie musculaire qui leur fait perdre progressivement de la masse corporelle, ils reçoivent des injections de vecteurs viraux, puis une mesure de force musculaire sous anesthésie avant d'être mis à mort par injection létale de pentobarbital, pour tester une thérapie génique de la myopathie de Duchenne. Le porteur indique que la mort des cellules musculaires peut provoquer un processus inflammatoire douloureux, anticipé par de la buprénorphine. Il affirme que le rat mime la maladie humaine "beaucoup plus fidèlement" que la souris myopathe et conclut à la nécessité d'une validation in vivo.
Objectifs
La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) survient lorsque la mutation du gène de la dystrophine provoque un manque de protéine fonctionnelle, entraînant une faiblesse musculaire progressive profonde. La transmission de la maladie est liée au chromosome X, les garçons atteints de la maladie perdent graduellement la capacité de marcher, et la plupart deviennent dépendants du fauteuil roulant et de la ventilation artificielle au fil du temps. Cette maladie est à ce jour incurable et l’âge moyen de survie sans traitement est de 19 ans, l'insuffisance cardio-respiratoire étant la cause la plus fréquente de décès. La prise en charge symptomatique, pluridisciplinaire, vise à optimiser la qualité de vie des patients mais aussi leur espérance de vie. Les progrès thérapeutiques réalisés au cours des dernières décennies ont permis de transformer le pronostic. Plus de 90 % des enfants atteints de DMD vivent désormais jusqu’à l’âge adulte et certains atteignent aujourd’hui l’âge de 40 ans. Plusieurs nouvelles approches pour le traitement de la DMD sont en cours d'approbation et de développement. Une étape critique est d'abord de déterminer l'efficacité et la sécurité de ces traitements en utilisant un modèle animal de la maladie. La stratégie de thérapie utilisée dans ce projet vise à démontrer l'efficacité d'un vecteur viral de thérapie génique permettant de rétablie l'expression d'une dystrophine plus courte mais fonctionnelle qui pourra préserver ou restaurer la structure et la fonction des cellules musculaires touchées par la maladie.
Bénéfices attendus
Grâce à l'étude des effets de cette stratégie thérapeutique sur la structure du tissu musculaire, nous comptons déterminer le meilleur vecteur de thérapie génique et évaluer l'efficacité de ce type de thérapie sur le processus de reconstruction musculaire suite à la restauration de la dystrophine musculaire et sur l'évolution de la maladie. A court terme si une des stratégies se révèle avoir un effet thérapeutique positif, elle sera testée à l'aide d'une injection dans la circulation sanguine générale pour permettre une analyse des fonctions des muscles squelettiques et cardiaque à l'echelle de l'organisme entier. A plus long terme, on peut espérer un essai pré-clinique dans un modèle animal myopathe de plus grande taille et une transposition aux patients dans un essai clinique.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles, ni aucune chirurgie ne sont prévus. L'injection des vecteurs viraux (procédure test du sérotype et procédures test de thérapie génique précoce et tardive), n'est pas douloureuse en soit mais peut produire une réaction inflammatoire prise en charge par antalgique. La mesure de force des muscles traités, critère d’évaluation de l’efficacité du traitement, nécessite une immobilisation et l'utilisation d'éléctrodes musculaires est rélaisée sous anesthésie injectable, 1 fois avant la mise à mort pour les animaux inclus dans les essais de thérapie précoce et tardive. Les animaux étant anesthésié et mis à mort immédiatement après la mesure de force, ils ne ressentent pas de douleur.
Impact sur les animaux
La mort des cellules musculaires peut induire un processus transistoire douloureux d'origine inflammatoire dont nous connaissons bien les conséquences que nous anticipons par des injections de buprénorphine. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. Nous connaissons bien l'évolution de la maladie, ce qui permet une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Les procédures 2 et 3 de ce projet incluent des animaux chez lesquels les nuisances musculaires de l'évolution spontanée de la maladie sont limitées et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers. Les vecteurs viraux utilisés ont été choisis pour optimiser l’efficacité de la thérapie génique et minimiser la réponse immunitaire.
Devenir
A l'issue des trois procédures expérimentales, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques permettant d'évaluer l'efficacité du traitement sur les muscles prélevés. La mise à mort sera réalisée sous anesthésie par une injection létale de pentobarbital.
Remplacement
Toutes les constructions incluses dans les vecteurs viraux et utilisées dans cette saisine ont été évaluées et validées in vitro sur cellules musculaires isolées à partir de rats DMD. Elles ont donc un potentiel thérapeutique qu'il faut maintenant évaluer in vivo lorsque les cellules musculaires sont dans leur environnement en interactions avec les autres types cellulaires présents dans un muscle en conditions pathologiques ce qui n'est possible que sur un animal vivant.
Réduction
Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec d'autres candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Il apparaît que pour chacun des lots, traiter 5 à 7 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution de la maladie. Le problème majeur auquel nous avons été confrontés est la sensibilité des animaux à l'anesthésie. Malgré nos soins, nous avons déploré l'absence de réveil chez quelques animaux. Il faut donc prévoir un animal supplémentaire par groupe de sorte qu'en cas d'accident anesthésique, on puisse traiter les données de 5 à 7 animaux arrivés au terme de la procédure. Au bilan, chacun des lots a pu être réduit à 6-8 animaux en fonction des analyses faites. Dans le cas présent, 6 animaux par lot seront suffisants. A des fins de réduction et de formation, les femelles sauvages issues de nos croisements, dont nous ne nous servons pas dans nos procédures d'élevage ou expérimentales, serviront lors de leur mise à mort à l'entrainement de nos étudiants au prélèvement post-mortem d'organes .
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage au début puis ce nombre est progressivement réduit jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600 g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft et des bâtons de bois à ronger ou des carrés de coton compacté. Dans le cadre du développement de la pathologie nous prêterons attention à l'apparatition des points limites tels que la perte de mobilité, la prostration, une lordose excessive, la dégradation du pelage, la vocalisation anormale (hors contention) ou des grimaces faciales. La cause de la douleur sera recherchée et des antalgiques pourront être prescrits, notamment sur les animaux DMD au delà de 8 mois, nous pourrons utiliser un anti-inflammatoire ou un opioïde après consultation du vétérinaire référent. La survenue de l'un des points ci-dessus associé à une perte de poids sur une semaine dépassant 20% du poids maximal atteint par l’animal et non compensée par la mise à disposition de nourriture humide et d’hydrogel en fond de cage entrainera la mise à mort compassionnelle de l'animal concerné. Lors de l'infection virale les animaux sont injectés une fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie (au démarrage de la procédure puis en fin de procédure) et une fois dans le muscle pour l'injection des vecteurs viraux (procédure test du sérotype et procédures test de thérapie génique précoce et tardive ). Ils sont préventivement injectés 3 fois par jours pendant 2-3 jours avec une molécule qui supprime la douleur, par voie sous-cutanée, en même temps que l'examen clinique pour éviter de les déranger inutilement. La mesure de force inclue également des antalgiques en plus de l'anesthésie générale garantissant que les animaux ne souffrent pas.
Choix des espèces
Le rat, une espèce de mammifère phylogénétiquement proche de l'homme, constitue un modèle apprécié. Les récents outils de manipulation du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Le modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle emblématique de la souris myopathe, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Dans cette saisine nous utiliserons, 1) des jeunes animaux sevrés reçus dans notre EU à l'âge de 3 semaines pour une semaine d'acclimatation puis inclus dans nos cohortes d'étude à partir de 4 semaines, pour les essais de vecteurs et la thérapie précoce, parce qu'ils correspondent au stade post-sevrage le plus précoce pour initier un traitement dans la phase asymptomatique de la maladie; 2) des animaux âgés de 6 mois pour l'essai de thérapie tardive parce qu'ils sont clairement symptomatiques. Si le traitement est efficace, il est attendu une diminution voir un arrêt de l'évolution de la maladie dans le muscle traité chez les animaux jeunes, et un ralentissement ou un arrêt voir une réversion du développement de la maladie dans le muscle traité chez les animaux âgés.
Choc septique et traitements innovants (B1-bloquants)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
Rats : 120
1 260 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur provoque un choc septique, avec pour certains une chirurgie avec réveil, puis des enregistrements cardiaques sous anesthésie, les animaux du modèle présentant isolement, faiblesse, perte de poids et baisse de température. Le porteur évalue l'effet de médicaments B1-bloquants sur les fonctions d'organes et la réponse immunitaire pendant le sepsis. Il justifie le recours aux animaux par la complexité d'une pathologie touchant plusieurs organes simultanément.
Objectifs
Le but de ce projet est d’évaluer les effets des B1-bloquants sur les fonctions d'organes et la réponse immunitaire au cours du sepsis à travers l'étude de voies de signalisation ou de mécanismes potentiellement impliqués.
Bénéfices attendus
La septicémie, principale cause d'admission dans les unités de soins intensifs, est caractérisée par une réponse inflammatoire généralisée résultant d’une infection non contrôlée. En dépit de la mise en œuvre des directives internationales, des progrès médicaux constants et des milliards dépensés chaque année, le traitement du sepsis est principalement symptomatique. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité d'un traitement curatif, les B1-bloquants.
Procédures
Tout animaux seront soumis à au moins une injection (Induction du modèle, administration du traitement, ...) ou un prélèvement sanguin. Il est prévu de réaliser une procédure chirurgicale avec réveil sur environ 70 animaux (30 minutes). Les animaux pourront aussi subir des procédures d’enregistrement de paramètres physiologiques sous anesthésie : échocardiographies, électrocardiogrammes et enregistrement de potentiels évoquées moteurs. Tous les prélèvements de tissus seront réalisé sur des animaux préalablement euthanasiés
Impact sur les animaux
Les animaux représentatifs du modèle présentent un changement de comportement (comme l’isolement), un état physique altéré (comme des faiblesses au cours de la marche), des sécrétions (rhinites), ainsi qu’une perte de poids et une diminution de la température.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés dans les 24 heures suivant la création du modèle de sepsis ou son placébo.
Remplacement
L’utilisation d’animaux, dans cette étude, est dictée par la complexité de cette pathologie touchant plusieurs organes simultanément. L’effet ne peut donc être considéré qu’à l’échelle d’un organisme. De plus, il existe une bonne corrélation entre les données obtenues chez les rongeurs (en cas de synergie des résultats des deux modèles étudiés) et l’Homme au cours du sepsis
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, nous nous sommes appuyés sur les travaux antérieurs réalisés au sein du laboratoire, sur une analyse bibliographique poussée de cette pathologie et une optimisation des prélèvements sanguins et des prélèvements tissulaires effectués après euthanasie sur chaque animal
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être animal à travers un suivi régulier des rongeurs et ce afin de déceler tout excès de douleurs. Le bien-être sera mesuré en évaluant les 5 paramètres suivants : i. Comportement; ii. Etat physique; iii. Sécrétions; iv. Poids; v. Température. Tous ces critères sont évalués fréquemment. Si le score dépasse le seuil fixé, les animaux seront euthanasiés. l'admnistration d'analgesique est également prévu.
Choix des espèces
- L’étude du choc septique, à travers l’utilisation de souris comme espèce animale, a fait l’objet de plus de 10 000 publications au cours des 40 dernières années. Une mise en perspective de nos résultats sera donc plus aisée, même si les effets des B1-bloquants, au cours du sepsis, restent, eux, très peu étudiés à ce jour. - Ce modèle a fait l'objet de recherches exhaustives, de sorte que tous les aspects du cycle de vie de l'animal et leurs incidences potentielles sur l'expérimentation sont relativement bien connus. - Un large éventail de techniques sont adaptées aux souris pour étudier différents paramètres et mécanismes, dont celles décrites dans cette saisine. - Une étude analysant les mécanismes physiopathologiques impliqués suite à l’administration de B1 bloquants sera entreprise dans un avenir proche. Cette étude utilisera des souris transgéniques. Une recherche de synergie avec ce projet pourra alors être entreprise. Les souris mâles auront un poids compris entre 20 et 45g lors de leur utilisation et seront agés de 6-8 semaines, soit l’âge de leur maturité sexuelle. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois pré pubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu. Les rats mâles auront un poids compris entre 200 et 300g lors de leur utilisation. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois pré pubères et de vieillissement et donc évite d’inclure des paramètres supplémentaires dans la compréhension des mécanismes mis en jeu. La grande majorité des animaux (80-90 pourcent) seront des souris. Les rats (10-20 pourcent) ne seront employés que pour les études nécessitant un grand volume de sang et ce afin de réduire le nombre d'animaux total.
Etude des effets d’un anticorps monoclonal bloquant l’interaction de l’activateur tissulaire du plasminogène et du récepteur N-Methyl-D-Aspartate dans un contexte ischémique en synergie avec les traitements thrombolytiques de référence.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par chirurgie, suivi d'une injection intraveineuse, d'une IRM et de plusieurs sessions de tests comportementaux, la chirurgie pouvant entraîner des atteintes motrices et sensorielles comme des tournoiements ou une perte de mouvement. Le porteur teste un anticorps, le Glunomab, et sa forme humanisée pour protéger le cerveau lors de l'ischémie. Il affirme qu'aucun modèle sans animaux ni aucun vertébré moins sensible ou invertébré ne peut remplacer ces procédures.
Objectifs
L’objectif de cette étude est de tester l'efficacité d’un anticorps monoclonal murin (Glunomab) dans des modèles d'accidents vasculaires cérébraux. Nous regarderons essentiellement ses effets protecteurs sur les lésions cérébrales, la réponse inflammatoire et la récupération fonctionnelle. Cet anticorps bloque l'interaction de l'activateur tissulaire du plasminogène avec les récepteurs N-Methyl-D-Aspartate. Nous testerons également les formes humanisées (Glunozumab) de cet anticorps.
Bénéfices attendus
Grâce à ce projet, nous allons tester l’efficacité de Glunomab (ainsi que les versions chimérique et humanisée) comme traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques avec ou sans le traitement thrombolytique de référence et sa capacité d’améliorer le devenir fonctionnel. L’AVC, étant la première cause de handicap physique acquis de l’adulte et représente désormais la première cause de mortalité chez la femme dans le monde nécessite une rapide amélioration de l’accessibilité aux traitements de référence en évitant les effets secondaires trop délétères.
Procédures
Les différents types d’interventions sont détaillés par procédure : • Procédure 1 (par animal) : 1 chirurgie + 1 injection intraveineuse (30 minutes) + 1 IRM (10 minutes) • Procédure 2 (par animal) : 1 chirurgie + 1 injection intraveineuse (30 minutes) + IRM (10 minutes) + 4 sessions de tests comportementaux (2 heures) • Procédure 3 (par animal) : 1 chirurgie + 1 injection intraveineuse (30 minutes) + 1 IRM (10 minutes) + 4 sessions de tests comportementaux (2 heures) • Procédure 4 (par animal) : 1 chirurgie + 1 injection intraveineuse (30 minutes) + 1 IRM (10 minutes) + 4 sessions de tests comportementaux (2 heures) • Procédure 5 (par animal) : 1 chirurgie + 1 injection intraveineuse (120 minutes) + 1 IRM (10 minutes) + 4 sessions de tests comportementaux (2 heures) • Procédure 6 (par animal) : 1 mise à mort (5 minutes)
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, les animaux seront surveillés durant deux heures jusqu’à leur réveil complet. Des mesures pré et post-opératoires sont utilisées afin de limiter la douleur directe associée à des injections iv ou ip répétées ou indirecte liée à la conséquence du produit injecté. La chirurgie pourrait avoir comme conséquences de nombreux dommages moteurs et sensoriels sur les animaux de ce protocole (circling, pas de mouvement, peu ou plus de toilettage...). Les injections iv ou ip répétées pourraient, quant à elles, engendrées des inflammations cutanées aux endroits touchés.
Devenir
Tous les animaux (soit 695) seront concernés par la mise à mort en vue de prélévements d'organes et de liquides corporels post-mortem.Tous les échantillons seront répertoriés et stockés à -80C pour une conservation à long terme afin d’optimiser l’utiliser des échantillons prélevés.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'informations. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. En amont de l'expérimentation animale, des méthodes alternatives in vitro existantes répondant au mécanisme d'action de la molécule d'étude ont déjà été employées, nous permettant de justifier le passage de l'in vitro à l'in vivo.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et de la littérature.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. En effet, dès lors que l'animal présentera des plaies externes, de l'Aluspray, un agent cicatrisant, sera appliqué une à deux fois par jour. Egalement, de la Lidocaïne, un agent analgésiant sera appliquée de manière locale dès lors que des signes de douleur physique apparaîtront. Lors des procédures chirurgicales, de la vitamine A sera appliquée sur le globe oculaire de l'animal afin de prévenir de tout asséchement. Si des signes de détresse physique apparaissent, des massages quotidiens seront effectués.
Choix des espèces
Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques et la souris reste l’espèce de choix pour de telles études de plasticité cérébrale. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différente de l’homme. Tous les animaux utilisés de ce projet sont agés de 8 semaines, âge pour equel, les animaux sont considérés comme des "jeunes adultes".
Evaluation de l’efficacité therapeutique de plusieurs doses d’un traitement pharmacologique dans un modele de souris Huntington
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Modèles génétiques de la maladie de Huntington, elles reçoivent un traitement dans l'eau de boisson pendant six semaines, subissent une injection dans le cerveau sous anesthésie et des tests au rotarod trois jours par semaine, avant un prélèvement de sang terminal. Le porteur vise à valider un effet synergique entre thérapie génique et médicament, avec l'espoir d'une application chez l'humain. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit la complexité du cerveau et qu'il est "nécessaire" de disposer d'animaux modèles.
Objectifs
La maladie de Huntington est une pathologie neurodégénérative héréditaire, qui se manifeste par des troubles moteurs, cognitifs et psychiatriques s’aggravant progressivement jusqu’au décès, qui survient en moyenne vingt ans après le début des symptômes. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de cette maladie. Le développement de nouvelles approches thérapeutiques est donc essentiel pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique, qui consiste à introduire du matériel génétique dans des cellules du cerveau dans le but de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans des modèles murins de la maladie de Huntington. L’association de cette approche avec un traitement pharmacologique X pourrait conduire à des effets bénéfiques synergiques. Les objectifs du projet sont doubles : 1) évaluer les effets du traitement pharmacologique X sur le phénotype des souris R6/2, modèle murin de la maladie de Huntington ; 2) évaluer l’effet combiné de ce traitement pharmacologique et de la thérapie génique sur les souris R6/2.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est de valider les effets bénéfiques synergiques du couplage d’un traitement en thérapie génique avec un traitement pharmacologique. Le but final est de trouver un traitement efficace et de le valider chez la souris modèle de la maladie de Huntington, afin de pouvoir l’appliquer chez l’Homme et plus précisément chez les patients atteints de cette maladie.
Procédures
Pour les animaux inclus dans la première étude : Administration par voie orale d’un traitement pharmacologique dissout dans l’eau de boisson pendant six semaines; Test comportemental (rotarod) réalisé trois jours par semaine (en cumulé, quinze minutes de test par jour maximum), pendant six semaines ; Mise à jeûn pendant six heures ; Prélèvement de sang et euthanasie sous anesthésie générale (cinq minutes). Pour les animaux inclus dans la deuxième étude : Injection stéréotaxique sous anesthésie générale (soixante-dix minutes) avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, avant et après la chirurgie; Administration par voie orale d’un traitement pharmacologique dissout dans l’eau de boisson pendant six semaines ; Test comportemental (rotarod) réalisé trois jours par semaine (en cumulé, quinze minutes de test par jour maximum), pendant six semaines ; Mise à jeûn pendant six heures ; Prélèvement de sang et euthanasie sous anesthésie générale (cinq minutes).
Impact sur les animaux
Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Selon nos précédentes études, une faible perte de poids due à l’injection de l’AAV pourrait être observée dans les jours suivant la chirurgie, bien que la concentration d’ AAV utilisée ait déjà évaluée in vivo dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité.
Devenir
Les souris inclues dans les deux études seront euthanasiées à la fin de leur dixième semaine de vie, pour les différentes études biocellulaires et biomoleculaires. Les animaux produits qui ne seront pas inclus dans les études seront euthanasiés, de même que les reproducteurs à l'issue de la période de reproduction.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, nous avons déjà utilisé des souris sauvages pour mettre au point des protocoles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agréés.
Réduction
La taille des effectifs (192 animaux au total) a été établie grâce à un calcul de puissance et correspond à la taille minimale requise pour pouvoir mettre en évidence les effets attendus. Des tests statistiques adaptés seront réalisés pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. L’application de critères d’arrêts standards en élevage ou utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et anti-inflammatoire, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. Les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi, avec du matériel pour la fabrication du nid et un igloo. L’accès continu en eau et en nourriture aux souris sera amélioré grâce à l’utilisation de biberons avec une tétine plus facile d’accès (plus longue). Des croquettes seront à disposition sur le fond de la cage pour éviter qu’ils aient besoin de se dresser pour grignoter les croquettes sur la grille
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie de Huntington permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études d'efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques. Les animaux R6/2 et littermates seront identifiés par tatouages par les zootechniciens autour de dix jours d’âge et en même temps une biopsie de la queue sera prélevée pour réaliser un génotypage par PCR. Chez le modèle murin de la maladie de Huntington (souris R6/2), les troubles neuropathologiques apparaissent dès la quatrième semaine et progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons donc les injections stéréotaxiques à un âge précoce (quatre semaines) afin de maximiser les effets bénéfiques du traitement sur la neuropathologie et le comportement moteur. Ce protocole a déjà été validé avec ce modèle transgénique. De même, le traitement pharmacologique sera administré dans l’eau de boisson à partir de la quatrième semaine postnatale. Le test du rotarod sera réalisé chaque semaine à partir de la cinquième semaine postnatale, jusqu’à l’euthanasie (fin de la dixième semaine postnatale).
Caractérisation d’un nouveau gène candidat PLCB1 impliqué dans les myopathies congénitales à spirales cylindriques
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Privées d'un gène, elles développent une myopathie avec une espérance de vie d'environ trois semaines et des organes anormaux, et subissent jusqu'à 28 tests de force, d'endurance et de locomotion avant une mesure musculaire sous anesthésie suivie de la mise à mort. Les animaux ayant servi à l'élevage de la lignée sont eux aussi tués une fois l'effectif atteint. Le porteur cherche à valider le rôle de ce gène dans une myopathie humaine et affirme qu'une étude sur cellules ne suffirait pas à évaluer l'atteinte de l'organisme entier.
Objectifs
Après avoir identifié une mutation candidate dans un gène engendrant une protéine impliquée dans la production de lipides chez une famille avec deux enfants atteints de myopathie à spirales cylindriques, nous souhaitons valider l'impact de cette mutation dans la maladie avec un modèle souris afin de valider un nouveau gène de myopathie et le diagnostic de cette famille. Cette mutation est présente sur les 2 copies présentes du gène chez les enfants et correspond à une perte de fonction, c'est-à-dire que nous avons démontré qu'elle entrainait une diminution de la lecture du gène dans les cellules entrainant donc une diminution de la production de protéine. Ce projet vise donc à caractériser un modèle souris ne possédant pas cette protéine dans le but de valider le rôle de la perte de fonction du gène dans la maladie grâce à des études du tonus et de la force musculaires et de la forme, de l'aspect et du fonctionnement moléculaire du muscle chez la souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront tout d'abord de valider l'implication de ce gène dans les myopathies congénitales, et d'identifier une nouvelle cause génétique possible. De plus, ils permettront de mieux comprendre les protéines impliquées dans ces pathologies, dans le muscle sain et dans le développement de la maladie. Valider un nouveau gène dans les myopathies congénitales permet tout d'abord d'avoir de nouveaux diagnostics pour les familles de patients et aussi d'avoir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le développement de traitements de la maladie.
Procédures
Les souris sont marquées afin d'être identifiées et un suivi journalier sera assuré. Les souris seront soumises à une série de tests phénotypiques entre 3 semaines et 8 mois d'âge maximum : - La mesure de la force du corps : les souris sont suspendues sur le couvercle de la cage durant 3 min maximum et elle sera mesurée 1 fois par mois. - La mesure de la force des pattes : le test sera effectué pendant 30 sec maximum et sera réalisé une fois par mois. - L'évaluation de la capacité de l'animal à se mouvoir : les animaux sont placés dans une enceinte contenant des cages individualisées pour le suivi de l'activité locomotrice pendant 24h. Ce test se fera 1 fois par mois. - La mesure de l'endurance et de la résistance à la fatigue : le test dure 5 jours et les souris marcheront sur un cylindre rotatif pendant 5 à 15 min par jour. Ce test ne sera réalisé qu'une seule fois durant l'étude. - La mesure des propriétés contractiles musculaires in situ : il s'agit d'un test qui ne sera réalisée qu'une seule fois par souris et la durée totale, de l'anethésie jusqu'à la fin des mesures, sera de maximum 1h. Au maximum, 28 tests de phénotypages seront effectués sur les souris vivant jusqu'à 8 mois.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, un seul gène est muté générant chez la souris un phénotype sévère et dommageable entrainant une faible espérance de vie, de 3 semaines d'après la littérature existante. A ce jour, seul le modèle ne portant qu'une seule copie fonctionnelle du gène a été observé , les animaux ne portant pas le gène fonctionnel mourant pour la plupart au moment du sevrage, c'est-à-dire à trois semaines de vie. Les souris observées ont été décrites comme présentant une morphologie anormale des ovaires, un foie plus grand, une rate plus grande, des noeuds lympahtiques plus grands, une morphologie anormale des reins et des yeux. Les animaux ne présentent pas d'infertilité contrairement aux animaux ne portant pas le gène fonctionnel. Les caractéristiques musculaires de ce modèle n'ont encore jamais été évaluées, à notre connaissance. Les différents tests phénotypiques permettant de suivre et mesurer la force, la résistance à l'exercice et la capacité à se mouvoir de la souris pourront induire du stress pendant une durée pouvant aller de 1 min à 15 min maximum et pourront induire de la fatigue à la fin des tests.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie et replacés dans leur cage jusqu'à la procédure suivante pour tous les tests jusqu'au test de la mesure des propriétés contractiles des muscles. A l'issu de ce test qui est réalisé sous anesthésie, les animaux sont mis à mort sous anesthésie et les organes seront prélevés pour des études moléculaires des muscles. Cela concerne l'ensemble des animaux d'expérience, soit 60. Pour ce qui est des animaux permettant le maintien de la lignée durant l'étude, une fois que le nombre souhaité d'animaux d'expérience sera atteint, les animaux ayant permis leur naissance seront mis à mort afin d'éviter la multiplication d'animaux alors que l'étude sera terminée.
Remplacement
Pour caractériser la myopathie à spirales cylindriques et identifier l'impact de la mutation du gène d'intérêt, nous souhaitons étudier la souris. Le modèle murin étant physiologiquement et structurellement assez proche de l'Homme, il nous permet de valider la pathogénécité de cette mutation. De plus, une étude exclusivement réalisée sur des cellules ne pourrait pas suffire à elle-même car les effets sur l'ensemble de l'organisme et l'évaluation de l'atteinte musculaire seraient impossible à évaluer.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les études réalisées. De plus, l'étude sera longitudinale afin de travailler sur les mêmes animaux sans en multiplier leur nombre. Le nombre de géniteurs sera réduit en créant des cages d'accouplements avec deux femelles pour un mâle. L'observation des souris permettra d'optimiser au mieux leur nombre. Nous prévoyons cependant 185 animaux pour cette étude. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisée avec un test maximum par jour.
Raffinement
Un certain nombre de procédures seront mises en place afin d'améliorer le bien-être de l'animal. Si des difficutés de locomotion apparaissent, de la nourriture sera placée dans la cage afin de soulager l'animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupes de 2 à 4 par cage et la qualité de l'air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Les cages d'accouplements seront constitutées de deux femelles par cage facilitant l'élevage des petits. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance, il seront donc surveillés tous les jours et pesés 3 fois par semaines. Si une perte d'état rapide est observée chez les animaux, l'étude sera alors stoppée. De même, en cas de douleur intense, un analgésique pourra être administré et l'étude sera prématurément stoppée.
Choix des espèces
Afin d'évaluer et de comprendre l'impact de la perte de fonction de la protéine d'intérêt dans la myopathie en spirales cylindriques, une pathologie humaine, nous avons besoin d'étudier son effet sur les fibres musculaires, de préférence chez les mammifères. La protéine que nous étudions est très bien concervée chez la souris avec 97% d'homologie. Ceci suggère une fonction très similaire chez l'humain et la souris. De plus, la structure des muscles est similaire chez la souris et l'humain. Les myopathies causant des défauts structuraux du muscle, la souris nous permettra de reproduire le plus fidèlement possible les défauts observés chez l'humain et ainsi de modéliser au plus près la maladie humaine. D'autre part, les souris ont des caractéristiques biologiques très utiles pour la recherche comme leur petite taille, une durée de vie plutôt courte et une durée de gestation courte. De plus, les souris sont couramment utilisées dans un grand nombre de recherche dans ce domaine, ainsi que dans notre équipe. Ces analyses ne peuvent pas être réalisées in vitro car nous souhaitons étudier l'impact de la mutation sur le phénotype d'un individu entier ainsi que sur la structure de la fibre musculaire. Le modèle utilisé étant déjà décrit comme ayant une faible espérance de vie, les études phénotypiques seront faites à 3 semaines de vie. Les souris seront néanmoins obervées et suivies attentivement de la naissance jusqu'à la mise à mort.
Evaluation de l’efficacité de nouveaux anti-inflammatoires dérivés du naproxène dans le modèle murin d’arthrose induit par injection de monoiodoacétate (modèle MIA)
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent dans l'articulation une injection de monoiodoacétate qui provoque une arthrose douloureuse, avec douleurs spontanées, allodynie et boiterie, puis un traitement quotidien pendant 28 jours et des tests de douleur. Le porteur évalue cinq dérivés d'un anti-inflammatoire, le naproxène, censés cibler le cartilage en réduisant les effets indésirables, une évaluation sur modèle chirurgical étant envisagée si un composé se révèle prometteur. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit pas le microenvironnement inflammatoire et que le passage in vivo est inévitable.
Objectifs
Avec 10 millions de personnes atteintes en France, l’arthrose est une pathologie qui représente un réel enjeu socio-économique. En l’absence de traitement curatif, les Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens (AINS) sont largement prescrits, pour enrayer le phénomène inflammatoire responsable du cercle vicieux entrainant la destruction du cartilage, et ce malgré leurs effets secondaires importants (cardiovasculaires et gastrointestinaux). Ce projet d’expérimentation animale, s’inscrit dans un projet plus large dont l’objectif est de concevoir de nouveaux AINS ciblant spécifiquement le site arthrosique afin de diminuer les effets indésirables associés couramment à l’utilisation des AINS. Ainsi, 30 dérivés du naproxène, un anti-inflammatoire non stéroïdien, ont déjà été synthétisés et caractérisés par les chimistes de notre unité. Ces dérivés exploitent une stratégie développée au laboratoire et qui permet de cibler le cartilage en diminuant les effets indésirables. L’ensemble de ces composés a déjà été évalué in vitro et les composés les plus intéressants ont été évalués in vivo dans un modèle inflammatoire d’arthrite. Les résultats obtenus nous ont permis de sélectionner 5 composés plus intéressant que la molécule parent, le naproxène. Nous souhaitons désormais valider la pertinence de notre stratégie et évluer ces 5 dérivés du naproxène dans un modèle d’arthrose. Le modèle d’arthrose selectionné pour cette étude est le modèle induit par injection en intraarticulaire de monoiodoacétate (MIA) chez la souris. Ce modèle, facile à mettre en place et très inflammatoire, est très exploité pour évaluer des molécules ou des extraits végétaux ayant un impact sur la douleur arthrosique et l’inflammation.
Bénéfices attendus
Les résultats non permettrons d’évaluer l’intérêt de notre stratégie pour contrôler localement l’inflammation dans l’arthrose tout en diminuant les effets indésirables. Ces résultats apporteront également quelques informations précieuses qui guideront la pharmacomodulation des prochaines molécules. De plus, si l’un des composés se révèle être très prometteur, nous envisagerons alors son évaluation sur un modèle chirurgical
Procédures
Injection en intraarticulaire pour la mise en place du modèle (sous anesthésie, 5 minutes). Traitement par voie sous-cutanée sur animaux vigiles : 1 fois par jour pendant 28 jours, durée quelques secondes. Test d'allodynie ou de locomotion : 1 à 2 fois par semaine
Impact sur les animaux
Le modèle MIA est un modèle qui induit une douleur arthrosique. L’injection de MIA en intra-articulaire entraine une augmentation de la sensibilité nerveuse avec douleur spontanées, allodynies, hyperalgies de façon dose dépendantes. Les effets indésirables sont donc de la douleur ainsi que des problèmes de locomotion (boiterie, difficultés d’appuis, …). Une légère perte de poids peut être observée les premiers jours post induction. Concernant, les injections quotidiennes des traitements à la dose définie en sous-cutanée, ils ne génèrent ni douleur, ni effets indésirables.
Devenir
Du fait de l'injection en IA du MIA qui induit une arthrose inflammatoire, les animaux ne peuvent pas être réutilisés
Remplacement
La culture cellulaire ne représente pas la complexité du micro-environnement et notamment de sa composante inflammatoire. Les études in vitro et in tubo nous permettent de réaliser une première sélection des molécules mais doivent être complétées par des études in vivo, d’autant plus lorsqu’il s’agit de vectorisation, comme c’est le cas ici. Le passage sur un modèle in vivo est donc inévitable pour juger de façon optimale notre stratégie thérapeutique.
Réduction
Dans un but de réduction du nombre d’animaux, nous avons choisi d’effectuer dans un premier temps la procédure 1 qui consiste à définir la dose optimale de MIA injectée en intra-articulaire et valider le modèle avant de passer à la procédure 2. Lors de la procédure 1, nous évaluerons progressivement les doses en commençant par la plus faible de 30 mg/ml et nous nous arrêterons lorsque l’effet attendu souhaité (arthrose inflammatoire) sera atteinte. Le nombre d’animaux pour cette procédure est donc surexprimé et il est possible que les doses les plus importantes ne soient pas nécessaires. Dans ce cas, nous réduirons le nombre d’animaux. De plus, nous avons constitué des groupes de 10 souris ce qui correspond au nombre de souris minimal nécessaire à la réalisation des analyses de caractérisation souhaitées avec une bonne significativité (5 souris pour de l’histologie et 5 souris pour des western-blot). En ce qui concerne la procédure 2, ici aussi les groupes sont de 10 souris. Ce nombre correspond au nombre minimal de souris qui nous permettra d’obtenir les données suffisantes attendues et de façon significatif pour avoir une réponse définitive sur l’efficacité du traitement sans avoir besoin de recommencer le protocole.
Raffinement
Le modèle MIA étant un modèle de douleur, une surveillance accrue sera mise en place notamment par le suivi du score clinique. Une attention particulière sera effectuée quant à la locomotion et un suivi du poids tous les deux jours sera réalisé. En effet, un problème de locomotion pourrait gêner les déplacements et l’accès à la nourriture. Dans ce cas là des dispositions seront prises telles que la nourriture directement dans la cage.
Choix des espèces
Le modèle d’inflammation MIA que nous avons choisi dans ce projet est très couramment utilisés et caractérisés chez le rongeur (rats ou souris). Nous avons choisi ici le modèle souris. Les souris seront utilisées à 8 semaines, un stade pour lequel leur articulation est suffisamment développée pour l’injection en intra-articulaire.
Effet de candicats-médicaments dans un modèle murin de la maladie de Parkinson, basé sur l’injection stéréotaxique d’alpha-synucléine oligomérique et de l’inhibition de GBA1
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
516 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique du cerveau, des traitements chroniques quotidiens par gavage ou injection, des tests moteurs, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie avant le prélèvement des tissus. Le porteur évalue le potentiel neuroprotecteur de plusieurs candidats-médicaments dans un modèle de la maladie de Parkinson, un éventuel passage en clinique restant conditionné à des résultats positifs. La rubrique remplacement tient en une phrase, le porteur affirmant que la complexité de la maladie ne peut être atteinte qu'avec un modèle animal.
Objectifs
L’objectif de cette étude est d'évaluer le potentiel neuroprotecteur de plusieurs candidats médicaments dans un modèle murin de la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats-médicaments pour cette maladie incurable. En cas de résultats positifs, le développement des candidats médicaments pourra être poursuivi, , et pourront à terme entrer dans des études cliniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à de la chirurgie stéréotaxique, sous anesthésie générale (isoflurane, 4 % induction puis 2%). Les souris récupèrent bien de la chirurgie. Les procédures incluent des traitements chroniques (quotidiens ou 3 fois par semaine) par gavage, injections sous-cutanées ou injections intra-péritonéales. Les fonctions motrices seront évaluées avec des tests de coordination motrice. Ces tests seront rapides (maximum 5 minutes par jour), sur deux jours. Les animaux subiront une perfusion intra-cardiaque sous anesthésie profonde.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Le traitement quotidien des souris par gavage peut induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Les tests de motricités peuvent également induire une nuisance chez les souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (ex. histologie).
Remplacement
Les processus pathophysiologiques de la maladie de Parkinson impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (neurones et cellules gliales) dans différentes structures cérébrales. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.
Réduction
Le nombre de souris (n par expérience) a été optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. À cette fin, des études antérieures disponibles dans la littérature scientifique suggèrent un nombre minimal de 12 souris par groupe, afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs en termes de (i) détérioration de fonctions motrices, et (ii) % de neurones morts (neurodégénérescence); deux caractéristiques essentielles et déterminantes dans la pathophysiologie de la maladie de Parkinson. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuel effets significatifs de candidats médicaments dans modèle animal de la maladie de Parkinson.
Raffinement
Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement, (ii) des approches d'analgésies avant, pendant et après l'opération, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (température corporelle) pendant et après l'opération (pour assurer un rétablissement rapide). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (5 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libidum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique (buprenorphine, 0.1mg/kg, 100µL) sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort..
Choix des espèces
La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la maladie de Parkinson. Le modèle reproduit notamment plusieurs caractéristiques de la ma La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiées aux études impliquant des souris.
Rôle des canaux TRP dans l’hypersensibilité viscérale générée par la consommation d’un régime riche en fer héminique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 72 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 24 modéré. Nourries trois semaines à un régime enrichi en fer héminique, 72 subissent une chirurgie d'une à deux heures pour poser un dispositif de mesure puis une pression douloureuse répétée dans le côlon, les 24 autres passant 24 heures en cage à métabolisme. Le porteur teste l'hypothèse que le fer des viandes rouges et charcuteries active des récepteurs de la douleur intestinale, en vue de futures pistes thérapeutiques contre le syndrome de l'intestin irritable. Il affirme qu'aucune approche in vitro n'évalue la sensibilité viscérale et que seule une approche in vivo intégrée le permet.
Objectifs
Le syndrome de l’intestin irritable est une pathologie intestinale chronique très répandue (10-15% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées, et une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Bien que d’origine multifactorielle, des facteurs nutritionnels contribuent fortement à l’aggravation des symptômes. Les viandes rouges et charcuteries ne sont actuellement pas connues comme des aliments associés à l’exacerbation des symptômes de douleurs viscérales associées à ce syndrome mais une étude suggère que le fer héminique de ces produits carnés, de par le stress oxydatif induit dans le côlon, engendre une sensibilité viscérale accrue en réponse à un stimulus douloureux. Une étude complémentaire est nécessaire pour comprendre comment ce stress oxydatif induit cette hypersensibilité. Sur la base de la littérature scientifique et des métabolites identifiés dans le contenu du côlon de souris nourries avec un régime supplémentés en fer héminique, nous émettons l’hypothèse que les métabolites associés à ce stress oxydatif activent au niveau de l’épithélium intestinal certains récepteurs de la famille des TRP, et plus particulièrement 2 d’entre eux, TRPA1 et TRPV1, pour lesquels des inhibiteurs pharmacologiques sont connus et déjà utilisés chez la souris pour inhiber les voies de signalisation suspectées.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mettre en lumière un nouveau facteur alimentaire à prendre en compte dans le régime des patients atteints du syndrome de l’intestin irritable, à savoir la consommation de viandes rouges et charcuteries. Ces données contribueront par ailleurs à préciser les bénéfices/risques et les recommandations nutritionnelles en fer au sein de la population générale. Enfin et surtout, elles devront permettre, par l’approche mécanistique envisagée, de comprendre comment cet inconfort digestif survient. Il s’agit donc d’un prérequis pour envisager à l’avenir de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
24 souris nourries avec un régime supplémenté ou non en fer héminique pendant 3 semaines seront placées chacune 24 heures en cage à métabolisme. 72 souris nourries avec un régime supplémenté ou non en fer héminique pendant 3 semaines seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (analgésiques/myorelaxants) à raison de 1h-2h par intervention pour placer un dispositif de mesure des contractions abdominales. Le nombre de contractions sera compté en réponse à l’application d’une pression intracolique pendant 10 secondes à 4 reprises par palier. Un inhibiteur pharmacologique ou son solvant sera administré par injection intrapéritonéale 2 heures avant la mesure pour inactiver les récepteurs TRPA1 et TRPV1.
Impact sur les animaux
Le stress modéré induit par la stabulation sur grille en cage à métabolisme pourrait modifier la mesure des contractions abdominales, c’est pourquoi ces 24 souris seront uniquement destinées à la collecte des échantillons. Pour minimiser ce stress, une buchette de bois à ronger est ajoutée dans la cage à métabolisme. Pour les souris dont l’amplitude des contractions abdominales sera mesurée, la douleur sera palliée pharmacologiquement pendant l’intervention chirurgicale et en post-opératoire tout en veillant au maintien de la température corporelle par un hébergement dédié en armoire ventilée chauffée, et à la réhydratation des souris. L'injection intra-péritonéale est un geste, rapide et indolore qui sera conduit après convalescence sur les souris vigiles. La pression intracolique appliquée à 4 reprises est associée à un inconfort, un stress et une mobilité réduite de la souris. L’arrêt entre chaque palier permet de retrouver immédiatement un enregistrement de base, signifiant l’arrêt instantané du stimulus douloureux. Si, comme attendu, le/les inhibiteurs pharmacologiques suppriment les effets induits par le fer héminique du régime des souris, alors le ressenti sera similaire à celui des souris sous régime conventionnel. Un personnel compétent ayant l’expérience de ces procédures fera un suivi quotidien pour leur apporter tous les soins nécessaires et maximiser leur bien-être. Il leur assurera en parallèle des manipulations les moins stressantes possibles avec des conditions d'hébergement les plus optimales.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures.
Remplacement
Les modèles cellulaires ont montré que le stress oxydatif généré dans la lumière colique lors de la consommation d’un régime riche en produit carné, pouvaient induire une cytotoxicité différentielle entre des cellules normales et précancéreuses. Cependant, aucune étude in vitro ou ex-vivo à ce stade du projet nous permet d’évaluer les conséquences d’un régime sur la physiologie digestive et plus particulièrement sur la sensibilité viscérale. Seule une approche in vivo intégrée nous permettra de prendre en compte la complexité des répercussions de l'exposition à ces contaminants d’origine alimentaire.
Réduction
Les études précédentes associées à ce projet nous ont permis d’améliorer la procédure en termes de technicité (expérience de l’expérimentateur) et de bien-être (de l’animal). L’amélioration de la prise en charge de la phase opératoire (technicité) et post-opératoire (augmentation de la température de l’hébergement sur 3 jours en armoire à 26°C) a permis de diminuer le nombre d’animaux requis pour aboutir à des résultats significatifs et fiables : de 15 souris initialement par groupe, 12 souris par groupe sont aujourd’hui considérées comme nécessaires pour compenser une variabilité interindividuelle résiduelle. Étant donné l’expertise technique acquise, la reproductibilité des mécanismes induits pour ce projet jusqu’ici, nous estimons qu’une répétition de cette étude ne sera pas nécessaire, ce qui permet de réduire également le nombre de souris requis.
Raffinement
Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être de l’animal (conditions d’hébergement, libre accès à l’eau et à la nourriture, contrôle de l’environnement, respect du cycle jour nuit, manipulations douces). Des buchettes en peuplier disposées sur la litière leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Un abri en aluminium leur permettra de s’y loger. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour détecter à temps toute anomalie et minimiser la durée de toute souffrance constatée. Toutes les mesures seront prises pour réduire la douleur (anesthésie, prise en charge de la douleur post opératoire, tapis chauffant, hébergement transitoire en armoire chauffée en période post-opératoire, réhydratation...). En parallèle, une combinaison d'analyses statistiques intégratives permettra d'exploiter l'ensemble des données générées et explorer plus finement les intéractions entre l'hôte et son microbiote.
Choix des espèces
La souris est un modèle rongeur largement utilisé pour la mesure de la sensibilité viscérale. Nous avons choisi la lignée C3H/HeN car les travaux précédents de l’équipe avec cette lignée permettent d’avoir maintenant une bonne base de connaissance de sa barrière intestinale, son microbiote, son système immunitaire et de sa réponse à la sensibilité viscérale. Pour l’analyse de la sensibilité viscérale, les animaux seront âgés de 9-10 semaines car il est indispensable d'avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.