Procédures sévères

488 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils subissent des chirurgies de deux heures, une induction de crises de migraine par injections répétées et des séances d'imagerie de quatre à cinq heures sous anesthésie, la sensibilité de la face étant mesurée par application de filaments. Le porteur écrit qu'il ne soulagera pas les animaux pendant les crises migraineuses, dont il attend l'apparition chez tous les animaux induits, sur une durée allant jusqu'à dix jours dans le modèle chronique. Il affirme que les approches sur "l'animal entier" restent "incontournables" et qu'aucune méthode in vitro ou in silico n'existe pour ces mécanismes de douleur.

Objectifs

La migraine est une pathologie neurovasculaire touchant près de 15% de la population mondiale qui se caractérise par des maux de tête (céphalées), associés à une hypersensibilité au bruit, à la lumière et aux stimuli tactiles, comme les caresses. La phase douloureuse est déclenchée par l’activation des terminaisons nerveuses innervant les méninges qui entourent le cerveau. Puis différentes régions du cerveau et des ganglions trigéminés seront activés à leur tour. Les modifications fonctionnelles et structurelles des réseaux neuronaux cérébraux impliquées dans la migraine, en particulier l’impact des antimigraineux, sont encore, à l’heure actuelle, mal connues. L’une des limitations est le manque de résolution des techniques d’imagerie disponibles pour les recherches sur le petit animal. Grâce à l’utilisation d’une technique innovante de neuroimagerie, nous proposons d’étudier les changements fonctionnels et structurels des différentes regions cérébrales impliquées dans la douleur associée aux crises migraineuses. De plus, nous voulons mieux comprendre les mécanismes d’action des antimigraineux et comme la migraine est plus fréquente chez la femme que chez l’homme nous voulons comparer des rats males et femelles. Pour cela, nous utiliserons différents modèles de migraine pertinents cliniquement. L’induction des modèles sera validé grâce à suivi étroit du comportement douloureux de nos animaux, avec la mesure de sensibilité mécanique faciale de l’ensemble des rats (contrôles et migraineux) avant, pendant et après la mise en place du modèle de migraine et lors des crises migraineuses. Ce test respecte les règles éthiques établies par l’IASP (International association for the Study of Pain) puisqu’il permet l’échappement de l’animal vis-à-vis du stimulus qui est de courte durée (3 secondes par stimulation mécanique).

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de mettre en evidence les changements fonctionnels au niveau cerebral et des ganglions trigéminés associés à la migraine. La comparaison des changements en contexte de crise aigüe ou chronique apportera des informations clés sur la le développement à long terme de la douleur migraineuse. De plus, l’évaluation de l’effet des traitements antimigraineux apportera des informations concrètes sur les changements fonctionnels cérébraux en réponse aux différents traitements. Enfin, les propriétés intrinsèques de la technologie de neuroimagerie utilisée apporteront de nouvelles informations pertinentes sur la composante neurovasculaire dans la migraine, qui joue un rôle clef dans sa physiopathologie. A plus long terme, les résultats de ce projet permettront d’envisager de futures études cliniques interventionnelles chez l’humain avec pour objectifs : 1) d’une part la confirmation des résultats obtenus chez l’animal chez l’humain et 2) d’autre part d’utiliser la neurostimulation d’une (ou des) zones identifiée(s) par notre technique innovante de neuroimagerie qui permettra la stimulation des structures cérébrales, même profondes, impliquées dans la physiopathologie de la migraine. Cette technique viendrait révolutionner la prise en charge thérapeutique des patients migraineux.

Procédures

Nous nous attendons à certaines nuisances et effets indésirables directement associés aux différents gestes techniques que nous allons réaliser : 1) Chirurgie pour permettre l’administration du mélange pro-inflammatoire en aigu. Cette chirurgie réalisée sous anesthésie générale (durée moyenne de 2h) sera réalisée sur 64 rats mâles et 64 rats femelles, une seule fois pour chaque animal. 2) Chirurgie de mise en place de la canule pour le modèle de mélange pro-inflammatoire chronique. Cette chirurgie réalisée sous anesthésie générale (durée moyenne de 2h) sera réalisée sur 64 rats mâles et 64 rats femelles, une seule fois pour chaque animal. 3) Chirurgie d’amincissement du crâne pour permettre la neuroimagerie. Cette chirurgie réalisée sous anesthésie générale (durée moyenne de 2h) sera réalisée sur l’ensemble de nos rats soit 244 rats mâles et 244 rats femelles, une seule fois pour chaque animal. 4) Modèle de migraine induit par l’administration d’un donneur de monoxyde d’azote en chronique : 4 injections intrapéritonéales réalisées sur animal vigile tous les jours pendant 4 jours et la 5ème injection sera réalisée sous anesthésie générale le 5ème jour : le jour de l’imagerie, sur 86 rats mâles et 86 rats femelles. 5) Modèle de mélange pro-inflammatoire aigu : injection sous anesthésie générale (10 minutes). Injection réalisée une seule fois sur 64 rats mâles et 64 rats femelles. 6) Modèle de mélange pro-inflammatoire chronique : 5 injections au total réalisées tous les deux jours sous anesthésie générale (10 minutes) via la canule guide sur 64 rats mâle et 64 rats femelle. 7) Neuromagerie: séance d’imagerie réalisée une fois pour chaque animal sous anesthésie générale (durée moyenne de 4 à 5h) par inhalation d’anesthésique gazeux pour l’ensemble de nos animaux soit 244 rats mâles et 244 rats femelles. 8) Mesure des seuils de sensibilité mécanique : mesure sur animal vigile pour l’ensemble de nos animaux soit 244 rats mâles et 244 rats femelles. Le test dure entre 60 minutes à 75 minutes mais l’application des filaments ne dure que 3 secondes et cette application n’est répétée qu’entre 5 et 8 fois. Cette mesure sera réalisée plusieurs fois selon les modèles, en amont, pendant et après les crises migraineuses.

Impact sur les animaux

Suite aux chirurgies, malgré l’utilisation d’antalgiques pendant et après ces procédures chirurgicales, les animaux peuvent présenter une activité réduire et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Ainsi, la période post-opératoire de 48h après une chirurgie d’amincissement avant la séance d’imagerie et d’une semaine après une chirurgie de mise en place d’une canule guide avant l’induction des modèles permettra une récupération complète de l’animal. Comme nous voulons étudier les mécanismes cérébraux associés aux douleurs migraineuses, nous ne soulagerons pas les animaux pendant les crises migraineuses. Il est donc attendu le développement de douleurs migraineuses pour l’ensemble de nos animaux induits. Cependant un suivi étroit sera réalisé et tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. traitements antalgiques, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal). Pour nos modèles, la durée moyenne des douleurs migraineuses sera de 1h30 pour une injection de soupe inflammatoire en aigu à 10 jours sur un modèle chronique avec des pic de douleur sous forme de crise d’1h à quelques heures et des phases moins douloureuses. Un suivi étroit de la douleur orofaciale sera réalisé dans chacun des modèles chroniques. Notons que nos analyses en imagerie se feront sur animal anesthésié, limitant ainsi la perception douloureuse de l’animal. Néanmois, l’anesthésie prolongée des animaux pour les séances d’imagerie pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal. Celles-ci seront monitorées grâce au suivi des fréquences cardiques et respiratoires. Tout dépassement d’un point limite conduira à une réponse adaptée de l’expérimentateur (i.e. correction du taux d’anesthésique gazeux pour maintenir le niveau adéquat d’anesthésie, modification de la procédure ou mise à mort de l’animal).

Devenir

L’issue de chacune des procédures n°1 à n°5 est la mise à mort des animaux par injection d’euthanasiant chimique pour les animaux utilisés pour la mise en place des modèles au sein du laboratoire ou par perfusion intracardiaque pour l’ensemble des animaux inclus dans notre étude.

Remplacement

Notre projet porte sur la mesure et le suivi des changements fonctionnels et structurels des différentes regions cérébrales impliquées dans la douleur associée aux crises migraineuses par une nouvelle approche de neuroimagerie. Dans ce contexte, les approches intégratives sur l’animal entier restent incontournables. A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données sur des processus cognitifs complexes et pour l’étude et l’analyse des mécanismes de la douleur.

Réduction

Pour ce projet et afin de respecter la règle de reduction, nous utiliserons un nombre limité de rats et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée (analyse de variance suivi d'un test post-hoc paramétrique si la distribution est normale ou un test non paramétrique dans le cas contraire). Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.

Raffinement

Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. Un suivi quotidien sera assuré contrôlant leur comportement général, leur apparence et la présence d’eau et de nourriture. Les animaux seront hébergés à deux par cage dans le respect des surfaces réglementaires avec enrichissement (tunnel, bois à ronger). Nous avons déterminé des points limites anticipés, liés à l’état général de santé et de bien-être et liés au modèle expérimental et aux procédures. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous définirons un score décisionnel en fonction des observations quotidiennes permettant de modifier la procédure en cours avec administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou de metre à mort l’animal en dernier recours. Les chirurgies seront réalisées en conditions aseptiques. Pour réduire la douleur pendant la chirurgie, elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse et l’animal sera injecté avec des antalgiques. De plus, toute infection suite aux chirurgies prévues dans nos procédures, non maitrisable par traitements médicamenteux entrainera un arrêt immédiat du protocole en cours et l’euthanasie de l’animal par une dose létale d’euthanasiant chimique sous anesthésie gazeuse. Pendant toute la durée des actes sous anesthésie, les constantes vitales seront suivies : température corporelle, pression partielle en O2 et fréquences cardiaque et respiratoire. Aucun acte ne sera entreprit avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement la mise à mort de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’euthanasiant chimique.

Choix des espèces

Les modèles rongeurs sont des modèles de choix pour les études comportementales et des bases physiologiques du cerveau car ils présentent des mécanismes cognitifs complexes et une cartographie fonctionnelle transposable aux humains. Le modèle rat est en particulier adapté aux études comportementales pour sa rapidité d’adaptation. Son poids et sa taille permettent d’avoir une bonne flexibilité expérimentale sans avoir recours à une miniaturisation ayant un coût prohibitif. De plus, les modèles de migraine choisis ont déjà été développés chez le rat et diminueront le nombre d’animaux utilisé pour la mise en place des modèles de migraine. Les rats seront reçus au poids choisi de 150-200g, correspond à celui d’un jeune adulte. Ainsi après une semaine d’habituation et une semaine de comportement, les animaux seront aux poids d’environ 250-300 g pour les mâles et 200-250 g pour les femelles pour démarrer les chirurgies. Notons que plus les animaux sont âgés, plus le crâne est épais et donc la chirurgie d’amincissement longue et susceptible de créer des dommages.

2 856 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 016 dans des procédures de souffrance sévère. Des femelles gestantes sont enfermées dans un tube de contention sous lumière vive trois fois par jour pendant six jours, et leur descendance est infectée par gavage bactérien puis soumise à une distension colorectale par électrodes implantées sous chirurgie et à un test d'anxiété en labyrinthe surélevé. Le porteur indique que l'infection provoque une colite avec diarrhée et sang dans les selles, et que les petits développent des comportements anxieux et dépressifs durables. Il affirme que la douleur, le stress et l'infection sont des réactions de l'"organisme entier" impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

Les maladies inflammatoires et/ou douloureuses chroniques (comme les maladies auto-immunes et allergiques) représentent un problème majeur de santé publique et les approches thérapeutiques utilisées aujourd’hui ne donnent pas entière satisfaction. Il est donc important de comprendre la physiopathologie de ces maladies au niveau cellulaire et moléculaire afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. De nombreux facteurs environnementaux ont été décrits comme participant à la genèse de ces pathologies ou comme facteurs facilitateurs de la mise en place de ces maladies chroniques. Parmi ces facteurs environnementaux, de nombreuses études épidémiologiques placent le stress et les infections bactériennes comme les facteurs majeurs impliqués dans la régulation de la douleur et de l'immunité. L'objectif de notre projet est de comprendre l'association qui pourrait exister entre le stress et l'infection dans la mise en place du système immunitaire intestinal et de la sensibilité viscérale.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche devrait nous permettre de mettre en évidence le rôle du stress et de l'infection au cours de la gestation sur le développement de maladie chronique chez la descendance. Il s'inscrit dans le concept beaucoup plus large des 1000 premiers jours de vie. En effet, beaucoup de grands systèmes (nerveux, immunitaires, intestinaux…) s’établissent au cours des 1000 premiers jours de vie de l’enfant en parallèle et de façon interdépendante de l’établissement du microbiote intestinal. Le stress et les infections bactériennes interagissent avec tous ces systèmes et peuvent donc avoir des conséquences à long terme sur la santé de l’individu. Les retombées immédiates de ce projet seront une meilleure connaissance de l'implantation du microbiote intestinal en lien avec la maturation du système immunitaire, de l'infection chez l'enfant, de l'impact du stress lors de la grossesse et de l’impact de ces perturbations sur la mise en place de maladie chronique à l’âge adulte. Nos analyses biologiques devraient permettre de déterminer des biomarqueurs permettant une prise en charge ciblée de ces pathologies.

Procédures

Pour générer des souris F1 issues de mères stressées, 84 femelles seront placées dans un tube de contention sous une lumière vive durant 30 min, 3 fois par jour, pendant 6 jours, du 13ème jour au 18ème jour de gestation. Pour une étude, sur les 576 souris F1, la moitié sera soumise à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 3ième semaine de vie. Sur la moitié des souris infectées ou non infectées, soit 288 souris, la douleur viscérale sera déterminée par distension colorectale suite à l’implantation d’électrodes sous anesthésie chirurgicale (environ 1h) à la 8ième semaine de vie. La perméabilité paracellulaire sera évaluée soit à la 5ième semaine de vie, soit à la 8ième semaine de vie, avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse. Pour une deuxième étude, sur les 576 souris F1, la moitié des souris sera soumise à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 3ième semaine de vie. Sur l’ensemble des 576 animaux, le comportement anxieux sera évalué par le test du labyrinthe en croix surélevé sur animaux vigiles à la 5ième semaine de vie (288 souris) ou à la 8ième semaine de vie (288 souris). La perméabilité paracellulaire sera évaluée soit la 5ième semaine de vie (288 souris) ou à la 8ième semaine de vie (288 souris) avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse. Dans une dernière partie de l’étude, sur les 864 souris, 288 des souris F1 seront soumis à une simple infection par citrobacter rodentium par gavage sur animaux vigiles à la 8ième semaine de vie alors que 288 souris seront soumises à une double infection par 2 gavages, un gavage à la 3ième semaine de vie et un gavage à la 8ième semaine de vie sur animaux vigiles. Sur la moitié des souris soit 432, la douleur viscérale sera déterminée par distension colorectale suite à l’implantation d’électrodes sous anesthésie chirurgicale (environ 1h) à la 10ième semaine de vie sur l’ensemble. Sur l’autre moitié des souris soit 432, le comportement anxieux sera évalué par le test du labyrinthe en croix surélevé sur animaux vigiles à la 10ième semaine de vie. La perméabilité paracellulaire sera évaluée à la 10ième semaine de vie avec un gavage oral de Dextran-FITC sur animaux vigiles et un prélèvement sanguin mandibulaire après anesthésie gazeuse pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Ce modèle de stress prénatal n'induit pas de douleur spontanée chez la souris. Nous attendons le premier jour de la procédure de stress une stabilisation du poids ou une perte de moins de 3.5% du poids des mères gestantes en comparaison avec les mères gestantes non stréssées. Dès le deuxième jour de la procédure de stress les mères gestantes doivent reprendre du poids. Le stress réalisé sur les mères gestantes ne comporte pas d'effet visible comportemental. Le stress prénatal entraine chez la descendance des comportements anxieux et dépressifs observés tout au long de la vie et révélés à l’aide de test comme le labyrinthe en croix surélevé. Ces comportements n’ont cependant pas d’impact sur la prise alimentaire ou la croissance des animaux. L’infection par citrobacter rodentium entraine une réponse inflammatoire colique transitoire (entre le 5ème et le 15ème jours post gavage). Lors de la colite, les souris souffrent de diarrhée, de présence de sang dans les selles et d’une perte de poids. La bactérie n’est plus détectée dans les selles 21 jours après le gavage. Trente jours après le gavage, les souris ne présentent plus de signes macroscopiques d’inflammation. Au niveau microscopique, elles présentent un épaississement de la muqueuse et de la musculeuse du colon. De nombreuses études ont utilisé l’infection par citrobacter rodentium, les doses que nous allons utiliser dans notre étude ont été décrites comme n’ayant pas d’impact sur la survie. Après la chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle pendant 4 jours au maximum afin d'éviter qu'ils ne se mangent les électrodes. Nous ne pouvons pas replacer les animaux ensemble, car sans les électrodes nous ne pouvons pas enregistrer l'activité musculaire au cours de la distension colorectale.

Devenir

Les animaux ayant servi à générer la descendance F1 seront mis à mort après le sevrage des F1 et des prelèvements d'organes seront réalisés. Les souris F1 après simple infection seront euthanasiées à différents âges : soit à 5 semaines de vie soit à 8 semaines de vie. Les souris F1 après double infection seront euthanasiées à 10 semaines de vie. Des prélèvements tissulaires seront collectés pour différentes études au niveau cellulaire et moléculaire.

Remplacement

Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut immunitaire et douloureux de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. De plus, la douleur, le stress, l'infection et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.

Réduction

Pour ce modèle, les animaux seront suivis régulièrement au cours du temps par des techniques non invasives comme le suivi du poids, la consistance des fèces et la présence de sang dans les fèces évaluée par le test HémoccultII® et de façon plus spécifique par l'analyse des scores cliniques pour l'infection. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude, permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. Le nombre de 12 animaux par groupe expérimental est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, principalement due à la variabilité interindividuelle des réponses étudiées. Nous utiliserons des analyses non paramétriques, le test Kruskal-wallis suivie d'un test post-hoc de Dunn pour les analyses multi-groupes et le test de Wilcoxon-Mann-Whitney pour les analyses concernant deux groupes.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, dans un premier temps, des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Selon la durée de l’étude, un deuxième enrichissement pourra être introduit dans l’environnement, tel que des aspen Brick, des tunnels en polycarbonate ou des igloos. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé quotidiennement. Une veille bibliographique sera effectuée pour déterminer si des méthodes de remplacement ont été mise en place. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure.

Choix des espèces

La souris présente des caractéristiques physiopathologiques proches de l'espèce humaine. Nous disposons également de souris déficientes pour l'expression de certains gènes cibles. Ces souris déficientes pourront, si ce projet aboutit, faire l'objet d'une nouvelle demande. Les mères seront stressées du 13 au 18 éme jours de gestation. C'est la période décrite dans la littérature pour ce modèle. Ensuite les souris F1 seront utilisées soit à 5 semaines de vie pour évaluer l'impact direct su stress et de l'infection avant le sevrage, soit à 8 semaines de vie pour évaluer l'impact du stress et de l'infection sur des animaux adultes et matures. D'autres souris F1, infectées ou non par citrobacter rodentium à la 3ième semaine de vie et ré-infectées à la 8ième semaine de vie pour évaluer l'éducation du système immunitaire vis-à-vis ce cette bactérie pathogène, seront utilisées à la 10ième semaine de vie.

12 350 animaux non-humains vont être utilisés, souris et rats, tous tués à l'issue, dont environ 4 600 dans des procédures de souffrance sévère. Quatre fibroses, rénale, pulmonaire, hépatique et dermique, leur sont provoquées, avec administrations répétées de composés pendant six à huit semaines, chirurgies et prélèvements sanguins, pour cribler des molécules antifibrotiques. Le porteur décrit des pertes de poids et des troubles respiratoires liés aux modèles. Il affirme que la mise à mort est "indispensable" pour prélever les organes et que les tests in vitro ne permettent pas de se passer de l'animal, avec pour horizon une mise sur le marché.

Objectifs

La fibrose se définit comme un processus pathologique de cicatrisation tissulaire. Elle est observée dans la majorité des organes (poumon, foie, rein, peau…). Le besoin médical est important car environ 45% des décès dans les pays développés sont reliés à une maladie fibrosante. Néanmoins à ce jour, aucun traitement curatif contre la fibrose n’est disponible et ce quel que soit l’organe touché. Deux traitements prescrits pour la fibrose pulmonaire permettent de ralentir la progression de la maladie sans nécessairement réduire les symptômes chez les patients. Dans ce contexte, le but de ce projet est de développer de nouvelles thérapies pour répondre à ce besoin médical important.

Bénéfices attendus

A ce jour, aucun médicament utilisé dans le traitement de la fibrose chez l’homme n'a permis de reverser et/ou stopper complètement une fibrose établie sur le plan histologique ou clinique. Toute fibrose confondue représente 45 % des décès dans les pays développés. Le but des expérimentations mises en place est de développer des molécules pouvant ralentir et/ou stopper le développement de la fibrose dans nos modèles expérimentaux. Les différentes procédures utilisées dans ce projet vont nous permettre d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement des différentes fibroses. Elles vont également nous permettre, en support du travail réalisé in vitro, la recherche et la validation de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de la fibrose. De plus ces procédures nous permettront, une fois une cible identifiée, de développer de petites molécules permettant de reverser et/ou stopper le développement de la fibrose et aussi d’évaluer des combinaisons thérapeutiques afin d’augmenter l’efficacité ou de limiter les effets non désirables de certains composés prometteurs pour le traitement de la fibrose. L’ensemble de ces travaux a pour but d’avancer au maximum le développement préclinique de traitement anti-fibrotique en vue de leur développement clinique et leur mise sur le marché.

Procédures

Les gestes techniques réalisés sur animaux se pratiquent sur rats et souris, vigiles ou anesthésiés. - Sur animaux vigiles : o Identification individuelle (oreille, queue, patte). Tous les animaux de ce projet sont concernés par au moins un type d’identification. o Administration de composés par voies orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse. Ces gestes concernent la totalité des animaux de ce projet. Les administrations par voies orale, péritonéale et sous-cutanée peuvent être réalisées une à deux fois par jour, pendant 6 à 8 semaines. Les administrations par voie intraveineuse peuvent être réalisées une à deux fois par semaine, pendant 6 à 8 semaines. - Sur animaux anesthésiés par voie gazeuse ou par voie systémique : o Administration par voie oropharyngée. Acte unique qui concerne 1500 souris. o Administration par voie sous-cutanée. Acte réalisé au maximum 5 fois par semaine, pendant 4 semaines qui concerne 250 souris o Prélèvements sanguins intermédiaires au maximum 4 fois par animal ou terminaux. Ils sont réalisés en respectant les recommandations en termes de volumes et temps de récupération. Tous les animaux de ce projet sont concernés. o Mises à mort par une méthode règlementaire ou une méthode validée par un comité d’éthique. Tous les animaux de ce projet sont concernés. o Chirurgie (acte unique). Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. 600 souris et 250 rats sont concernés.

Impact sur les animaux

Quatre procédures décrivent des modèles de fibroses (rénale, pulmonaire, hépatique et dermique) qui par conséquent recréées de façon accélérée toutes les étapes impliquées dans la progression de cette pathologie. Ces modèles sont bien caractérisés dans nos laboratoires et n’engendrent pas d’effets indésirables autres que ceux liés aux modèles eux-mêmes. Le modèle de fibrose rénale nécessite de recourir à la chirurgie pour sa mise en place. Cette chirurgie provoque une perte de poids mineure. Sur la durée pendant laquelle le modèle est étudié, aucun signe clinique majeur n’est relevé. Les modèles de fibrose pulmonaire et dermique engendrent l’apparition de signes cliniques bien caractérisés tels que la perte de poids, liée essentiellement à une phase inflammatoire précoce et un trouble respiratoire par la suite. Le modèle de fibrose hépatique n’engendre pas de signes cliniques caractéristiques sur la durée pendant laquelle il est réalisé.

Devenir

La mise à mort des animaux à l’issue des procédures est indispensable afin de pouvoir prélever le sang et les organes et réaliser les analyses permettant de répondre aux objectifs du projet.

Remplacement

Pour tester l’activité in vivo des composés issus du screening cellulaire in vitro, il est indispensable de recourir à l’utilisation de modèles animaux reproduisant le plus possible la pathologie humaine, qui intègrent toute la complexité des réactions physiologiques (interactions intercellulaires, inter-organes, inflammations…). Tous les modèles utilisés sont très bien décrits dans la littérature scientifique et ont été validés avec des composés de référence. Le processus de screening des composés est réalisé sur des tests cellulaires ou non-cellulaires in vitro. Ces tests permettent de réduire le nombre de composés à tester chez l’animal mais ne permettent malheureusement pas de se passer des modèles animaux.

Réduction

La sélection des composés est faite en utilisant des tests cellulaires ou non cellulaires in vitro. Seules les molécules présentant une activité sur les tests in-vitro et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront testées sur les animaux. Ce système permet de réduire considérablement le nombre de molécules testées chez l’animal et donc le nombre d’animaux utilisés. Seuls les modèles animaux, bien décrits et validés par la communauté scientifique sont réalisés. En règle générale, 5 à 12 animaux sont utilisés par groupe. Des analyses statistiques permettent de mesurer si l’effet du composé est significatif. L’étude est répétée une deuxième fois pour évaluer la reproductibilité du test.

Raffinement

Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. Dès l’arrivage, les animaux sont habitués à la manipulation afin de limiter le stress lors du déroulement des procédures. Ils sont observés tous les jours et leur état clinique est évalué au minimum deux fois par semaine grâce à des grilles de signes cliniques permettant une gradation précise et adaptée de leur gravité. Ces grilles gradées engendrent la mise en place d’actions correctives comme la modulation des doses et fréquences des composés administrés ou l’ajout d’aliment gélifié dans les cages, voire l’arrêt de la procédure pour les animaux concernés (points limites et critères d’arrêt). Lors des procédures, notamment chirurgicales, les animaux bénéficient de soins peropératoires comprenant l’administration d’antalgiques et d’anesthésiques. Leur réveil est monitoré sur couverture chauffantes et accompagné de soins tels que l’ajout de complément d’enrichissement de leur milieu. Les conditions de chaque procédure expérimentale sont étudiées individuellement par la Structure Chargée du Bien-Être Animal (SBEA) qui émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux.

Choix des espèces

En pharmacocinétique, la souris puis le rat sont les espèces standards dans les premières phases de recherche et développement de nouveaux candidats médicaments. Le rat est choisi pour les molécules les plus intéressantes, afin de commencer la comparaison pharmacocinétique inter espèce, ainsi que de préparer les études de toxicologie futures. En pharmacologie, la souris est l’espèce recommandée et largement utilisée pour les premières étapes de la recherche. Elle permet de réduire les quantités de composés nécessaires à l’évaluation de leur efficacité. Les souris génétiquement modifiées permettent de valider de façon plus spécifique certains mécanismes d’action. Les modèles de fibrose ainsi que les études de pharmacocinétique sont réalisés avec des animaux juvéniles à adultes qui permettent une bonne évaluation de leur efficacité et la détermination de l’exposition des composés.

Des crises d'épilepsie provoquées par des chocs électriques délivrés sur les yeux ou les oreilles, par un son de forte intensité ou par l'injection de substances chimiques : 27 430 rongeurs vont être utilisés dans ces tests, 8 700 souris, 17 730 rats et 1 000 gerbilles de Mongolie. Pour 26 040 d'entre eux, les procédures impliquent un niveau de souffrance sévère, modéré pour les 1 390 autres, et tous sont tués à l'issue, certains après avoir reçu des électrodes dans le cerveau et des stimulations électriques deux fois par jour pendant cinq jours, pour qu'ils fassent une crise à chaque stimulation. Le porteur indique que les études, menées pour tester "l'innocuité et l'efficacité de substances pharmacologiques en développement", sont "principalement réalisées pour des clients du secteur privé pharmaceutique". Il affirme aussi que les procédures ont été "optimisées pour limiter la douleur chez l'animal", et précise que les rongeurs sont anesthésiés ou tués juste après une crise tonique "si possible", sinon à la fin du test. La cour administrative d'appel de Paris a annulé l'autorisation de ce projet le 3 juillet 2026, à la demande de l'association One Voice (arrêt n° 24PA05219), et le résumé ne figure plus sur ALURES.

Objectifs

Scientifique: le projet consiste en l'utilisation de tests basés sur l’induction de crises épileptiques par le moyen de stimulation électrique ou substances chimiques permettant de tester l'innocuité et l'efficacité de substances pharmacologiques en développement. Les études sont principalement réalisées pour des clients du secteur privé pharmaceutique. Ces études sont validées par les directeurs d'étude et la direction du site d'essai. Educatif: de façon à réaliser les procédures expérimentales décrites dans ce projet, dans de bonnes conditions et en respectant le mieux possible les 3Rs, il est indispensable que le personnel réalisant ces procédures soit correctement formé. Cette formation nécessaire dans le cadre de la validation du personnel à ces compétences techniques est réglementaire car permettant d'attester de l’acquisition de ces compétences.

Bénéfices attendus

Bien que ces modèles pré-cliniques soient sévères, ils sont recommandés pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments et leurs mises sur le marché. La recherche de nouveaux traitements est indispensable pour améliorer les conditions de vie ainsi que l’espérance de vie des patients. A l’heure actuelle, environ 30% des patients épileptiques ne répondent pas aux traitements médicamenteux disponibles.

Procédures

Chacune des procédures inclut une phase d’administration de substance (e.g. par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intra-veineuse). Procédures 1, 2, et 4 et 5 : les rongeurs sont soumis à une stimulation électrique (délivrée au moyen d'électrodes cornéales ou auriculaires) ou sonore (de forte intensité). Les symptômes épileptiques sont scorés dans la minute suivant la stimulation. Procédure 3 : un réactif est injecté et les symptômes épileptiques sont observés sur 30 minutes. Procédure 6 : des électrodes épidurales et en profondeur sont implantées afin d'enregistrer l'électroencéphalogramme (EEG). Après 2 semaines, une substance chimique est administrée et les signaux sont enregistrés sur 1 à 4 heures pendant 1 à 2 jours par semaine (durée totale de 4 à 5 semaines). Procédures 7 et 10 : les animaux sont implantés avec des électrodes afin d'enregistrer l'EEG. Après deux semaines, les signaux sont enregistrés sur 1 à 24 heures pendant 1 à 2 jours par semaine (durée totale de 4 à 5 semaines). Procédure 8 : les animaux sont opérés pour implanter des électrodes, afin de délivrer les stimulations et enregistrer l'EEG. Après 2 semaines de récupération, les animaux reçoivent des stimulations électriques cérébrales, 2 fois par jour pendant 5 jours sur 2 semaines, afin de les sensibiliser et que ces derniers développent une crise après chaque stimulation électrique. Puis, les effets d'une substance sont évalués et les animaux reçoivent 2 stimulations par semaine sur 4 à 5 semaines consécutives. Procédure 9 : une substance chimique est injectée et les symptômes épileptiques sont observés sur 1h (maximum de 3 injections sur 1 h). Une fois les animaux en état épileptique pendant 1 heure, une substance stoppant les symptômes est administrée. Les animaux sont gardés pendant 5 à 6 semaines et ceux présentant des symptômes d'agressivité sont sélectionnés et implantés avec des électrodes. Après 2 semaines, les signaux sont enregistrés sur 2 semaines consécutives pour détecter les crises spontanées. Quand cela est pertinent, des prélèvements de sang (en générale, veine mandibulaire, sublinguale ou caudale) peuvent être réalisés au cours de chaque procédure pour collecter des données de pharmacocinétique.

Impact sur les animaux

Certains tests décrits dans ce projet conduisent à l'apparition de crises partielles (clonus des pattes avant) ou généralisées (crises toniques ou redressement), après une stimulation électrique ou l'administration d'une substance chimique. Les animaux sont anesthésiés et /ou euthanasiés juste après l'observation d'une crise tonique si possible ou à la fin du test pour limiter la douleur. Bien que ces modèles soient sévères, ils sont recommandés pour évaluer de nouveaux traitements anti-épileptiques.

Devenir

Procédures 1 à 5 et 9 : en raison de l’induction de convulsions toniques, ces animaux sont immédiatement anesthésiés/euthanasiés à la fin du test. Procédures 6, 7, 8 et 10 : les animaux peuvent être gardés à la fin de la première étude car ils vont montrer des crises d'absence non convulsive ou des crises partielles évoluant en crises généralisées sans l'apparition de crises toniques. Ces animaux peuvent donc être réutilisés (dans le même modèle) pour tester d’autres composés anti-épileptiques et réduire le nombre total d’animaux utilisés pour plusieurs études. Ils seront toutefois euthanasiés à la fin de l’expérience.

Remplacement

Il existe des techniques alternatives permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de limiter le nombre d'animaux utilisés et de sélectionner les meilleurs candidats médicaments. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux et l'activité cérébrale.

Réduction

Dans certains modèles aigus d’épilepsie (test de convulsions suite à l'administration induite par une substance chimique, une stimulation électrique (test du 6 Hz) ou un son (test audiogénique), il est possible de tester plusieurs composés et doses dans une même expérience. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux contrôles (négatifs et/ou positifs) sur plusieurs études. Pour les modèles chroniques d’épilepsie (par faibles stimulations électriques répétées (« kindling ») ou test sur souche de rats «épileptiques » (rats WAG), un lot d'animaux sera implanté avec des électrodes et ces animaux recevront les 4 à 5 substances inclus dans une même étude, espacé d'une semaine entre chaque traitement. Les animaux sont réutilisés plusieurs fois afin de réduire le nombre total d’animaux. Par exemple, 12 rats seront opérés et ces animaux recevront 5 traitements différents sur 5 semaines (un traitement par semaine) au lieu d'utiliser 12 rats par traitement (soit 60 rats).

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Par exemple, lorsque les convulsions sont induites par une stimulation électrique cornéale, un gel anesthésiant est appliqué sur les yeux de l'animal pour limiter la douleur liée à l’application du choc électrique. Pour les procédures avec une chirurgie cérébrale, une analgésie est assurée pendant et durant les 48 heures suivants l’opération. Les animaux sont opérés sous anesthésie générale, mais une anesthésie supplémentaire est appliquée au niveau du crâne pendant la chirurgie, pour s’assurer de l’absence totale de sensation douloureuse. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter le dessèchement de l'œil pendant la chirurgie (les yeux restants ouverts lorsque les rongeurs sont anesthésiés). Dans certains modèles, l'enregistrement de l'électroencéphalogramme est réalisé en plus de l’évaluation comportementale des animaux (absence ou présence de convulsions) ce qui permet de compléter l'analyse comportementale et de raffiner le modèle.

Choix des espèces

Dans la plupart des cas, les études d’épilepsie sont effectuées chez le rongeur (souris ou rat) car ces modèles sont translationnels. Les substances anti-épileptiques mises sur le marché ont été découvertes en utilisant des modèles pré-cliniques chez le rongeur. Le choix de l’espèce (souris ou rat) est souvent lié aux études préalables réalisées (études de pharmacocinétique par exemple) et aussi en fonction de la disponibilité de la molécule. On utilisera de préférence la souris lorsque la molécule est en quantité limitée. Dans certains cas, le modèle n’est validé que chez une espèce (exemple du modèle du kindling par stimulation électrique de l’amygdale) utilisé principalement chez le rat). Une fois, l’efficacité d’une substance démontrée chez la souris et/ou le rat, une troisième espèce peut être recommandée par l’ANSM pour l’autorisation de mise sur le marché d’une nouvelle substance. Les rongeurs (rats, souris) sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique (Bialer and White, 2010; Barker-Haliski and White, 2020). Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période néonatale jusqu'à l'âge adulte.

514 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'au sévère, déclaré sévère pour 380 d'entre elles. Elles subissent une injection intracérébrale de virus et l'implantation de fibres optiques ou d'électrodes, puis un conditionnement qui associe un environnement à des stimulations désagréables, avant la réactivation optogénétique des neurones et la mise à mort. Le porteur étudie la peur et l'anxiété et affirme que ce travail ne peut se faire ni in vitro ni chez des invertébrés, jugés trop simples. Les retombées annoncées pour les troubles anxieux humains restent hypothétiques.

Objectifs

Les troubles anxieux représenteraient d’un quart à la moitié des troubles mentaux à travers le monde. En France, la prévalence des troubles anxieux est de 21,6%. Malgré cette prévalence, les traitements ne sont efficaces que chez seulement 30% des patients. Cette faible efficacité peut être en partie expliquée par la difficulté de classer précisément les différentes réactions de peur (comme les crises de panique et l’anxiété) dans les modèles animaux. Or, de récentes études menées au sein de notre laboratoire ont montré qu'un nouveau protocole expérimental permettait l'identification chez la souris de 2 états similaires à la panique et l'anxiété. Avec cette nouvelle perspective, l'anxiété semble être liée a des réactivations de neurones liés à une mémoire négative dans le cerveau. Le but de ce projet serait alors d'étudier l'impact de la réactivation artificielle de neurones liés à une mémoire négative chez la souris afin de savoir si cela permet l'observation d'un état similaire à l'anxiété. L'ensemble de ces travaux permetrait une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux et corporels impliqués dans des situations aversives, comme la peur et l'anxiété.

Bénéfices attendus

Ces travaux apparaissent comme nécessaires afin de pouvoir améliorer notre compréhension des troubles liés à la peur car ils pourraient permettre une définition claire des troubles associés à la peur, notamment en se basant sur des critères objectifs, universels et mesurables. Cette meilleure définition pourrait alors permettre une meilleure identification et évaluation de troubles mentaux afin d'anticiper leur apparition et d'améliorer la prise en charge des patients. De par l'utilisation du modèle rongeur, nous espérons pouvoir transposer les résultats de nos travaux non seulement aux patients atteints de troubles mentaux, mais aussi à d'autres espèces animales comme les animaux de production ou domestiques. En effet, les résultats de ces travaux pourraient également permettre une meilleure évaluation de l'état émotionnel de l'animal, thématique d'importance croissante dans l'amélioration du bien-être animal.

Procédures

La plupart des animaux de ce projet subiront une injection intracérébrale de virus permettant l'expression de protéines fluorescentes et parfois d'opsines (molécules permettant l'activation du neurone après stimulation lumineuse). Un quart des animaux ne subira qu'une deuxième rapide chirurgie pour implanter des fibres optiques en position intracérébrale. Les autres subiront une chirurgie plus technique permettant notamment l'enregistrement de signaux électrophysiologiques et l'implantation de fibres optiques. Suite à ces chirurgies, la plupart des animaux suivront un protocole d'association d'un environnement donné à des stimulations désagréables. Ils seront ensuite replacés dans cet environnement pour étudier la mémoire qu'ils en ont. Dans un autre temps, les neurones associés à cet environnement seront réactivés dans un contexte neutre. Après ce protocole expérimental qui dure de 3 à 4 semaines, les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes ainsi que les caractéristiques (niveau d'activation, nombre, localisation,..) des neurones qui ont été réactivés.

Impact sur les animaux

Pour réaliser les travaux de ce projet, il est nécessaire de réaliser des procédures invasives sur les sujets expérimentaux comme l'injection intracérébrale ou la chirurgie d'implantation des électrodes. De plus, le protocole de conditionnement aversif implique d'utiliser des stimulations désagréables pour l'animal afin de mieux pouvoir étudier la peur. Tout au long de leur hébergement, les animaux ont accès dans leur cage à des objets d’enrichissement (dôme, tubes). Le suivi par le personnel de l'animalerie est quotidien dans un contexte général et le suivi post-chirurgie est assuré par l'expérimentateur quotidiennement pendant une semaine avec relevé de signes potentiels de douleur et prise en charge analgésique si nécessaire.

Devenir

A l'issue de la procédure 1 et 2, les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir vérifier la localisation des électrodes ainsi que les caractéristiques (niveau d'activation, nombre, localisation,..) des neurones qui ont été réactivés.

Remplacement

Notre objectif est de comparer les réactions de défense quand elles sont induites par une expérience réelle et quand elles sont initiées par le souvenir d’une expérience aversive. Ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro, ex vivo ou in silico. Ces études ne peuvent pas non plus être réalisées chez les invertébrés, qui ont une structure cérébrale et un comportement trop simple De plus nous souhaitons étudier à la fois les réactions comportementales mais aussi les paramètres physiologiques comme la respiration ou le rythme cardiaque pour pouvoir faire un parallèle avec l’Homme (en plus de la proximité des agents pharmacologiques pour traiter les troubles anxieux). Enfin, les outils permettant de manipuler les neurones liés à un souvenir aversifs nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques et ont été le mieux caractérisés chez la souris. Le modèle rongeur est le seul modèle permettant de répondre à tous ces critères.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés nous adoptons une stratégie où nous vérifions méthodiquement et progressivement l’efficacité de la technique. En effet, la procédure 1 a pour but de mieux appréhender les caractéristiques des neurones réactivés par optogénétique et donc les effets observés dans la procédure 2. Le nombre d'animaux requis pour ces expériences sera réduit au minimum nécessaire, pour pouvoir réaliser des tests statistiques, à partir de nos résultats. Étant donné que nos résultats dépendent de l’efficacité des injections virales, de l’efficacité du conditionnement, de l’efficacité de la procédure chirurgicale,... globalement de la bonne réussite dans l’enchainement des gestes techniques, le nombre d’animaux total doit être conséquent. Néanmoins, la quantité massive d’informations apportés par un seul animal opérationnel est telle qu’elle peut permettre des analyses de haut niveau pendant plusieurs années.

Raffinement

Nos procédures seront optimisées afin de minimiser la douleur et la souffrance des animaux. Les chirurgies se feront en conformité avec la règlementation (anesthésie et analgésie appropriées). Les animaux recevront un soin optimal après les chirurgies. Tout au long de leur hébergement, les animaux ont accès dans leur cage à des objets d’enrichissement (dôme, tubes). Le suivi par le personnel de l'animalerie est quotidien dans un contexte général et le suivi post-chirurgie est assuré par l'expérimentateur quotidiennement pendant une semaine avec relevé de signes potentiels de douleur et prise en charge analgésique si nécessaire.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car il s’agit de l’espèce pour laquelle nous avons le plus de données préexistantes dans ce domaine permettant de réduire au maximum les expériences préliminaires pour la validation des procédures. De plus, il s’agit de l’espèce, pour laquelle l’outil pharmacogénétique est le plus développé et le plus caractérisé. Nous utiliserons des souris de laboratoire sans modification génétique ainsi que des souris transgéniques. L’efficacité des infections virales au niveau du cerveau décroît avec l’âge de la souris. En revanche, la procédure de stéréotaxie nécessite d’utiliser des animaux dont la croissance de l’os du crâne est stabilisée. C’est pourquoi, en accord avec la littérature, nous choisirons un âge compris entre 5 et 9 semaines pour réaliser les injections stéréotaxiques. Les implantations d’électrodes se feront 1 semaine après les injections de virus.