Procédures sévères

320 souris de huit semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Opérées du cerveau par stéréotaxie, elles portent un implant crânien, entrent en état de mal épileptique ("status epilepticus") au réveil, puis subissent huit jours d'injections quotidiennes dans l'abdomen sous contention, deux enregistrements EEG de 24 heures et un isolement social. Les antiépileptiques testés sont déjà employés en clinique, et le projet doit décrire leur effet sur des mesures d'IRM que les procédures ne mentionnent pas. Le porteur, qui classe ces procédures en souffrance sévère, affirme que ce type de crise focale "ne provoque pas de signe de souffrance et de mortalité".

Objectifs

Un tiers des patients épileptiques ne répond pas aux médicaments antiépileptiques et, parmi eux, 1/4 peuvent bénéficier d'une chirurgie résective. L'identification des zones du cerveau à enlever par chirurgie (la zone épileptogène, ZE) est un processus difficile. Il nécessite un ensemble d'outils complexes comprenant des examens cliniques, d'imagerie et neurophysiologiques, y compris des enregistrements électroencéphalographiques intracrâniens (iEEG) lorsque les procédures non invasives se sont révélées insuffisantes. Cependant, même en utilisant les informations de l'EEG, la chirurgie de l'épilepsie peut avoir des résultats défavorables chez 20 à 60% des patients, ce qui implique que le développement de nouvelles méthodes pour délimiter le tissu épileptogène reste une question cruciale. La neuro-imagerie, non invasive et largement disponible dans le contexte clinique, apparaît comme un candidat naturel pour aborder cette question. Nous avons récemment montré que l'IRM (imagerie par résonance magnétique) quantitative multiparamétrique (mqMRI) et de la spectroscopie de résonance magnétique combinées à des outils d'apprentissage automatique, pouvaient améliorer la détection de la zone épileptique. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de médicaments anti-épileptiques utilisés en routine clinique en utilisant un modèle de crises focales sur la souris.

Bénéfices attendus

Les données recueillies dans cette étude nous permettrons de caractériser l'impact de différents médicaments antiépileptiques sur les mesures IRM en corrélation avec l'électroencéphalographie, l'histochimie et les analyses biochimiques. Ces informations seront utilisées pour modéliser l'impact attendu des médicaments chez l'homme lors de l'évaluation clinique de ces mêmes méthodes d'imagerie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une anesthésie générale suivie d'une chirurgie par stéréotaxie d'environ 30 minutes. Une contention quotidienne pour des injections en intra péritonéales sur une durée de 8 jours. Deux séries d'enregistrements électroencéphalographiques sur 24H impliquant une contention pour branchement au système.

Impact sur les animaux

Mise en place d'un status epilepticus après réveil de la chirurgie. Inconfort due à la pose d'un implant crânien. Stress due à l'isolement social.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire de récupérer les organes pour analyses.

Remplacement

Nous avons effectué une recherche bibliographique approfondie sur Pubmed et Google Scholar afin de nous assurer de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre malformations du développement cortical, crises épileptiques et fonction de la barrière hémato-encéphalique. Nous avons utilisé des combinaisons de mots-clés tels qu'épilepsie, crise, électroencéphalographie, dysplasie, cerveau, neurone, modèles animaux, in vitro et tests animaux alternatifs. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communications multicellulaires nécessaires à ce projet.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés avec une approche statistique pour utiliser un minimum d'animaux tout en nous permettant de répondre aux objectifs du projet. Cette étude permettra de faire des analyses longitudinales répétées sur chaque souris (e.g., électroencéphalographie). Les mêmes séries d'animaux utilisées pour la pharmacologie et l'électroencéphalogramme seront utilisées en histologie pour les explorations moléculaires. De plus, nous avons prévu de créer une banque d'échantillons à partir des prélèvements qui seront effectués (organes et sang). Elle nous servira à la suite du projet ou encore pour des études préliminaires dans de nouveaux projets.

Raffinement

Le modèle provoque une crise focale localisée dans l'hippocampe, donc non généralisée. Ce type de crise focale ne provoque pas de signe de souffrance et de mortalité. Le raffinement passe par une adaptation de l'enrichissement dans les cages notamment en cas d'isolement des souris pour les besoins de l'expérience. Tous les animaux seront surveillés tout au long de la procédure. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie et analgésie et l'état de l'animal monitoré tout au long de la chirurgie. Nous utiliserons une grille de score et des points limites pour le suivi des animaux post chirurgicaux. Si une souffrance est observée, l'animal sera pris en charge, en fonction de son état, par de l'analgésie ou sortie d'expérimentation par euthanasie. Pour les enregistrements d'électroencéphalographie, une habituation à la contention sera effectuée chaque jour pour minimiser le stress lors des enregistrements.

Choix des espèces

Notre projet propose l'utilisation de petits animaux in vivo (souris). Les souris ( 8 semaines d’âge) sont très couramment utilisées en recherche sur l’épilepsie. Ce modèle animal exprime les mêmes marqueurs et récepteurs cérébraux que l'homme. Il constitue donc un modèle adapté pour les expériences proposées par notre étude, où l'unité neuro-vasculaire complètement fonctionnelle est requise pour investiguer les effets des médicaments antiépileptiques sur les crises. La littérature fournit des preuves de la fiabilité du monitoring électroencéphalographique in vivo pour le suivi de la progression de la pathologie et sa réponse aux traitements. Enfin, ce modèle étant bien établi, y compris au laboratoire où il est utilisé en routine, les expérimentations seront immédiatement ciblées sur les questions posées, et de fait le nombre d’animaux immédiatement optimisé.

224 ratons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Âgés de 10 à 15 jours, ils reçoivent par chirurgie une électrode sur le crâne, puis une injection déclenche des crises épileptiques avec convulsions tonico-cloniques ou des spasmes, pour tester trois médicaments contre l'épilepsie du nourrisson. Le porteur affirme que la perte de conscience pendant les crises limite la souffrance et que les spasmes ne seraient pas douloureux, chaque raton étant tué après l'enregistrement pour des prélèvements. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle cellulaire ni numérique ne reproduit le tissu cérébral en développement.

Objectifs

Le terme épilepsie recouvre un groupe de pathologies neurologiques se caractérisant par des crises épileptiques (convulsions et perte de conscience principalement) spontanées et récurrentes. Elles sont dues à une activité électrique anormale du cerveau. On estime à environ 70 millions le nombre de patients atteints dans le monde. Il s’agit aussi de l’atteinte neurologique chronique la plus fréquente chez le nourrisson et l’enfant. On estime que plus de la moitié des formes d’épilepsies infantiles sont résistantes aux traitements médicamenteux. Enfin, plus de 50% des enfants ayant déclaré une épilepsie avant l’âge de 1 an présenteront des troubles de la mémoire ou de l'apprentissage, responsable de déficiences intellectuelles perceptibles à l’âge adulte et ce même si l’épilepsie est traitée par des médicaments. Le développement de nouvelles voies de traitement adaptées aux nourrissons est donc nécessaire. Au cours de la première année de vie, le cerveau est plus à risque de générer des crises d’épilepsies. En effet, la communication entre les cellules nerveuses est très active et peu contrôlée. Cela est dû à l’un des récepteurs aux messagers chimiques activant les neurones, dont une forme très active est très présente au début de la vie. Cette forme active de récepteur pourrait être impliquée dans le risque important d’apparition de crises d’épilepsie chez les nourrissons. En effet, elle est notamment retrouvée en grande quantité dans le cerveau de ratons après induction de crises épileptiques expérimentales. De plus, des premières études avec des médicaments ciblant ce récepteur en particulier ont montré une bonne efficacité malgré des effets secondaires, dans des modèles d’épilepsie expérimentales chez le raton. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de 3 médicaments ciblant spécifiquement la forme plus active de ce récepteur dans deux modèles d’épilepsies infantiles dont un modèle de spasmes qui est le syndrome le plus fréquent.

Bénéfices attendus

Il est important de noter qu'il existe actuellement très peu de médicaments anti-épileptiques utilisés chez les nourrissons, de par le faible nombre d'études visant à mettre sur le marché des médicaments pour ces derniers. De plus, les médicaments disponibles ont été mis sur le marché il y a longtemps, reflétant des exigences réglementaires anciennes. Il y a donc un besoin crucial en de nouveaux médicaments adaptés aux nourrissons. Ce projet s'inscrit dans cette dynamique et il a pour but de valider l’utilisation de médicaments ciblant spécifiquement la forme plus active d’un récepteur aux messager chimiques activant les neurones, présents en grande quantité chez le nourrisson, comme traitement de l'épilepsie infantile, et notamment du syndrome de spasmes spécifiques au nourrisson.

Procédures

Des ratons âgés de 10 jours de vie et de 15 jours de vie seront utilisés dans ce projet qui comporte deux expériences, chacune en 3 parties. Chaque raton ne participera qu’à une seule des deux expériences. L'expérience 1 comportera : 1) la pose d'une électrode électroencéphalographique (EEG) par chirurgie sur le crane de l'animal anesthésié, durée de 30 à 45 minutes; 2) le traitement de l'animal vigile par un des 3 médicaments testés ou du sérum physiologique, 24h après la chirurgie, par une unique injection dans le ventre, durée d'environ 5 min; 3) l'induction d'une crise épileptique séquentielle chez l'animal vigile, 1h après le traitement, par une injection unique dans le ventre d'une molécule induisant des convulsions. Les manifestations de cette crise seront enregistrées pendant 1h : comportement de l’animal (contractions musculaires et convulsiosn) par vidéo et activité électrique du cerveau via l’électrode EEG. (implantée 1 jour avant). L'expérience 2 comportera les deux mêmes premières parties que l’expérience 1 (pose l'électrode EEG et traitement). La troisième partie consistera en l'induction de spasmes épileptiques chez l'animal vigile, 1h après le traitement, par une injection unique dans le ventre d'une molécule excitatrice des neurones. Les manifestations des spasmes seront suivies comme pour l’expérience 1 mais pendant 1h30 : comportement enregistré en vidéo et activité électrique du cerveau enregistré par l’électrode EEG.

Impact sur les animaux

Les nuisances qui peuvent apparaitre chez l’animal impliqué dans ce projet sont les mêmes pour les deux expériences. Ainsi, la pose de l'électrode EEG chez l'animal anesthésié par chirurgie pourrait provoquer l'apparition de douleurs ou d'infection cutanée en post-opératoire. Ce sont cependant deux éléments extrêmement rares. Nous utiliserons deux modèles d'épilepsie induites qui peuvent chacun être la responsable de l’apparition de stress ou de douleurs. Dans le modèle de crise épileptique séquentielle (expérience 1), l'animal expérimentera des secousses musculaires involontaires et brèves (myoclonies) puis le raidissement et la contraction de l'ensemble de ses muscles (crise tonico-clonique). Cependant ces manifestations comportementales sont associées à une perte de conscience qui limite grandement l'apparition de souffrance chez l'animal. En ce qui concerne le second modèle d'épilepsie, modèle de spasmes épileptiques, l'animal expérimentera des mouvements de replis et/ou de contractions de ses membres et des contractions des autres muscles. Ces manifestations pourraient être à l'origine d'un stress mais ne seront pas douloureuses car elles sont beaucoup moins intenses que celles du premier modèle.

Devenir

Le devenir de tous les ratons est le même qu'ils aient été utilisés dans le modèle de crises épileptiques séquentielles ou de spasmes épileptiques. A l'issu de l'enregistrement des manifestations comportementales et des signaux EEG (1h ou 1h30 selon le modèle d’épilepsie) induite dans les deux modèles d’épilepsie expérimentale, le raton est euthanasié afin de réaliser des prélèvements biologiques, nécessaire pour évaluer l'effet du traitement médicamenteux.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’évaluer le potentiel de médicaments agissant sur une forme très active d'un récepteur aux messagers chimiques activant les cellules nerveuses dans le cerveau. Cette forme est présente de façon abondante au début du développement et diminue par la suite. Il est donc nécessaire d'évaluer l'effet des médicaments à deux âges différents chez l'animal (10 et 15 jours de vie), correspondant à une expression différente de ce récepteur. De plus, l'évaluation de l'effet des médicaments doit se faire avec des paramètres qui sont le plus proche de ceux utilisés lors du traitement des malades. Il faut donc évaluer l'effet sur les manifestations comportementales classiques des crises épileptiques séquentielles et des spasmes épileptiques ainsi que sur le tissu cérébral après l'induction de ces deux types d'épilepsies. Or, il n'existe pas à leur heure actuelle de modèle reposant sur la culture cellulaire ou de modèles numériques qui modélisent de façon complète et fiable le tissu cérébral en développement, ni qui permettrait d'obtenir le type de données évoquées ci-avant. Cela justifie donc l'approche d'expérimentation animale que nous proposons.

Réduction

Le principe de réduction a été pris en compte pour définir le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet. Ainsi, nous avons prévu de réaliser nos deux expériences avec dans un premier temps des groupes de 7 ratons par âge (un groupe de ratons âgés de 10 jour et un autre âgés de 15 jours) et par traitement (1 groupe par médicament évalué et 1 groupe avec du sérum physiologique comme contrôle) pour un total de 8 groupes, soit 56 ratons pour chaque modèle d'épilepsie donc 112 ratons au total. Une fois les données obtenues pour l'ensemble de ces animaux, nous évaluerons l'efficacité de chaque médicament au moyen de tests statistiques. Si les résultats semblent concluants ou qu'ils pourraient le devenir en augmentant le nombre d'animaux étudiés, nous réaliserons une seconde série d'expériences avec de nouveaux des groupes de 7 ratons. L'évaluation statistique intermédiaire se fera pour chaque traitement de façon indépendante afin de poursuivre les expériences que pour les médicaments prometteurs et ainsi réduire au mieux le nombre d'animaux impliqués dans ce projet de recherche. Ainsi, le nombre maximum d’animaux pouvant être impliqué dans le projet sera de 224 ratons.

Raffinement

Le bien-être de l'animal et son maintien ont été pris en compte lors de la conception de ce projet. Ainsi, nous suivons l'animal tout au long de sa vie et de son inclusion dans notre projet de recherche au moyen d'une grille de scores permettant de quantifier l’apparition de stress, inconfort ou douleur. Ce suivi permet de mettre en place, si besoin, une prise en charge de la douleur par exemple si elle apparait après à la pose de l'électrode EEG par chirurgie. De plus, nous avons prévu d'utiliser tous les ratons d'une même portée ce qui permet de conserver des conditions d'hébergement "naturel" et de ne pas induire de stress. Ainsi une mère et ses petits sont hébergés dans une cage contenant litière, eau et croquette à disposition. Du papier est mis à disposition de la mère afin qu'elle bâtisse un nid ainsi qu'un tunnel en plastique pouvant aussi lui servir de nid. Ce tunnel est fait d'un plastique transparent rouge que l'animal considère opaque mais qui permet son observation et le suivi des animaux.

Choix des espèces

Le modèle de crise épileptique séquentielle et celui des spasmes épileptiques infantiles sont deux modèles reconnus dans la littérature scientifique, couramment utilisé dans les études précliniques évaluant des médicaments contre l'épilepsie. Ces deux modèles sont décrits dans la littérature scientifique chez le rat, rongeur plus grand que la souris donc plus facile à manipuler et plus résistant aux effets néfastes des modèles. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèles reposant sur la culture cellulaire ou de modèles numériques qui permettraient d’évaluer de façon fidèle l’effet de molécules bloquant spécifiquement la forme active d’un récepteur aux messagers chimiques activant les cellules nerveuses et ce à différents moments du développement cérébral. Ainsi, le rat est l’animal le plus pertinent dans ce projet expérimental. L’objectif de ce projet de recherche est d'évaluer le potentiel de médicaments ciblant la forme la plus active d'un récepteur aux messagers chimiques activant les cellules nerveuses comme anti-épileptique pour le nourrisson. Pour cela, il faut évaluer l'effet de ces médicaments au cours du développement du cerveau puisque l'expression de la forme active du récepteur diminue avec celui-ci. Nous allons donc utiliser des ratons âgés de 10 jours et des ratons âgés de 15 jours qui présentent une forte et une faible expression respectivement de la forme active du récepteur que nous ciblons avec les médicaments. De plus, les deux âges étudiés correspondent à deux étapes du développement du cerveau chez l'Homme, à savoir le nourrisson et le bébé d'environ 1 an, ce qui nous permettra de comparer l'efficacité des médicaments au cours du développement.

120 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par administration dans la trachée d'un virus, avant leur mise à mort pour prélever le sang, le liquide pulmonaire et les poumons, afin d'évaluer le rôle d'un gène régulant une protéine impliquée dans la fibrose. Le porteur ne détaille pas les procédures dans la rubrique prévue, qui reprend le texte des objectifs, mais mentionne un suivi de la douleur par une échelle intégrant la perte de poids et les difficultés respiratoires. Il affirme travailler in vitro "si possible" tout en jugeant "indispensable" le recours au poumon entier vivant.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est un processus pathologique létal aboutissant à une destruction fibreuse des poumons. C’est une maladie rare avec une prévalence de 10 à 20 cas pour 100 000. Elle conduit à une insuffisance respiratoire et au décès avec une médiane de survie de 3 à 5 ans après diagnostic. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. La fibrose pulmonaire est le fait d’une cicatrisation exagérée avec accumulation de collagène et remodelage de la matrice extracellulaire. Le Transforming Growth Factor (TGF)-β1 est une cytokine clé impliquée dans la fibrogenèse. Nous proposons d’utiliser des souris C57bl/6J avec une délétion génétique d’une protéine cible qui est impliquée dans la régulation de la voie du TGF-β1. Plusieurs publications ont récemment démontré que l’activation de cette protéine permettait de limiter le développement de la fibrose. L’objectif principal de ce projet consiste à étudier l’impact de la délétion génique d’une protéine cible (identité confidentielle) sur la gravité de la fibrose pulmonaire induite par administration intra-trachéale d’un adénovirus codant pour le TGFbeta.

Bénéfices attendus

La fibrose pulmonaire idiopathique est un processus pathologique létal. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. Cette expérimentation permettra de mettre en lumière la protéine délétée comme une cible thérapeutique potentielle dans la fibrose pulmonaire.

Procédures

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est un processus pathologique létal aboutissant à une destruction fibreuse des poumons. C’est une maladie rare avec une prévalence de 10 à 20 cas pour 100 000. Elle conduit à une insuffisance respiratoire et au décès avec une médiane de survie de 3 à 5 ans après diagnostic. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. La fibrose pulmonaire est le fait d’une cicatrisation exagérée avec accumulation de collagène et remodelage de la matrice extracellulaire. Le Transforming Growth Factor (TGF)-β1 est une cytokine clé impliquée dans la fibrogenèse. Nous proposons d’utiliser des souris C57bl/6J avec une délétion génétique d’une protéine cible qui est impliquée dans la régulation de la voie du TGF-β1. Plusieurs publications ont récemment démontré que l’activation de cette protéine permettait de limiter le développement de la fibrose. L’objectif principal de ce projet consiste à étudier l’impact de la délétion génique d’une protéine cible (identité confidentielle) sur la gravité de la fibrose pulmonaire induite par administration intra-trachéale d’un adénovirus codant pour le TGF-β1.

Impact sur les animaux

La fibrose pulmonaire idiopathique est un processus pathologique létal. Il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique efficace. Cette expérimentation permettra de mettre en lumière la protéine délétée comme une cible thérapeutique potentielle dans la fibrose pulmonaire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang, le liquide lavage broncho-alvéolaire et le tissu pulmonaire dans le but d’étudier l’impact de la délation du gène régulant la voie du TGF-β1 sur le développement de la fibrose pulmonaire.

Remplacement

Nous remplacerons si possible l’expérimentation sur animaux par des expériences in vitro. Mais le tissu pulmonaire est un tissu complexe issu de différentes cellules épithéliales, fibroblastiques, mésothéliales, organisées en tissu et interagissant dans un système dynamique. La fibrose pulmonaire est elle aussi complexe et son développement implique plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire). Tout ceci rend indispensable de travailler in vivo sur l’organe pulmonaire entier pour bien comprendre le rôle du gène d’intérêt dans le développement de la FPI.

Réduction

Nous réduirons le nombre d’animaux au minimum tout en permettant de remplir nos objectifs. Le nombre d’animaux sera déterminé a priori par une analyse de puissance et représentera le nombre minimal d’animal permettant de produire des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit) au sein d’un centre de zootechnie. Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers (permettant leur isolement dans la cage). De plus, ils bénéficieront depuis 7 jours avant le début du protocole et pendant toute sa durée, d’une alimentation enrichie sous forme d’aliments gélatineux déposés sur la litière, ce qui en facilite l’accès pour limiter la perte de poids et la déshydratation qui caractérisent le modèle. Le modèle de fibrose pulmonaire sera appliqué par du personnel qualifié et entrainé. Afin de réduire la douleur, les animaux seront suivis au moyen d’une échelle d’évaluation de la douleur (Apparence physique, perte de poids, altération de la mobilité et difficultés respiratoires). Les points limites fixés nous permettront de décider de la mise à mort ou non des animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est très bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. De plus, le modèle murin offre la possibilité de manipulation génétique, et ce projet utilisera des souris génétiquement modifiées (souris KO pour un gène d’intérêt). Nous utiliserons des souris âgées de 10 à 15 semaines correspondant à un stade de développement adulte de l’animal, et à un poids suffisant. Pour minimiser la dégradation de l’état général des animaux induit par le développement de la fibrose pulmonaire, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g.

Greffées sous anesthésie de cellules de cancer du sein qui peuvent croître, former des métastases et s'ulcérer, 180 souris adultes peuvent ensuite recevoir, pendant trois semaines au plus, une injection hebdomadaire derrière l'œil sous anesthésie, en changeant d'œil à chaque fois. Selon les groupes, ces injections apportent un nanomédicament chargé en docétaxel, qui peut provoquer neutropénie et anémie, et une immunothérapie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur écrit pourtant qu'"aucun stress ou souffrance particulière n'est attendue au cours des diverses étapes des tests". Les souris sont tuées à l'atteinte d'un point limite, comme une tumeur de plus de 1 500 mm3 ou une perte de plus de 15 % de leur poids, ou pour le prélèvement de leur sang, de leur rate et de leur tumeur.

Objectifs

L'immunothérapie est révolutionnaire en oncologie mais ne fonctionne que chez un nombre restreint de patients. Ainsi il est essentiel de l'associer à des thérapies pouvant optimiser le terrain immunogène des patients. Notre objectif est alors double: - définir le caractère immunomodulateur de notre nanomédicament (immunoliposome de docétaxel et trastuzumab) -définir à l'aide de modèles mathématiques, les modalités optimales (posologies et schémas thérapeutiques) d'association de notre nanomédicament avec l'immunothérapie (Atezolizumab)

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait d'amener des éléments de réponse quant aux modalités d'association des immunothérapies et nanomédicaments et ce afin de limiter les résistances actuelles observées avec les immunothérapies dans le cancer du sein.

Procédures

Greffe de cellules cancereuses murine sur animal anesthésié (1greffe par animal). Administration des traitements par voie intraveineuse au niveau rétroorbital (angle: 30 degrès, chez l’animal anesthésié (3% sévoflurane- O2) avec une seringue de 26G, le volume maximum d'injection sera de 150µl, avec des injections hebdomadaires pour les animaux concernés sur trois semaines maximum ,changement d’œil à chaque injection). Prélèvement sanguin, rate et tumeur

Impact sur les animaux

Les animaux seront greffés de cancer du sein de manière orthotopique pouvant métastaser, croitre et ulcérer. Les traitements peuvent également avoir des effet indésrables, notamment les liposomes chargés en docétaxel qui présente des effets indésirables hématologiques (neutropénie/anémie). L'injection de ces solutions lipidiques peut également être source d'hypersensibilité au site d'injection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort une fois l'atteinte du point limite ou le prélevement sanguin et d'organes

Remplacement

En raison de l’absence de modèle in vitro relevant pour explorer toute la complexité de l’immunité tumorale, cette étude doit se faire sur l'organisme. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de faire un suivi de croissance tumorale ainsi que de prélever sang/tumeur/rate.

Réduction

Notre projet comprend une étape de modélisation mathématique permettant de réduire le nombre de tests à effectuer pour définir les modalités d'association des immunothérapies à notre nanomédicament.

Raffinement

Le bien être animal est respecté: - temps d'acclimatation de 10 jours avant toute procédure - enrichissement des cages (dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques/stériles (Cell Nest), - prévention de la douleur, réduction du stress (les manipulations telles que les administrations, prélèvements seront conduites sous anesthésie générale et aucun stress ou souffrance particulière n’est attendue au cours des diverses étapes des tests) - définition des points limites et évaluation quotidienne (volume tumoral au-delà de 1500mm3, difficultés respiratoires importantes, prostration, atonie, défaut d'alimentation avec perte de poids supérieure à 15%, ou toute autre manifestation de comportement anormal)

Choix des espèces

Les données de la littérature montrent que la souris est un bon modèle expérimental pour des études de pharmacocinétiques et d'immunomonitoring. De plus, toutes nos données d’efficacité et de pharmacocinétique de ce nanomédicament portent déjà sur cette espèce. Par ailleurs, la facilité de manipuler la souris dans un milieu confiné fait de cette espèce animale l’espèce la plus appropriée pour répondre aux questions posées. Des souris adultes (6 semaines d’âge). Par rapport à la pathologie étudiée (cancer du sein) qui touche exclusivement les populations adultes en clinique humaine, l’utilisation de souris adultes est retenue.

276 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Âgées de seize mois, elles subissent une chirurgie stéréotaxique pour l'injection d'un peptide amyloïde dans l'hippocampe, un gavage quotidien de composés et des tests de mémoire dont la piscine de Morris, pour évaluer des candidats médicaments contre la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que la chirurgie peut causer une souffrance postopératoire et que le gavage et la piscine de Morris induisent un stress. Il affirme que la complexité de la maladie ne peut être atteinte qu'avec un modèle animal et présente la souris comme le modèle "le plus proche de l'humain".

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la maladie neurodégénérative la plus fréquente. Elle est caractérisée par des troubles de la mémoire et du comportement, ainsi que par une désorientation dans le temps et dans l'espace et touche aujourd’hui 50 millions de personnes dans le monde, dont plus de 1 000 000 en France. Son incidence augmente très fortement avec l’âge : de 1,5 % de la population âgée de 65 ans, elle double tous les ans pour atteindre 30 % dans la tranche des 80 ans et plus. La maladie d’Alzheimer engendre rapidement une dépendance physique, intellectuelle et sociale majeure, qui retentit sur l’entourage. Elle représente la principale cause de dépendance et de placement en institut spécialisé (40 % des malades sont dans cette situation). Le manque de médicaments efficace contre la maladie représente un défi majeur de santé humaine. Ce projet sera divisé en 5 procédures indépendantes (une procédure par classe de composés). L'objectif de ce projet est d'évaluer le potentiel neuroprotecteur de candidats médicaments dans un modèle murin de la maladie de Alzheimer. Les effets des composés seront étudiés par l’analyse des capacités mnésiques des animaux et par analyse histologique. Un composé prometteur devra améliorer la mémoire à court et/ou à long terme des souris, diminuer la perte des neurones dans une région clé pour la formation de la mémoire. En cas de résultats positifs, le développement préclinique des composés pourra se poursuivre.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de médicament pour cette maladie incurable. En cas de résultats positifs, le ou les candidats médicaments pourront à terme entrer dans des études de phases cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à de la chirurgie stéréotaxique, sous anesthésie générale (isoflurane, 4 % induction puis 2%). Les souris récupèrent bien de la chirurgie. Il n'y aura pas de prélèvement sanguin au courant de l'étude. Les procédures incluent des traitements chroniques (quotidiens) par gavage. La mémoire à court et long terme sera étudiée avec des tests comportementaux. Ces tests seront rapides (maximum 15 minutes par jour), sur une durée de 7 jours, non consécutifs. Les animaux subiront une perfusion intra-cardiaque sous anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Le traitement quotidien des souris par gavage peut induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Les tests comportementaux peuvent également induire une nuisance chez les souris, notamment avec le test de la piscine de Morris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (ex. histologie).

Remplacement

Notre but est d'évaluer les effets neuroprotecteurs de candidats médicaments dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Les processus physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (neurones et cellules gliales) dans différentes structures cérébrales. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal. La souris est le modèle intégré le plus proche de l’humain pour ce projet.

Réduction

Le nombre de souris (n par expérience) sera optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. À cette fin, des études antérieures disponibles dans la littérature scientifique suggèrent un nombre minimal de 12 souris par groupe, afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs en termes de (i) détérioration des fonctions cognitives se traduisant par une perte de mémoire spatiale, et (ii) % de neurones morts (neurodégénérescence); deux caractéristiques essentielles et déterminantes dans la pathophysiologie de la maladie d'Alzheimer. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuel effets significatifs de candidats médicaments dans modèle animal de la maladie d’Alzheimer.

Raffinement

La stratégie de raffinement sera basée sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement, (ii) des approches d'analgésies pré, pendant et après l'opération, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (température corporelle) pendant et après l'opération (pour assurer un rétablissement rapide). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (5 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libidum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiées aux études impliquant des souris. Comme dans la plupart des cas les symptômes de la maladie d'Alzheimer apparaissent à un âge avancé, nous utiliserons des souris âgées de 16 mois. Ainsi, nous pourrons reproduire plus fidèlement et plus précisément la physiopathologie humaine de la maladie d'Alzheimer dans notre modèle de souris.

75 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par injection de thrombine après pose d'un cathéter dans la veine de la queue, puis les lésions sont évaluées par IRM avant prélèvement du cerveau, pour tester un nanomédicament censé améliorer le traitement de l'AVC humain. Le porteur indique que certaines souris peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures et un affaiblissement de la patte avant gauche correspondant à la zone lésée. Il affirme que les méthodes sans animaux n'apporteraient pas le même niveau d'information et présente la souris comme le meilleur compromis entre "pertinence scientifique" et "sensibilité de l'espèce".

Objectifs

L'AVC est une maladie qui survient de manière inattendue et a une issue désastreuse. Environ 15 millions de personnes connaîtront un épisode d'AVC chaque année dans le monde, dont 33 % avec une incapacité permanente, tandis que 40 % des cas entraîneront la mort. La thrombolyse avec l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant intraveineux (rtPA) est le seul traitement médicamenteux approuvé pour les patients ayant subi un AVC ischémique aigu, mais son utilisation est limitée par une fenêtre thérapeutique étroite, une efficacité sélective et des complications hémorragiques. L'ambition principale du projet est de mettre au point un nouveau modèle de nanomédicaments « intelligents » afin d'améliorer l'efficacité thrombolytique du rtPA, réduire le risque de saignement systémique, d'hémorragie, et d'évaluer le taux de recanalisation par des techniques d'imagerie. Cette stratégie innovante devrait améliorer les résultats des patients victimes d'AVC traités par rtPA, augmenter la fenêtre de temps thérapeutique et donc le nombre de patients victimes d'AVC qui peuvent bénéficier de ce traitement.

Bénéfices attendus

Cette stratégie innovante devrait améliorer les résultats des patients victimes d'un AVC traités par rtPA, augmenter la fenêtre de temps thérapeutique et donc le nombre de patients victimes d'un AVC qui peuvent bénéficier de ce traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à un modèle d'accident vasculaire cérébral ischémique. Puis un cathéter intraveineux sera mis en place pour permettre l'injection des différents traitements. Les lésions cérébrales seront ensuite évalués par imagerie par résonnance magnétique (IRM). Enfin les cerveaux seront prélevés pour permettre de futures analyses.

Impact sur les animaux

Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la pate avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de souffrance sont le suivi strict et rapproché des animaux, l’hébergement en petits groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (un carré de coton (Nestlets), dôme en carton, paillettes), et la manipulation uniquement par des personnels expérimentés. Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température (21°), hygrométrie (55%), luminosité (100 lux), et durée du cycle de lumière (12h/12h).

Devenir

A partir de la procédure 1 (Pose d'un cathéter dans la veine caudale de la queue pour l'injection des différents traitements pharmacologiques), tous les animaux seront utilisés pour la procédure 2 (Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine) puis la procédure 3 (Evaluation des lesions cérébrales par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM)) qui sera suivie de leur mise à mort.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. De plus, l'utilisation de technique d'imagerie non invasives permettant un suivie longitudinal du même individu permet de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le traitement de l'accident vasculaire cérébrale. Les souris Swiss utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de l'AVC.

12 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent un candidat vaccin puis sont infectés par le virus Lassa, sous une dizaine d'anesthésies et de prélèvements, pour tester une protection en post-exposition. Le porteur indique que les animaux témoins développent la maladie, fièvre, diarrhée, hémorragies et hypothermie avant leur mise à mort, encadrée par un score clinique. Il affirme que le primate est le "seul bon modèle" de la fièvre de Lassa et qu'il "ne peut donc pas être remplacé".

Objectifs

Le virus Lassa (LASV) a un impact significatif sur la santé et l’économie des pays d’Afrique de l’Ouest, infectant et causant la mort de plusieurs milliers de personnes chaque année. De plus, 20% des survivants présentent des séquelles à long-terme, notamment un déficit auditif. Bien qu’étant un problème de santé publique majeur dans les pays endémiques, il n’existe à ce jour aucun vaccin pour prévenir les infections à LASV et aucun traitement complètement efficace. Le développement de vaccin LASV a notamment été ralenti par le manque de connaissance sur ce pathogène. Bien qu’un vaccin préventif soit le meilleur moyen de contrôler les épidémies à virus LASV, un vaccin protégeant rapidement les personnes à risque ou permettant de contrer le développement de la maladie chez des patients récemment exposés serait un atout majeur dans la lutte contre la fièvre de Lassa. Ce projet de recherche translationnelle de 5 ans se concentre sur le développement de contre-mesures prophylactiques et thérapeutiques contre LASV. En ce sens, nous avons développé MOPEVAC-LAS, un vecteur recombinant basé sur une souche hyperatténuée du virus Mopeia, un virus non pathogène pour l’homme que nous avons modifié par génétique inverse afin de lui faire exprimer un antigène de LASV. Il est rendu inoffensif par une modification au sein de la nucléoprotéine (NP), présentant un rôle central dans le contrôle des réponses antivirales. L’innocuité, l’immunogénicité et l’efficacité de MOPEVAC-LAS ont été démontrées chez le singe cynomolgus dans une étude précédente. Nous savons donc que MOPEVAC induit une immunité protectrice chez des singes vaccinés un mois avant le challenge par le virus LASV. Le but de ce projet est de tester si ce candidat vaccin peut induire une immunité protectrice lorsqu’il est administré seulement 8 jours avant ou dans les heures qui suivent l'infection par LASV. Nous souhaitons aussi comparer le MOPEVAC-LAS classique à un MOPEVAC-LASNPwt produit dans des cellules exprimant une NP sauvage (non modifiée) afin d’aider à la production du vaccin et d’augmenter son immunogénicité chez le singe en post-exposition. A terme, nous pensons identifier le meilleur candidat vaccinal pour la vaccination en post-exposition.

Bénéfices attendus

Bien que la fièvre de Lassa soit un problème de santé publique majeur en Afrique de l’Ouest, il n’existe à ce jour aucun traitement ou vaccin disponible. La vaccination demeure l’approche la plus pragmatique pour enrailler les épidémies à virus Lassa. Les clusters épidémiques sont généralement restreints à de petites zones géographiques. Dans ce contexte, en l’absence d’une vaccination de masse, une vaccination d’urgence des populations à risque pendant les épidémies a tout son sens. Pour cela, il est nécessaire de développer des vaccins pouvant protéger à court terme les personnes exposées ou pouvant induire une protection en post-exposition. Le but de ce projet est d’apporter la preuve de concept de l’utilisation de MOPEVAC-LAS comme vaccin d’urgence pouvant induire une immunité sur le court terme ou protéger en post-exposition. A long terme, nous souhaitons que MOPEVAC-LAS entre en essais cliniques chez l’homme et qu’il puisse à terme être testé en contexte épidémique. De plus, la comparaison MOPEVAC-LAS vs MOPEVAC-LASNPwt nous apportera des clés quant au rôle de la nucléoprotéine dans l’induction des réponses immunes.

Procédures

La procédure expérimentale soumettra les animaux à des anesthésies (au nombre de 10 prévues dans la procédure expérimentale et d'une durée de 1h à 2h selon les individus) et à des prélèvements salivaires, nasaux et sanguins sur animaux anesthésiés (8 sessions de prélèvements prévues dans cette procédure expérimentale). Lors de l'atteinte de point limite ou de la fin du protocole, les animaux seront anesthésiés, puis des prélèvements (sang, liquide céphalo-rachidien, moelle osseuse) ainsi que la mise à mort seront réalisés. Pour les animaux ne présentant pas de point limite ou de score supérieur ou égale à 15 points, la procédure s'achèvera donc à partir de J28 et jusque J30. En effet, les mises à mort des survivants en fin de projet seront réalisées entre J28 et J30, par programmation de 3 à 4 animaux par jour, selon le nombre d'animaux concernés. La durée de la procédure pour les survivants sera donc de 13 jours d’acclimatation puis 30 jours au maximum de protocole.

Impact sur les animaux

Les animaux contrôles devraient développer les signes cliniques d’une infection par le virus LASV. Sur la base de nos expériences antérieures, nous nous attendons à ce qu’ils présentent des signes de stress ainsi qu’une hausse de la température corporelle à peu près 3 jours après l’infection par LASV. Dans les jours qui suivent, les animaux pourront présenter des signes tels que de la fatigue, de la diarrhée, une déshydratation et/ou une perte de poids. Au pic de la maladie, soit à peu près 10 à 15 jours après l’infection, des pétéchies, des hémorragies et des troubles de l’équilibre peuvent apparaître, en plus d’une hypothermie dans les heures précédant l’euthanasie des animaux. Les individus vaccinés devraient quant à eux présenter uniquement une élévation transitoire de la température, des signes de stress pendant quelques jours, puis devraient présenter un état de santé normal une à 2 semaine(s) après l’infection.

Devenir

L'étude implique que les organes et les tissus puissent être prélevés sur l'ensemble des animaux de l'étude (n=12), ceux-ci étant répartis en divers groupes infectés et vaccinés. Par conséquent, seule la mise à mort des 12 animaux de l'étude permettra d'obtenir des données statistiquement robustes.

Remplacement

Il existe désormais plusieurs méthodes alternatives in vitro, dérivées de la culture cellulaire classiquement utilisée depuis des décennies. Ces nouvelles technologies tendent à recréer artificiellement les interactions inter cellulaires que nous pouvons retrouver dans l'organisme. Citons par exemple le développement de la culture cellulaire en trois dimensions, ou encore la culture d'organoïdes, sphéroïdes ou d'organes sur puce. Dans tous les cas, il s'agit de reconstituer la structure organisationnelle de systèmes cellulaires complexes ex vivo, afin de mimer les conditions observées in vivo. Ces avancées récentes ont déjà permis d'étudier des questions complexes et multidimensionnelles telles que l'apparition de la maladie, la régénération tissulaire ou bien les interactions entre organes. Bien que très prometteuses, ces techniques restent très localisées et répondent à des problématiques assez ciblées, tout en étant multi factorielles. Dans le cadre de notre étude, elles ne permettent pas, pour l'instant, de répondre à des questions globales telles que l'apparition d'une maladie dans un système vivant "entier", le développement symptomatologique ou la mise en place des réactions immunitaires dans leur ensemble. Les variabilités inhérentes aux individus peuvent induire des résultats imprévisibles et bien différents de ceux observés artificiellement in vitro. Il est actuellement impossible de remplacer l'utilisation d'un organisme vivant complexe. Les animaux utilisés dans cette étude sont exclusivement des singes cynomolgus (Macaca fascicularis). Il est le seul bon modèle animal (présentant une pathologie similaire à l’Homme) pour l’étude de la fièvre de Lassa, et tout vaccin destiné à entrer en essai clinique doit avoir été testé chez le primate non-humain (PNH). Ce modèle ne peut donc pas être remplacé.

Réduction

Le projet est basé sur l’utilisation de 12 PNH répartis en 4 groupes de 3 animaux (en accord avec les capacités d’hébergement et la réglementation). Il s’agit du nombre minimal pour observer des différences statistiquement significatives entre chaque groupe et pour s’assurer d’une reproductibilité. Les animaux seront uniquement des mâles pour cette expérience mais auraient pu être exclusivement des femelles, selon la disponibilité. Plusieurs types d’analyses seront réalisés sur un même animal au cours de l’expérimentation et un nombre maximal d’échantillons de fluides et tissus sera prélevé à l’autopsie, afin de procéder à des analyses ultérieures. Cette procédure inclut l'utilisation d'un groupe contrôle de 3 animaux (infectés par l'exacte même dose que les animaux vaccinés et simultanément) pour lesquels des analyses plus poussées que les études précédentes seront réalisées. Ces nouvelles analyses (transcriptomiques, analyses de nouveaux marqueurs immunologiques plus spécifiques, …) seront réalisées grâce à ce groupe contrôle, composé de 3 animaux afin d’obtenir une puissance statistique de même puissance que les analyses des autres groupes. Ces individus contrôles seront également observés en étroite comparaison (et simultanément) avec les animaux étant vaccinés en post-exposition, pour lesquels la cinétique d'apparition (ou non) de signes cliniques n'est pas encore connue et doit être observée dans les mêmes conditions (même dose d’épreuve virale et jours de prélèvements). Les données obtenues sur ces contrôles ainsi que sur les contrôles des études précédentes permettront une analyse des paramètres biochimiques, hématologiques, virologiques et immunologiques statistiquement plus puissante. De plus, l’utilisation de contrôles historiques n’est pas toujours acceptée par les revues à comité de lecture.

Raffinement

Afin d’assurer au mieux le bien-être des animaux, ils seront hébergés en volière par groupes de 3, dans un environnement enrichi avec des dispositifs favorisant l’adoption d’un comportement naturel (perchoir, hamac, jeu, diversification alimentaire…). Les animaux seront implantés par télémétrie, nous permettant de surveiller et d’enregistrer en temps réel, l’activité et la température corporelle des animaux. Un système de vidéosurveillance permettra également de visualiser le comportement des animaux pendant les périodes où ils ne seront pas stimulés par la présence des techniciens. La surveillance via ce système est réalisée quotidiennement en fin de journée, et plus régulièrement pendant la période critique. L'accès aux enregistrements est également possible. En cas de doute sur l’état d’un ou plusieurs animaux, une entrée en laboratoire sera programmée immédiatement pour procéder à une observation en zone et à une possible décision. Une matrice de score, établie pour l’étude de la physiopathologie induite par le virus Lassa, nous permettra de réaliser un scoring quotidien (éprouvé sur d’autres protocoles similaires) qui sera mis en place dès le jour du challenge et des points limites seront définis à l’avance (hypothermie, pyrexie, perte de poids, durée des symptômes, coma post anesthésie, durée de symptômes persistants, …). L’observation d’un point limite ou l’atteinte d’un score supérieur ou égal à 15 points (représentant la limite précoce d'un état de la maladie devenant une limite éthique en termes de douleur/détresse de l'animal (selon notre matrice de score) seront anesthésiés puis mis à mort) permettra de mettre fin à la procédure expérimentale pour l’animal concerné. La majorité des procédures réalisées au cours de ce protocole ont un impact mineur sur le bien-être des animaux. Ces procédures comprennent notamment des injections musculaires et sous-cutanées, des écouvillonnage nasopharyngés et des prises de sang, réalisés sur des animaux anesthésiés.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans cette étude sont exclusivement des singes cynomolgus (Macaca fascicularis). Il est le seul bon modèle animal pour l’étude de la fièvre de Lassa en raison de l’induction d’une physiopathologie similaire à celle observée chez l’Homme. De plus, et tout vaccin destiné à entrer en essai clinique doit avoir été testé chez le PNH. Dans ce contexte, ce modèle ne peut donc pas être remplacé par une autre espèce. Les animaux utilisés seront des juvéniles (de plus de 2 ans et moins de 3 ans). En effet, les cages du laboratoire permettent l’accueil de PNH de moins de 3 ans uniquement, par groupes de 3 animaux par volière. Cependant, les animaux auront plus de deux ans afin d’avoir un système immunitaire le plus mature possible. L’âge des animaux est donc contraint par les capacités d’accueil. La moyenne des poids lors des dernières pesées (mars 2022) était de 3.01kg.