Procédures sévères

1 165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 765 modéré. Elles sont infectées par la grippe H1N1 par voie intranasale, certaines irradiées puis greffées de moelle osseuse, avec injections et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que les doses peuvent être létales et provoquer jusqu'à 25 % de perte de poids, seuil au-delà duquel les souris sont mises à mort. Il justifie le recours à l'animal par la complexité de la réponse immunitaire antivirale, impossible selon lui à reproduire in vitro, et par l'accès à des souris génétiquement modifiées.

Objectifs

Les virus de la grippe (virus Influenza A, IAV) est un agent pathogène responsable de la mort de près de 500 000 personnes par an dans le monde. Une meilleure compréhension de la réplication du virus de la grippe, de sa propagation dans les hôtes infectés et de son inhibition par le système immunitaire est essentielle dans le développement de nouvelles stratégies prophylactiques et thérapeutiques. L’isoforme courte de la protéine NCOA7 (ici dénommée NCOA7) est une protéine présentant une activité antivirale contre le virus de la grippe au cours des réponses immunes innées. Les données de la littérature indiquent également que la protéine NCOA7 pourrait impacter les réponses immunes adaptatives. Ces données ont été obtenues in vitro. Dans ce projet, nous souhaitons étudier l’impact de NCOA7 sur le contrôle de la réplication du virus de la grippe ainsi que sur la mise en place des réponses antivirales de l'immunité innée et adaptative in vivo, dans un modèle murin. Pour cela, des souris C57Bl/6J WT et NCOA7-/- (que nous avons générées) seront infectées par voie intranasale avec le virus de la grippe (souche H1N1 A/WSN/1933). L’analyse du nombre, du phénotype et des fonctions des cellules immunitaires ainsi que la mesure de la charge virale dans le poumon et de la production de cytokines dans les organes et le lavage broncho-alvéolaire seront effectuées à différents temps post-infection.

Bénéfices attendus

Le virus de la grippe est un problème de santé publique majeure et les risques liés à l’émergence de souches virales responsables d’une pandémie sont très élevés. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes de défense de l’organisme, contre une infection par le virus de la grippe et de caractériser l’importance de NCOA7 dans la mise en place des réponses immunitaires innée et adaptative.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Procédure 1 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 2 : - - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 1 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes Procédure 3 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - irradiation (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 10 minutes maximum, 30 minutes avec transport vers l'irradiateur- 1 fois par animal (procédure 4 et 5) - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 1 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 4 : - Injection intra-péritonéale (pour anesthésie profonde) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - irradiation (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal– durée 10 minutes maximum, 30 minutes avec transport vers l'irradiateur- 1 fois par animal (procédure 4 et 5) - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 2 fois par animal – durée 30 secondes - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 2 fois par animal– durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine Procédure 5 : - injection intraveineuse (sous anesthésie brève, à l’isoflurane) – 2 fois par animal – durée 30 secondes - Infection intranasale (sous anesthésie profonde) : 1 fois par animal – durée 30 secondes par narine - Prélèvements sanguins (sous brève anesthésie ) : 1 fois par animal– durée 30 secondes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont : i) une légère douleur générée par les injections intra-péritonéales ou intraveineuses; ii) le stress généré par l’anesthésie et/ou la procédure d’inoculation du virus par voie intranasale ; iii) une légère douleur et le stress généré par les prélèvements de sang, l’irradiation et le transfert de moelle osseuse ; iv) le stress généré par le transport entre l’animalerie et l’irradiateur. L'infection par le virus influenza A est une procédure utilisée en routine dans le laboratoire et qui, aux doses sous létales utilisées, , ne génère pas de souffrance visible sur les animaux. Les doses utilisées dans la procédure 1 et 3 pouvant être létales, notre expérience a montré que les animaux pouvaient expérimenter une perte de poids allant jusqu’à 25% de leur poids initial entre jour 6 et 10 après infection, avant de revenir à leur poids initial entre jour 12 et 15 après infection. Dans ce cas, un point limite de 25% de perte de poids est fixé.

Devenir

Mise à mort des animaux pour analyse des organes, par dislocation cervicale ou surdose de pentobarbital. La méthode par surdose de pentobarbital sera utilisée sur des groupes d’animaux, pour permettre l’analyse des lavages broncho-alvéolaires.

Remplacement

Le role antiviral de la protéine NCOA7 a été mis en évidence in vitro, dans des cellules pulmonaires humaine. Nous souhaitons à présent mettre en évidence un rôle de NCOA7 in vivo, dans un contexte global d'infection par le virus de la grippe. De plus, des résultats préliminaires indiquent que NCOA7 pourrait égalemet jouer un rôle dans la mise en place des réponses antivirale adaptatives. La réponse immunitaire anti-virale est un phénomène biologique complexe faisant intervenir de multiples types cellulaires et une organisation spatiale qui rend impossible son étude dans des tests in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires a été estimé sur la base des expériences antérieures, afin d’assurer un calcul statistique précis et permettre une interprétation robuste des résultats.

Raffinement

Afin de réduire la souffrance, le stress et la douleur de l’animal, i) les infections intra-nasales seront réalisées sous anesthésie profonde et la température corporelle des animaux sera maintenue lors de l'anesthésie; ii) les prélèvements de sang seront réalisées sous anesthésie à Isoflurane et après application d'un collyre; iii) les injections intraveineuses seront réalisées sous anesthésie légère; iv) nous maintiendrons les animaux en groupes sociaux au sein de chaque cagée (en moyenne 5 animaux par cagée) ; v) des points limites assez prédictifs et définis pour chaque procédure ont été établis afin d'anticiper toutes souffrances et tout mal être des animaux; vi) nous assurerons une surveillance adaptée à chacune des procédures ou étape au sein d'une procédure, comme décrit au sein de chaque procédure. vii) pour les procédures 1 et 3, les animaux serons surveillés et pesés quotidiennement (mêmes jours fériés et week-end) après infection.

Choix des espèces

Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de réaliser des expériences dans des animaux génétiquement modifiés. Dans ce projet, des souris WT (fond C57Bl/6J), des souris F5 (transgénique pour le récepteur à l’antigène des lymphocytes T et spécifique du peptide NP68) et des souris invalidées pour NCOA7 (fond C57Bl/6J CD45.2) seront utilisées. Adultes de 6 semaines à 3 mois : le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant au moment de l’infection (6 à 8 semaines) et certains animaux seront gardés jusqu’à 50 jours après infection afin d’étudier la mise en place des réponses immunitaires mémoires.

1332 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections déclenchant une inflammation, dont un modèle sévère au LPS qui altère fortement leur état général et peut entraîner la mort, la survie étant mesurée. Un modèle de maladie auto-inflammatoire porte sur des nouveau-nés dont l'espérance de vie ne dépasse pas quatorze jours. Le porteur affirme vouloir vérifier in vivo un mécanisme observé sur cellules et décrit le modèle murin comme déjà validé.

Objectifs

L’inflammation est la première réaction du système immunitaire à une agression externe (infection, traumatisme, brulure, etc…) ou interne (cellules cancéreuses) . C’est un processus universel qui concerne tous les tissus faisant intervenir l’immunité innée. L’inflammation est un processus de défense généralement bénéfique mais qui peut devenir délétère lorsqu’elle est dérégulée. Dans des maladies telles silicose, arthrite goutteuse, diabète de type 2, athérosclérose, maladie d'Alzheimer ou sepsis. ). Il existe également des pathologies génétiques spécifiques de l’inflammation appelées syndrome périodique associé à la cryopyrine (CAPS) dans lesquelles une mutation sur un gène entraine une dérégulation de l’inflammation. Ces maladies sont des maladies dites autoinflammatoires qui sont caractérisées par de l’urticaire, des atteintes oculaires, articulaires et neurologiques et qui peuvent engendrer de l’amylose (accumulation de protéines dans les organes). La cause de ces maladies est la mutation d’un gène codant pour une protéine clé dans le processus d’inflammation qui est appelée inflammasome. Cette mutation entraine un gain de fonction pour l’inflammasome dont la conséquence est une dérégulation de l’inflammation. Sur des cellules immunitaires en culture nous avons observé qu’en activant un type de protéines membranaires sensibles à la pression mécanique, nous les rendions plus sensibles aux stimuli déclenchant l’inflammation. Par ailleurs, toujours sur des cellules en culture mais porteuses d’une mutation de l’inflammasome analogue à celle retrouvée chez des patients atteints de CAPS, nous avons observé que la seule activation de ces protéines membranaires suffit à déclencher l’inflammation. Nous voulons maintenant confirmer ces observations dans un modèle murin in vivo afin de vérifier leur validité dans un contexte physiologique. Dans ce but, nous utiliserons une approche pharmacologique en administrant un activateur ou un inhibiteur de nos protéines d’intérêt sur des souris qui seront soumises à un modèle d’inflammation induite. Nous testerons également une approche génétique en générant des souris porteuses d’une mutation qui récapitule une maladie autoinflammatoire afin d’observer si le ciblage de nos protéines d’intérêt peut réduire l’intensité de l’autoinflammation.

Bénéfices attendus

L'industrie pharmaceutique fournit des efforts importants pour le traitement des maladies inflammatoires (silicose, arthrite goutteuse, diabète de type 2, athérosclérose, maladie d'Alzheimer ou le sepsis) et autoinflammatoires (Syndrome périodique associé à la cryopyrine - CAPS) médiées par un type particulier d'inflammasome. Lors de nos observations in vitro, nous avons montré sur des cellules immunitaires en culture, que des protéines membranaires sensibles à la pression mécanique jouent un rôle dans l’inflammation médiée par un type particulier d’inflammasome. Si nous confirmons cette découverte in vivo sur un modèle murin, alors ces protéines membranaires constitueront une nouvelle cible thérapeutique à explorer pour les maladies inflammatoires et autoinflammatoires.

Procédures

- Pour l’activation pharmacologique des protéines d’intérêt : au jour 1, les souris subiront une injection intrapéritonéale (IP) de l’activateur et une injection sous cutanée (SC) d’un antalgique puis, 1h après, une injection IP d’un facteur induisant une inflammation. L’injection d’antalgique est répétée toutes les 6h pendant la durée de l’observation (5j maximum) (252 souris). - Pour l’inhibition pharmacologique des protéines d’intérêt : les souris subiront, au jour 1, une injection IP d’un inhibiteur et une injection SC d’un antalgique puis, 1h après, l’injection d’un facteur induisant une inflammation. L’injection de l’inhibiteur est répétée 1x/jour pendant les 5 jours d’observation. L’injection SC de l’antalgique est répétée toutes les 6h pendant la durée d’observation (5 jours). La durée des injections n’excède pas 5 secondes (504 souris). Pour suivre les événements précoces de l’inflammation, nous avons prévus des cohortes qui subiront un prélèvement sanguin à la veine temporo-mandibulaire aux temps 3h ou 6h après induction de l’inflammation. La durée du prélèvement n’excède pas 15 secondes (504 souris). - Pour le modèle génétique de maladie autoinflammatoire : nous générerons des nouveaux nés qui subiront une injection IP d’un inhibiteur et une injection IP d’antalgique (si nécessaire) par jour pendant les 14 jours d’observation. La durée des injections n’excède pas 5 secondes (324 souris). - Pour le modèle génétique de maladie autoinflammatoire invalidé pour les protéines d’intérêt : nous générerons des nouveaux nés qui recevront une injection IP d’antalgique par jour. L’injection n’excède pas 5 secondes (108 souris)

Impact sur les animaux

Nous déclarons dans ce projet 2 modèles d’inflammation induite : - L’induction d’une péritonite : Dans ce modèle d’inflammation modéré, une inflammation localisée au niveau du péritoine (péritonite) apparaitra après l’injection d’une suspension de cristaux d’acide urique. Les souris sont mises à mort 6h après l’induction de l’inflammation pour analyse des marqueurs de l’inflammation. - Induction d’une inflammation systémique aigüe : un composant de la paroi de bactéries est injecté dans le péritoine et entrainera une inflammation systémique C’est un modèle d’inflammation sévère qui altère fortement l’état général des animaux pouvant aller jusqu’à la mort. La survie des souris sera mesurée pendant 5 jours après l’induction. Nous déclarons aussi la génération de souris modèles d’une maladie autoinflammatoire : les nouveaux nés portant une mutation sur un gène qui joue un rôle clé dans l’inflammation présenteront un syndrome inflammatoire important qui se traduit par une rougeur de la peau, un érythème, une inflammation des organes et un fort retard de croissance. L'espérance de vie de ces animaux ne dépasse pas 14 jours.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront mis à mort : - induction d’une inflammation modérée : tous les animaux seront mis à mort pour analyses post mortem. - induction d’une inflammation sévère : Une partie des animaux est dédiée pour analyse post mortem à des temps précis après l’induction de l’inflammation. Une autre partie est dédiée pour les mesures de survie. Parmi ces animaux certains décèderont du fait de l’inflammation induite. Les survivants ne seront pas réutilisés et mis à mort. - Modèle de maladie autoinflammatoire : l’espérance de vie des nouveaux nés ne dépasse pas 14 jours. Les survivants ne seront pas réutilisés et seront mis à mort.

Remplacement

Nous avons observé sur des cellules immunitaires en culture qu’en agissant sur un type de protéines membranaires mécano-sensibles on peut moduler le processus inflammatoire qui est pourtant médié par un autre type de protéines dans ces cellules. Nous voulons maintenant vérifier que ce mécanisme observé in vitro, sur un type cellulaire isolé, est toujours présent in vivo à l’échelle d’un organisme ou de nombreux types cellulaires interagissent. Le modèle murin constitue un modèle déjà validé dans le domaine des recherches sur l’inflammation. Par ailleurs des lignées de souris génétiquement modifiées qui récapitulent les maladies autoinflammatoires sont disponibles et validés.

Réduction

Ce projet nécessitera un total de 1332 souris Nous avons prévu dans ce projet une approche pharmacologique et une approche génétique. Pour l’approche pharmacologique, des souris seront traitées par différents composés puis soumises à un modèle d’inflammation induite. Nous avons prévu deux modèles d’inflammation : Le premier est un modèle d’inflammation modéré (péritonite induite) dans lequel 18 souris par groupe seront nécessaires pour comparer statistiquement les niveaux des cytokines inflammatoires entre les groupes. Le deuxième modèle est un modèle d’inflammation sévère dans lequel 18 souris par groupe seront nécessaires pour pouvoir comparer statistiquement la mortalité entre les groupes. Dans ce modèle nous comparerons aussi, à 2 temps différents après l’induction, les niveaux sanguins des cytokines inflammatoires. Pour que la comparaison soit statistiquement fiable, les groupes seront composés de 18 souris. Par souci de réduction, si le modèle modéré nous permet de répondre à nos questions pour l’approche pharmacologique alors nous ne testerons pas le modèle sévère, évitant ainsi l’utilisation de 864 animaux Pour l’approche génétique, nous générerons dans un 1er temps, des souris invalidées pour nos protéines d’intérêt. Ces animaux seront soumis à un des 2 modèles d’inflammation décrits plus haut. Si le modèle modéré nous permet de répondre à nos questions, alors nous ne testerons pas le modèle sévère, évitant ainsi l'utilisation de 216 animaux. Dans un 2ième temps, toujours pour l’approche génétique, nous générerons des nouveaux nés présentant une maladie autoinflammatoire, traités ou non par un inhibiteur de nos protéines d’intérêt, ainsi que des nouveaux nés présentant la maladie autoinflammatoire dans lesquels nos protéines d’intérêt sont invalidées ou non. Pour que la comparaison de la mortalité entre les groupes soit staistiquement fiable, ils devront être composés de 18 animaux. Par ailleurs, les marqueurs sanguins de l’inflammation seront comparés entre les groupes à 2 âges différents. Ici encore, pour une comparaison statistique fiable, les groupes seront composés de 18 individus.

Raffinement

Pour l'approche pharmacologique, les animaux seront soumis à des modèles d'inflammation induites dont un induit une inflammation sévère. Afin de limiter autant que possible leur souffrance, des traitements antalgiques puissants (analogue de morphine) seront administrés préventivement et curativement aux animaux testés. Pour les mesures de survie, des points limites sont fixés en fonction de l'état général des animaux. Au-delà des point limites, l'état de l'animal sera considéré irréversible et il sera euthanasié. Nous avons prévu pour cette approche 2 modèles d'inflammation induite : un modèle modéré (induction par cristaux de MSU) et un sévère (induction au LPS). Si le modèle d'inflammation modérée nous permet de répondre à nos questions, alors nous ne testerons pas le modèle d'inflammation sévère. Pour l'approche génétique qui consiste en la génération de nouveaux nés présentant une maladie autoinflammatoire, nous avons établi une grille d'évaluation spécifique pour les nouveaux nés. Cette grille permettra d'établir un score en fonction des différents paramètres observés. Les nouveaux nés seront observés quotidiennement et, en fonction du score, différentes actions seront réalisées (réchauffage de la cage, réhydratation en injectant du NaCl 0.9%, traitement avec un analogue de morphine). Ce scorage spécifique nous servira également à déterminer le point limite au-delà duquel les nouveaux nés seront mis à mort. Par ailleurs, une attention particulière sera portée à la manipulation des souriceaux : passage dans la litière sale avant remise en contact avec la mère, matériel de nidification placé dans la cage, volumes injectés et aiguilles adaptés aux souriceaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal déjà validé dans le domaine de l’inflammation Par ailleurs, plusieurs lignées génétiquement modifiées sont disponibles : lignées de souris invalidées pour nos protéines d'intérêt et lignées de souris modèle d'une maladie autoinflammatoire (animaux exprimant une mutation analogue à celle retrouvée chez les patients). Pour les modèles d’inflammation induite les souris seront utilisées au stade adulte (à partir de 8 semaines). À ce stade, le système immunitaire est complètement développé. Si les souris sont trop jeunes, le système immunitaire ne sera pas mature. Si les souris sont trop âgées, le système immunitaire ne sera plus assez efficace. Pour les souris modèles d'une maladie autoinflammatoire les animaux seront utilisés dès la naissance.

2432 souris vont être utilisées, dont 848 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie subit une lésion partielle du nerf sciatique qui provoque une douleur neuropathique irréversible, avant des injections quotidiennes et des tests de sensibilité, pour évaluer des composés analgésiques. Le porteur indique que les administrations répétées peuvent provoquer constipation, tolérance, addiction et dépression respiratoire. Une partie des souris est tuée pour analyse des tissus, l'autre transférée vers l'établissement partenaire du projet.

Objectifs

La douleur neuropathique affecte 8 à 10% de la population et, dans nombre de cas, est réfractaire aux traitments actuellement disponibles. Les hétéromères opioïdes mu-delta représentent une nouvelle entité fonctionnelle formée par l'association des récepteurs mu et delta opioïdes. Les données de la litérature indique que l'activation de ces hétéromères induit une analgésie associée à moins d'effets indésirables telles que tolérance et dépendance. Toutefois, les ligands actuellement disponibles présentent de sérieuses limitations soit ils ne passent pas la barrière hématoencéphalique, ce qui limite leur potentiel pour la clinique, soit ils manquent de sélectivité. Le CYM51010 réduit la sensation douleureuse en conditions neuropathiques mais active les récepteurs mu ou delta non associés. Le MP135 présente une séléctivité accrue mais également des effets indésirables forts chez l'animal naïf. Son efficacité n'a par ailleurs pas été évaluée en conditions neuropathiques. Notre projet a pour but de synthétiser des dérivés du CYM51010 qui soient sélectifs des hétéromères mu-delta, présentent une analgésie forte avec peu d'effets indésirables tels que tolérance, dépendance et dépression respiratoire. L'évaluation des molécules sera réalisée en souris naïves ou neuropathiques après lésion partielle du nerf sciatique. Ces nouveaux composés seront comparés à la morphine, composé de référence en clinique, et aux deux petites molécules ciblant les hétéromères mu-delta déjà disponibles, le CYM51010 et le MP135. L'utilisation de lignées de souris déficientes pour l'un ou l'autre récepteur permettra de vérifier la sélectivité des composés. Finalement, l'utilisation de nos lignées génétiquement modifiées exprimant des versions fluorescentes des récepteur mu et delta permettra d'étudier in vivo les mécanismes sous-jacents à l'action des composés, notamment leur internalisation . L'objectif est à terme de proposer de nouveaux composés pour traiter la douleur chronique.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront une meilleure connaissance du rôle physiopathologique des hétéromères mu-delta. L’obtention de composés sélectifs des hétéromères permettra de les cibler in vivo, d’isoler et d’étudier leur contribution spécifique à différents processus dont la nociception. Cet aspect est très fondamental car il permettra d’engager une étude mécanistique des voies de signalisation et des circuits neuronaux impliqués. Ceci est impossible actuellement car les composés existants activent également les récepteurs non associés. D’autre part, obtenir des composés sélectifs permettra, nous l’espérons, d’obtenir une bonne réponse analgésique avec moins d’effets secondaires et d’ouvrir une nouvelle voie thérapeutique.

Procédures

Un groupe de souris adultes sera testé quotidiennement pendant 10 secondes sur une durée de 15 jours et recevra une injection quotidienne d’une durée de 10 secondes pendant 10 jours (soit au total 3 minutes de test et moins de 2 minutes d’injection sur une période de 15 jours). A l'issue de cette période, une partie d'entre elles sera testées pendant 30 minutes dans un second test. Un deuxième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes, recevra après la chirurgie une injection quotidienne de 10 secondes pendant 10 jours et sera testé 20 fois dans deux tests de durée respective de 10 secondes et 3 minutes (soit au total 63 minutes de test et moins de 2 minutes d’injection sur une période de 35 jours). A l'issue de cette période, une partie d'entre elles seront testées pendant 30 minutes dans un troisième test. Un troisième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes et sera testé 10 fois dans deux tests de durée respective de 10 secondes et 3 minutes (soit au total 32 minutes de test sur une période de 35 jours). A l'issue de cette période, elles seront testées pendant 4heures dans un troisième test

Impact sur les animaux

La lésion partielle du nerf sciatique induit une douleur de type neuropathique non réversible qui se traduit par une sensibilité accrue au froid transitoire et sensibilité mécanique augmentée de façon persistente. Pour cette raison, l'efficacité des composés sera tout d'abord testés en souris non douloureuses afin de réduire le nombre d'animaux subissant cette procédure. L'administration répétée des composés pourra induire de la constipation, tolérance, addiction et dépression respiratoire. Les trois derniers sont l’objet de l’étude. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable.

Devenir

une partie des animaux est euthanasiée à la fin de chaque procédure pour analyse des tissus in vitro, une autre partie est transférée dans l'établissement partenaire du projet

Remplacement

L'effet analgésique et les effets indésirables des composés ne peuvent être évalués que sur organisme entier et vivant et ne peuvent être mesurés par une approche en cellules ou en organoïdes.

Réduction

le nombre d’animaux nécessaires au projet a été évalué mathématiquement pour permettre d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes de 2-5 animaux du même sexe pour respecter leur besoins d'interaction sociale et leur cage enrichie avec des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation. Le changement de litière se fait avec des tunels pour éviter la prise par la queue et reduire le stress des animaux. L'apparition éventuelle de signes de souffrance ou de détresse est surveillée quotidiennement en portant une attention particulière à tout changement de l’état général (perte de poids supérieure à 15%, défaut de toilettage, plaie ouverte, blessure, déshydratation) ainsi qu'à l'état comportemental (prostration, dos arqué, réticence au déplacement, léthargie, agressivité). Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur est réalisée. Dans les tests comportementaux, un seuil maximal de stimulation est déterminé (point limite afin d'éviter une souffrance à l'animal ou des dommages tissulaires) même en absence de réaction de l'animal. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale et du gel oculaire est apliqué durant la procédure. Un suivi postopératoire quotidien (pesée, observation de l'œdème inflammatoire) est effectué pendant 3 jours.

Choix des espèces

la souris a été choisie car ces animaux peuvent être modifiés génétiquement et cette espèce est un modèle validé du comportement humain pour les questions abordées dans ce projet. L'utilisation des souris génétiquement modifiées n'exprimant que le récepteur opioïde mu ou delta permet d'évaluer la sélectivité des composés pharmacologiques à tester et celle des animaux exprimant une version fluorescente des récepteurs mu et delta permet de visualiser directement les changements dans leur distribution induits par les traitements. Ces lignées de souris ont déjà été utilisées avec succès pour évaluer des traitements de la douleur neuropathique et la distribution des récepteurs en conditions physiopathologiques. L'étude comportementale nécessite le développement complet du système nerveux soit des souris agées de 6 semaines ou plus

6704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1676 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par la tuberculose, parfois co-infectées par le SARS-CoV-2, la grippe ou le pneumocoque, et reçoivent des composés par gavage jusqu'à sept jours par semaine. Le porteur indique que les surinfections peuvent provoquer des signes cliniques graves pouvant aller jusqu'à la mort des animaux. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'infection et revendique la souris comme un "modèle incontournable".

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier l'effet de composés (médicaments, substances chimiques ou produits biologiques) à visée thérapeutique contre la tuberculose, et d'évaluer la pathogénicité de différentes souches bactériennes de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou mutantes, ainsi que la contribution de l'hôte à la pathogénicité des mycobactéries in vivo chez la souris. L'intéraction entre la tuberculose chronique et d'autres pathogènes pulmonaires étant encore mal caractérisée, un autre objectif de ce projet sera de caractériser et d'étudier l'évolution de la co-infection (tuberculose et agents pathogènes viraux/bactériens pulmonaires, tels que les virus SRAS-CoV-2 et Influenza H3N2/H1N1 et les bactéries Streptococcus pneumoniae Sérotype 1) dans un modèle de souris.

Bénéfices attendus

Selon les estimations de l’Organisation Mondiale de la Santé, 9,9 millions de personnes ont développé la tuberculose dans le monde, et 1,5 million de personnes sont mortes de la tuberculose en 2020 (dont 214 000 présentaient également une infection à VIH). À l’échelle mondiale, la tuberculose est la 13e cause de mortalité et la deuxième due à une maladie infectieuse, derrière la COVID-19 (et avant le sida). Cette évolution est principalement liée à la recrudescence de la tuberculose chez des patients immunodéprimés, ainsi qu'à l’émergence des souches résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nos projets visent (i) à identifier de nouveaux types d'antituberculeux efficaces sur les souches multirésistantes de Mycobacterium tuberculosis, (ii) à comprendre les mécanismes fondamentaux de l'interaction de l'hôte avec ces mycobactéries, afin de comprendre les mécanismes responsables de l’infection, et (iii) à caractériser et étudier l'impact d'une co-infection pulmonaire chez la souris atteinte d'une tuberculose latente.

Procédures

Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés quotidiennement (5 à 7 jours par semaine) par gavage ou voie intrapéritonéale ou une fois par semaine par voie intraveineuse (dans la veine caudale) aux souris non-anesthésiées, pendant 3 à 8 semaines. L’administration par voie endotrachéale ou intranasale peut également être utilisée 3 à 4 fois par semaine et pendant 1 à 3 semaines sur souris préalablement anesthésiées. L'infection des souris avec les différents agents pathogènes pulmonaires est réalisée par voie intranasale sous anesthésie ou par voie intraveineuse ou sous cutanée sur animaux vigiles. Dans le cadre des expériences de co-infections, les animaux seront infectés à deux reprises, (i) avec Mycobacterium tuberculosis, puis (ii) un des autres pathogènes pulmonaires étudiés. Pour l'imagerie, les animaux sont anesthésiés et placés dans une cassette de contention pendant une durée de 5 minutes pour permettre l'acquisition des images (1 à 2 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Lors des expériences de surinfection, des signes cliniques graves pourraient etre observés, pouvant aller jusqu'à entrainer la mort des animaux.

Devenir

Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d'expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.

Remplacement

Aucun modèle expérimental in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la tuberculose pulmonaire évolutive, ni de reproduire la physiopathologie de l’infection respiratoire, ni d’étudier les mécanismes de défense contre l’infection. Seules les études in vivo permettent de déterminer l'efficacité de composés face à une épreuve virulente de M. tuberculosis. Et l’efficacité chez la souris constitue un pré-requis avant toute phase clinique sur l'homme. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du bacille tuberculeux in vivo et l’étude de l’interaction entre l’hôte et les mycobactéries. Les différentes stratégies innovantes de vaccination contre les mycobactéries pathogènes peuvent être évaluées et validées chez la souris qui, infectée efficacement par des souches de M. tuberculosis pathogènes humaines, développe une tuberculose pulmonaire active.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, une partie des organes est également utilisée et analysée par histologie ou par FACS, afin de visualiser la localisation des bactéries dans différents types cellulaires. Une approche par imagerie du petit animal, sous anesthésie, sera développée au sein du Laboratoire de Haute Sécurité pour permettre le suivi de l'infection d'un seul groupe d'animaux au cours du temps, sans avoir besoin de sacrifier les animaux. Nous espérons à terme que cela puisse réduite le nombre d'expériences.

Raffinement

De façon à réduire le stress, l'inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées avant l''infection ou le gavage. De plus, la surveillance sera accrue, 2 à 3 fois par semaine ou quotidienne, selon les procédures. L'apparence physique, l'alimentation et le comportement des anmaux seront surveillés, afin de détecter le plus tot possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques a été établie et est utilisée pour évaluer un "score" de douleur et permet d'évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables seront euthanasiés. Les souris seront sacrifiées au maximum 10 semaines post-infection, i.e. avant l'apparition des signes de morbidité, sur la base des connaissances de la souche de M.tuberculosis de type sauvage qui est la plus pathogène parmi les mycobactéries que nous étudions. Si des signes de morbidité étaient observés, les points de cinétiques serons revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocément par rapport à celles initialement prévues.

Choix des espèces

1)La possibilité d’induction d’une tuberculose chronique chez la souris par des souches de M. tuberculosis pathogènes pour l’homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2)L’existence de nombreuses similitudes de l’immunité anti-mycobactérienne entre l’homme et la souris, 3)Les nombreuses connaissances disponibles pour cette espèce, font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles. Les animaux (Balb/C et C57BL/6, wild-type et KO) utilisés sont âgés de 6 à 10 semaines au moment de l'infection par M. tuberculosis. Cet intervalle d’âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.

33 souris âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Le porteur les soumet à un régime carencé en protéines et calories jusqu'à la dénutrition, qu'il qualifie lui-même de stress sévère, en s'attendant à un affaiblissement, une mobilité réduite et une possible surmortalité. Cette étude pilote vise à fixer les points limites de futurs projets, les souris étant hébergées seules et pesées quotidiennement avant d'être mises à mort pour prélever leurs organes. Il affirme que l'impact de la dénutrition sur la santé respiratoire des personnes âgées ne peut s'étudier que sur des animaux vivants.

Objectifs

Les personnes âgées présentent un risque accru de développer des maladies respiratoires telles que les infections pulmonaires. L’apparition d’infections respiratoires récurrentes chez les personnes âgées est associée à un état de dénutrition qui affaiblit les fonctions physiologiques de manière générale et qui affecte aussi la composition des microbiotes de l’intestin et des poumons. L’objectif de cette étude pilote est d’évaluer l’impact de la dénutrition protéino-énergétique sur des souris âgées afin de définir des points limites pour de futurs projets qui étudieront l’effet de cette dénutrition sur la physiologie pulmonaire et la susceptibilité aux infections respiratoires, et l’impact de différents compléments alimentaires. Cette étude permettra aussi de déterminer la durée de régime nécessaire à l’installation de la dénutrition chez ces animaux âgés en établissant une cinétique de l’affaiblissement des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’établir le modèle de dénutrition chez la souris âgée dans notre laboratoire et servira à déterminer les points limites auxquels nous pourront nous attendre lors des études qui s’attacheront à établir l’effet de la dénutrition protéino-énergétique sur la susceptibilité aux infections pulmonaires et leur modulation grâce à des compléments alimentaires (probiotiques et prébiotiques). A terme, ce projet permettra de (i) identifier les mécanismes d’action de la dénutrition sur la santé respiratoire et (ii) de proposer des compléments alimentaires pour prévenir le développement de pathologies infectieuses pulmonaires chez les personnes âgées en état de dénutrition. L’objectif de cette étude pilote est d’évaluer l’impact de la dénutrition protéino-énergétique sur des souris âgées afin de définir des points limites pour de futurs projets qui étudieront l’effet de cette dénutrition sur la physiologie pulmonaire et la susceptibilité aux infections respiratoires, et l’impact de différents compléments alimentaires. A terme, ce projet permettra de (i) identifier les mécanismes d’action de la dénutrition sur la santé respiratoire et (ii) de proposer des compléments alimentaires pour prévenir le développement de pathologies infectieuses pulmonaires chez les personnes âgées en état de dénutrition.

Procédures

Les animaux recevront un régime restricitif en protéines et calories riche qui entrainera une diminution de leur poids. Ils seront aussi manipulés quotidiennement afin de les peser, méthode qui ne prendra pas plus que quelques minutes. Une fois par semaine, au moment de la pesée, les souris seront aussi mises dans dans pots individuels pendant quelques minutes afin de récolter 2-3 fèces.

Impact sur les animaux

Lors de cette procédure, il sera nécessaire d’héberger les animaux en cages individuelles car nous devrons suivre précisément la prise alimentaire de chaque souris, cela entraine un stress modéré. La diminution de l’apport alimentaire (en quantité) entrainera une perte de poids qui sera mesurée quotidiennement et rapportée au poids du J0 de l’expérience. Du fait de l’âge de ces animaux et de ce régime alimentaire carencé, nous nous attendons à ce que les animaux soient affaiblis et montrent une réduction de leur mobilité. Cette dénutrition est considérée comme un stress sévère. L’accumulation de l’âge avancé des animaux avec le régime alimentaire restrictif pourra avoir des conséquences importantes sur le bien-être et la santé des souris âgées pouvant aller jusqu’à une mortalité accrue. La mise en place de cette étude pilote est prévue dans cette optique et permettra de sélectionner le temps d’étude de la dénutrition le plus approprié dans les futurs projets.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de collecter les organes et tissus permettant d'évaluer les effets de du régime restrictif sur les marqueurs de l’inflammation et de la sénescence.

Remplacement

L’impact de la dénutrition sur la santé respiratoire d’individus âgés n’est actuellement possible que sur des animaux vivants. En effet, il n’existe pas de système permettant de récapituler un être constituté de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies. D’autre part, les systèmes de « communication » entre le tractus digestif et l’appartil respiratoire n’étant pas connus à l’heure actuelle, il n’est pas possible d’utiliser des systèmes in vitro.

Réduction

Les animaux utilisés, au nombre maximum de 33, seront des animaux de l’élevage de l’unité qui fournira les animaux. Ces animaux ont préalablement été utilisés pour générer des souriceaux pour d’autres projets d’autres équipes/unités du centre de recherche (ces animaux n’ont pas été inclus dans des projets soumis à une demande d’autorisation). Nous nous inscrirons donc dans le cadre d’une réduction des animaux en expérimentation animale en évitant d’avoir recours à des animaux commandés chez un fournisseur externe. Ce projet ayant pour but de déterminer le temps de restriction calorique nécessaire à l’installation de la dénutrition, tout en évitant l’atteinte des points limite, nous estimons que nous aurons besoin de 8 animaux par groupe pour les 3 temps d’étude de la dénutrition (3 × 8 = 24) et de seulement 3 animaux par temps pour les animaux sans restriction énergétique (3 × 3 = 9 ; 24 + 9 = 33). Cela prend en compte la possibilité de mise à mort de certains animaux (25% = 2 animaux par groupe dénutris) à des temps précoces si ceux-ci atteignent les points limite. Dans le cas où nous devrions mettre à mort les animaux plus précocément que prévu (particulièrement pour les groupes pour lesquels la mise à mort est prévue à J45 et J55), nous en tirerons la conclusion que pour nos futures études, il faudra se baser sur un temps précoce de dénutrition.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement, avec dans chaque cage, en plexiglas transparent qui permet aux animaux des interactions visuelles, olfactives et auditives avec leurs congénères, l'ajout d’un abri obscur en polycarbonate et des feuilles de cellulose. Du fait de l’âge de ces animaux et du régime alimentaire carencé, nous éviterons un stress supplémentaire et nous nous assurerons de la prise complète de la nourriture, par l’humidification de celle-ci et son dépôt dans une coupelle à l’intérieur des cages, avec de l’eau gélifiée. Cela permettra aux animaux de s’alimenter et s’abreuver sans effort physique. La manipulation régulière des animaux par les mêmes personnels expérimentés pour les mesures du poids, de la prise alimentaire et le prélèvement des fèces permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Les animaux seront surveillés quotidiennement (surveillance visuelle, suivi de la prise alimentaire et de la perte de poids) et le remplissage d’une grille de scoring quotidien permettra de d’arrêter l’expérience pour les animaux ayant atteint un état de stress ou de souffrance trop élevé.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en nutrition et immunologie ; disciplines au carrefour desquelles la thématique du projet nous positionne. Elle est aussi une espèce largement utilisée dans l’étude du vieillissement et dans le cadre de la restriction calorique. Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur les maladies liées à l’alimentation. Les animaux utilisés seront des adultes âgés d’environ 16 mois ce qui équivaut à 50 ans pour les humains. Cet âge a été choisi car les souris auront environ 18 mois à la fin du protocole, limitant le risque de mort prématurée des animaux, non-due au protocole, l’espérance de vie moyenne des souris C57BL/6 étant d’environ 24 mois, en l’absence de tout traitement.

1 553 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère. Le porteur leur injecte des cellules T humaines génétiquement modifiées, leur inflige jusqu'à trente prélèvements sanguins rétro-orbitaux et, pour une partie, une greffe de peau, avec le développement attendu d'une réaction du greffon contre l'hôte provoquant une inflammation sévère et une perte de poids. Toutes sont euthanasiées pour analyse, certaines souris conditionnées mais non injectées servant d'abord à "maintenir les compétences" du personnel. Il affirme qu'un modèle de souris humanisée est le plus pertinent pour évaluer ces cellules avant les premiers essais chez l'humain.

Objectifs

Les objectifs du projet sont : 1) vérifier l'impact des cellules Natural killer (NK) sur la persistance des cellules T régulatrices en présence ou non de traitement concomitant 2) l'efficacité des cellules T régulatrices génétiquement modifiées dans des modèles de transplantation (GvHD et transplantation de peau) 3) vérifier la distribution et l'innocuité du produit dans un modèle de souris humanisées relevant par bioluminescence

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont: 1) détermination de la dose à injecter aux patients pour obtenir une efficacité thérapeutique 2) obtenir des données précliniques d'efficacité thérapeutique du produit 3) obtenir des données de sécurité/innocuité du produit thérapeutique avant les premiers tests chez l'humain

Procédures

Les prélèvements de sang se font par voir rétro-orbitale sous anesthésie locale. Nous prélèverons 100uL de sang toutes les semaines jusqu'à semaine 6 à partir de Jour7 après injection des cellules (6 prélèvements) puis le cas échéant une fois toutes les 2 semaines jusqu'à semaine 15 (9 prélèvements) et enfin 1 prélèvement une fois par mois jusqu'à semaine 30 (15 prélèvements) soit au total 30 prélèvements si l'expérience dure jusqu'à semaine 30. Chaque prélèvement sanguin prend environ 2 minutes/souris maximum. Pour la procédure de greffe de peau, les animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et traitement anti-douleur. La douleur des animaux sera atténuée par une injection de buprénorphine. L'intervention chirurgicale dure environ 1heure mais nous surveillerons les souris jusqu' à leur réveil complet (durée de l'intervention: 2 heures maximum)

Impact sur les animaux

Développement de signes de Graft versus Host Disease (GvHD) (perte de poids, pilo-érection, prostration...) qui est une réaction immunitaire du greffon contre l'hôte, entraînant une inflammation sévère.

Devenir

Tous les animaux qui ont reçu une injection de cellules seront euthanasiés en fin d'expérimentation pour l'analyse ex-vivo Les animaux qui ont été conditionnés au busulfan mais n'ayant pas reçu de cellules (le nombre de cellules peut ne pas être suffisant en fonction de leur expansion in vitro qui peut être variable d'un donneur à un autre) pourront être utilisés pour le maintien des compétences du personnel puis euthanasiés

Remplacement

De nombreux tests in vitro permettant une sélection importante de nos cellules seront effectués afin de valider leur qualité et leur efficacité avant les tests in vivo

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisé, chaque groupe contiendra le nombre minimum indispensable à l'obtention de résultats statistiquement pertinents. Nous prévoyons 3 expériences mais si les 2 premières expériences donnent le même résultat, la 3eme sera annulée pour réduire le nombre de souris utilisé. Utilisation de la bioluminescence pour déterminer le temps de mise à mort et ainsi réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Dans une approche éthique, nous prévoyons de limiter au maximum le nombre d'animaux avec des scores cliniques sévères et mettre en place des points limites adaptés. Pour les actes de prélèvement invasifs comme les prélèvements sanguins, nous utiliserons un anesthésique local pour limiter la douleur. Les actes de chirurgie seront faits sous anesthésie générale avec administration de produits analgésiant et anti-douleur jusqu'à la prise de greffe et rétablissement de l'animal. Nous utiliserons également une litière adaptée (douce, non-poussiéreuse) qui favorise l'expression des comportements normaux de la souris (enfouissement, nidification...). Pour les souris qui recevront une greffe de peau, nous réduirons le nombre de souris par cage de 6 à 4 animaux.

Choix des espèces

Nous avons développé des méthodes permettant de modifier génétiquement les cellules humaines et en particulier les cellules T régulatrices (Tregs). Afin de pouvoir estimer l'efficacité, l'innocuité et la persistance de ces Tregs humains, nous devons utiliser un modèle murin humanisé le plus relevant possible. Un tel modèle n'existe que chez la souris et permet l'analyse de la biologie des cellules humaines in vivo. Souris adultes de 8 à 12 semaines pour leur poids relativement stable en fin de croissance, pour la facilité de manipulation, de prélèvement et d'analyses d'échantillons, d'évaluation physique (bien-être) Pour les souris NSG/NXG et HLA-A2 NSG reconstituées par des cellules CD34+ (huNSG, huHLA-A2 NSG) chez Jax Labs ou Janvier labs (huNXG), seules des souris de plus de 12 semaines sont disponibles car c'est le temps nécessaire pour que les cellules CD34+ se greffent et se différencient en cellules immunes matures.