Procédures sévères

456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une myopathie qui provoque atrophie musculaire, paralysie des membres et mort vers sept à huit semaines sans traitement, elles reçoivent des injections hebdomadaires et des tests d'agrippement, avant une chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil. Le projet compare deux formes d'un composé déjà en essai clinique, pour réduire sa toxicité pour le foie en ciblant le muscle. Le porteur affirme que suivre à la fois l'effet musculaire et l'absorption par le foie impose un "organisme vivant entier".

Objectifs

Les myopathies centronucléaires, sont des myopathies congénitales très sévères caractérisées par une faiblesse musculaire, une forte atrophie et des anomalies de la structure des fibres musculaires. La myopathie centronucléaire liée à l'X (XL-MTM), due à des mutations de la myotubularine, MTM1, est la plus commune et la plus sévère des formes de myopathies centronucléaires, caractérisée par une hypotonie néonatale sévère et un décès précoce. Il a été précédemment montré qu'un niveau trop élevé d’une certaine protéine dans le muscle semblait jouer un rôle majeur dans la survenue de cette myopathie et que la sous-expression de cette protéine dans un modèle murin reproduisant les caractéristiques de la maladie, pouvait l’améliorer. L’équipe a également montré qu’il est aussi possible de traiter des souris malades quand elles sont déjà affectées. Nous avons actuellement un composé en essai clinique pour réduire l’expression de la protéine impliquée. Pour concevoir l'essai clinique, les études sur la souris ont été essentielles afin d'effectuer une modélisation PK/PD (pharmacocinétique et pharmacodynamique) et de choisir les doses et la fréquence d'administration appropriées en clinique. Cependant, pour des raisons de sécurité, nous voulons éviter de donner une dose trop élevée du composé et risquer d'induire une toxicité. Par exemple, il est connu que certains patients atteints de XL-MTM ont une maladie du foie sous-jacente. L'objectif de ce projet est de soutenir l'efficacité et l'innocuité de notre composé en clinique via une approche permettant d’augmenter son efficacité tout en réduisant sa toxicité, et ce, en le conjuguant à une molécule qui cible certains récepteurs préférentiellement exprimés dans le muscle. Cette approche éviterait que le composé soit fortement exprimé dans les tissus non ciblés, tel que le foie, et permettrait d'utiliser des doses réduites du composé conjugué en clinique pour atteindre le même effet thérapeutique qu'une dose plus élevée du composé sans conjugaison. Nous souhaitons donc tester ce composé conjugué dans le modèle murin XL-MTM et comparer son efficacité et sa sécurité à notre composé non conjugué.

Bénéfices attendus

Nous avons actuellement un composé en essai clinique pour réduire notre protéine cible, dynamine 2. Pour concevoir l'essai clinique, les études sur la souris ont été essentielles. Pour des raisons de sécurité, nous voulons éviter de donner une dose trop élevée du composé et risquer d'induire une toxicité. Il est connu que certains patients de notre étude ont une maladie du foie sous-jacente. Notre composé étant injecté par voie systémique, il peut atteindre d'autres tissus que le muscle, notamment le foie. L'objectif de ce projet et son bénéfice sont donc de soutenir l'efficacité et l'innocuité de notre composé en clinique. En améliorant son ciblage musculaire, on peut utiliser une dose moindre pour un effet thérapeutique équivalent ou supérieur et ainsi augmenter la puissance et la sécurité du composé.

Procédures

Des injections ainsi qu'une évaluation de leur phénotype (évaluation de la gravité de la maladie) seront effectué 1 fois par semaine pendant 3 semaines (soit 3 injections) sur tous les animaux des procédures expérimentales (soit 240 animaux au total). Les injections durent 1 à 2 minutes par souris. L’évaluation du phénotype est constituée d’une évaluation plus visuelle qui dure moins de 2-3 minutes et d’un test d’agrippement qui dure maximum 1 minute et qui est répété 3 fois avec 5 minutes de repos entre chaque test. A la fin de ces 3 semaines, à 5 semaines d'âge, les dernières procédures seront effectuées sous anesthésie générale sans réveil : chirurgie et mesure de la contraction d’un muscle du membre postérieur et prélèvement sanguin par ponction intracardiaque. Cette chirurgie (anesthésie, dissection, mesure de la contraction du muscle et la ponction intracardiaque) dure au total 1 heure par souris.

Impact sur les animaux

La première nuisance attendue sur les animaux est l’effet du phénotype dommageable de la lignée choisie. En effet, les souris, dès l’âge de 3 semaines, développent les premiers signes d’une atrophie musculaire. Cette atrophie se caractérise par une non prise puis une perte de poids, une faiblesse musculaire de plus en plus importante conduisant à la paralysie des membres inférieurs, une difficulté à s’alimenter et à s’hydrater. Sans traitement, ces critères durent et s’amplifient jusqu’à la mort des souris vers 7-8 semaines. Les traitements mis en place dans nos procédures ont pour but de limiter la perte de poids voire de permettre une reprise de croissance, d’empêcher la paralysie des membres et prolonger la durée de vie des animaux. La seconde nuisance potentielle attendue sur les animaux est due aux injections qui peuvent induire des signes d'inflammation, induration, infection, occlusion intestinale (perte de poids et gonflement ventral).

Devenir

Les animaux de la procédure maintien de la lignée sont maintenus en vie pour les procédures suivantes. Lors des procédures qui suivent : Etude pilote et Dose réponse, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale, après mesure de la contraction musculaire in situ et prélèvement sanguin par ponction cardiaque (le tout fait sous anesthésie générale).

Remplacement

Nous savons que notre composé, étant injecté systémiquement, est fortement retenu dans le foie des animaux. Or certains patients présentent une maladie du foie sous-jacente. Avec le conjugué que nous souhaitons tester nous espérons d’une part pouvoir limiter son action aux muscles et d’autre part diminuer la dose sans diminuer l’efficacité. Pour attester cela, nous devons pouvoir regarder, après l’injection de nos composés, dans un même animal, l’efficacité sur les muscles et le niveau d’absorption par le foie. Ceci ne peut être étudié que sur un organisme vivant entier, d’où l’utilisation des souris.

Réduction

Les lots ont été établis en utilisant une méthode statistique adpatée à l'évaluation de l'atrophie musculaire et de l'effet des composés testés sur cette atrophie. Il a été déterminé que le nombre optimal de souris par groupe sera de 15 souris pour atteindre une différence statistiquement significative lorsqu’un phénotype apparait entre les souris contrôles et les souris génétiquement modifiées. Afin de limiter le nombre de groupes expérimentaux utilisés nous avons diminué le nombre de groupes expérimentaux en ne reproduisant pas les groupes expérimentaux déjà testés dans les études précédentes sachant que les résultats obtenus sont stables et homogènes. Avant de lancer notre étude complète nous réaliserons également une étude pilote pour vérifier la faisabilité de notre projet. En effet, si l’injection de notre composé conjugué ne s’avère pas plus efficace et moins « toxique » que notre composé non conjugué actuellement en clinique, alors l’étude complète ne sera pas effectuée.

Raffinement

Une surveillance quotidienne permettra de repérer précocement les signes de souffrance / douleur / stress. Dès l’apparition de ces signes un suivi sera effectué via une fiche scoring pour définir les points limites permettant de prendre les mesures appropriées en fonction du niveau observé, limitant ainsi la souffrance de l'animal. Afin d'améliorer le bien-être animal tout au long de la vie de l'animal, de la nourriture adaptée à ce modèle de souris sera utilisée (eg. de la nourriture et de l’eau en gel ainsi que quelques croquettes seront placées dans la cage pour les souris malades à la place des croquettes sur la grille).

Choix des espèces

Nous souhaitons suivre à la fois l'efficacité du traitement et les effets secondaires sur les autres organes que les organes cibles, notamment le foie, nous devons donc utiliser un organisme vivant entier. Le modèle de la maladie que nous étudions : myopathie myotubulaire liée à l'X, est disponible chez le chien et la souris. L’utilisation du modèle canin pour une étude pilote/préclinique n’étant pas la plus adéquate (disponibilité de la lignée, nombre nécessaire, durée de vie des animaux, long processus de reproduction…) nous proposons de réaliser ces techniques sur une lignée de souris MTM1 KO disponible dans nos laboratoires. Les animaux seront étudiés à partir de l'âge de 3 semaines (âge d'apparition des symptômes et début du traitement) jusqu'à l'âge de 5 semaines pour pouvoir analyser l'effet "immédiat" du traitement sur les souris.

Remis en élevage à la fin des essais "pour poursuivre leur croissance", 1 250 porcs d'environ 50 kg vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun passe 21 jours en cage individuelle, dont 10 jours aux mouvements limités pour recueillir des fèces sans urine, afin de mesurer l'énergie qu'il tire d'un aliment, à raison de 5 porcs par aliment testé. Le porteur cite comme nuisances le stress de cet isolement partiel et une possible néophobie alimentaire, et retient des objets à manipuler que les porcs ne peuvent pas ronger, pour ne pas fausser les mesures. Les résultats doivent aider à composer les aliments des élevages commerciaux, et le porteur affirme avoir "besoin d'avoir recours à des essais sur animaux" pour atteindre cette précision.

Objectifs

Les aliments des porcs sont constituées de matières premières qui sont combinées dans une recette permettant de satisfaire au mieux les besoins nutritionnels des animaux, tout en limitant les excédents nutritionnels préjudiciables au bien-être animal (développement de maladies métaboliques, surpoids entraînant des troubles locomoteurs, inadaptation digestive à l'origine de diarrhée). Les matières premières utilisées dans les aliments doivent donc systématiquement faire l'objet d'études de caractérisation. L'un des principaux critères permettant la combinaison des matières premières dans une recette est leur teneur en énergie. Celle-ci est déterminée sur la base de l'utilisation digestive de l'énergie, qui est mesurée par différence entre les quantités d'énergie ingérée et excrétée dans les fèces. L'objectif du projet est de déterminer l'utilisation digestive de l'énergie des aliments chez le porc.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre de disposer de connaissances concernant la valeur nutritionnelle des aliments. Celles-ci sont bénéfiques pour les animaux, l'environnement, les éleveurs et l'ensemble de la société car elles permettent une meilleure utilisation des ressources alimentaires, diminuant ainsi les risques métaboliques pour les animaux, les risques liés aux impacts environnementaux des élevages et la compétition entre les animaux et l'homme pour l'utilisation des ressources alimentaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à des conditions d'hébergement particulières (hébergement individuel pendant 21 jours et limitation des mouvements pendant 10 jours).

Impact sur les animaux

La principale nuisance est liée aux modalités d'hébergement. D'une part, les animaux sont placés en cages individuelles. D'autre part, les mouvements des animaux sont limités pendant la deuxième phase du projet pour la collecte des fèces non contaminées par de l'urine. Ces pratiques pourront induire un stress pour les animaux, qui seront partiellement isolés de leurs congénères. Les aliments qui seront utilisés pendant les études seront également variables et différents des aliments consommés préalablement par les animaux. Une néophobie alimentaire est donc possible.

Devenir

Les animaux réintègrent une structure d'élevage pour poursuivre leur croissance.

Remplacement

Nous souhaitons mesurer l'utilisation digestive des aliments chez le porc. Pour cela, nous ne disposons pas de modèles (in vitro ou mathématiques) suffisamment précis pour permettre la représentation de la complexité biologique des phénomènes digestifs et nous avons besoin d'avoir recours à des essais sur animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé comme étant le nombre d'animaux strictement nécessaire pour mesurer l'utilisation digestive de l'énergie des aliments avec une précision suffisante (nous considérons qu'un écart-type de 1% est nécessaire pour que les mesures réalisées soient bénéfiques pour la connaissances des valeurs nutritionnelles des aliments). Sur la base de nos essais antérieurs, cette précision est atteinte avec un effectif de 5 animaux par aliment. Les comparaisons entre aliments seront réalisées sur la base d'analyses de variance dans les conditions d'application des modèles statistiques linéaires généralisés.

Raffinement

Les animaux sont toujours placés à proximité de leurs congénères pendant le projet, soit en contact direct (phase d'adaptation), soit en contact visuel et auditif (phase de collecte). Toutes les cages sont équipées de dispositifs d'enrichissement qui sont renouvelés régulièrement et au gré des comportements individuels. Nous utiliserons des matériels manipulables (chaînes métalliques et balles en plastique dur) qui ne peuvent pas être rongés par les porcs, car cela aboutirait à la présence de résidus dans les fèces, pénalisant les mesures. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel expérimenté afin de détecter l'atteinte d'un point limite.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce-cible des études. Les animaux seront en croissance, d'un poids moyen de 50 kg. Ce poids correspond au poids vif moyen des animaux présents dans les élevages commerciaux et qui sont la cible des résultats du projet.

9 000 poissons, poissons zèbres, saumons, loups de mer et autres espèces, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, la quasi-totalité tuée et 70 poissons zèbres conservés pour l'élevage. Ils sont exposés dans l'eau à des concentrations de substances chimiques, effluents, biocides ou produits phytosanitaires, dans des essais où la mort d'un certain nombre d'individus est le résultat recherché. Le porteur indique que ces essais réglementaires servent à évaluer la toxicité pour l'environnement. Les poissons issus de ces procédures sévères ne peuvent être ni réutilisés ni relâchés.

Objectifs

La qualité des écosystèmes et leur préservation est en lien directe avec la santé. Dans ce cadre, il est important d’établir des diagnostics de l’état de ces écosystèmes et également de prédire l’impact potentiel des activités anthropiques sur ces écosystèmes. La toxicité des effluents, des produits chimiques, des phytosanitaires et biocides ou des substances sur les écosystèmes aquatiques est évaluée en utilisant différents modèles biologiques comme des bactéries, des végétaux, des invertébrés et des poissons. Les effets recherchés peuvent être aigus (mort) ou chroniques (croissance, développement larvaire). Ces essais rentrent dans le cadre de nombreuses règlementations (CLP, REACH, directive biocide, directive phytosanitaire) et permettent d’évaluer les risques pour l’environnement. Cette étude correspond à l’évaluation de la toxicité aiguë sur les poissons en suivant la ligne directrice OCDE 203 ou une méthode équivalente. L'objectif du projet est de déterminer les concentrations en élément d'essai entrainant des effets sur la survie des poissons. Les valeurs à déterminer sont la concentration n'entrainant pas d'effet (NOEC) et si nécessaire la concentration entrainant 10% ou 50% d'effet sur la survie des poissons.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettent l'étiquetage des substances et la réalisation de l'évaluation des risques des substances introduites dans l'environnement.

Procédures

Les animaux sont exposés à des concentrations en substance chimiques via le milieu aquatique. Il n'y a pas de prélèvements ni de procédures chirurgicales.

Impact sur les animaux

Cet essai visant à déterminer la toxicité aiguë vis-à-vis des poissons, il est probable qu'un certain nombre d'individus meurent au cours de la procédure.

Devenir

Les animaux sont issus d'une procédure sévère, ils ne peuvent donc pas être réutilisés. De plus, les espèces de poissons utilisées ne sont pas toutes des espèces domestiques qui peuvent être replacés en aquarium ou par des associations.

Remplacement

Dans le cas où des méthodes alternatives, des essais sur lignées cellulaires ou des essais sur les embryons de poissons n'ont pas permis de dériver des données fiables, les autorités peuvent exiger un essai de toxicité aiguë sur poisson.

Réduction

Les données issues d'essai sur les oeufs de poissons peuvent être utilisées à la place de l'essai préliminaire. Dans le cas où les essais poissons sont réalisés en même temps que d’autres essais (par exemples daphnies et algues), ces essais sont réalisés au préalable et un essai limite avec 7 poissons par condition est réalisé sur les poissons à la concentration entrainant 50% d'effet la plus basse des autres tests conformément à la monographie n°126 de l’OCDE. Utilisation de 14 poissons par test limite au lieu de 42 poissons pour un test complet. Si plusieurs essais sont réalisés en même temps, les témoins sont mutualisés.

Raffinement

Une charge maximale de 0.8 g de poids frais/L est utilisée au cours des tests. la concentration en oxygène dissout doit être maintenu au dessus de 60%. Les perturbations (vibrations ou bruit excessifs, par exemple) qui pourraient modifier le comportement des poissons doivent être évitées ou réduites autant que possible. Les poissons témoins pourront être en fonction des demandes placés à la fin du test. Une observation journalière des organismes est réalisée a minima et 2 fois par jour si apparition de symptômes évocateurs de souffrances.

Choix des espèces

Les espèces utilisées sont celles préconisées dans les normes imposées par les règlementations. Les poissons utilisés seront au stade juvénile ou adulte conformément aux normes utilisées.

2 500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit un cathéter veineux puis sert à provoquer un accident vasculaire cérébral par thrombine, chlorure de fer ou électrocoagulation, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des expérimentateurs aux gestes techniques et chirurgicaux. Le porteur présente cette formation comme un moyen de réduire à terme le nombre d'animaux utilisés dans les études de l'établissement. Les animaux sont tués par perfusion transcardiaque après imagerie.

Objectifs

L'AVC est une maladie qui survient de manière inattendue et a une issue désastreuse. Environ 17 millions de personnes connaîtront un épisode d'AVC chaque année dans le monde, dont 60% gardent des séquelles neurologiques, tandis que 40 % des cas entraîneront la mort. La thrombolyse avec l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant intraveineux (rtPA) est le seul traitement médicamenteux approuvé pour les patients ayant subi un AVC ischémique aigu, mais son utilisation est limitée par une fenêtre thérapeutique étroite, une efficacité sélective et des complications hémorragiques. Les projets associés à cette pathologie qui sont réalisés dans l'établissement utilisent des techniques méritant un apprentissage pour acquérir la finesse des gestes techniques et chirurgicaux. Cette formation pratique aura pour résultat de réduire le nombre d'animaux des groupes expérimentaux associés aux projets ultérieurs grâce à une meilleure reproductibilité des gestes chirurgicaux des expérimentateurs ainsi qu'une meilleure prise en charge du bien-être animal.

Bénéfices attendus

Cette stratégie d'apprentissage a pour but d'améliorer les résultats des projets précliniques sur les AVC. Le nombre d'animaux utilisés dans les projets scientifiques ultérieurs sera réduit du fait de la meilleure reproductibilité des gestes des expérimentateurs. La prise en charge des animaux sera également améliorée (soins pré, post-opératoire), ce qui participera à l'amélioration du bien-être des animaux.

Procédures

1 - Pose d’un cathéter intraveineux pour injection de traitements (n=2500, durée de la procédure :15 minutes) 2 - Approches endovasculaires : (n=1800 souris = 12 personnes x 5 ans de projet x 10 souris par type de modèle x 3 modèles pour cette procédure) et (n =75 rats pour 3 personnes = 5 ans de projet x 5 rats par type de modèle x 3 types de modèles dans cette procédure) 2.1 - Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine (durée de la procédure :1.5 heures) 2.2 - Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par application de FeCl3 (durée de la procédure :1.5 heures) 2.3 - Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par électrocoagulation (durée de la procédure :1.5 heures) 3 - Approche extracranienne (n=600 souris = 12 personnes x 5 ans de projet x 10 souris pour ce modèle, durée de la procédure: 45 minutes) et (n=5 ans de projet x 5 rats pour ce type de modèle = 25 rats pour 3 personnes) 4 - Evaluation des lesions cérébrales par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) et/ou par échographie ultrasonore (n=2500, durée de la procedure :15 minutes). La totalité des animaux (n=2500) seront mis à mort par perfusion transcardiaque selon la dérogation. Chaque animal subira la procédure 1 : pose de cathéter dans la veine caudale de la queue, la procédure 2 ou 3 suivant le type d'approche et le type de modèle, la procédure 4 d'imagerie suite à l'induction de l'ischémie et seront enfin perfusés (dérogation de mise à mort).

Impact sur les animaux

Ce projet à titre d'apprentissage sera soumis à une attention et un encadrement strict pour garantir le bien-être des animaux pendant cette phase d'entrainement. Le stress de l'experimentateur qui manipule l'animal (préhension de l'animal dans sa cage) et la douleur occasionnée lors des procédures (gestes chirurgicaux) sont pris en charge par une couverture analgésiante, anesthésiante, du contrôle de la température des animaux et d'un encadrement supplémentaire. Un environnement contrôlé par des conditions d'hébergements réglementaires et une surveillance strict pallient également les nuisances attendus sur les animaux.

Devenir

A partir de la procédure 1 (Pose de cathéter sur la veine caudale), tous les animaux seront utilisés pour les procédures suivantes : un type de modèle selon l'approche pour induire l'ischémie (procédure 2 ou 3) et la procédure d'imagerie suivie de la perfusion transcardiaque.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques d'apprentissage de chirurgies actuelles de substitution ne permettent pas d'acquérir les gestes techniques. Nous avons sélectionné les modèles expérimentaux les plus utilisés dans la thématique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend ces espèces (souris et rat) particulièrement intéressantes dans le cadre des études portant sur l'AVC.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction tout en aquérant un certain niveau d'expertise technique. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon l'expertise nécessaire à la bonne réalisation des gestes techniques. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure a été calculé par l'expérience de plus de vingt ans de formation aux gestes chirurgicaux des personnels dans l'établissement. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expériencen prédisposition pour ce type de gestes), le nombre de 10 animaux par modèle pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM, échographie) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. L'utilisation d'un animal pour un enchainement de procédures légères et modérées réduit également le nombre total d'animaux.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les travaux de recherche pré-cliniques ont amené à développer l'utilisation de souris transgéniques (tPA null/tPA KO). Cela renforce l'intérêt de s'entrainer sur des souris : espèce qui sera utilisée par la suite. Le rat (Rattus norvegicus) reprend les caractéristiques de la pertinence de l'utilisation de la souris citées ci-dessus mais il est utilisé à moindre mesure, justifiant son nombre plus limité prévu ici. Il n'existe pas de rats transgéniques sur la thématique mais sa morphologie suscite son intérêt pour l'imagerie grâce à plus grande taille et à sa palette comportementale plus grande que la souris. Les animaux utilisés seront âgés de 10 semaines et auront un poids de 35 g environ pour les SWISS et d'environ 20 g pour les C57BL/6J et d’environ 300 g pour les rats Wistar ou SPRAGUE DAWLEY âgés de 10 semaines également. Nous réaliserons nos modèle sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.

18 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur crée un anévrisme cérébral par cathéter à ballon introduit dans la carotide, laissé mûrir jusqu'à trois mois, avant l'insertion d'un dispositif de mesure puis la résection du tissu. Le porteur reconnaît des complications déjà observées sur un modèle voisin, hémorragies mortelles, gangrène d'une patte, réouverture de plaies et perte d'appétit. Il présente le lapin comme un modèle validé et justifie le recours à l'animal après des essais sur artères imprimées en 3D.

Objectifs

Un anévrisme intracrânien correspond à une anomalie anatomique résultant d’une déformation structurale et résiduelle de la paroi d’une artère cérébrale. On estime qu’entre 2 et 5% de la population possède un anévrisme cérébral. Le risque annuel de rupture de ce dernier varie entre 1 et 4% dans la population porteuse de la pathologie (130000 AVC chaque année en France). Les anévrismes intracrâniens sont généralement découverts lors de leur rupture, ce qui entraîne, dans un cas sur quatre environ, le décès du patient avant même son arrivée à l’hôpital. La formation d’un anévrisme peut être interprétée comme une dégradation locale des propriétés mécaniques du tissu artériel et dans le cadre de ce projet, nous proposons de développer un dispositif de caractérisation in vivo des anévrismes cérébraux, de le valider sur des artères artificielles, puis de le tester sur l’animal. Les objectifs du projet sont les suivants : • Expérimentation in vivo sur modèle lapin avec anévrisme induit permettant l’établissement d’une gamme de pressions n’engendrant pas la rupture de l’anévrisme et étant suffisamment importante pour être détectée à l’imagerie • Imagerie de l’anévrisme induit durant l’essai grâce à un scanner spectral qui permettra l’obtention d’images durant le temps de sollicitation de la paroi anévrismale.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément la pathologie visée. Sur du court terme, comme indiqué au préalable, l’identification d’une gamme de pressions est visée. Ce projet aura aussi pour bénéfice de permettre la validation de notre prototype de sollicitation de la paroi anévrismale in situ et in vivo. Cette étape semble indispensable avant de passer à l’expérimentation de notre dispositif sur modèle anatomique humain. Effectivement, sur du long terme, l’objectif principal de ce projet est de donner un outil de diagnostic aux praticiens quant à la distance à la rupture ou non d’un anévrsime à partir des propriétés biomécaniques de la paroi.

Procédures

Les lapins seront soumis à une procédure d’induction d’anévrisme classée sévère. Cette procédure implique une anesthésie générale des animaux afin d’introduire via l’artère fémorale un système de cathéter avec ballon, monté jusque dans l’artère carotide commune afin de créer l’anévrisme. Selon les groupes, la procédure pourra s'étendre jusqu'à 3 mois (1 mois, 2 mois, 3 mois) à compter de la création de l’anévrisme afin de tester et de comprendre l’effet du temps de maturation sur la fragilité des parois anévrismales (durée opération création anévrisme entre 45 et 60 minutes). Les lapins seront de nouveau anesthésiés afin d’introduire le dispositif de caractérisation jusque dans l’anévrisme réalisé et imagés (durée 45 minutes + imagerie 30 minutes).

Impact sur les animaux

Les lapins seront soumis à une procédure d’induction d’anévrisme classée sévère. Hormis les décès liés à une complication pendant la réalisation de la procédure d'anévrisme (hémorragie ) ; sur un précédent modèle, avec un même abord chirurgical, portant sur l’aorte du lapin, certaines nuisances ont été observées : - réouverture de la plaie par les points de sutures qui sautent, une anesthésie est réalisée pour refaire les points, entrainant une cicatrisation en seconde intention. – de rare cas de gangrènes sur la patte postérieure peuvent être observés en raison d'une injection trop proche du nerf sciatique, entrainant une paralysie du membre - une perte d'appétit : les lapins ne s'alimentent pas après l'opération et deviennent léthargiques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure, une résection du tissu anévrismal est effectuée afin de réaliser des tests de caractérisations biomécaniques sur ces tissus.

Remplacement

L’expérimentation animale (in vivo) arrive après une phase expérimentale sur artère cérébrale artificielle (impression 3D) ainsi qu’une phase couplée de simulations numériques qui nous ont permis de créer une première itération de notre prototype de dispositif médical qu’il reste à valider en in vivo. De plus les analyses in vitro ne suffisent pas en ce qui concerne les propriétés biomécaniques de la paroi, car des paramètres biofidèles sont très durs à obtenir et à reproduire (élasticité, dégradation de la paroi, multicouche...). La première étape a consisté à développer et à dimensionner un outil de sollicitation de la paroi anévrismale. Un travail de deux ans a été réalisé sur des artères fantômes (imprimées en 3D) en testant différents paramètres afin d’établir une première gamme de pressions utile.

Réduction

Afin de réduire le nombre de lapins nécessaires à l’étude, un test de puissance statistique a été utilisé dans un premier temps. Il s’agit d’un test ANOVA à l’aide du logiciel GPower. Trois groupes de 5 lapins seront créés soit 15 avec 3 lapins supplémentaires afin d’anticiper une mortalité accidentelle, soit un nombre total de 18. La puissance du test statistique utilisé dans ce cas est de 0,95 pour une taille d’effet de 0,81.

Raffinement

La règle de raffinement est appliquée notamment pour l’hébergement. Un hébergement au sol est prévu quand des lapins de sexe femelles seront utilisées : litière, cartons de différentes hauteur, jouet, foin et abreuvement automatique Un hébergement individuel par l’utilisation de cages enrichies quand des lapins de sexe mâles seront utilisés : bâton et bloc de cellulose à ronger, foin, paroi de cages transparentes permettant aux animaux de se voir. Enfin, toutes les procédures expérimentales seront réalisées avec l’utilisation d’anesthésie gazeuse et sous analgésiques pour éviter en tout point que les animaux ne souffrent. Une grille de score et fiche de suivi individuelle permettront de mettre en avant des critères d’interruptions de la procédure et exclusion des animaux.

Choix des espèces

Le lapin reste un des modèles de choix pour la création d’anévrismes cérébraux et est validé par plusieurs publications et est considéré comme un bon modèle préclinique dans cette pathologie. La taille de l’animal permet d’utiliser le prototype de déformation ainsi que l’imagerie souhaitée et il est possible de mimer la pathologie (en termes de dégradation des couches artérielles) humaine avec ce modèle. Les lapins au stade de développement adulte seront utilisés afin d'avoir un accès fémoral et une navigation pendant la procédure aisée.

Deux macaques à longue queue déjà équipés de matériel d'enregistrement dans un autre projet autorisé sont repris pour cette étude, et deux autres ne seront opérés qu'en cas d'exclusion des premiers. Les 4 macaques sont exploités dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et sont tués à la fin du projet pour vérifier sur leur cerveau la position de l'électrode de stimulation. Pendant deux ans, les singes implantés effectuent jusqu'à trois heures par jour, cinq jours sur sept, une tâche de vigilance assis sur une chaise pour primates, et subissent des enregistrements de 24 heures et des tests itératifs de latence d'endormissement. Ils reçoivent une stimulation électrique profonde, parfois pendant une nuit entière, et sont rendus parkinsoniens par des injections d'un produit chimique, isolés 72 heures après chacune. Pour écarter le rongeur, "un animal nocturne" selon le porteur, celui-ci retient un macaque dont il précise qu'il "ne constitue pas une espèce menacée d'extinction".

Objectifs

Les troubles du sommeil sont très fréquents dans la maladie de Parkinson où environ 70% des patients sont affectés. Ces troubles induisent une mauvaise qualité de l’éveil et du sommeil, ils altèrent fortement la qualité de vie des sujets atteints car ils empêchent la réalisation d’activités quotidiennes comme la conduite automobile. Seulement ces troubles sont mal pris en charge par les traitements actuels et il est important de trouver un traitement efficace. Il est établi que l’activité du cortex cérébral nous aide à déterminer les différents états de veille/sommeil. Ainsi, l’étude de l’activité du cortex et de sa modulation par la stimulation électrique de régions cérébrales profondes sont fondamentales pour mieux traiter ces troubles. Le macaque est un modèle de choix pour étudier les troubles du sommeil. Il présente des structures cérébrales et un comportement de veille/sommeil identique à celui de l’humain. Ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui sont des animaux nocturnes. Il est également impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Nous avons pour objectif de rétablir un comportement de veille/sommeil normal chez le singe parkinsonien. D’abord nous étudierons les états de sommeil du macaque sain et parkinsonien. Puis nous étudierons l’effet de la stimulation électrique d’une zone profonde du cerveau dans le but de restaurer un sommeil normal chez le singe parkinsonien. Le dispositif utilisé dans cette étude est déjà utilisé chez l’être humain. Cette étude permettra d’élargir son utilisation au traitement des troubles du sommeil. La plupart des expériences seront réalisées dans la cage d’hébergement des singes, ce qui diminue l’inconfort et le stress de l’animal. Leur état de santé sera surveillé tout au long des expériences. Ce qui permet d’intervenir immédiatement et de manière appropriée au moindre signe de souffrance. Cette étude nécessitera 2 animaux pour obtenir des résultats exploitables, mais deux autres animaux pourront être inclus dans cette étude si nécessaire. Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum mais est suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences.

Bénéfices attendus

D’après la littérature, environ 70% des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent aussi de troubles du sommeil. Donc, si il est possible de réguler les troubles du sommeil par la stimulation cérébrale profonde (SCP) du noyau sous-thalamique (NST), ce projet aboutirait à une meilleure prise en charge des troubles du comportement de veille/sommeil (V/S) chez les patients atteints de cette pathologie. Mais ceci permettrait aussi d’améliorer grandement leur qualité de vie car ces troubles empêchent la réalisation de tâches du quotidien qui demandent de l’attention comme la conduite automobile par exemple. Les bénéfices attendus de ce projet au niveau de la santé sont donc importants. Surtout que d’après la littérature, les troubles du sommeil semblent être des facteurs aggravants des maladies neurodégénératives. Au niveau scientifique ce projet va permettre de caractériser l’activité du noyau sous-thalamique (NST) dans les différents états de vigilance. Ceci permettrait une meilleure compréhension du comportement de veille/sommeil (V/S) au niveau cérébral. De plus. Des retombées technologiques sont aussi attendues de ce projet. En effet, de nouveaux paramètres de stimulation du NST par la SCP sont attendus afin de réguler le comportement de V/S..

Procédures

La phase 1 du projet est la chirurgie d’implantation, celle-ci sera réalisée uniquement si les deux animaux implantés dans un projet autorisé en cours sont sortis de l’étude. Des enregistrements télémétriques de longue durée (24h) de l’activité du cortex et du noyau sous-thalamique se dérouleront sur 2 ans et seront effectués à raison de 10 fois par condition. C’est-à-dire 10 fois chez l’animal sain, 10 fois chez l’animal ayant reçu une stimulation thérapeutique et sain, 10 fois chez l’animal parkinsonien et 10 fois chez l’animal parkinsonien ayant reçu une stimulation thérapeutique. Les enregistrements se feront chez les 2 animaux implantés et à l’état vigile. Ils seront effectués dans la volière d’hébergement de l’animal sans manipulation. La tâche comportementale de vigilance sera réalisée au maximum 3h par jour, à heure fixe et 5j/7 pendant 2 ans. Elle se déroulera sur les 2 animaux implantés, à l’état vigile et sur une chaise pour primates. Les animaux seront progressivement entrainés à réaliser cette tâche et chaque progrès ou bonne réponse sera récompensée. Le test itératif de la latence d’endormissement (TILE) sera réalisé chez les 2 animaux. Ce test sera réalisé 14 fois par conditions décrites précédemment. Pour déterminer les paramètres de la stimulation thérapeutique, des enregistrements sous anesthésie générale et en état vigile seront réalisés pour une durée maximale de 1h. Les enregistrements seront effectués de 5x1h en état vigile dans la volière d’hébergement. Puis des gammes de stimulation seront effectuées de façon à pouvoir tester le voltage maximal à utiliser à fréquence fixe de 130Hz (fréquence de stimulation utilisée en clinique). Le voltage utilisé est de 20% en dessous du voltage laissant apparaitre des effets secondaires. Les enregistrements couplés à la stimulation seront effectués sous anesthésie générale et vigile à raison de 5x1h par condition, ces enregistrements détermineront la fréquence de stimulation à utiliser. Les paramètres de stimulation permettront ensuite de stimuler le singe durant toute une nuit. Les 2 animaux seront ensuite rendus parkinsoniens par des injections d'un produit chimique induisant la pathologie. Après chaque injection les animaux seront isolés pendant 72h jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modérément sévère et stable. Cette phase dure 4 mois.

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation peut induire des douleurs au niveau du matériel implanté jusqu’à maximum une semaine après l’implantation. Elle sera réalisée uniquement si les deux animaux implantés dans un projet autorisé en cours sont sortis de l’étude.. Mais, au moindre signe de douleur un accompagnement de l’animal et un traitement médicamenteux est prévu pour réduire au maximum la douleur. La tâche de vigilance peut induire du stress chez l’animal mais celui-ci est rapidement dissipé par un apprentissage progressif à réaliser la tâche. De plus l’entrainement et la réalisation de la tâche sont couplé à un renforcement positif récompensant l’animal. Le test itératif de la latence d’endormissement ainsi que les enregistrements télémétriques de longue durée n’induisent pas d’effets indésirables chez les animaux car ils sont réalisés dans la volière d’hébergement des animaux. Ces derniers sont vigiles, libres de leur mouvement et aucune manipulation n’est effectuée sur ces derniers. Enfin l’induction du syndrome parkinsonien induira chez ces derniers un symptôme parkinsonien progressif et maitrisé. Ce syndrome induira des troubles moteurs semblables à la maladie de parkinson. Les animaux seront suivis et accompagnés durant cette procédure.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour vérifier le bon positionnement de l’électrode de stimulation profonde.

Remplacement

Le singe Macaque fascicularis, qui ne constitue pas une espèce menacée d’extinction, est un animal qui présente une neuroanatomie, notamment du cortex et du noyau sous-thalamique, très proche de celle de l'humain. Il présente aussi un comportement de veille/sommeil similaire à celui des humains. De plus ce modèle animal a permis l’élaboration de la stimulation cérébrale profonde du noyau sous-thalamique ainsi que son transfert aux patients. Enfin, c’est un modèle de choix validé par la littérature pour l’étude neurophysiologique et comportementale de la maladie de Parkinson induite par injection de neurotoxine. C'est donc pour toutes ces raisons que le Macaque fascicularis est un modèle de choix pour l'étude de l’efficacité de la stimulation cérébrale profonde sur le comportement de veille/sommeil dans la maladie de Parkinson. Cette étude préclinique sur le comportement de veille/sommeil nécessite des animaux ayant de fortes similitudes avec l’humain, il nous est donc impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle rongeur qui est un animal nocturne, un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le recours à ces animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un traitement chirurgical applicable à l’humain.

Réduction

Le nombre de d’animaux a été déterminé avec un test statistique appliqué pour l’étude. Il permet de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées. Les animaux seront leur propre contrôle car les tests seront effectués sur les animaux sains puis rendus parkinsoniens. Pour que cette étude soit exploitable il faut enregistrer des signaux de courte durée (au moins 1h) et de longue durée (au moins 24h) à raison de 10 fois chez un seul animal. Ces durées permettent d’obtenir des données statistiquement exploitables. Les analyses spectrales de ces signaux seront comparées à l’aide de tests statistiques adaptés. Dans la définition du nombre d’animaux prévus, nous prenons en compte le risque de rupture de vaisseaux pouvant créer une hémorragie silencieuse pendant la chirurgie, mais s’aggravant en post opératoire ; la mauvaise implantation car le noyau ciblé est très petit. Ceci nous conduit à inclure 100% d’'animaux en plus, soit 2 animaux supplémentaires qui seront opérés uniquement en cas d’exclusion des premiers, ce qui fait un total de 4 animaux maximum pour cette étude. Une étude préliminaire a permis d’enregistrer les signaux corticaux et du NST d’un animal pendant les différents états de veille/sommeil ainsi que de valider la faisabilité des enregistrements. 2 animaux impliqués dans cette étude sur lesquels les expérimentations sont réalisées sont issus d’un projet autorisé en cours de réalisation ce qui réduit le nombre de nouveaux animaux impliqués dans cette étude de moitié.

Raffinement

Des actions sont mises en place pour limiter les risques chirurgicaux : l’imagerie anatomique préopératoire, la ventriculographie et une vérification électrophysiologie per opératoire sont prévues. De plus, des analgésiques, des anesthésiques et des antibiotiques seront administrés aux animaux avant et pendant l’opération chirurgicale afin de supprimer les douleurs et de diminuer les risques d’infections. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques et des antibiotiques afin de réduire au maximum les douleurs et les risques d’infections. Afin de diminuer le stress des animaux soumis à ce contexte expérimental un programme d’habituation aux conditions expérimentales (tâche de vigilance) est mis en place dans l’animalerie. Ces entrainements se font selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée. Un tableau de progression est utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assurent par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Durant la phase 5, étant donné que l’administration du produit induisant la pathologie se fera en même temps pour les deux animaux dans une pièce adaptée, ils ne seront donc pas séparés car l’isolement des animaux est généralement un standard dans le protocole d’administration de ce produit. Deux animaux sont réutilisés pour cette étude et ont reçu une implantation de matériel d’enregistrement, ce matériel sera utilisé pendant cette étude ce qui dispense cet animal de la chirurgie d’implantation.

Choix des espèces

Le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) qui ne constitue pas une espèce de primate menacée d’extinction et qui sont issus d’élevage fait partie des mammifères les plus proches de l’espèce humaine. Son anatomie cérébrale est très proche de celle du cerveau humain, notamment au niveau des structures impliquées dans le comportement de veille/sommeil, ce qui permet de mettre en place la stimulation cérébrale profonde dans les mêmes conditions que chez l’humain, chose impossible à faire avec des animaux plus petits tels que les rongeurs. Ils permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil. Ce modèle animal est d’autant plus pertinent que le comportement de veille/sommeil de ce dernier est très similaire à celui de l’être humain. Aussi, la complexité du comportement de veille/sommeil ainsi que l’impact de la stimulation cérébrale profonde sur ce dernier rend impossible le remplacement de ce modèle animal par un modèle cellulaire ou par une simulation informatique. Des adultes seront utilisés dans cette étude car les traitements à développer à la suite visent des patients adultes.